JPH10174583A - 酸化酵素、その製造方法及び用途 - Google Patents
酸化酵素、その製造方法及び用途Info
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- JPH10174583A JPH10174583A JP33400496A JP33400496A JPH10174583A JP H10174583 A JPH10174583 A JP H10174583A JP 33400496 A JP33400496 A JP 33400496A JP 33400496 A JP33400496 A JP 33400496A JP H10174583 A JPH10174583 A JP H10174583A
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- polyphenol oxidase
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- polyphenol
- oxidase according
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アルカリ側に至適反応ｐＨを有する新規なポ
リフェノールオキシダーゼ、その生産微生物及び用途の
開発、提供。 【解決手段】 スティルベラ、サゲノメラ、スタキリジ
ウム属菌類が生産するポリフェノールオキシダーゼ。該
酵素を用いる着色物質の処理、紙、パルプもしくは繊維
の処理、微生物もしくはウィルスの処理、または、洗浄
処理等の方法や脱酸素剤、洗剤組成物の提供。スティル
ベラ・ｓｐ．SD3101、サゲノメラ・ｓｐ．SD3102、スタ
キリジウム・ｓｐ．SD3103。
リフェノールオキシダーゼ、その生産微生物及び用途の
開発、提供。 【解決手段】 スティルベラ、サゲノメラ、スタキリジ
ウム属菌類が生産するポリフェノールオキシダーゼ。該
酵素を用いる着色物質の処理、紙、パルプもしくは繊維
の処理、微生物もしくはウィルスの処理、または、洗浄
処理等の方法や脱酸素剤、洗剤組成物の提供。スティル
ベラ・ｓｐ．SD3101、サゲノメラ・ｓｐ．SD3102、スタ
キリジウム・ｓｐ．SD3103。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アルカリ側に至適
反応ｐＨを有する新規なポリフェノールオキシダーゼ及
びこのようなポリフェノールオキシダーゼを菌類培養物
から製造する方法と利用方法に関する。さらに詳しく言
えば、本発明はｐＨ８近辺のアルカリ側に至適反応ｐＨ
を有する新規なポリフェノールオキシダーゼ、そのポリ
フェノールオキシダーゼを生産する微生物、そのポリフ
ェノールオキシダーゼの製造方法、及び着色物質、微生
物もしくはウィルス、紙、パルプ、または繊維の処理、
洗浄等の分野における利用方法に関するものである。
反応ｐＨを有する新規なポリフェノールオキシダーゼ及
びこのようなポリフェノールオキシダーゼを菌類培養物
から製造する方法と利用方法に関する。さらに詳しく言
えば、本発明はｐＨ８近辺のアルカリ側に至適反応ｐＨ
を有する新規なポリフェノールオキシダーゼ、そのポリ
フェノールオキシダーゼを生産する微生物、そのポリフ
ェノールオキシダーゼの製造方法、及び着色物質、微生
物もしくはウィルス、紙、パルプ、または繊維の処理、
洗浄等の分野における利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、担子菌類、不完全菌類等の糸状菌
が生産するポリフェノールオキシダーゼやラッカーゼに
よるポリフェノール酸化作用が知られている。しかしな
がら、従来のポリフェノ−ル酸化酵素はアルカリ側で活
性が著しく低いため、実際の用途が限られていた。例え
ば、ポリフェノール酸化酵素の漂白への利用について
は、ＷＯ９１−０５８３９、ＥＰ５８０７０７、ＤＥ４
００８８９４、特開昭６４−６０６９３などに記載され
ている。しかしながら洗濯などの洗浄操作は通常アルカ
リｐＨで行われ、特に過酸化水素存在下での酸化漂白を
同時に行う場合には過酸化水素の漂白作用を促進するた
めにもアルカリｐＨでの洗浄操作が望ましい。従って、
こうした用途にポリフェノールオキシダーゼを用いる場
合、酸性ｐＨに至適反応ｐＨを有する従来の酵素では実
質的な利用は困難であった。
が生産するポリフェノールオキシダーゼやラッカーゼに
よるポリフェノール酸化作用が知られている。しかしな
がら、従来のポリフェノ−ル酸化酵素はアルカリ側で活
性が著しく低いため、実際の用途が限られていた。例え
ば、ポリフェノール酸化酵素の漂白への利用について
は、ＷＯ９１−０５８３９、ＥＰ５８０７０７、ＤＥ４
００８８９４、特開昭６４−６０６９３などに記載され
ている。しかしながら洗濯などの洗浄操作は通常アルカ
リｐＨで行われ、特に過酸化水素存在下での酸化漂白を
同時に行う場合には過酸化水素の漂白作用を促進するた
めにもアルカリｐＨでの洗浄操作が望ましい。従って、
こうした用途にポリフェノールオキシダーゼを用いる場
合、酸性ｐＨに至適反応ｐＨを有する従来の酵素では実
質的な利用は困難であった。
【０００３】ポリフェノールを構造部分に有する天然の
着色物質として、フラボノイド系、キサントン系、メラ
ニン系などの植物色素やリグニンが知られており、ポリ
フェノールオキシダーゼはこれらの天然物に対する漂白
作用を有する。また、毒性が問題になっているジクロロ
フェノール、トリクロロフェノールをもポリフェノール
オキシダーゼは反応基質にできる。それ故に、これらの
天然物や非天然物を含有する廃水処理においてもポリフ
ェノールオキシダーゼは有用である。しかしながら従来
の酵素では酸性ｐＨから中性ｐＨに至適反応ｐＨを有す
るためアルカリｐＨでの利用は実質的に困難であり、こ
のことがポリフェノールオキシダーゼの産業上の利用範
囲を狭くする要因となっていた。
着色物質として、フラボノイド系、キサントン系、メラ
ニン系などの植物色素やリグニンが知られており、ポリ
フェノールオキシダーゼはこれらの天然物に対する漂白
作用を有する。また、毒性が問題になっているジクロロ
フェノール、トリクロロフェノールをもポリフェノール
オキシダーゼは反応基質にできる。それ故に、これらの
天然物や非天然物を含有する廃水処理においてもポリフ
ェノールオキシダーゼは有用である。しかしながら従来
の酵素では酸性ｐＨから中性ｐＨに至適反応ｐＨを有す
るためアルカリｐＨでの利用は実質的に困難であり、こ
のことがポリフェノールオキシダーゼの産業上の利用範
囲を狭くする要因となっていた。
【０００４】一方、動植物由来のポリフェノールオキシ
ダーゼの中には、ｐＨ８以上の高ｐＨに至適ｐＨを有す
るものが知られている（Comp. Biochem. Physiol.,199
2,102B(4)891-896 : Zhongguo Nongye Huaxue Huizhi,1
991,29(2),177-185 : Agric.Biol. Chem.,1991,55(1),1
3-17）。しかしながら、これらのポリフェノールオキシ
ダーゼを動植物の組織から安定かつ安価に生産すること
は困難であり、産業上の利用に供するためには微生物由
来のポリフェノールオキシダーゼが望まれていた。
ダーゼの中には、ｐＨ８以上の高ｐＨに至適ｐＨを有す
るものが知られている（Comp. Biochem. Physiol.,199
2,102B(4)891-896 : Zhongguo Nongye Huaxue Huizhi,1
991,29(2),177-185 : Agric.Biol. Chem.,1991,55(1),1
3-17）。しかしながら、これらのポリフェノールオキシ
ダーゼを動植物の組織から安定かつ安価に生産すること
は困難であり、産業上の利用に供するためには微生物由
来のポリフェノールオキシダーゼが望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、アルカリ側に至適反応ｐＨを有するポリフ
ェノールオキシダーゼおよびこのようなポリフェノール
オキシダーゼを菌類培養物から製造する方法を提供する
ことにある。本発明が解決しようとする別の課題は、ア
ルカリ側に至適反応ｐＨを有するポリフェノールオキシ
ダーゼを用いることにより、アルカリｐＨ域での実用的
な酵素的酸化を達成して、ポリフェノールオキシダーゼ
の利用分野の拡大に寄与することである。
する課題は、アルカリ側に至適反応ｐＨを有するポリフ
ェノールオキシダーゼおよびこのようなポリフェノール
オキシダーゼを菌類培養物から製造する方法を提供する
ことにある。本発明が解決しようとする別の課題は、ア
ルカリ側に至適反応ｐＨを有するポリフェノールオキシ
ダーゼを用いることにより、アルカリｐＨ域での実用的
な酵素的酸化を達成して、ポリフェノールオキシダーゼ
の利用分野の拡大に寄与することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らはポリフェノ
−ル物質の酸化をアルカリｐＨにおいて触媒する菌体外
生産物を広範な微生物において鋭意探索を行い、不完全
菌類であるスティルベラ（Stilbella ）属、サゲノメラ
（Sagenomella ）属、あるいはスタキリジウム（Stachy
lidium）属に属する菌株がｐＨ８近辺のアルカリ側に至
適反応ｐＨをする目的の酵素を菌体外に生産することを
見出し、本発明を完成させるに至った。
−ル物質の酸化をアルカリｐＨにおいて触媒する菌体外
生産物を広範な微生物において鋭意探索を行い、不完全
菌類であるスティルベラ（Stilbella ）属、サゲノメラ
（Sagenomella ）属、あるいはスタキリジウム（Stachy
lidium）属に属する菌株がｐＨ８近辺のアルカリ側に至
適反応ｐＨをする目的の酵素を菌体外に生産することを
見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】すなわち本発明は以下のものを提供するも
のである。 ［１］ 以下の特性： （１）作用：ポリフェノールを酸化する； （２）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．２付近に至適反応ｐＨを
有する； （３）至適反応温度：５０℃付近に至適反応温度を有す
る； （４）分子量：ＧＦＣ分析により測定した分子量が約７
６，０００； （５）等電点：等電点電気泳動により測定した等電点が
約６．６；を有するポリフェノールオキシダーゼ。 ［２］ スティルベラ（Stilbella ）属菌類が生産す
る、前記［１］記載のポリフェノールオキシダーゼ。 ［３］ スティルベラ（Stilbella ）属菌類がスティル
ベラ・sp. （Stilbellasp. ）SD3101（受託番号FERM P-
15963）である前記［２］記載のポリフェノールオキシ
ダーゼ。
のである。 ［１］ 以下の特性： （１）作用：ポリフェノールを酸化する； （２）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．２付近に至適反応ｐＨを
有する； （３）至適反応温度：５０℃付近に至適反応温度を有す
る； （４）分子量：ＧＦＣ分析により測定した分子量が約７
６，０００； （５）等電点：等電点電気泳動により測定した等電点が
約６．６；を有するポリフェノールオキシダーゼ。 ［２］ スティルベラ（Stilbella ）属菌類が生産す
る、前記［１］記載のポリフェノールオキシダーゼ。 ［３］ スティルベラ（Stilbella ）属菌類がスティル
ベラ・sp. （Stilbellasp. ）SD3101（受託番号FERM P-
15963）である前記［２］記載のポリフェノールオキシ
ダーゼ。
【０００８】［４］ 以下の特性： （１）作用：ポリフェノールを酸化する； （２）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．５付近に至適反応ｐＨを
有する； （３）至適反応温度：５０℃付近に至適反応温度を有す
る； （４）分子量：ＧＦＣ分析により測定した分子量が約３
３，０００； （５）等電点：等電点電気泳動により測定した等電点が
約５．９；を有するポリフェノールオキシダーゼ。 ［５］ サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類が生産す
る、前記［４］記載のポリフェノールオキシダーゼ。 ［６］ サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類がサゲノメ
ラ・sp. （Sagenomellasp. ）SD3102（受託番号FERM P-
15964）である前記［５］記載のポリフェノールオキシ
ダーゼ。
有する； （３）至適反応温度：５０℃付近に至適反応温度を有す
る； （４）分子量：ＧＦＣ分析により測定した分子量が約３
３，０００； （５）等電点：等電点電気泳動により測定した等電点が
