WO1996006909A2

WO1996006909A2 - Enzymatische, aktiven sauerstoff liefernde mischung sowie herstellung von persäuren

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Publication number: WO1996006909A2
Application number: PCT/EP1995/003342
Authority: WO
Inventors: Karl-Heinz VAN PÉE; Hans-Jürgen HECHT; Albrecht Berkessel; Thomas Schrapel; Hartmut Laatsch
Original assignee: Degussa Aktiengesellschaft
Priority date: 1994-08-27
Filing date: 1995-08-23
Publication date: 1996-03-07
Also published as: DE4430327C1; TR199501064A2; AU3472495A; WO1996006909A3; EP0777718A2

Abstract

Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischungen können Anwendung als Oxidationsmittel zur Herstellung chemischer Verbindungen sowie in Bleich-, Wasch-, Reinigungs- und Desinfektionsmitteln finden. Erfindungsgemäß besteht die Mischung aus Oxidoreduktase mit einer α/β-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure, einer Peroxidquelle, einer wäßrigen Lösung einer organischen Säure oder deren Salz. Die Herstellung organischer Persäuren erfolgt erfindungsgemäß derart, daß in Anwesenheit von Oxidoreduktase mit einer α/β-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure und Wasserstoffperoxid oder Peroxidverbindungen organische Säuren oder deren Salze in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und bei Temperaturen zwischen 15 und 80 °C zu organischen Persäuren umgewandelt werden.

Description

Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung sowie Herstellung von Persauren

Beschreibung π U±i flr- ___^,_■_-»_. - JP_. -_! _V_. _ _-. 1_.4

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Sauerstoff liefernde Mischung sowie ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Persauren. Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischungen finden Anwendung bei Oxidationsreaktionen zur Herstellung chemischer Verbindungen. Derartige Mischungen sind aber auch als oxidative Bleichmittel in Waschmittelzusammensetzungen wirksam. Das erfindungsgemaße Verfahren ist insbesondere bei der Synthese organischer Verbindungen anwendbar, bei denen die in situ gebildete Persaure als oxidierender Reaktionspartner teilnimmt.

Bekannt ist die chemische Persaureherstellung, die über die Umsetzung von Saureanhydriden und Saurehalogeniden mit Wasserstoffperoxid erfolgt. Technisch lassen sich Persauren aus Carbonsauren und Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Mineralsauren herstellen. Die Persauren sind außerordentlich instabil. Bei Erhitzen können derartige Verbindungen ohne Vorwarnung explodieren.

Auch wenn die hohe Reaktivität organischer Persauren bekannt und für viele chemische Reaktionen von Vorteil ist, fanden bislang im wesentlichen Natriumperborate als Bleichmittel in Waschmitteln Anwendung. Aus der US-PS 5,296,161 ist ein Verfahren beKannt, das ausgenend von der enzymatischen Aktivität von Esterasen - katalytisch Ester zu verseifen - diese Wirkung nutzt, um organische Persauren in Losung herzustellen und deren sauerstoffbildende Aktivität beispielsweise für Bleichprozesse zu nutzen. Dabei werden in Gegenwart von Esterasen und Lipasen Fettsaureester definierter Struktur enzymatisch unter Bildung von Persauren gespalten. Aufgrund der Anwendung von Fettsaureestern erfordern derartige Systeme jedoch zusatzliche Emulgatoren, um das System in Lösung bzw. Suspension zu halten und dadurch die enzymatische Reaktion zu ermöglichen. ^ττnabhängig dessen, daß bei diesem System nach Verbrauch bzw. Reaktion der Reaktionskomponenten ökologisch schwer abbaubare Produkte entstehen können, setzt dieses System zunächst eine aufwendige Synthese definierter Verbindungen - hier Glyzeridverbindungen - voraus. Zum anderen entwickeln sich hier längerkettige Persäuren, deren Reaktivität gegenüber niederkettigen organischen Persauren vermindert ist. Eingeschränkt ist auch der Temperaturbereich derartiger enzymatischer Systeme, was deren Anwendung als Bleichmittel, beispielsweise bei Voll- und Kaltwaschmitteln begrenzt.

