WO1996028456A1

WO1996028456A1 - Antibiotiques tkr1912-i et tkr1912-ii et leur procede de production

Info

Publication number: WO1996028456A1
Application number: PCT/JP1996/000565
Authority: WO
Inventors: Kazutoh Takesako; Yoshie Yoshikawa; Eiko Koyama; Tomoko Masuda; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1995-03-10
Filing date: 1996-03-08
Publication date: 1996-09-19
Also published as: EP0814086B1; DE69622541T2; US6068839A; AU4889696A; US6380245B1; DE69622541D1; JP3341773B2; ATE221077T1; EP0814086A4; EP0814086A1

Description

明細書抗生物質 T K R 1 9 1 2 I、 Τ Κ R 1 9 1 2— I I及びそれらの製造方法技術分野

本発明は、真菌感染症の治療剤として有用な抗生物質 TKR 1 9 1 2 一 I、 TKR 1 9 1 2— I I及びこれらの製造方法並びにこれらを産生する微生物に関する。背景技術

真菌は、ヒト、動物、植物等に感染して種々の疾病を引き起こすことが知られている。例えば、ヒトの皮庸、口腔等に表在性真菌症を起こし内臓、脳等に全身性真菌症を起し、ぺット、家畜等の動物に対しても同様の感染症を起こす。更に、果樹、野菜等の植物に対しても、種々の病害を起こす。

このうち、ヒ卜に感染して、全身性真菌症を起こす原因真菌の主なものとしては、カンジダ (C a n d i d a) 、クリブトコッカス (C r y D t o c o c c u s ) 、ァスぺノレギノレス（A s p e r g i 1 l u s ) 等が知られ、表在性真菌症では、皮膚、口腔、膣等に感染するカンジダ、手足の皮慮等に感染する白癣菌等が主なものと考えられている。生活環境中にはこれら以外にも多様な真菌が存在し、動植物の汚染を引き起こす原因と考えられている。

このような真菌による感染症、汚染に対する治療、防御の目的に使用可能である抗真菌剤は、現在のところ、非常に少数のものが知られているに過ぎない。このうち、特にヒトを始めとする動物の全身性感染症に対する治療剤としては、アンホテリシン B、フルシトシン、ミコナゾール、フルコナゾ一ル等を挙げることができる。しかし、これらのものは, 効力、毒性、抗菌スペクトル等の点で問題があり、治療剤としては充分なものではなかった。発明の開示

本発明の目的は、上述の現状に繮み、真菌感染症の治療剤として有用な新規抗生物質を提供するところにある。

本発明者らは、新規な抗生物質の探索を目的として、多数の微生物を自然界より分離し、その産生する抗生物質を単離し、生物学的性質を調ベたところ、オーレオノくシティゥム (A u r e o b a s i d i u m ) 厲に厲する微生物の培養物中に、カンジダ ' アルビカンス、クリプトコッカス · ネオホルマンス等の病原性真菌に対して抗菌活性を示す抗生物質が存在していることを見いだした。その後、本発明者らは、この抗生物質を単離し、その理化学的性質を調べた結果、待有の理化学的性質を有する文献未記載の二つの新規物質であることを確認し、これらの抗生物質をそれぞれ、 TK R 1 9 1 2 — I、及び、 T K R 1 9 1 2 — I I と命名した。本発明は、上記抗生物質 T K R 1 9 1 2 — I及び T K R 1 9 1 2 — I I 並びにこれらの製造方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1 は、抗真菌性物質 TK R 1 9 1 2 - 1の紫外線吸収スぺクトルを示す図である。縦軸は波長（ n m) を示す。