約５．９；を有するポリフェノールオキシダーゼ。 ［５］ サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類が生産す
る、前記［４］記載のポリフェノールオキシダーゼ。 ［６］ サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類がサゲノメ
ラ・sp. （Sagenomellasp. ）SD3102（受託番号FERM P-
15964）である前記［５］記載のポリフェノールオキシ
ダーゼ。
【０００９】［７］ 以下の特性： （１）作用：ポリフェノールを酸化する； （２）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．２付近に至適反応ｐＨを
有する； （３）至適反応温度：５０℃付近に至適反応温度を有す
る； （４）分子量：ＧＦＣ分析により測定した分子量が約５
５，０００； （５）等電点：等電点電気泳動により測定した等電点が
約７．０；を有するポリフェノールオキシダーゼ。 ［８］ スタキリジウム（Stachylidium）属菌類が生産
する、前記［７］記載のポリフェノールオキシダーゼ。 ［９］ スタキリジウム（Stachylidium）属菌類がスタ
キリジウム・sp. （Stachylidium sp.）SD3103（受託番
号FERM P-15965）である前記［８］記載のポリフェノー
ルオキシダーゼ。
有する； （３）至適反応温度：５０℃付近に至適反応温度を有す
る； （４）分子量：ＧＦＣ分析により測定した分子量が約５
５，０００； （５）等電点：等電点電気泳動により測定した等電点が
約７．０；を有するポリフェノールオキシダーゼ。 ［８］ スタキリジウム（Stachylidium）属菌類が生産
する、前記［７］記載のポリフェノールオキシダーゼ。 ［９］ スタキリジウム（Stachylidium）属菌類がスタ
キリジウム・sp. （Stachylidium sp.）SD3103（受託番
号FERM P-15965）である前記［８］記載のポリフェノー
ルオキシダーゼ。
【００１０】［１０］ スティルベラ（Stilbella ）属
菌類を培養することを特徴とする前記［１］記載のポリ
フェノールオキシダーゼの製造方法。 ［１１］ スティルベラ（Stilbella ）属菌類がスティ
ルベラ・sp. （Stilbella sp. ）SD3101（受託番号FERM
P-15963）またはその変異株である前記［１０］記載の
ポリフェノールオキシダーゼの製造方法。 ［１２］ サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類を培養す
ることを特徴とする前記［４］記載のポリフェノールオ
キシダーゼの製造方法。 ［１３］ サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類がサゲノ
メラ・sp. （Sagenomella sp. ）SD3102（受託番号FERM
P-15964）またはその変異株である前記［１２］記載の
ポリフェノールオキシダーゼの製造方法。 ［１４］ スタキリジウム（Stachylidium）属菌類を培
養することを特徴とする前記［７］記載のポリフェノー
ルオキシダーゼの製造方法。 ［１５］ スタキリジウム（Stachylidium）属菌類がス
タキリジウム・sp. （Stachylidium sp.）SD3103（受託
番号FERM P-15965）またはその変異株である前記［１
４］記載のポリフェノールオキシダーゼの製造方法。
菌類を培養することを特徴とする前記［１］記載のポリ
フェノールオキシダーゼの製造方法。 ［１１］ スティルベラ（Stilbella ）属菌類がスティ
ルベラ・sp. （Stilbella sp. ）SD3101（受託番号FERM
P-15963）またはその変異株である前記［１０］記載の
ポリフェノールオキシダーゼの製造方法。 ［１２］ サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類を培養す
ることを特徴とする前記［４］記載のポリフェノールオ
キシダーゼの製造方法。 ［１３］ サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類がサゲノ
メラ・sp. （Sagenomella sp. ）SD3102（受託番号FERM
P-15964）またはその変異株である前記［１２］記載の
ポリフェノールオキシダーゼの製造方法。 ［１４］ スタキリジウム（Stachylidium）属菌類を培
養することを特徴とする前記［７］記載のポリフェノー
ルオキシダーゼの製造方法。 ［１５］ スタキリジウム（Stachylidium）属菌類がス
タキリジウム・sp. （Stachylidium sp.）SD3103（受託
番号FERM P-15965）またはその変異株である前記［１
４］記載のポリフェノールオキシダーゼの製造方法。
【００１１】［１６］ スティルベラ・sp. （Stilbell
a sp. ）SD3101（受託番号FERM P-15963）。 ［１７］ サゲノメラ・sp. （Sagenomella sp. ）SD31
02（受託番号FERM P-15964）。 ［１８］ スタキリジウム・sp. （Stachylidium sp.）
SD3103（受託番号FERM P-15965）。 ［１９］ 洗浄剤、洗剤、または界面活性剤、及び前記
［１］〜［９］のいずれか一項に記載のポリフェノール
オキシダーゼを含むことを特徴とする洗剤組成物。 ［２０］ 前記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴と
する着色物質の漂白処理方法。 ［２１］ 前記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴と
する、微生物またはウィルスの処理方法。 ［２２］ 前記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴と
する紙、パルプ、または繊維の処理方法。 ［２３］ 前記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを用いることを特徴とする
脱酸素方法。
a sp. ）SD3101（受託番号FERM P-15963）。 ［１７］ サゲノメラ・sp. （Sagenomella sp. ）SD31
02（受託番号FERM P-15964）。 ［１８］ スタキリジウム・sp. （Stachylidium sp.）
SD3103（受託番号FERM P-15965）。 ［１９］ 洗浄剤、洗剤、または界面活性剤、及び前記
［１］〜［９］のいずれか一項に記載のポリフェノール
オキシダーゼを含むことを特徴とする洗剤組成物。 ［２０］ 前記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴と
する着色物質の漂白処理方法。 ［２１］ 前記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴と
する、微生物またはウィルスの処理方法。 ［２２］ 前記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴と
する紙、パルプ、または繊維の処理方法。 ［２３］ 前記［１］〜［９］のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを用いることを特徴とする
脱酸素方法。
【００１２】以下に本発明を詳細に説明する。 ［生産菌］本発明のポリフェノールオキシダーゼを得る
ために用いるスティルベラ（Stilbella ）属に属する菌
株にはスティルベラ・アニュラタ（Stilbella annulat
a）、スティルベラ・ブルビコーラ（Stilbella bulbico
la ）、スティルベラ・エリスロセファラ（Stilbella e
rythrocephala）、スティルベラ・ファラベセンス（Sti
lbella flavescens）、スティルベラ・フラビペス（Sti
lbella flavipes）、スティルベラ・サーモフィラ（Sti
lbella thermophila ）、スティルベラ・ｓｐ．（Stilb
ella sp. ）が挙げられるが、好ましくはスティルベラ
・ｓｐ．ＳＤ３１０１（Stilbella sp. SD3101）（工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-15963として寄
託）を用いる。
ために用いるスティルベラ（Stilbella ）属に属する菌
株にはスティルベラ・アニュラタ（Stilbella annulat
a）、スティルベラ・ブルビコーラ（Stilbella bulbico
la ）、スティルベラ・エリスロセファラ（Stilbella e
rythrocephala）、スティルベラ・ファラベセンス（Sti
lbella flavescens）、スティルベラ・フラビペス（Sti
lbella flavipes）、スティルベラ・サーモフィラ（Sti
lbella thermophila ）、スティルベラ・ｓｐ．（Stilb
ella sp. ）が挙げられるが、好ましくはスティルベラ
・ｓｐ．ＳＤ３１０１（Stilbella sp. SD3101）（工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-15963として寄
託）を用いる。
【００１３】また、本発明のポリフェノールオキシダー
ゼを得るために用いるサゲノメラ（Sagenomella ）属に
属する菌株にはサゲノメラ・ビリデ（Sagenomella viri
de）、サゲノメラ・ｓｐ．（Sagenomella sp. ）が挙げ
られるが、好ましくはサゲノメラ・ｓｐ．ＳＤ３１０２
（ Sagenomella sp. SD3102 ）（工業技術院生命工学工
業技術研究所にFERM P-15964として寄託）を用いる。ま
た、本発明のポリフェノールオキシダーゼを得るために
用いるスタキリジウム（Stachylidium）属に属する菌株
にはスタキリジウム・ビカラ（Stachylidiumbicolo
r）、スタキリジウム・セオブロメ（Stachylidium theo
bromae ）、スタキリジウム・ｓｐ．（Stachylidium s
p.）が挙げられるが、好ましくはスタキリジウム・ｓ
ｐ．ＳＤ３１０３（Stachylidium sp. SD3103 ）（工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-15965として寄
託）を用いる。
ゼを得るために用いるサゲノメラ（Sagenomella ）属に
属する菌株にはサゲノメラ・ビリデ（Sagenomella viri
de）、サゲノメラ・ｓｐ．（Sagenomella sp. ）が挙げ
られるが、好ましくはサゲノメラ・ｓｐ．ＳＤ３１０２
（ Sagenomella sp. SD3102 ）（工業技術院生命工学工
業技術研究所にFERM P-15964として寄託）を用いる。ま
た、本発明のポリフェノールオキシダーゼを得るために
用いるスタキリジウム（Stachylidium）属に属する菌株
にはスタキリジウム・ビカラ（Stachylidiumbicolo
r）、スタキリジウム・セオブロメ（Stachylidium theo
bromae ）、スタキリジウム・ｓｐ．（Stachylidium s
p.）が挙げられるが、好ましくはスタキリジウム・ｓ
ｐ．ＳＤ３１０３（Stachylidium sp. SD3103 ）（工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-15965として寄
託）を用いる。
【００１４】本発明での代表的な菌株について、ポテト
キャロット寒天培地及びマルトエキス寒天培地上で、25
℃で14〜60日間培養したときの集落の色調、形状及び分
生子、分生子形成構造等の形態観察を行った。その結
果、アクレモニウム属（Acremonium）に類似した白色、
粘質状の集落を形成し、分生子柄束（シンネマ）を形成
し、長径 3〜 5μｍの楕円形の小型分生子を形成する糸
状菌をスティルベラ・ｓｐ．ＳＤ３１０１（Stilbella
sp. SD3101）と命名し、また、同様に、アクレモニウム
属（Acremonium）に類似した白色、粘質状の集落を形成
し、分生子柄束（シンネマ）を形成せず連鎖状の分生子
を形成し、長径 2〜 4μｍの楕円形〜レモン形の小型分
生子を形成する糸状菌をサゲノメラ・ｓｐ．ＳＤ３１０
２（ Sagenomella sp. SD3102 ）、さらには、暗褐色〜
黒色の粘質状集落を形成し、輪生した分性子柄とフィア
ロ型分性子を有するが分性子座は形成しない糸状菌をス
タキリジウム・ｓｐ．ＳＤ３１０３（Stachylidium sp.