Bedingt durch die hohe Reaktivität niederkettiger organischer Persäuren, sind solche Verbindungen bevorzugt Reaktionspartner in der Synthese organischer Verbindungen. Die Anwendung von Persäuren war aufgrund der Reaktivität bislang aber auf die laborchemische Synthese beschränkt.

Auch die enzymatische Synthese nach US-PS 5,296,161 erlaubt nicht die gezielte Herstellung reaktiver, niederkettiger organischer Persäuren und ist aufgrund der beteiligten, spezifischen Reaktionspartner in ihrem Einsatzbereich bei der Synthese organischer Verbindungen eingeschränkt.

Aufgabe der Erfindung ist es, m einfacher Weise enzymatisch organische Persäuren herzustellen und eine Mischung als Lieferant aktiven Sauerstoffs für die unterschiedlichsten Anwendungen bereitzustellen.

Erfmdungsgemaß besteht die enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung aus

Oxidoreduktase mit einer α/ß-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure einer Peroxidquelie und einer organischen Saure oder derem Salz,

wobei die Mischung in wassriger Losung angewandt wird.

Bei flüssiger Form der Mischungskomponenten wird die Peroxidquelle getrennt von den anderen Komponenten aufbewahrt.

Dadurch, daß sich das erfindungsgemäße Enzym gefriertrocknen und bei Raumtemperatur auch über längere Zeiten aufbewahren läßt, kann das Enzym z.B. in Verbindung mit Natriu acetat und Natriumperborat in einer Feststoffmischung angewandt werden.

Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Mischung in wassriger Lösung katalysiert das Enzym die Umwandlung der organischen Säure in Persäure unter Beteiligung der Peroxidquelle.

Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme können aus unterschiedlichen Organismen (Pro- und Eukaryonten) isoliert werden. Vorzugsweise wird als Enzym bakterielle Nicht-Häm-Haloperoxidase, z. B. Chlorperoxidase oder Bromperoxidase unterschiedlicher Herkunftsstamme für die erfindungsgemaße Mischung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren angewandt.

Als organische Saure werden vorzugsweise Mono- und Dicarbonsauren und Hydroxycarbonsauren mit 2 bis 4 C- Atomen, wie insbesondere Essigsaure, Propionsaure oder Milchsäure bzw. deren Salze eingesetzt. Als Peroxidquelle werden vorzugsweise Wasserstoffperoxid oder Wasserstoffperoxid freisetzende Verbindungen, wie Perborate, insbesondere Natriumperborat, Percarbonate, insbesondere Natriumpercarbonat, und Persulfate genutzt.

Die angewandte Enzymmenge ist abhangig vom Volumen des Gesamtsystems und betragt vorzugsweise pro 0,15 bis 50 μmol Wasserstoffperoxid und pro 100 μmol Säure oder Salz 8 bis 16 mU Enzym. Wird statt Wasserstoffperoxid eine andere Peroxidquelle eingesetzt, beispielsweise Natriumperborat, bezieht sich die einzusetzende Menge auf das daraus freigesetzte Wasserstoffperoxid. Die Enzymeinheit U bezeichnet die Enzymmenge, die ein μmol Substrat pro Minute umsetzt.

Der pH-Bereich der erfindungsgemäßen Mischung wird durch die beteiligte organische Säure oder deren Salze im Bereich 3,5 bis 6 gepuffert. Die Anwendungstemperatur der erfindungsgemäßen Mischung kann je nach verwendetem Enzym zwischen 20 und 80 °C liegen.

Die erfindungsgemäßen Oxidoreduktasen besitzen gleiche Strukturmerkmale, nämlich eine α/ß-Hydrolase-Faltung und eine katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure. Neben diesen Merkmalen benötigen die angewandten bakteriellen Nicht-Häm- Haloperoxidasen im Gegensatz zu den hämhaltigen Haloperoxidasen keine Häm-Gruppe als prosthetische Gruppe und im Gegensatz zu den eukaryontischen Nicht-Häm-

Haloperoxidasen auch keine Metallionen oder andere Co- Faktoren für ihre Aktivität.