図 2 は、抗真菌性物質 TK R 1 9 1 2 — Iの赤外線吸収スぺクトルを示す図である。横軸は波数（ c m— ¹) を示す。

図 3は、抗真菌性物質 TK R 1 9 1 2— I I の紫外線吸収スぺクトルを示す図である。縦軸は波長（nm) を示す。

図 4は、抗真菌性物質 TKR 1 9 1 2 - I Iの赤外線吸収スぺクトルを示す図である。横軸は波数（ c m_') を示す。

図 5は、抗真菌性物質 T K R 1 9 1 2— Iの 'Η— NMRスぺクトルを示す図である。横軸は化学シフト値（p pm) を示す。

図 6は、抗真菌性物質 TKR 1 9 1 2— Iの ¹³ C— NMRスぺクトルを示す図である。横軸は化学シフト値（p p m) を示す。

図 7は、抗真菌性物質 T K R 1 9 1 2— I Iの 'H— NMRスぺクトルを示す図である。横蚰は化学シフト値（P pm) を示す。

図 8は、抗真菌性物質 T K R 1 9 1 2 — 1 Iの ¹³ C— NMRスぺクトルを示す図である。横軸は化学シフト値（p p m) を示す。

図 9は、抗真菌性物質 TKR 1 9 1 2— Iの H P L Cでの溶出位を示す図である。縦軸は 2 2 0 n mにおける相対紫外線強度を示し、横軸は保持時間（分）を示す。

図 1 0は、抗真菌性物質 TKR 1 9 1 2 - I Iの H P L Cでの溶出位置を示す図である。縱軸は 2 2 0 n mにおける相対紫外線強度を示し、横軸は保持時間（分）を示す。発明の詳細な開示

以下に本発明を詳述する。

本発明の伉生物質 T K R 1 9 1 2 — I は、下記（ 1 ) 、（ 2 ) 、 ( 3 ) , ( 4 ) 及び（ 5 ) の理化学的性質を有する。

( 1 ) F A B— M S法による質量スぺクトルが、 mZ z 5 5 9 [ M + H] + のビークを有する

( 2 ) 炭素数が、 2 6であり、窒衆数が、 0である

( 3 ) メタノール中における紫外線吸収スペクトルが、図 1 に示す通り . 末端吸収を示す

( 4 ) K B r法による赤外線吸収スぺクトルの主要な吸収波数が、図 2 に示す通り、 3 4 3 0 c m 、 2 9 2 0 c m 、 2 8 5 0 c m— '、 1 7 4 0 c m 、 1 1 9 0 c m ¹である

( 5 ) メタノール、クロ口ホルム及び水に可溶であり、へキサンに難溶である

本発明の抗生物質 T K R 1 9 1 2 — I I は、下記（ 6 ) 、（ 7 ) 、 ( 8 ) 、（ 9 ) 及び（ 1 0 ) の理化学的性質を有する。

( 6 ) F A B — M S法による質量スぺクトルが、 mノ z 5 8 5 [ M + H] ' のビークを有する

( 7 ) 炭素数が、 2 8であり、窒素数が、 0である

( 8 ) メタノール中における紫外線吸収スペクトルが、図 3 に示す通り末端吸収を示す

( 9 ) K B r法による赤外線吸収スペクトルの主要な吸収波数が、図 4 に示す通り、 3 4 4 0 c m-'、 2 9 2 0 c m - 2 8 5 0 c m -'、 1 7 4 0 c m— '、 1 2 0 0 c m 'である

( 1 0：) メタノール、クロ口ホルム及び水に可溶であり、へキサンに難溶である

上記 T K R 1 9 1 2 — I は、また、図 5 に示す ' Η— NMRスぺクトル、図 6 に示す ^{1 3} C— NMRスペクトルを有し、逆相分配高速液体クロマトグラフィ一において、図 9示す位置に溶出される特性を有する。

また、上記 T K R 1 9 1 2 — 1 I は、図 7 に示す ' H— NMRスぺクトル、図 8 に示す） ^a C— NMRスペクトルを有し、逆相分配高速液体ク口マトグラフィ一において、図 1 0 示す位 Sに溶出される特性を有する。