SD3103 ）と命名した。
キャロット寒天培地及びマルトエキス寒天培地上で、25
℃で14〜60日間培養したときの集落の色調、形状及び分
生子、分生子形成構造等の形態観察を行った。その結
果、アクレモニウム属（Acremonium）に類似した白色、
粘質状の集落を形成し、分生子柄束（シンネマ）を形成
し、長径 3〜 5μｍの楕円形の小型分生子を形成する糸
状菌をスティルベラ・ｓｐ．ＳＤ３１０１（Stilbella
sp. SD3101）と命名し、また、同様に、アクレモニウム
属（Acremonium）に類似した白色、粘質状の集落を形成
し、分生子柄束（シンネマ）を形成せず連鎖状の分生子
を形成し、長径 2〜 4μｍの楕円形〜レモン形の小型分
生子を形成する糸状菌をサゲノメラ・ｓｐ．ＳＤ３１０
２（ Sagenomella sp. SD3102 ）、さらには、暗褐色〜
黒色の粘質状集落を形成し、輪生した分性子柄とフィア
ロ型分性子を有するが分性子座は形成しない糸状菌をス
タキリジウム・ｓｐ．ＳＤ３１０３（Stachylidium sp.
SD3103 ）と命名した。
【００１５】［酵素の調製］本発明のポリフェノールオ
キシダーゼは、前記のスティルベラ属またはサゲノメラ
属、スタキリジウム属に属する菌株及びその変異株を培
養して得られる他、遺伝子操作菌を利用して調製するこ
とも可能である。すなわち、該ポリフェノールオキシダ
ーゼをコードするＤＮＡが宿主生物での酵素発現機能を
有する適当なプロモーター、及びオペレーター、ターミ
ネーターＤＮＡと共に、宿主生物中でベクターを複製す
るための複製開始点を有するＤＮＡベクターに挿入され
た発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞、また
は該ポリフェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡが
宿主生物での酵素発現機能を有する適当なプロモータ
ー、及びオペレーター、ターミネーターＤＮＡと共に、
宿主細胞ＤＮＡにインテグレーションせしめることで形
質転換された宿主細胞を、ポリフェノールオキシダーゼ
の発現できる条件のもとに培養し、さらにポリフェノー
ルオキシダーゼを培地から回収する方法によっても生産
される。
キシダーゼは、前記のスティルベラ属またはサゲノメラ
属、スタキリジウム属に属する菌株及びその変異株を培
養して得られる他、遺伝子操作菌を利用して調製するこ
とも可能である。すなわち、該ポリフェノールオキシダ
ーゼをコードするＤＮＡが宿主生物での酵素発現機能を
有する適当なプロモーター、及びオペレーター、ターミ
ネーターＤＮＡと共に、宿主生物中でベクターを複製す
るための複製開始点を有するＤＮＡベクターに挿入され
た発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞、また
は該ポリフェノールオキシダーゼをコードするＤＮＡが
宿主生物での酵素発現機能を有する適当なプロモータ
ー、及びオペレーター、ターミネーターＤＮＡと共に、
宿主細胞ＤＮＡにインテグレーションせしめることで形
質転換された宿主細胞を、ポリフェノールオキシダーゼ
の発現できる条件のもとに培養し、さらにポリフェノー
ルオキシダーゼを培地から回収する方法によっても生産
される。
【００１６】また、本発明のポリフェノールオキシダー
ゼは、該ポリフェノールオキシダーゼをコードするＤＮ
Ａ配列等を元に得られる該ポリフェノールオキシダーゼ
のアミノ酸配列に関する知見を元に、従来の酸性側に至
適反応ｐＨを有するポリフェノールオキシダーゼのＤＮ
Ａを改変するプロテイン・エンジニアリングの手法によ
って生産されるものであってもよい。本発明のポリフェ
ノールオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片の取得のた
めには、例えば本発明の菌株からのｃＤＮＡまたはゲノ
ムライブラリィを分離源とし、本発明のポリフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列もしくは既知のポリフェノ
ールオキシダーゼのアミノ酸配列に基づいて合成された
オリゴヌクレオチドをプローブとして目的のＤＮＡ断片
を特定するか、または酵素活性を発現するクローンを選
択するか、または該ポリフェノールオキシダーゼに対す
る抗体と反応する蛋白質を生産するクローンを選択する
といった常法によって行うことができる。
ゼは、該ポリフェノールオキシダーゼをコードするＤＮ
Ａ配列等を元に得られる該ポリフェノールオキシダーゼ
のアミノ酸配列に関する知見を元に、従来の酸性側に至
適反応ｐＨを有するポリフェノールオキシダーゼのＤＮ
Ａを改変するプロテイン・エンジニアリングの手法によ
って生産されるものであってもよい。本発明のポリフェ
ノールオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片の取得のた
めには、例えば本発明の菌株からのｃＤＮＡまたはゲノ
ムライブラリィを分離源とし、本発明のポリフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列もしくは既知のポリフェノ
ールオキシダーゼのアミノ酸配列に基づいて合成された
オリゴヌクレオチドをプローブとして目的のＤＮＡ断片
を特定するか、または酵素活性を発現するクローンを選
択するか、または該ポリフェノールオキシダーゼに対す
る抗体と反応する蛋白質を生産するクローンを選択する
といった常法によって行うことができる。
【００１７】本発明のポリフェノールオキシダーゼを得
るための培養は、通常用いられる合成培地や有機炭素源
及び有機窒素源を含む栄養培地が使用可能である。ま
た、Ｃｕ2+イオンを金属塩として０．００１ｍＭから１
０ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭから１ｍＭの濃度で添
加することが望ましい。培養温度は１０〜６０℃、好ま
しくは２０〜４０℃である。また、適当な培養時間は２
０時間から２５０時間、好ましくは５０時間から１５０
時間である。分泌されたポリフェノールオキシダーゼは
培地中から周知の方法で回収できる。この回収手順に
は、遠心分離もしくはろ過、膜分離により培地から細胞
を分離し、例えばイオン交換クロマトグラフィー等によ
るクロマトグラフィーを行うという一連の手順が含まれ
る。また、限外ろ過膜を用いる膜濃縮も有効である。
るための培養は、通常用いられる合成培地や有機炭素源
及び有機窒素源を含む栄養培地が使用可能である。ま
た、Ｃｕ2+イオンを金属塩として０．００１ｍＭから１
０ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭから１ｍＭの濃度で添
加することが望ましい。培養温度は１０〜６０℃、好ま
しくは２０〜４０℃である。また、適当な培養時間は２
０時間から２５０時間、好ましくは５０時間から１５０
時間である。分泌されたポリフェノールオキシダーゼは
培地中から周知の方法で回収できる。この回収手順に
は、遠心分離もしくはろ過、膜分離により培地から細胞
を分離し、例えばイオン交換クロマトグラフィー等によ
るクロマトグラフィーを行うという一連の手順が含まれ
る。また、限外ろ過膜を用いる膜濃縮も有効である。
【００１８】［酵素の性質］本発明のポリフェノールオ
キシダーゼは５〜１１の広いｐＨ範囲で酸化反応を行え
るが、好ましくはｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ７
〜９であり、ｐＨ８近辺に至適ｐＨがあり、中性からア
ルカリ性での酸化反応を触媒するという特長を有する
（図１〜図３）。また、ｐＨ８で１０分間の反応を行っ
た場合の至適温度は５０℃付近にあり（図４〜図６）、
さらには、様々な温度で３０分間の加熱処理を施した後
の活性は、５０℃以下の範囲でほぼ１００％の残存活性
を示した（図７〜図９）。さらには、様々なｐＨのバッ
ファー中で３０℃、３０分間の処理を施した後の残存活
性は、広範囲のｐＨにおける安定性を示した（図１
０）。これらの結果は、中性からアルカリ性の広範囲の
ｐＨ域で、中低温の様々な溶液中での酸化反応を保証す
る。
キシダーゼは５〜１１の広いｐＨ範囲で酸化反応を行え
るが、好ましくはｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ７
〜９であり、ｐＨ８近辺に至適ｐＨがあり、中性からア
ルカリ性での酸化反応を触媒するという特長を有する
（図１〜図３）。また、ｐＨ８で１０分間の反応を行っ
た場合の至適温度は５０℃付近にあり（図４〜図６）、
さらには、様々な温度で３０分間の加熱処理を施した後
の活性は、５０℃以下の範囲でほぼ１００％の残存活性
を示した（図７〜図９）。さらには、様々なｐＨのバッ
ファー中で３０℃、３０分間の処理を施した後の残存活
性は、広範囲のｐＨにおける安定性を示した（図１
０）。これらの結果は、中性からアルカリ性の広範囲の
ｐＨ域で、中低温の様々な溶液中での酸化反応を保証す
る。
【００１９】また、本発明のポリフェノールオキシダー
ゼは、従来の酸性側に至適反応ｐＨを有する酵素と共に
組み合わせて用いることも可能である。つまり、従来知
られている酸性側に至適反応ｐＨを有するポリフェノー
ルオキシダーゼと本発明のポリフェノールオキシダーゼ
を組み合わせて用いることで、酸性からアルカリ性の広
範囲のｐＨ域においてポリフェノールオキシダーゼ反応
を行うことが可能となる。このような目的で酵素を混合
して用いるとき、酸性側に至適反応ｐＨを有するポリフ
ェノールオキシダーゼの活性量と本発明のポリフェノー
ルオキシダーゼの活性量の混合比率は、好ましくは１：
１０〜１０：１、より好ましくは１：３〜３：１であ
る。このようにして広範囲のｐＨ域においてポリフェノ
ールオキシダーゼ反応を達成するためにも、本発明のポ
リフェノールオキシダーゼは有用である。
ゼは、従来の酸性側に至適反応ｐＨを有する酵素と共に
組み合わせて用いることも可能である。つまり、従来知
られている酸性側に至適反応ｐＨを有するポリフェノー
ルオキシダーゼと本発明のポリフェノールオキシダーゼ
を組み合わせて用いることで、酸性からアルカリ性の広
範囲のｐＨ域においてポリフェノールオキシダーゼ反応