Überraschend hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Enzyme durch Hydrolyse eines Serinesters in Verbindung mit Wasserstoffperoxid Persauren bilden, die dann als oxidierendes Agens wirken. Der Seπnester entsteht dabei durch Reaktion der organischen Säure mit einem Serinrest im aktiven Zentrum des Enzyms.

Die erfindungsgemäß verwendeten Oxidoreduktasen sind durcn Klonierung der Gene und Uberexpression leicht m großen Mengen darstellbar.

Die erfindungsgemaße Mischung läßt sich aufgrund ihrer oxidativen Wirkung verschiedentlich anwenden, z. B. in der Synthese organischer Verbindungen, oder generell als Oxidationsreagenz. Ein derartiges Anwendungsgebiet sind Bleichmittel, etwa Bleichmittel für Papier und Textilien, insbesondere für Bleichprozesse im sauren bis neutralen pH- Bereich. Aufgrund der hohen bioziden Wirksamkeit von niederen Percarbonsäuren eignet sich die erfindungsgemäße Mischung auch als Desinfektionsmittel zur Desinfektion von wäßrigen Lösungen und Oberflächen oder zur Herstellung von Desinfektionsmitteln. Als Zusatz in Wasch-, Bleich-, Reinigungs- und Desinfektionsmitteln angewendet, reagieren die in situ aus der erfindungsgemäßen Mischung gebildeten Persäuren durch Oxidation mit Schmutzstoffen, färbenden Komponenten und Mikroorganismen.

Erfindungsgemäß wird das Verfahren zur enzymatischen Herstellung organischer Persäuren so geführt, daß

Oxidoreduktase mit einer α/ß-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure in Gegenwart von Wasserstoffperoxid, einer organischen Säure oder deren Salze bei einem pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und bei Temperaturen zwischen 15 und 80 °C die Bildung der organischen Persäure katalysieren. Verwendet man in diesem Prozeß Essigsäure, bildet sich in situ als Reaktionsprodukt Peressigsäure, bei Verwendung von Propionsäure oder Milchsäure analog Perpropionsäure oder Permilchsäure.

Vorzugsweise wird als Enzym bakterielle Nicht-Häm- Haloperoxidase, z. B. Chlorperoxidase oder Bromperoxidase, als Peroxidverbindung Wasserstoffperoxid oder Natriumperborat und als organische Säure Essigsäure oder Propionsäure oder Milchsäure oder deren Salze eingesetzt. Der Enzymanteil beträgt vorzugsweise pro 0,15 bis 50 μmoi Wasserstoffperoxid und pro 100 μmol Säure oder Salz 8 bis 16 mU Enzym. Wird statt Wasserstoffperoxid Natriumperborat eingesetzt, bezieht sich die einzusetzende Menge auf das daraus freigesetzte Wasserstoffperoxid. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Persaure ist außerordentlich reaktiv. Sie oxidiert Verbindungen oder zersetzt sich unter Bildung von aktivem Sauerstoff und freier Säure. Der aktive Sauerstoff kann damit als Reaktionspartner genutzt werden. Über derartige Oxidationsreaktionen läßt sich auch die in situ gebildete Persäure nachweisen, beispielsweise durch Oxidation von Anilin zu Nitrobenzol. In Gegenwart von Halogenidionen werden diese in situ oxidiert und bei Anwesenheit von für die elektrophile Substitution geeigneten Substraten kommt es zu Halogenierungs-reaktionen. Unabhängig dessen, daß sich über die vorgenannten Oxidationsreaktionen die m situ gebildeten Persauren nachweisen la se , zeigen diese Beispiele ein vorteilhaftes Anwendungsgebiet des erfmdungsgemaßen Verfahrens bei der Synthese organischer Verbindungen.

Anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele, eines beigefügten Sequenzprotokolls mit Aminosäuresequenzen untersuchter Enzyme sowie der Figuren 1 und 2 soll die Erfindung näher erläutert werden. Dabei zeigen:

Fig. 1: dreidimensionale Struktur des Enzyms

Bromperoxιdase-A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762 - Gesamtansicht

Fig. 2: Ausschnitt aus der dreidimensionalen StruKtur des Enzyms Bromperoxιdase-A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762

Enzyme

Folgende Enzyme werαen verwandt:

- Chlorperoxidase aus Pseudomonia pyrrocmia, nachfolgend mit CPO-P bezeichnet

BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91 ) ISA/EP Bromperoxidase AI aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762, nachfolgend mit BPO-Al bezeichnet

Bromperoxidase A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762, nachfolgend mit BPO-A2 bezeichnet

- Chlorperoxidase aus Streptomyces aureofaciens Tu 24, nachfolgend mit CPO-T bezeichnet

Chlorperoxidase aus Streptomyces lividans, nachfolgend mit CPO-L bezeichnet

Chlorperoxidase aus Pseudomonas fluorescens, nachfolgenα mit CPO-F bezeichnet

Chlorperoxidase aus Serratia marcescens, nachfolgend mit CPO-S bezeichnet

Acetylcholmesterase aus Zitteraal, nachfolgend mit Ace bezeichnet

Die Herstellung der Enzyme erfolgt im wesentlichen nach Zellaufschluß und Entfernen der unlöslichen Zeilbestandteile durch Zentrifugation je nach Enzym über Hitzeschritt, Fallung von Fremdproteinen durch pH- Erniedrigung und anschließender Saulenchromatographie an unterschiedlichen Medien.

Das Gen der Bromperoxidase A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762 sowie auch die Überexpression mit anschließender Reinigung ist im J. Gen.Microbiol. 138, S. 1123-1131 (1992) beschrieben. Die Reinigungen αer Bromperoxidasen BPO-Al und BPO-A2 aus S. aureofaciens ATCC 10762 sind in J. Gen. Microbiol. 137, S. 2539-2546 (1992) veröffentlicht.

Die Reinigungen der Chlorperoxidasen von Streptomyces aureofaciens TU 24 (CPO-T) und Pseudomonas pyrrocima finden sich im Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, S. 1225-1232 (1987) bzw. J. Biol. Chem. 263, S. 13725-13732 (1988) . Die Klonierung der Gene, die Uberexpression und die neuen, vereinfachten Reinigungsverfahren sind in J. Bacteriol. 170, S. 5890-5894 (1988) bzw. Gene 130, S. 131-135 (1993) beschrieben.

Eine Herstellungsvorschrift für das Enzym CPO-L findet sich in J. of Bacteriology, Vol. 176, S. 2339-2347 (1994). Das Enzym CPO-S wird aus dem Wildstamm isoliert (FEMS Microbiol. Lett. Vol. 129, S. 255-260 (1995)). Das Enzym Ace ist käuflich erwerbbar (Fa. Sig a) .

Zur Herstellung des Enzyms CPO-F wurde zur Klonierung des Gens ein synthetisches Oligonukleotid folgender Zusammensetzung verwendet:

TTT TAT AAA GAT TGG GG C C G C

Dieses Oligonukleotid wurde entsprechend der Angaben des Herstellers mit einem DIG Oligonukleotid 3' - END Labeling Kit der Firma Boehringer Mannheim markiert und mit EcoRI- verdauter Gesamt-DNA aus Pseudomonas fluorescens hybridisiert. DNA im hybridisierenden Bereich wurde isoliert und in den Plasmid-Vektor pUC18 ligiert und für' die Transformation von E. coli TG 1-Zellen verwendet. Ampicillin-resistente E. coli-Transformanten wurden mit Hilfe des Oligonukleotids durch Koloniehybridisierung auf Vorhandensein des Chlorperoxidasegens hin untersucht. Der erhaltene Klon enthielt ein 9 kb großes Insert, das mit BamHI/EcoRI-Verdauung zu einem 3.8 kb großen Insert verkleinert wurde. Dieses Fragment wurde ebenfalls in pUC18 ligiert und damit E.coli TG1 transformiert. Die resultierenden rekombinanten E. coli-Klone enthielten das Plasmid pSK380. Ausgehend von pSK 380 wurde durch Verdauung mit Xhol ein 2,3 kb großes Insert erhalten, das wiederum in pUC18 ligiert wurde (pSK230) . E. coli-Klone, die das Plasmid pSK 230 enthielten, produzierten erhöhte Mengen an CPO-F. Dazu wurde E. coli mit dem Plasmid pSK230 für 24 h gezüchtet, die Zellen durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Nac^Λ_ Ammoniumsulfatfallung (35 - 55 _ Sättigung) wurde die Proteinlosung langsam auf 55 °C erhitzt, dann auf Eis gekühlt und ausgefallenes Protein durch Zentrifugation entfernt. Anschließend wurde die Losung auf einen