上記 T K R 1 9 1 2 — 1 、上記 T K R 1 9 1 2 - I I は、オーレォバシディゥム (A u r e o b a s i d i u m) 厲に厲し、上記 T K R 1 9 1 2— 1、上記 TKR 1 9 1 2— 1 Iを産生する菌株を培養し、その後. 上記菌株の培養物から単離することにより製造することができる。

本発明で使用される上記菌株としては、オーレォバシディウ厶 ( A u r e o b a s i d i u m) 属に属し、上記 T K R 1 9 1 2 — I、上記 T

KR 1 9 1 2 - I Iを産生するものであれば特に限定されず、例えば、オーレオノくシディウム ' エスピー（ A u r e o b a s i d i u m s p. ) TKR 1 9 1 2株（以下「TKR 1 9 1 2株」という）等を挙げることができる。

上記 TKR 1 9 1 2株は、文献未記載の新菌株であって、本発明者らによつて初めて分離同定されたものであり、 TKR 1 9 1 2— 1、 TK R 1 9 1 2— I Iを有利に産生する特性を有するものである。以下、上記 TKR 1 9 1 2株の菌学的性質を詳細に説明する。

上記 TKR 1 9 1 2株は、各種培地におけるコロニー（以下「集落」ともいう）の色調が、表 1 に示す通りである。なお、表中の色調は、曰本工業規格 J I S Z 8 1 0 2 ( 1 9 8 5年）による色名を基準とし培地に接種後 2 5てで培養し、 4 日後、 7日後及び 1 4 日後に観察した桔果によって示したものである。

表 1

上記 T K R 1 9 1 2株は、麦芽エキス寒天培地、ポテトデキストロ一ス寒天培地、サブロー寒天培地等でよく生育し、そのコロニーの中心部は光沢があり、通常、粘性を呈するか又は糊状を呈するが、培養日数が経過するにつれて皮革状となることもある。コロニーの色調は、培養初期においては白く、その後、次第に局部的にごくうすい黄赤からビーチないしあんず色を呈するが、日が経過すると、オリーブ色からうぐいす茶色を呈する。更に日が経過すると、コロニーの色調は、褐色から黒褐色へと爽化する。この色素は不溶性である。

菌糸は 2 〜 3 m径であって、よく発達するが、気中菌糸は形成されず、寒天の内部に伸長する。菌糸の先端又は側面から、しばしば、 2 〜 4 X 3 〜 8 mの出芽型分生子を指先状に生じ、まり状の塊に増殖するものも観察される。若い栄養細胞は、酵母状を呈し、 2 〜 4 X 8 〜 1 4 / mの大きさであり、その形状は楕円形又はレモン形を呈し、多極出芽によって増殖を行う。大きさ 4〜 1 0 X 8〜 2 0 zmの分節胞子、大きさ 4〜 8 X 8〜 1 4 x mの厚膜胞子を形成し、子のう胞子は形成しない。

上記 TKR 1 9 1 2株の菌学的性質のうち、生理学的性質は、下記に示す通りである。

生育温度範囲：生育可能温度範囲が、 1 0〜 3 0 であり、生育最適温度が、 2 5 °C付近である。

生育 P H範囲：生育可能 p H範囲が、 P H 2〜！ H 9であり、生育最適 p Hが、 p H 3〜p H 7である。

色素の生成：メラ二ン様の不溶性の色素を生成する。

上述の菌学的性質を有する菌種を、ダブリュー ' ビー ' クック（W. B . C 0 0 k e ) 著、ミコバソロジァ ' エト ' ミコロジァ ' アブリカータ（My c o p a t h o l o g i a e ΐ M y c ο 1 o g i a A p 1 i c a t a ) 第 1 7卷第 1〜 4 3頁（ 1 9 6 2年）；ジエイ ' エー

• フォン ' ァルクス（J. A. v o n A r X ) 著、ザ ' ジヱネラ * ォブ ' ファンジ ' スボルレイティング ' イン ' ピュア ' カルチャー（T h e G e n e r o f F u n i S p o r u l a t i n g i n P u r e C u l t u r e) 、ジエイ ' クラマー ' レーレ（J. C r a m e r L e h r e ) ；ィ一 ' ジエイ ' へノレマ二デス一二ジホフ