を行うことが可能となる。このような目的で酵素を混合
して用いるとき、酸性側に至適反応ｐＨを有するポリフ
ェノールオキシダーゼの活性量と本発明のポリフェノー
ルオキシダーゼの活性量の混合比率は、好ましくは１：
１０〜１０：１、より好ましくは１：３〜３：１であ
る。このようにして広範囲のｐＨ域においてポリフェノ
ールオキシダーゼ反応を達成するためにも、本発明のポ
リフェノールオキシダーゼは有用である。
【００２０】［活性測定法］本発明において、ポリフェ
ノール酸化活性の活性測定は２５℃において２０ｐｐｍ
のシリンガルダジン（syringaldazine）と１００ｍＭの
リン酸カリウムバッファー溶液（pH8.2 ）を含む水溶液
中で反応を行い、５２５ｎｍの吸光度を測定することで
行った。そして、１分間に１μｍｏｌのシリンガルダジ
ンを酸化する活性量を１ｕｎｉｔ（以下Ｕと略す）と定
義した。
ノール酸化活性の活性測定は２５℃において２０ｐｐｍ
のシリンガルダジン（syringaldazine）と１００ｍＭの
リン酸カリウムバッファー溶液（pH8.2 ）を含む水溶液
中で反応を行い、５２５ｎｍの吸光度を測定することで
行った。そして、１分間に１μｍｏｌのシリンガルダジ
ンを酸化する活性量を１ｕｎｉｔ（以下Ｕと略す）と定
義した。
【００２１】［分解反応、漂白反応の利用方法］アルカ
リｐＨに至適反応域を有する新規なポリフェノールオキ
シダーゼの用途としては、例えば、漂白への適用が可能
である。ポリフェノールオキシダーゼの漂白への利用に
ついては、ＷＯ９１−０５８３９、ＤＥ４００８８９
４、特開昭６４−６０６９３などに記載されている。し
かしながら洗濯などの洗浄操作は通常アルカリｐＨで行
われ、特に過酸化水素存在下での酸化漂白を同時に行う
場合には過酸化水素の漂白作用を促進するためにもアル
カリｐＨでの洗浄操作が望ましい。従って、こうした用
途にポリフェノールオキシダーゼを用いる場合、酸性ｐ
Ｈに至適反応ｐＨを有する従来の酵素では実質的に利用
は困難であった。本発明のポリフェノールオキシダーゼ
はこうした、アルカリ洗浄、アルカリ漂白分野に酵素の
用途を開くものとして有用である。
リｐＨに至適反応域を有する新規なポリフェノールオキ
シダーゼの用途としては、例えば、漂白への適用が可能
である。ポリフェノールオキシダーゼの漂白への利用に
ついては、ＷＯ９１−０５８３９、ＤＥ４００８８９
４、特開昭６４−６０６９３などに記載されている。し
かしながら洗濯などの洗浄操作は通常アルカリｐＨで行
われ、特に過酸化水素存在下での酸化漂白を同時に行う
場合には過酸化水素の漂白作用を促進するためにもアル
カリｐＨでの洗浄操作が望ましい。従って、こうした用
途にポリフェノールオキシダーゼを用いる場合、酸性ｐ
Ｈに至適反応ｐＨを有する従来の酵素では実質的に利用
は困難であった。本発明のポリフェノールオキシダーゼ
はこうした、アルカリ洗浄、アルカリ漂白分野に酵素の
用途を開くものとして有用である。
【００２２】過酸化水素による酸化漂白は洗浄、洗濯に
おいて現在広く用いられている。しかしながら、過酸化
水素は６０℃以下の低温でその漂白力が十分ではない。
これを改善するために、過酸前駆体が過酸化水素と共に
用いられているが、４０℃以下の低温での漂白力は十分
ではなく、より効果の高い漂白系が求められている。そ
のため、様々な酵素的漂白促進方法が従来より提案され
ている。ここに開示するポリフェノールオキシダーゼ
を、ペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マ
ンガンペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ作用を有
する物質の内の１つもしくは複数と共存させることで、
アルカリｐＨでの酸化漂白を促進することができ、本発
明の有用性は明らかである。
おいて現在広く用いられている。しかしながら、過酸化
水素は６０℃以下の低温でその漂白力が十分ではない。
これを改善するために、過酸前駆体が過酸化水素と共に
用いられているが、４０℃以下の低温での漂白力は十分
ではなく、より効果の高い漂白系が求められている。そ
のため、様々な酵素的漂白促進方法が従来より提案され
ている。ここに開示するポリフェノールオキシダーゼ
を、ペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、マ
ンガンペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ作用を有
する物質の内の１つもしくは複数と共存させることで、
アルカリｐＨでの酸化漂白を促進することができ、本発
明の有用性は明らかである。
【００２３】酸化漂白のために広く用いられている過酸
化水素は高価な酸化剤であり、そして、洗浄剤にしばし
ば用いられている過酸化水素前駆体や過酸前駆体、過酸
はさらに高価な酸化剤である。また、オキシダーゼとそ
の基質を用いることで過酸化水素を酵素的に生成するこ
とも可能だが、こうした過酸化水素発生系もまた高価な
酸化剤と考えることができる。ここに開示するポリフェ
ノールオキシダーゼを、従来より酸化漂白のために用い
られている酸化剤である空気、酸素、オゾン、過酸化水
素、過酸化水素前駆体、過酸前駆体、または過酸を、単
独で、または複数組み合わせて用いることで、酸化漂白
を促進することができる。従って、酸化剤を有効に用い
て酸化漂白を達成できる本発明の有用性は明かである。
化水素は高価な酸化剤であり、そして、洗浄剤にしばし
ば用いられている過酸化水素前駆体や過酸前駆体、過酸
はさらに高価な酸化剤である。また、オキシダーゼとそ
の基質を用いることで過酸化水素を酵素的に生成するこ
とも可能だが、こうした過酸化水素発生系もまた高価な
酸化剤と考えることができる。ここに開示するポリフェ
ノールオキシダーゼを、従来より酸化漂白のために用い
られている酸化剤である空気、酸素、オゾン、過酸化水
素、過酸化水素前駆体、過酸前駆体、または過酸を、単
独で、または複数組み合わせて用いることで、酸化漂白
を促進することができる。従って、酸化剤を有効に用い
て酸化漂白を達成できる本発明の有用性は明かである。
【００２４】酸化剤の内、過酸化水素前駆体は水に溶解
してパーヒドロキシルイオンを生成するものである。こ
のような物質には、１水和物もしくは４水和物のパーボ
レート、パーカルボネート、過ホウ砂、過ピロリン酸ナ
トリウム、過安息香酸、尿素−Ｈ2 Ｏ2 反応物、メラミ
ン−Ｈ2 Ｏ2 反応物、クエン酸過水和物などがあり、特
に好ましくはパーボレート、パーカルボネートである。
またさらには、過酸化水素前駆体としてオキシダーゼ及
びその基質による過酸化水素発生系を用いることもでき
る。このようなオキシダーゼの例は、グルコースオキシ
ダーゼ、アルコールオキシダーゼ、グリセロールオキシ
ダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アリールアルコールオキシ
ダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、ガラクトースオキシ
ダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、ウレートオキシダー
ゼ、キサンチンオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼなどがあり、特に好ましくはグルコースオキシダー
ゼ、アルコールオキシダーゼである。
してパーヒドロキシルイオンを生成するものである。こ
のような物質には、１水和物もしくは４水和物のパーボ
レート、パーカルボネート、過ホウ砂、過ピロリン酸ナ
トリウム、過安息香酸、尿素−Ｈ2 Ｏ2 反応物、メラミ
ン−Ｈ2 Ｏ2 反応物、クエン酸過水和物などがあり、特
に好ましくはパーボレート、パーカルボネートである。
またさらには、過酸化水素前駆体としてオキシダーゼ及
びその基質による過酸化水素発生系を用いることもでき
る。このようなオキシダーゼの例は、グルコースオキシ
ダーゼ、アルコールオキシダーゼ、グリセロールオキシ
ダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アリールアルコールオキシ
ダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、ガラクトースオキシ
ダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、ウレートオキシダー
ゼ、キサンチンオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼなどがあり、特に好ましくはグルコースオキシダー
ゼ、アルコールオキシダーゼである。
【００２５】また過酸前駆体は、反応性アシル基を有す
る有機化合物もしくはカルボン酸エステル、カルボン酸
無水物、酢酸塩であり、このような物質にはＴＡＥＤ
（tetraacetylethylenediamine）、ＴＡＭＤ（tetraace
tylmethylenediamine ）、ＴＡＧＵ（tetraacetylglyco
luril ）、ＤＡＤＨＴ（diacetyldioxohexahydrotriazi
ne）、ＳＮＯＢＳ（sodium nonanoyloxybenzene sulfon
ate ）、ＩＳＯＮＯＢＳ（sodium isononanoyloxybenze
ne sulfonate）、コハク酸無水物、安息香酸無水物、フ
タル酸無水物、ＰＡＧ（glucose pentaacetate）、キシ
ローステトラアセテートがあり、特に好ましくは、ＴＡ
ＥＤ、ＳＮＯＢＳである。さらに過酸は、例えばＤＰＤ
ＤＡ（diperoxydodecanedioic acid）、diperoxyisopht
halic acid、magnesium monoperoxyphthalate hexahydr
ate 、ＮＡＰＡＡ（nonylamidoperoxyadipic acid ）で
ある。
る有機化合物もしくはカルボン酸エステル、カルボン酸
無水物、酢酸塩であり、このような物質にはＴＡＥＤ
（tetraacetylethylenediamine）、ＴＡＭＤ（tetraace
tylmethylenediamine ）、ＴＡＧＵ（tetraacetylglyco