Proteingehalt von 5 mg/ml eingestellt und mit 1/100 Volumen einer Trypsmlosung (10 mg/ml) versetzt und über Nacht bei 37 °C inkubiert . Nach Ultrafiltrat cn (YM30-Membran) wurde die Proteinlosung auf eine mit 10 mM Natπumacetat-Puffer, pH 5,5, equilibrierte DEAE-Sephacel-Saule (10 ml) aufgetragen. Die Elution erfolgte mit einem NaCl-Gradienten von 0 - 0,6 M m 10 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5,5 (10 ml) . Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und durch Ultrafiltration konzentriert. Die Protemlosung wurde dann auf eine Sephacryl S 300-Saule, equiiibriert mit 0, 1 M Ammoniumacetat, pH 6,8, aufgetragen und fraktioniert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und bei -20 °C gelagert.

Das Sequenzprotokoll zeigt die Ammosauresequenzen αer Enzyme CPO-P, BPO-Al, BPO-A2, CPO-T, CPO-L und CPO-F. Die Ammosauresequenzen wurden von den nach der Kettenabbruchmethode erhaltenen DNA-Sequenzen abgeleitet.

Sichtbar ist, daß die Ammosauresequenzen der dargestellten Enzyme an gleicher Stelle gleiche Aminosäuren, nämlich die Aminosäuren Serin (Ser) , Histidin (His) und Asparaginsäure (Asp) aufweisen. Diese Aminosäuren bilden die kataly ische Triade der Enzyme.

Fig. 1 zeigt Gesamtansicht eine dreidimensionale Struktur des Enzyms Bromperoxιdase-A2 aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762, die αurch Rontgenstrukturanalysen erhalten wurde (Hecht et. al, Nature Struct. Biol. 1, S. 532-537 (1994) .

BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91 ) ISA/EP In Fig. 2 ist ein Ausschnitt der dreidimensionalen Struktur des Enzyms BPO-A2 dargestellt. Das aktive Zentrum mit der katalytischen Triade, bestehend aus Serin (Ser 101A) , Histidin (His 264A) und Aspartat (Asp 235A) , ist deutlich zu erkennen. Zusatzlich sind in Fig. 2 angegeben: Met 102A, Tyr 76A und Trp 211A.

Ausfύhrungsbeispiel 1

Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung unter Beteiligung von Chlorperoxidase

Die Mischung besteht aus

0,5 mg Chlorperoxidase aus Streptomyces aureofaciens TU 24 gelöst Wasser

4 ml 1 M Natriumacetat-Puffer pH 4, 0 und

- 15,7 μl (152 μmol) H₂0₂ (30%ιg) .

Vor Reaktion wird die Wasserstoffperoxidlosung getrennt von den anderen Komponenten gelagert. Diese Mischung soll nachfolgend für die Oxidation von Thioanisol zum entsprechenden Sulfoxid verwendet werαen.

Dazu werden zu 4 ml 1 M Natriumacetat-Puffer pH 4, 0 und 1 ml 1,4-Dιoxan 11,8 μl Thioanisol μnd 15,7 μl H₂0₂ 30^'.ιg gegeben. Dieser Losung werden 0,5 mg Chlorperoxidase aus Streptomyces aureofaciens TU 24 zugefugt und die Reaktion für 78 mm bei 22 °C inkubiert. Als alleiniges Proαukt wurde zu 100 % das Sulfoxid erhalten.

Ausfuhrungsbeispiel 2

Enzymatische, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung unter Beteiligung von Bromperoxiαase

Die Mischung besteht aus

BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP 1 ml 0, 1 M Natriumacetat, pH 5,5

100 μl 0,03 % H₂0₂-Lösung

0,3 μg Bromperoxidase aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762.