(E. J . H e r m a n i d e s— N i j h o f f ) 著、スタディズ ' イン ' ミコロジ一（S t u d i e s i n My c o l o g y 、 N o . 1 5 第 1 4 1〜 1 6 6頁、シーピーエス ' バーン（C B S. B a a r n ) ( 1 9 7 7年）等の文献に記載されたオーレォバシディウム厲の菌種について検索することにより、上記 TKR 1 9 1 2株は、オーレォバシディウム属に属する菌株であると同定することができる。しかしながら、オーレォバシディウム厲に厲する菌株であって、 T K R 1 9 1 2 — 1 、 T K R 1 9 1 2 — 1 I の産生能を有するものについては、これまで報告がなされたことはなく、本発明者らは、これを新菌株とし、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名；曰本国茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3号（郵便番号 3 0 5 ) ) に、 F E RM B P — 5 3 6 8 (原寄託日；平成 7年 2 月 1 5 日、国際寄託への移管請求日：平成 8年 1 月 1 9 日）として寄託した。

本発明においては、上記 T K R 1 9 1 2株の他に、 T K R 1 9 1 2株の自然的又は人工的変異株、その他のオーレォバシディゥム属に属する菌種等であって、 T K R 1 9 1 2 — 1 、 T K R 1 9 1 2 — 1 I の産生能を有する微生物を使用することができる。

本発明においては、 T K R 1 9 1 2 — 1 、 T K R 1 9 1 2 — 1 I は、上杞 T K R 1 9 1 2 — I 、 T K R 1 9 1 2 — 1 I を産生する菌株を、栄養源含有培地に接種し、培養することによって製造される。上記栄養源のうち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、サッカロース、 ¾粉、デキス卜リン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸等を挙げることができる。

上記栄養源のうち、窒索源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コーンスチープリカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽尿素、アミノ酸、アンモニゥム塩等の有機窒素化合物、無機窒素化合物等を挙げることができる。上記栄養源のうち、塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、りん酸塩等の無機塩類を挙げることができる。これらはそれぞれ単独で使用されてもよく、適宜組み合わせて使用されてもよい。

上記栄養源含有培地には、更に必要に応じて、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の重金属；ピオチン、ビタミン B , 等のビタミン類：その他、菌の生育を助け、 TK R 1 9 1 2 — 1 、 T KR 1 9 1 2 — I I の産生を促進する有機物、無機物等を適宜添加することができる。

上記栄養源含有培地には、上記栄養源の他に、更に必要に応じて、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエーテル等の消泡剤、界面活性剤等を添加することができる。

上記 T K R 1 9 1 2 — 1、 T K R 1 9 1 2 — 1 I を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては、抗生物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される方法を採用することができるが、液体培養法、中でも振通又は深部通気攪拌培養法を好適に使用することができる。

上記塔養は、 1 5〜 3 0 °Cで行うことが好ましく、培地の p Hは、通常 p H 2〜 8であるが、 p H 4付近であることが好ましい。培養期間は. 通常 1 〜 6 日で充分な産生 Sを得ることができる。

上述の培養方法によって、 T K R 1 9 1 2 — 1 、 T K R 1 9 1 2 一 I I は、培養液及び菌体に含有されて培養物中に蓄積される。本発明においては、培養物中に蓄稜された T K R 1 9 1 2 — 1 、 T K R 1 9 1 2 — I I は、これら抗真菌性物質の理化学的性質を利用して培養物中から分離した後、必要に応じて更に精製し、取得することができる。

上記分離は、培養物全体を、酢酸ェチル、酢酸プチル、クロ口ホルムブタノール、メチルイソプチルケトン等の非親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる。また、培 *物を濂過又は遠心分離によつて培 *液と菌体とに分離した後、培養液、菌体のそれぞれから分離することもできる。