luril ）、ＤＡＤＨＴ（diacetyldioxohexahydrotriazi
ne）、ＳＮＯＢＳ（sodium nonanoyloxybenzene sulfon
ate ）、ＩＳＯＮＯＢＳ（sodium isononanoyloxybenze
ne sulfonate）、コハク酸無水物、安息香酸無水物、フ
タル酸無水物、ＰＡＧ（glucose pentaacetate）、キシ
ローステトラアセテートがあり、特に好ましくは、ＴＡ
ＥＤ、ＳＮＯＢＳである。さらに過酸は、例えばＤＰＤ
ＤＡ（diperoxydodecanedioic acid）、diperoxyisopht
halic acid、magnesium monoperoxyphthalate hexahydr
ate 、ＮＡＰＡＡ（nonylamidoperoxyadipic acid ）で
ある。
【００２６】本発明のポリフェノールオキシダーゼは、
様々な洗浄剤、洗剤、または界面活性剤と共に用いるこ
とができる。これにより、本発明のポリフェノールオキ
シダーゼを配合した洗浄剤または洗剤組成物が提供され
る。このような洗浄剤または洗剤組成物の代表例は、洗
浄剤または洗剤組成物重量当たり１０〜５０重量％の界
面活性剤、０〜５０重量％のビルダー、１〜５０重量％
のアルカリ剤あるいは無機電解質、０．１〜１０重量％
の再汚染防止剤、酵素、漂白剤、蛍光染料、ケーキング
防止剤及び酸化防止剤からなる群より選ばれる少なくと
も１種以上の配合成分からなる洗浄剤または洗剤組成物
が挙げられる。
様々な洗浄剤、洗剤、または界面活性剤と共に用いるこ
とができる。これにより、本発明のポリフェノールオキ
シダーゼを配合した洗浄剤または洗剤組成物が提供され
る。このような洗浄剤または洗剤組成物の代表例は、洗
浄剤または洗剤組成物重量当たり１０〜５０重量％の界
面活性剤、０〜５０重量％のビルダー、１〜５０重量％
のアルカリ剤あるいは無機電解質、０．１〜１０重量％
の再汚染防止剤、酵素、漂白剤、蛍光染料、ケーキング
防止剤及び酸化防止剤からなる群より選ばれる少なくと
も１種以上の配合成分からなる洗浄剤または洗剤組成物
が挙げられる。
【００２７】界面活性剤としては石鹸、例えば直鎖また
は分岐鎖のアルキルあるいはアルケニル硫酸塩、アミド
硫酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニ
ル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイ
ド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成
分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩
のような脂肪族硫酸化物、アルキルスルホン酸塩、アミ
ドスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、α−オ
レフィン、ビニリデン型オレフィン及び内部オレフィン
の各スルホン酸塩のような脂肪族スルホン酸塩、直鎖ま
たは分岐鎖のアルキルベンゼンスルホン酸塩のような芳
香族スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基また
はアルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレ
ンオキサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独ある
いは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエー
テルカルボン酸塩またはアミド、α−スルホ脂肪酸塩ま
たはエステル、アミノ酸型界面活性剤、アルキルまたは
アルケニル酸性リン酸エステル、アルキルまたはアルケ
ニルリン酸塩のごときリン酸エステル系界面活性剤、ス
ルホン酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性
剤、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基
を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及
びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が
付加したアルキルまたはアルケニルエーテルあるいはア
ルコール、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケ
ニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサ
イド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数
成分が付加したポリオキシエチレンアルキルフェニルエ
ーテル、高級脂肪酸アルカノールアミドまたはそのアル
キレンオキサイド付加物、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪
酸グリセリンモノエステル、アルキルまたはアルケニル
アミンオキサイド、テトラアルキルアンモニウム塩型カ
チオン界面活性剤など洗剤組成物として通常配合される
界面活性剤であればいずれも使用可能であり、陰イオン
性界面活性剤の場合の対イオンとしてはナトリウムイオ
ンまたはカリウムイオンであることが好ましい。これら
の界面活性剤は、単独または２種以上の混合物として使
用される。
は分岐鎖のアルキルあるいはアルケニル硫酸塩、アミド
硫酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニ
ル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイ
ド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成
分が付加したアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩
のような脂肪族硫酸化物、アルキルスルホン酸塩、アミ
ドスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、α−オ
レフィン、ビニリデン型オレフィン及び内部オレフィン
の各スルホン酸塩のような脂肪族スルホン酸塩、直鎖ま
たは分岐鎖のアルキルベンゼンスルホン酸塩のような芳
香族スルホン酸塩、直鎖または分岐鎖のアルキル基また
はアルケニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレ
ンオキサイド及びブチレンオキサイドのうちの単独ある
いは複数成分が付加したアルキルまたはアルケニルエー
テルカルボン酸塩またはアミド、α−スルホ脂肪酸塩ま
たはエステル、アミノ酸型界面活性剤、アルキルまたは
アルケニル酸性リン酸エステル、アルキルまたはアルケ
ニルリン酸塩のごときリン酸エステル系界面活性剤、ス
ルホン酸型両性界面活性剤、ベタイン型両性界面活性
剤、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケニル基
を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及
びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数成分が
付加したアルキルまたはアルケニルエーテルあるいはア
ルコール、直鎖または分岐鎖のアルキル基またはアルケ
ニル基を有し、エチレンオキサイド、プロピレンオキサ
イド及びブチレンオキサイドのうちの単独あるいは複数
成分が付加したポリオキシエチレンアルキルフェニルエ
ーテル、高級脂肪酸アルカノールアミドまたはそのアル
キレンオキサイド付加物、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪
酸グリセリンモノエステル、アルキルまたはアルケニル
アミンオキサイド、テトラアルキルアンモニウム塩型カ
チオン界面活性剤など洗剤組成物として通常配合される
界面活性剤であればいずれも使用可能であり、陰イオン
性界面活性剤の場合の対イオンとしてはナトリウムイオ
ンまたはカリウムイオンであることが好ましい。これら
の界面活性剤は、単独または２種以上の混合物として使
用される。
【００２８】ビルダー及びアルカリ剤あるいは無機電解
質としてはオルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリ酸
塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩
などのリン酸塩、エタン−1,1 −ジホスホン酸及びその
誘導体、エタンヒドロキシ−1,1,2 −トリホスホン酸、
エタン−1,2 −ジカルボキシ−1,2 −ジホスホン酸、メ
タンヒドロキシホスホン酸などのホスホン酸塩、2 −ホ
スホノブタン−1,2 −ジカルボン酸、1 −ホスホノブタ
ン−2,3,4 −トリカルボン酸、α−メチルホスホノコハ
ク酸などのホスホノカルボン酸塩、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸などのアミノ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチ
レンジアミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩
などのアミノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリイタコ
ン酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸共重合体、カル
ボキシメチルセルロース塩などの高分子電解質、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコールなどの非解離
高分子、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキ
シメチルオキシコハク酸、グルコン酸、クエン酸、乳