Bis zur Reaktion wird die Wasserstoffperoxidlösung getrennt von den anderen Mischungskomponenten gelagert. Anhand einer Bromierungsreaktion von Monochlordimedonlösung soll die Anwendung der vorbenannten Mischung beschrieben werden:

Dazu werden zu 1 ml 0,1 M Natriumacetat pH 5,5 10 μl 4,8 mM Monochlordimedonlösung in Ethanol und 100 μl 0,03 % H₂0₂-Lösung gegeben. Dieser Lösμng werden 0,3 μg Bromperoxidase aus Streptomyces aureofaciens ATCC 10762 sowie 100 μl 1 M Natriumbromidlösung zugefügt.

In dieser Lösung katalysiert die Bromperoxidase die Umwandlung von Natriumacetat in Peressigsäure. Die gebildete Peressigsäure reagiert dann weiter mit dem Natriumbromid. Dadurch wird das Bromidion oxidiert und es kommt zur vollständigen Bromierung des eingesetzten Monochlordimedons innerhalb von 10 min.

Ausführungsbeispiel 3

Enzymatisch, aktiven Sauerstoff liefernde Mischung unter Beteiligung von Chlorperoxidase

Die Mischung besteht analog Ausführungsbeispiel 2 aus

1 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5

- 100 μl 0,03 % H₂0₂-Lόsung

0,3 μg Chlorperoxidase aus Pseudomonas pyrrocmia.

Bis zur Reaktion werden die Mischungkomponenten getrennt voneinander gelagert. Analog Ausführungsbeispiel 2 wird diese Mischung zur Bromierung einer Monochlordimedonlösung angewandt .

In der nachfolgenden Tabelle ist die Abhängigkeit der bromierenden Aktivität der Chlorperoxidase aus Pseudomonas pyrrocinia von der Temperatur aufgeführt:

Tabelle 1

% Aktivität

20 30

30 50

40 70

50 90

60 100

70 50

Tabelle 1 zeigt die Enzymaktivität über einen weiten Temperaturbereich, wobei bei 40 bis 70 °C gute und bei 60 °C die besten Ergebnisse erzielt werden.

Ausführungsbeispiel 4

Bromierung von Monochlordimedon mit einer enzymatischen, aktiven Sauerstoff liefernden Mischung unter Verwendung von Enzymen unterschiedlicher Herkunft

Analog Ausführungsbeispiel 2 wird jeweils eine Mischung aus

- 1 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5 100 μl 0,03 _ H₂0₂-Lösung und

10 mU Enzym CPO-P, CPO-T, BPO-Al, BPO-A2, CPO-F, CPO-L, CPO-S bzw. Ace hergestellt.

Dazu werden zu 1 ml 0, 1 M Natriumacetat pH 5,5 10 μl 4,8 mM Monochlordimedonlösμng in Ethanol μnd 100 μl 0,03 % H₂θ₂-Lösung gegeben. Dieser Lösung werden 10 mU Enzym sowie 100 μl 1 M Natriumbromidlösung zugefügt.

Anhand der Bromierungsreaktion von Monochlordimedon zu Monobrommonochlordimedon wird die Aktivität der enzymatischen Mischung bestimmt. Dabei wird Bromid durch die enzymatisch gebildete Persäure oxidiert und reagiert dann mit dem organischen Substrat Monochlordimedon. Hierbei führt ein mol Persäure zur Bromierung eines mols Monochlordimedon. Die Enzyme zeigen je nach Herkunft unterschiedliche spezifische Aktivitäten:

Enzym spez. Aktivität (unit/mg Protein)

CPO-P 63

CPO-T 9

BPO-Al 45

BPO-A2 15

CPO-F 4

CPO-L 19

CPO-S 390

Ace 0,013 Ausführungsbeispiel 5

Verfahren zur Herstellung von Peressigsäure

19 μg Chlorperoxidase werden in 1 ml IM Natriumacetat, pH 4,0 gelöst und mit 5 μl 30 % H₂θ₂~Lösung versetzt und für 50 min. bei 30 oC inkubiert. Die dabei entstehende Peressigsäure wird anhand der Oxidationsreaktion von 2-Chloranilin zu 2-Nitrochlorbenzol nachgewiesen.