上記培養液から T K R 1 9 1 2 — I 、 T K R 1 9 1 2 — I I を分離するには、. 上記非親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することもでき、また、培養液を吸着性の担体に接触させ、培養液中の T K R 1 9 1 2 - I 、 T K R 1 9 1 2 — 1 I を担体に吸着させた後、溶媒で溶出する方法を採用することもできる。上記担体としては、例えば、活性炭、粉末セルロース、吸着性樹脂等を挙げることができる。上記溶媒としては、担体の種類、性質等によって適宜 1種又は 2種以上を組み合わせて使用することができ、例えば、含水アセトン、含水アルコール類等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を適宜組み合わせたもの等を挙げることができる。上記菌体から T K R 1 9 1 2 — I 、 T K R 1 9 1 2 — 1 I を分離するには、ァセ卜ン等の親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することができる

本発明においては、このようにして培養物中から分離された T KR 1 9 1 2 — 1、 T K R 1 9 1 2 — I Iの粗抽出物を、必要に応じて、更に精製する工程に付することができる。上記精製は、脂溶性抗生物質の分離、精製に通常使用される方法によって行うことができ、このような方法としては、例えば、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性樹脂等の担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィ一法等を挙げることができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えばクロ口ホルム、酢酸ェチル、メタノール、アセトン、水等を挙げることができ、これらは 2種以上を併用することができる。

上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては例えば、ォクタデシル基、ォクチル基、フユニル基等が桔合した化学桔合型シリカゲル：ボリスチレン系ボーラスボリマーゲル等を挙げることができ .. 移動相としては、例えば、含水メタノール、含水ァセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を使用することができる。

本発明の T K R 1 9 1 2 — I 、 TK R 1 9 1 2 — 1 I は、そのまま、又は、その薬理学的に許容される塩として医薬に使用することができる。

上記塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、りん酸、ふつ化水素酸、臭化水素酸等の鉱酸の塩；ぎ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クェン酸、フマール酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、カンファースルホン酸等の有機酸の塩；ナトリウム、カリウム、カルシゥム等のァルカリ金属又はアルカリ土類金属等の塩等を挙げることができる。

本発明の T K R 1 9 1 2 — 1、 TK R 1 9 1 2 - I I、又は、その薬理学的に許容される塩を医薬として投与する場合、本発明の T K R 1 9 1 2 — 1、 T K R 1 9 1 2 — I I 、又は、その薬理学的に許容される塩は、そのまま、又は、医薬的に許容される無毒かつ不活性の担体中に、例えば、 0. 1〜 9 9. 5 %、好ましくは 0. 5〜 9 0 %含有する医薬組成物として、ヒ卜を含む動物に投与される。

上記担体としては、例えば、固形、半固形若しくは液状の希釈剤、充填剤又はその他の処方用の助剤等を挙げることができ、これらは、 1種以上を用いることができる。

上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与、局所投与（経皮投与等）又は経直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。

本発明の T K R 1 9 1 2 — I、 T K R 1 9 1 2 — 1 I 、又は、その薬理学的に許容される塩を医薬として投与する場合、抗真菌剤としての用 Sは、年齢、体重等の患者の状態、投与経路、病気の性質と程度等を考慮した上で調整することが望ましいが、通常は、ヒトについては、成人に対して本発明の有効成分置として、一日当たり、 1 0〜 2 0 0 0 m g の範囲である。上記範囲未満の用量で足りる場合もあるが、逆に上記範囲を超える用量を必要とする場合もある。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。

上記経口投与は、固形、粉末又は液状の用量単位で行うことができ、例えば、末剤、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤, その他の剤型等により行うことができる。

上記非経口投与は、例えば、溶液や懇濁剤等の皮下、筋肉内又は静脈内注射用の液状用量単位形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の T K R 1 9 1 2 — 1 、 T K R 1 9 1 2 — 1 I . 又は、その薬理学的に許容される塩の一定置を、例えば、水性や油性の媒体等の注射の目的に適合する非毒性の液状担体に想濁又は溶解し、次いで該懸濁液又は溶液を滅菌することにより製造される。