酸、酒石酸、ショ糖、ラクトースなどのカルボキシメチ
ル化物、ペンタエリスリトールのカルボキシメチル化
物、グルコン酸のカルボキシメチル化物、ベンゼンポリ
カルボン酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、
グルコン酸などの有機酸塩、ゼオライトなどのアルミノ
ケイ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、メタケイ酸
塩などの無機塩をアルカリ金属塩として用いることがで
き、またデンプン、尿素などの有機物質及び塩化ナトリ
ウム、ベントナイトなどの無機化合物を用いることがで
き、更には有機アルカリ剤としてトリエタノールアミ
ン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、トリ
イソプロパノールアミンなどを用いることができる。
質としてはオルソリン酸塩、ピロリン酸塩、トリポリ酸
塩、メタリン酸塩、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸塩
などのリン酸塩、エタン−1,1 −ジホスホン酸及びその
誘導体、エタンヒドロキシ−1,1,2 −トリホスホン酸、
エタン−1,2 −ジカルボキシ−1,2 −ジホスホン酸、メ
タンヒドロキシホスホン酸などのホスホン酸塩、2 −ホ
スホノブタン−1,2 −ジカルボン酸、1 −ホスホノブタ
ン−2,3,4 −トリカルボン酸、α−メチルホスホノコハ
ク酸などのホスホノカルボン酸塩、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸などのアミノ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチ
レンジアミン四酢酸塩、ジエチレントリアミン五酢酸塩
などのアミノポリ酢酸塩、ポリアクリル酸、ポリイタコ
ン酸、ポリマレイン酸、無水マレイン酸共重合体、カル
ボキシメチルセルロース塩などの高分子電解質、ポリエ
チレングリコール、ポリビニルアルコールなどの非解離
高分子、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキ
シメチルオキシコハク酸、グルコン酸、クエン酸、乳
酸、酒石酸、ショ糖、ラクトースなどのカルボキシメチ
ル化物、ペンタエリスリトールのカルボキシメチル化
物、グルコン酸のカルボキシメチル化物、ベンゼンポリ
カルボン酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、
グルコン酸などの有機酸塩、ゼオライトなどのアルミノ
ケイ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、メタケイ酸
塩などの無機塩をアルカリ金属塩として用いることがで
き、またデンプン、尿素などの有機物質及び塩化ナトリ
ウム、ベントナイトなどの無機化合物を用いることがで
き、更には有機アルカリ剤としてトリエタノールアミ
ン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、トリ
イソプロパノールアミンなどを用いることができる。
【００２９】本発明の洗剤組成物は、前述のごとく、界
面活性剤、本発明のポリフェノールオキシダーゼ等を構
成成分として含むが、その必要に応じて両性界面活性
剤、例えばパーボレート、パーカルボネートなどの漂白
剤、色素、ビルダー、例えばポリエチレングリコール、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボ
キシメチルセルロースなどの再汚染防止剤、ケーキング
防止剤、酸化防止剤、例えば他のオキシダーゼやペルオ
キシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セ
ルラーゼなどのその他の酵素を必要に応じて含ませるこ
とができる。
面活性剤、本発明のポリフェノールオキシダーゼ等を構
成成分として含むが、その必要に応じて両性界面活性
剤、例えばパーボレート、パーカルボネートなどの漂白
剤、色素、ビルダー、例えばポリエチレングリコール、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボ
キシメチルセルロースなどの再汚染防止剤、ケーキング
防止剤、酸化防止剤、例えば他のオキシダーゼやペルオ
キシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セ
ルラーゼなどのその他の酵素を必要に応じて含ませるこ
とができる。
【００３０】本発明の洗剤組成物にポリフェノールオキ
シダーゼ等の酵素を配合するには如何なる方法をもって
行ってもよいが、微粉末状で配合することは、洗剤取扱
い時の発塵による洗剤使用者や洗剤工業における作業者
の安全衛生上好ましいことではなく、溶液状態あるいは
あらかじめ発塵性をおさえた形状に賦形しておくことが
好ましい。この賦形は通常よく用いられるマルメ造粒、
押し出し造粒、流動造粒、遠心流動造粒やその他の方法
のいずれによるものであってもよく、本発明の洗剤組成
物に配合する酵素の形状は特にこれらの方法によって賦
形されたものに限定されるものではない。
シダーゼ等の酵素を配合するには如何なる方法をもって
行ってもよいが、微粉末状で配合することは、洗剤取扱
い時の発塵による洗剤使用者や洗剤工業における作業者
の安全衛生上好ましいことではなく、溶液状態あるいは
あらかじめ発塵性をおさえた形状に賦形しておくことが
好ましい。この賦形は通常よく用いられるマルメ造粒、
押し出し造粒、流動造粒、遠心流動造粒やその他の方法
のいずれによるものであってもよく、本発明の洗剤組成
物に配合する酵素の形状は特にこれらの方法によって賦
形されたものに限定されるものではない。
【００３１】脱リグニン、漂白を目的として、パルプ工
程の一部において本発明の菌株を接種して本発明のポリ
フェノールオキシダーゼを生産せしめるか、もしくは直
接本発明の酵素標品を添加して、チップや粗砕パルプ等
に作用させるバイオパルピング、バイオ漂白が有用な用
途分野に挙げられる。この場合も、従来の酸性側に至適
反応ｐＨを有するポリフェノールオキシダーゼと比べ、
アルカリ側に至適反応ｐＨを有する本発明のポリフェノ
ールオキシダーゼの方がｐＨ調整のために使用する薬液
の量を削減することができコスト・ダウンが可能であ
る。
程の一部において本発明の菌株を接種して本発明のポリ
フェノールオキシダーゼを生産せしめるか、もしくは直
接本発明の酵素標品を添加して、チップや粗砕パルプ等
に作用させるバイオパルピング、バイオ漂白が有用な用
途分野に挙げられる。この場合も、従来の酸性側に至適
反応ｐＨを有するポリフェノールオキシダーゼと比べ、
アルカリ側に至適反応ｐＨを有する本発明のポリフェノ
ールオキシダーゼの方がｐＨ調整のために使用する薬液
の量を削減することができコスト・ダウンが可能であ
る。
【００３２】［その他の利用方法］本発明のポリフェノ
ールオキシダーゼを用いるバイオセンサーは、本酵素の
特性を反映して、中性からアルカリ性域のｐＨを有する
様々な水溶液、有機溶媒中の芳香族化合物をモニターす
るために用いることができ有用である。また、本発明の
ポリフェノールオキシダーゼにより発生するフェノキシ
ラジカルの反応性を利用して、中性〜アルカリ性のｐＨ
域において効率よく微生物やウィルスの殺菌や不活性化
を行うことも可能である。つまり、ポリフェノールオキ
シダーゼの基質自体の殺菌性に加えて、酵素的に発生す
るフェノキシラジカルによってより強力な殺菌性を与え
ることが可能である。しかも、殺菌処理物がそののち人
体に接触もしくは摂取される場合、もしくは環境中に放
出される場合には、ポリフェノールオキシダーゼの基質
は酸化によって毒性の軽減された物質に変わっているた
め、必要な時点での殺菌性とその後の安全性の双方を達
成でき、有用性が高い。
ールオキシダーゼを用いるバイオセンサーは、本酵素の
特性を反映して、中性からアルカリ性域のｐＨを有する
様々な水溶液、有機溶媒中の芳香族化合物をモニターす
るために用いることができ有用である。また、本発明の
ポリフェノールオキシダーゼにより発生するフェノキシ
ラジカルの反応性を利用して、中性〜アルカリ性のｐＨ
域において効率よく微生物やウィルスの殺菌や不活性化
を行うことも可能である。つまり、ポリフェノールオキ
シダーゼの基質自体の殺菌性に加えて、酵素的に発生す
るフェノキシラジカルによってより強力な殺菌性を与え
ることが可能である。しかも、殺菌処理物がそののち人
体に接触もしくは摂取される場合、もしくは環境中に放
出される場合には、ポリフェノールオキシダーゼの基質
は酸化によって毒性の軽減された物質に変わっているた
め、必要な時点での殺菌性とその後の安全性の双方を達
成でき、有用性が高い。
【００３３】ポリフェノールを構造部分に有する天然の
着色物質として、フラボノイド系、キサントン系、メラ
ニン系などの植物色素やリグニンが知られており、ポリ
フェノールオキシダーゼはこれらの天然物に対する漂白
作用を有する。また、毒性が問題になっているジクロロ
フェノール、トリクロロフェノール等のＡＯＸをもポリ
フェノールオキシダーゼは反応基質にできる。それ故
に、例えばこれらの天然物や非天然物を含有する廃水処
理においても本発明のポリフェノールオキシダーゼは有
用である。
着色物質として、フラボノイド系、キサントン系、メラ
ニン系などの植物色素やリグニンが知られており、ポリ
フェノールオキシダーゼはこれらの天然物に対する漂白
作用を有する。また、毒性が問題になっているジクロロ
フェノール、トリクロロフェノール等のＡＯＸをもポリ
フェノールオキシダーゼは反応基質にできる。それ故
に、例えばこれらの天然物や非天然物を含有する廃水処
理においても本発明のポリフェノールオキシダーゼは有
用である。
【００３４】また、本発明のポリフェノールオキシダー
ゼをアルカリｐＨ域においてフェノール化合物、アルコ
キシル基含有芳香族化合物、ハロゲン化フェノール化合
物、キノン化合物、または芳香族アミン化合物に作用さ
せ、溶存する酸素を消費せしめることを利用した脱酸素
法あるいは脱酸素剤の製造も可能である。こうした脱酸