Nachfolgende Tabellen geben Reaktionsergebnisse bei unterschiedlichen Mengen der Reaktionspartner Acetat und Wasserstoffperoxid wieder.

Tabelle 2:

2-Nitrochlorbenzolbildung in Abhängigkeit von unterschiedlichen H₂θ₂-Konzentrationen

H₂θ₂-Anteil Reaktionsprodukt

110 mM H₂0₂ 95 ng 2-Nitrochlorbenzol

176 mM H₂0₂ 160 ng 2-Nitrochlorbenzol

220 mM H₂0₂ 200 ng 2-Nitrochlorbenzol

330 mM H₂0₂ 230 ng 2-Nitrochlorbenzol

440 mM H₂0 240 ng 2-Nitrochlorbenzol Tabel le 3 :

2 -Nitrochlorbenzoibi ldung in Abhängigkeit von unterschiedlichen Acetatkonzentrat ionen

Acetat-Konzentration Reaktionsprodukt

20 mM Acetat 30 ng 2-Nitrochlorbenzol

100 mM Acetat 120 ng 2-Nitrochlorbenzol

200 mM Acetat 180 ng 2-Nitrochlorbenzol

500 mM Acetat 240 ng 2-Nitrochlorbenzol

1000 mM Acetat 240 ng 2-Nitrochlorbenzol

Die oben aufgeführten Tabellen zeigen eine Abhängigkeit sowohl von der Konzentration von Wasserstoffperoxid als auch von Acetat. Acetatgehalte bis zu 500 mM führen zu erhöhter Persäureproduktion.

Claims

Patentansprüche

1. Enzymatische, aktiven Sauerstoff bildende Mischung in trockener oder flussiger Form, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung aus

Oxidoreduktase mit einer α/ß-Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure, einer Peroxidquelle und - einer organischen Saure oder derem Salz besteht,

und wassriger Losung angewandt wird.

2. Mischung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung aus

- in Wasser gelöster Oxidoreduktase mit einer α/ß- Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure, Peroxidlosung - einer wassrigen Losung einer organischen Saure oder derem Salz besteht,

wobei bis zur Anwendung dieser Mischung die Peroxidlosung getrennt von den anderen Komponenten aufbewahrt wird.

3. Mischung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidoreduktase bakterielle Nicht-Ham- Haloperoxidase, als organische Saure Essigsaure oder Propionsäure oder Milchsaure oder deren Salze und als Peroxidquelle Wasserstoffperoxid oder Natriumperborat eingesetzt werden.

4. Mischung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als bakterielle Nicht-Ham-Haloperoxidase Chlorperoxidase oder Bromperoxidase eingesetzt werden.

5. Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil Oxidoreduktase pro 0,15 bis 50 μmol Wasserstoffperoxid und pro 100 umol Säure oder deren Salz 8 bis 16 mU betragt.

6. Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil Oxidoreduktase bei Einsatz von Natriumperborat 8 bis 16 mU pro 0,15 bis 50 umol in Lösung freigesetztem Wasserstoffperoxid betragt.

7. Verfahren zur Herstellung von organischen Persauren, dadurch gekennzeichnet, daß in Anwesenheit von Oxidoreduktase mit einer α/ß- Hydrolase-Faltung und einer katalytischen Triade aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure und Wasserstoffperoxid oder Peroxidverbindungen organische Sauren oder deren Salzen in wassriger Losung bei einem pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und bei Temperaturen zwischen 15 und 80 °C zu organischen Persauren umgewandelt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidoreduktase bakterielle Nicht-Ham- Haloperoxidase, als Peroxidverbindung Natnumperborat und als organische Saure Essigsaure oder Propionsäure oder Milchsäure oder deren Salze eingesetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als bakterielle Nicht-Häm-Haloperoxidase Chlorperoxidase oder Bromperoxidase eingesetzt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß pro 0,15 bis 50 μmol Wasserstoffperoxid und pro 100 umol Säure oder Salz 8 bis 16 mU Nicht-Häm- Haloperoxidase eingesetzt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß bei Einsatz von Natriumperborat 8 bis 16 U Oxidoreduktase pro 0, 15 bis 50 umol in Lösung freigesetztem Wasserstoffperoxid eingesetzt werden.