上記局所投与（経皮投与等）は、例えば、液、クリーム、粉末、ベースト、ゲル、钦膏剤等の外用製剤の形態を用いることによって行うことができる。これらのものは、本発明の T K R 1 9 1 2 — I 、 T K R 1 9 1 2 — 1 1 、又は、その薬理学的に許容される塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮庸钦化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤等のうちの一種以上と組み合わせることにより製造される。

直腸投与は、本発明の T K R 1 9 1 2 — I 、 T K R 1 9 1 2 — 1 I 、又は、その薬理学的に許容される塩の一定量を、例えば、パルミチン酸ミリスチルエステル等の高級エステル類、ボリエチレングリコール、力カオ脂、これらの混合物等の低 ¾点の固体に混入した座剤等を用いて行うことができる。

発明を実施するための ft良の形態以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

実施例 1

T K R 1 9 1 2株（ F E R M P - 1 4 7 5 9 ) の斜面培養から一白金耳を、 1 0 O m l の液体培地（ディフコポテトデキス卜ロースブロス 2 . 4 % (W/ V) ) を入れた 5 0 0 m l 容の三角フラスコに接種し、 2 5 °Cで 3 日間振通し、種培養液を得た。この種培養液 1 . 0 m 1 を、上記液体培地 1 2 5 m l を入れた 5 0 0 m l 容の三角フラスコ 2 4本に接種し、 2 5 °C、 8 日間振通培養（振通 2 2 0 r p m) を行った。このようにして得た培養液を遠心分離し、上澄み液と菌体とに分離した。得られた上澄み液を P H 2 に調整し、水で平衡化したダイヤイオン H P 4 0 (三菱化成社製）カラム（ 2 L ) に吸着させ、水洗後、 5 Lのメタノールで溶出し、活性画分を得た。この画分を減圧濃縮することにより、残渣 2. 2 4 gを得た。

得られた残渣を水 6 0 0 m 1 に溶解し、 p Hを 8. 7 に調整した後、 6 0 0 m l の酢酸ェチルで 2 回抽出し、得られた酢酸ェチル抽出物を減圧下濃縮乾固し、残渣 1 . 0 gを得た。これをメタノール 5 0 m 1 に溶解し、分取用高速液体クロマトグラフィーに付し、 2 つの活性画分を得た。なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は下記によった。

装置：デルタブレップ 4 0 0 0 システム（ウォーターズ社製）

カラム：ソーゲンパック（ 8. 0 c m 5 0 c m) (綜研化学社製）移動相： 8 0 〜 1 0 0 % ( V/ V) ァセトニトリル Z水

これらの画分を減圧濃縮し、 T K R 1 9 1 2 — I の粗精製物 3 2 m g 及び T K R 1 9 1 2 — 1 I の精製物 1 7 2 m gを白色粉末として得た。

T K R 1 9 1 2 — I の粗精製物を再び高速液体クロマトグラフィーに付し、活性画分を得た。この画分を減圧濃縮することにより T K R 1 9 1 2 — I の精製物 1 3 m gを白色粉末として得た。なお、高速液体クロマ卜グラフィ一の条件は下記によつた。

装置： L C一 8 A (島津製作所社製）

カラム： YM C p a c k ( 2. 0 c m x 2 5 c m) (ヮイエムシ一社製）

移動相： 0. 0 5 % トリフルォロ酢酸を含む 7 0 % ( V/ V) ァセト二トリル水

理化学的性質

次に、得られた白色粉末がそれぞれ T KR 1 9 1 2 — I及び T K R 1 9 1 2 — I I であることを確認するため、 J M S— D X 3 0 2型質量分析装置（日本電子社製）を用いた質量分析、 J NM— A 5 0 0核磁気共鳴装置（曰本電子社製）を用いた重メタノール中での 'H— NMR (檩準物質：テトラメチルンラン）、及び' ^SC— NMR (標準物質：重メタノール）、 U V— 2 5 0型自記分光光度計（島津製作所社製）を用いた紫外線スぺクトル分析（メタノール溶液約 3 0 g / m 1 中）、 2 7 0 一 3 0型赤外分光光度計（日立製作所社製）を用いた赤外線スぺクトル分析（K B r法）に供し、それぞれの理化学的性質を調べた。