素法及び脱酸素剤においては、天然もしくは非天然の多
くのフェノール化合物、アルコキシル基含有芳香族化合
物、ハロゲン化フェノール化合物、キノン化合物、また
は芳香族アミン化合物が利用可能であり、急速に溶存酸
素濃度を低減することができ極めて有用である。特に、
カテコール類等の易酸化性のポリフェノールを含む物質
群を酸化する場合、アルカリｐＨでの自動酸化反応と酵
素触媒的なポリフェノールの酸化反応を同時に進行させ
ることができるアルカリｐＨでのポリフェノールオキシ
ダーゼの使用は、効率の良い脱酸素のために極めて有効
である。
ゼをアルカリｐＨ域においてフェノール化合物、アルコ
キシル基含有芳香族化合物、ハロゲン化フェノール化合
物、キノン化合物、または芳香族アミン化合物に作用さ
せ、溶存する酸素を消費せしめることを利用した脱酸素
法あるいは脱酸素剤の製造も可能である。こうした脱酸
素法及び脱酸素剤においては、天然もしくは非天然の多
くのフェノール化合物、アルコキシル基含有芳香族化合
物、ハロゲン化フェノール化合物、キノン化合物、また
は芳香族アミン化合物が利用可能であり、急速に溶存酸
素濃度を低減することができ極めて有用である。特に、
カテコール類等の易酸化性のポリフェノールを含む物質
群を酸化する場合、アルカリｐＨでの自動酸化反応と酵
素触媒的なポリフェノールの酸化反応を同時に進行させ
ることができるアルカリｐＨでのポリフェノールオキシ
ダーゼの使用は、効率の良い脱酸素のために極めて有効
である。
【００３５】
【実施例】以下に本発明について代表的な例を示し、さ
らに具体的に説明する。ただし、これらは単なる例示で
あり、本発明はこれらのみに限られるものではない。
らに具体的に説明する。ただし、これらは単なる例示で
あり、本発明はこれらのみに限られるものではない。
【００３６】実施例１：培養及び濃縮 ２リッター容のフラスコ４器を培養装置に用い、１％グ
ルコース及び０．２％ＮＨ4 Ｃｌ、１．３４％Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．１％
ＮａＣｌ、０．２％ペプトン、０．０５％ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ、０．０２ｍＭＣｕＳＯ4 を含む５００ｍｌの
培地に２Ｎ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．５としたもの
を各々のフラスコに調製し、スティルベラ・ｓｐ．（St
ilbellasp. ）ＳＤ３１０１（受託番号FERM P-15963）
を接種し、２７℃、１００時間の振とう培養を行った。
培養後、４℃での遠心分離により除菌された培養ブロス
を得た。次に、この除菌された培養ブロスを、ミニタン
・フィルターパケット（CAT.NO.: PTGC0MP04, ミリポア
社製）を用いるミニタン限外ろ過システム（ミリポア社
製）によって、分子量10,000以上の画分として濃縮し
た。
ルコース及び０．２％ＮＨ4 Ｃｌ、１．３４％Ｎａ2 Ｈ
ＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．１％
ＮａＣｌ、０．２％ペプトン、０．０５％ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ、０．０２ｍＭＣｕＳＯ4 を含む５００ｍｌの
培地に２Ｎ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．５としたもの
を各々のフラスコに調製し、スティルベラ・ｓｐ．（St
ilbellasp. ）ＳＤ３１０１（受託番号FERM P-15963）
を接種し、２７℃、１００時間の振とう培養を行った。
培養後、４℃での遠心分離により除菌された培養ブロス
を得た。次に、この除菌された培養ブロスを、ミニタン
・フィルターパケット（CAT.NO.: PTGC0MP04, ミリポア
社製）を用いるミニタン限外ろ過システム（ミリポア社
製）によって、分子量10,000以上の画分として濃縮し
た。
【００３７】実施例２：粗精製 １．３４％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ
2 ＰＯ4 、０．１％ＮａＣｌによって平衡化したＤＥＡ
Ｅ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ Ａ−８００ｍ（生化学工
業（株））カラム（φ60mm, 330cc ）の上部に、実施例
１記載の濃縮された培養ブロスをカラム上部の空隙にア
プライし、さらに平衡化に使用したものと同組成の緩衝
液、４００ｍｌによるカラム洗浄を行った。次に、１．
３４％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 、０．３％ＮａＣｌを１回に５０ｍｌずつ使用し
て、合計８回の溶出を行ったところ、ポリフェノールオ
キシダーゼ活性を２回目から５回目の画分に得た。これ
らの活性画分は、実施例１記載と同様の限外ろ過システ
ムによって濃縮し、さらに、２００ｐｐｍ ＮＨ4 ＨＣ
Ｏ3 に対して透析後、凍結乾燥に供し、粗精製物を凍結
乾燥物として得た。凍結乾燥物のポリフェノールオキシ
ダーゼ活性は５Ｕ／ｍｇであった。
2 ＰＯ4 、０．１％ＮａＣｌによって平衡化したＤＥＡ
Ｅ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ Ａ−８００ｍ（生化学工
業（株））カラム（φ60mm, 330cc ）の上部に、実施例
１記載の濃縮された培養ブロスをカラム上部の空隙にア
プライし、さらに平衡化に使用したものと同組成の緩衝
液、４００ｍｌによるカラム洗浄を行った。次に、１．
３４％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 、０．３％ＮａＣｌを１回に５０ｍｌずつ使用し
て、合計８回の溶出を行ったところ、ポリフェノールオ
キシダーゼ活性を２回目から５回目の画分に得た。これ
らの活性画分は、実施例１記載と同様の限外ろ過システ
ムによって濃縮し、さらに、２００ｐｐｍ ＮＨ4 ＨＣ
Ｏ3 に対して透析後、凍結乾燥に供し、粗精製物を凍結
乾燥物として得た。凍結乾燥物のポリフェノールオキシ
ダーゼ活性は５Ｕ／ｍｇであった。
【００３８】実施例３：培養及び濃縮、粗精製 サゲノメラ・ｓｐ．（Sagenomella sp. ）ＳＤ３１０２
（受託番号FERM P-15964）の培養及び濃縮を実施例１と
同様に行い、ポリフェノールオキシダーゼ活性を有する
水溶液を得た。さらに、実施例２と同様の粗精製を行
い、凍結乾燥物を得た。凍結乾燥物のポリフェノールオ
キシダーゼ活性は３．５Ｕ／ｍｇであった。
（受託番号FERM P-15964）の培養及び濃縮を実施例１と
同様に行い、ポリフェノールオキシダーゼ活性を有する
水溶液を得た。さらに、実施例２と同様の粗精製を行
い、凍結乾燥物を得た。凍結乾燥物のポリフェノールオ
キシダーゼ活性は３．５Ｕ／ｍｇであった。
【００３９】実施例４：培養及び濃縮、粗精製 スタキリジウム・ｓｐ．（Stachylidium sp.）ＳＤ３１
０３（受託番号FERMP-15965 ）の培養及び濃縮を実施例
１と同様に行い、ポリフェノールオキシダーゼ活性を有
する水溶液を得た。さらに、実施例２と同様の粗精製を
行い、凍結乾燥物を得た。凍結乾燥物のポリフェノール
オキシダーゼ活性は２．５Ｕ／ｍｇであった。
０３（受託番号FERMP-15965 ）の培養及び濃縮を実施例
１と同様に行い、ポリフェノールオキシダーゼ活性を有
する水溶液を得た。さらに、実施例２と同様の粗精製を
行い、凍結乾燥物を得た。凍結乾燥物のポリフェノール
オキシダーゼ活性は２．５Ｕ／ｍｇであった。
【００４０】実施例５：等電点の測定 実施例２〜４で得たポリフェノールオキシダーゼ活性サ
ンプルを用い、ロトフォア・システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ
社製）を用いる等電点電気泳動により、活性染色と等電
点を測定した。バッファーにはファルマライト(pH2.5〜
5)（Ｓｉｇｍａ社から入手）を使用した。また、活性染
色は、電気泳動終了後のゲル・プレートを、５０ｐｐｍ
のシリンガルダジン（syringaldazine）と１００ｍＭの
リン酸カリウムバッファー溶液（pH8.2 ）を含む水溶液
に浸漬し、ポリフェノールオキシダーゼによる反応の結
果生じる赤紫色のバンドを観察することで行った。その
結果、スティルベラ・ｓｐ．（Stilbella sp. ）SD3101
（受託番号FERM P-15963）、サゲノメラ・ｓｐ．（Sage
nomella sp. ）SD3102（受託番号FERM P-15964）、スタ
キリジウム・ｓｐ．（Stachylidium sp.）SD3103（受託
番号FERMP-15965 ）の等電点はそれぞれ、6.6 ±0.5 、
5.9 ±0.5 、7.0 ±0.5 であった。
ンプルを用い、ロトフォア・システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ
社製）を用いる等電点電気泳動により、活性染色と等電
点を測定した。バッファーにはファルマライト(pH2.5〜
5)（Ｓｉｇｍａ社から入手）を使用した。また、活性染
色は、電気泳動終了後のゲル・プレートを、５０ｐｐｍ
のシリンガルダジン（syringaldazine）と１００ｍＭの
リン酸カリウムバッファー溶液（pH8.2 ）を含む水溶液
に浸漬し、ポリフェノールオキシダーゼによる反応の結
果生じる赤紫色のバンドを観察することで行った。その
結果、スティルベラ・ｓｐ．（Stilbella sp. ）SD3101
（受託番号FERM P-15963）、サゲノメラ・ｓｐ．（Sage
nomella sp. ）SD3102（受託番号FERM P-15964）、スタ
キリジウム・ｓｐ．（Stachylidium sp.）SD3103（受託
番号FERMP-15965 ）の等電点はそれぞれ、6.6 ±0.5 、
5.9 ±0.5 、7.0 ±0.5 であった。
【００４１】実施例６：基質特異性 実施例２〜４記載の粗精製ポリフェノールオキシダーゼ
を用いて酸化反応の基質特異性を調べた。室温（２５
℃）において、０．０５ｍＭの基質と０．１Ｍのリン酸