( 1 ) 貿麓分析

再度の高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、質量分析計による F A B— M S測定で、 m/ z 5 5 9 [M + H] ⁺ であることが判明した。最初の高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、質量分析計による F A B— M S測定で、 mZ z 5 8 5 [Μ + H] ⁺ であることが判明した。

( 2 ) 炭素数、窒素数

再度の高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、 ' Η— N MRスぺク卜ル測定、 ^{l 3} C — NMRスぺクトル測定及びその解析により、炭素数 2 6 であり、窒素数 0であることが判った。

その ' H— NMRスぺクトルを図 5 に、 ^{1 3} C— NMRスぺクトルを図

6 に示す。

最初の高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、 ' H— NMRスぺク卜ル測定、 ^{1 3} C— NMRスぺクトル測定及びその解析により、炭素数 2 8 であり、窒素数 0であることが判った。

その ' Η— NMRスぺクトルを図 7 に、 ^{1 3}C— NMRスぺクトルを図 8 に示す。

( 3 ) 紫外竦スぺク卜ル

再度の高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、紫外線スぺクトル測定装 Sによるメタノール中における測定では、図 1に示すように、末端吸収を示すことが判明した。

最初の高速液体ク口マトグラフィ一に付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、紫外線スぺクトル測定装 Sによるメタノール中における測定では、図 3 に示すように、末端吸収を示すことが判明した。

( 4 ) 赤外線スぺクトル

再度の高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を减圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、 K B r法による赤外線スぺクトル測定では、図 2 に示すように、主要吸収波数は下記のとおりであることが判明した。

I R (K B r ) ( c m— ') : 3 4 3 0、 2 9 2 0 、 2 8 5 0、 1 7 4 0 1 1 9 0

最初の高速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、 K B r法による赤外線スぺクトル測定では、図 4 に示すように、主要吸収波数は下記のとおりであることが判明した。

I R (K B r ) ( c m— ') : 3 4 4 0、 2 9 2 0、 2 8 5 0、 1 7 4 0. 1 2 0 0

また、これらのものは、いずれも、メタノール、クロ口ホルム、水に可溶であるが、へキサンには難溶であった。

上記分析結果により、再度の髙速液体クロマトグラフィーに付し、得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は、 T K R 1 9 1 2 — 1 であり、最初の高速液体クロマトグラフィーに付し得られた活性画分を減圧濃縮することにより得られた白色粉末精製物は T K R 1 9 1 2 — 1 I であることが判明した。

上記 T K R 1 9 1 2 — I及び T KR 1 9 1 2 - I I を、 L C— 1 O A 型高速液体クロマトグラフィー装 (島津製作所社製）を用いた逆相分配高速液体クロマトグラフィー（H P L C ) による分析に供した。なお高速液体クロマ卜グラフィ一の条件は下記によった。

カラム： C A P C E L L P AK C ,₈ ( 6 m m 1 5 0 mm) (资生堂社製）

移動相： 0. 0 5 % トリフルォロ醉酸を含む 7 0 % ( V / V ) ァセ卜二トリルノ水

力ラム温度： 4 0 ^

検出 U V波長： 2 2 0 n m

その結果、上記 TK R 1 9 1 2 — I及び TK R 1 9 1 2 — 1 I は、それぞれ図 9及び図 1 0 に示す位置に溶出されることが明らかとなった。 O 96/28456

1 7

生物学的性質

得られた TK R 1 9 1 2— I及び TKR 1 9 1 2— I Iを使用して各種微生物に対する抗菌スぺクトルを調べた。測定は、液体培地希釈法により、菌の增殖をほぼ完全に阻止した濃度を最少生育阻害濃度 s / m l ) として求めた。結果を表 2に示した。また、部分的に菌の增殖を阻害する最少濃度を半阻止濃度（ / g/m l ) として求め、併せて表 2 の括弧内に示した。表中、 YN B Gは、イーストナイトロジェンベース (ディフコ社製） 0. 6 7 %、グルコース 1. 0 %を含有する YN B G 培地を、 B H I は、ブレインハートインヒユージョンブイヨン（日水製薬社製） 0. 5 %を含有する B H I培地をそれぞれ表す。表 2

表 2の結果から、本発明の抗真菌性物質 TKR l 9 1 2 — I及び TK R 1 9 1 2— I Iは、カンジダ ' アルビカンス、カンジダ ' ケフィールクリブトコッカス · ネオホルマンス等の病原性真菌に対して抗菌活性を有することが判明した。

また、得られた TKR 1 9 1 2— 1、 TKR 1 9 1 2 — 1 Iを、それぞれ、 C R系マウスに S O m gZk gを腹腔内投与したが、毒性は認めらォ 1な力、つた。産業上の利用可能性

本発明は、上述したように、真菌症の治療剤等の臨床医薬として有用である抗真菌性物質 TKR 1 9 1 2— I及び TKR 1 9 1 2— I I並びにそれらの製造方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 下記（ 1 ) 、〔 2 ) 、（ 3 ) 、（ 4 ) 及び（ 5 ) の理化学的性質を有することを特徴とする抗生物質 T K R 1 9 1 2 — I 又はその薬理学的に許容される塩。

( 1 ) F A B — M S法による質量スペクトルが、 m Z z 5 5 9 [ M 十 H ] ⁺ のピークを有する

( 2 ) 炭素数が、 2 6であり、窒素数が、 0である

( 3 ) メタノール中における紫外線吸収スペクトルが、末端吸収を示す

( 4 ) K B r法による赤外線吸収スぺクトルの主要な吸収波数が、 3 4 3 0 c m - 2 9 2 0 c m"' , 2 8 5 0 c m— '、 1 7 4 0 c m— '、 1 1 9 0 c m 'である

2. 下記（ 6 ) 、（ 7 ) 、（ 8 ) 、（ 9 ) 及び（ 1 0 ) の理化学的性質を有することを特徴とする抗生物質 T K R 1 9 1 2 — I I 又はその薬理学的に許容される塩。

( 6 ) F A B — M S法による質量スペクトルが、 m Z z 5 8 5 [ M + H ] ⁺ のビークを有する

( 7 ) 炭素数が、 2 8であり、窒素数が、 0である

( 8 ) メタノール中における紫外線吸収スペクトルが、末端吸収を示す ( 9 ) K B r法による赤外線吸収スぺクトルの主要な吸収波数が、 3 4

4 0 c m' 2 9 2 0 c m— '、 2 8 5 0 c m 、 1 7 4 0 c m 、 1 2

0 0 c m である

( 1 0 ) メタノール、クロ口ホルム及び水に可溶であり、へキサンに難溶である

3. オーレオノくシディウム（A u r e o b a s i d i u m ) 厲に厲する菌株であって、抗生物質 TKR 1 9 1 2— I及び抗生物質 TKR 1 9 1 2 — I 【のうち少なくとも 1種を産生する菌株を培養し、その後、前記菌株の培養物から目的物を単離することを特徴とする抗生物質 TKR 1 9 1 2 ~ 1及び抗生物質 T KR 1 9 1 2— 1 Iのうち少なくとも 1種の製造方法。

4. ォ一レオノくシアイゥム (A u r e o b a s i d i u m ) 屑にし、抗生物 "liTKR l 9 1 2— I及び抗生物質 TKR 1 9 1 2— 1 Iのうち少なくとも 1種を産生することを特徴とする微生物。