カリウムバッファー（pH8.0 ）を含む溶液における酵素
添加、無添加での酸素消費速度の差を、マノメータ（YS
I Model 5300 Biological Oxygen Monitor、Yellow Spr
ings Instrument Co.,Inc.製）で測定することで行っ
た。この測定ではアスコルビン酸を基質に用いた場合の
酸素消費速度の差（Δ酸素消費速度）が最大であったた
め、この値を１００として、相対値で結果を表１に示し
た。なお、対照として、市販アスコルビン酸オキシダー
ゼ（Cucumis sp. 由来、フナコシ（株）から入手）を用
いて同様の測定を行った場合の結果も併せて示した。
を用いて酸化反応の基質特異性を調べた。室温（２５
℃）において、０．０５ｍＭの基質と０．１Ｍのリン酸
カリウムバッファー（pH8.0 ）を含む溶液における酵素
添加、無添加での酸素消費速度の差を、マノメータ（YS
I Model 5300 Biological Oxygen Monitor、Yellow Spr
ings Instrument Co.,Inc.製）で測定することで行っ
た。この測定ではアスコルビン酸を基質に用いた場合の
酸素消費速度の差（Δ酸素消費速度）が最大であったた
め、この値を１００として、相対値で結果を表１に示し
た。なお、対照として、市販アスコルビン酸オキシダー
ゼ（Cucumis sp. 由来、フナコシ（株）から入手）を用
いて同様の測定を行った場合の結果も併せて示した。
【００４２】
【表１】
【００４３】実施例７：分子量 分子量測定は、ＧＦＣ（ゲルろ過クロマトグラフィー）
を用いて行った。１．３４％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2
Ｏ、０．３％ＫＨ2 ＰＯ4 、１％ＮａＣｌによって流速
１．０ｍｌ／ｍｉｎで平衡化したＧＦＣカラム（Shodex
PROTEINKW-802.5, ２連）とＵＶ検出器（２８０ｎ
ｍ）を用いるＨＰＬＣにより、実施例２〜４記載の粗精
製ポリフェノールオキシダーゼの分析及び分取と活性測
定を行ったところ、ポリフェノールオキシダーゼ活性ピ
ークはそれぞれ、分子量76,000±5000、33,000±5000、
55,000±5000の位置に溶出された。なお、分子量マーカ
ー蛋白質として、オリエンタル工業（株）のＭＷ−Ｍａ
ｒｋｅｒ（ＨＰＬＣ）を使用した。
を用いて行った。１．３４％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2
Ｏ、０．３％ＫＨ2 ＰＯ4 、１％ＮａＣｌによって流速
１．０ｍｌ／ｍｉｎで平衡化したＧＦＣカラム（Shodex
PROTEINKW-802.5, ２連）とＵＶ検出器（２８０ｎ
ｍ）を用いるＨＰＬＣにより、実施例２〜４記載の粗精
製ポリフェノールオキシダーゼの分析及び分取と活性測
定を行ったところ、ポリフェノールオキシダーゼ活性ピ
ークはそれぞれ、分子量76,000±5000、33,000±5000、
55,000±5000の位置に溶出された。なお、分子量マーカ
ー蛋白質として、オリエンタル工業（株）のＭＷ−Ｍａ
ｒｋｅｒ（ＨＰＬＣ）を使用した。
【００４４】実施例８：５リッターフラスコでの培養及
び粗精製 １％グルコース及び０．２％ＮＨ4 Ｃｌ、１．３４％Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ2 ＰＯ4 、
０．１％ＮａＣｌ、０．２％ペプトン、０．０５％Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０２ｍＭＣｕＳＯ4 からなる１
リッターの培地に２Ｎ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．５
としたものを含む５リッター容のフラスコ，２器に、ス
ティルベラ・ｓｐ．（Stilbella sp. ）ＳＤ３１０１
（受託番号FERM P-15963）を接種し、２８℃、５日間の
振とう培養を行った。培養後、４℃での遠心分離により
除菌された培養ブロス１．８リッターを得た。次に、こ
の培養ブロスの一部を、ミニタン・フィルターパケット
（CAT.NO.: PTGC0MP04, ミリポア社製）を用いるミニタ
ン限外ろ過システム（ミリポア社製）によって、分子量
１０，０００以上の画分として濃縮した。これをさら
に、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ Ａ−８００ｍ
カラムクロマトグラフィーに供し、溶出した活性画分を
再び、上記のミニタン限外ろ過システムによって、分子
量１０，０００以上の画分として再濃縮した。さらにこ
の再濃縮液を２００ｐｐｍＮＨ4 ＨＣＯ3 に対して透析
後、凍結乾燥に供し、粗精製物を凍結乾燥品として得
た。凍結乾燥品のポリフェノールオキシダーゼ活性は８
Ｕ／ｍｇであった。
び粗精製 １％グルコース及び０．２％ＮＨ4 Ｃｌ、１．３４％Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ2 ＰＯ4 、
０．１％ＮａＣｌ、０．２％ペプトン、０．０５％Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０２ｍＭＣｕＳＯ4 からなる１
リッターの培地に２Ｎ−ＮａＯＨを加えてｐＨを７．５
としたものを含む５リッター容のフラスコ，２器に、ス
ティルベラ・ｓｐ．（Stilbella sp. ）ＳＤ３１０１
（受託番号FERM P-15963）を接種し、２８℃、５日間の
振とう培養を行った。培養後、４℃での遠心分離により
除菌された培養ブロス１．８リッターを得た。次に、こ
の培養ブロスの一部を、ミニタン・フィルターパケット
（CAT.NO.: PTGC0MP04, ミリポア社製）を用いるミニタ
ン限外ろ過システム（ミリポア社製）によって、分子量
１０，０００以上の画分として濃縮した。これをさら
に、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ Ａ−８００ｍ
カラムクロマトグラフィーに供し、溶出した活性画分を
再び、上記のミニタン限外ろ過システムによって、分子
量１０，０００以上の画分として再濃縮した。さらにこ
の再濃縮液を２００ｐｐｍＮＨ4 ＨＣＯ3 に対して透析
後、凍結乾燥に供し、粗精製物を凍結乾燥品として得
た。凍結乾燥品のポリフェノールオキシダーゼ活性は８
Ｕ／ｍｇであった。
【００４５】また、同様の培養および粗精製操作によ
り、サゲノメラ・ｓｐ．（Sagenomella sp. ）ＳＤ３１
０２（受託番号FERM P-15964）およびスタキリジウム・
ｓｐ．（Stachylidium sp.）ＳＤ３１０３（受託番号FE
RM P-15965）の生産するポリフェノールオキシダーゼの
凍結乾燥品を得た。活性はそれぞれ５Ｕ／ｍｇ、４．５
Ｕ／ｍｇであった。
り、サゲノメラ・ｓｐ．（Sagenomella sp. ）ＳＤ３１
０２（受託番号FERM P-15964）およびスタキリジウム・
ｓｐ．（Stachylidium sp.）ＳＤ３１０３（受託番号FE
RM P-15965）の生産するポリフェノールオキシダーゼの
凍結乾燥品を得た。活性はそれぞれ５Ｕ／ｍｇ、４．５
Ｕ／ｍｇであった。
【００４６】実施例９：酵素含有洗剤による汚染布の処
理 ２５重量％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム（ＬＡＳ）、５重量％のポリオキシエチレンラウリル
エーテル、１５重量％のトリポリリン酸ナトリウム、６
重量％のケイ酸ナトリウム、１重量％のカルボキシメチ
ルセルロースナトリウム、及び４８重量％のＮａ2 ＳＯ
4 からなる指標洗剤１グラムに、実施例８記載の凍結乾
燥品を２０ｍｇ添加したものを酵素配合洗剤とし、凍結
乾燥品を添加していないものを酵素非配合洗剤とした。
また、木綿白布（５ｃｍ×５ｃｍ）の中央に１００ｐｐ
ｍエバンスブルー（和光純薬工業（株））０．２ｍｌを
加えることで汚染布を調製した。次に、５００ｍｌ容ビ
ーカーに汚染布１枚と水１０ｍｌを加えた後、さらに酵
素配合洗剤または酵素非配合洗剤を１０ｍｇ添加し、１
２分間振とうすることで洗浄処理を行った。処理後の汚
染布は、水洗、風乾し、色彩色差計（CR-200, MINOLTA
製）によって Y,y,x値を測定し、さらに式［Ｚ＝（１−
ｘ−ｙ）Ｙ／ｙ］によってＺ値を算出し、処理前後のＺ
値の差（△Ｚ値）によって白色度の向上を評価した。酵
素配合洗剤使用時の白色度の向上と酵素非配合洗剤使用
時の白色度の向上を比較したときの酵素添加効果（ΔΔ
Ｚ値）を表２に示した。
理 ２５重量％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム（ＬＡＳ）、５重量％のポリオキシエチレンラウリル
エーテル、１５重量％のトリポリリン酸ナトリウム、６
重量％のケイ酸ナトリウム、１重量％のカルボキシメチ
ルセルロースナトリウム、及び４８重量％のＮａ2 ＳＯ
4 からなる指標洗剤１グラムに、実施例８記載の凍結乾
燥品を２０ｍｇ添加したものを酵素配合洗剤とし、凍結
乾燥品を添加していないものを酵素非配合洗剤とした。
また、木綿白布（５ｃｍ×５ｃｍ）の中央に１００ｐｐ
ｍエバンスブルー（和光純薬工業（株））０．２ｍｌを
加えることで汚染布を調製した。次に、５００ｍｌ容ビ
ーカーに汚染布１枚と水１０ｍｌを加えた後、さらに酵
素配合洗剤または酵素非配合洗剤を１０ｍｇ添加し、１
２分間振とうすることで洗浄処理を行った。処理後の汚
染布は、水洗、風乾し、色彩色差計（CR-200, MINOLTA
製）によって Y,y,x値を測定し、さらに式［Ｚ＝（１−
ｘ−ｙ）Ｙ／ｙ］によってＺ値を算出し、処理前後のＺ
値の差（△Ｚ値）によって白色度の向上を評価した。酵
素配合洗剤使用時の白色度の向上と酵素非配合洗剤使用
時の白色度の向上を比較したときの酵素添加効果（ΔΔ
Ｚ値）を表２に示した。
【００４７】
【表２】
【００４８】実施例１０：従来のポリフェノールオキシ
ダーゼとの混合 試薬として市販されているポリフェノールオキシダーゼ
（Rigidoporus zonalis 由来、 TaKaRa （株）から入
手）と、実施例８記載の凍結乾燥品を混合したものを用
いて様々なｐＨで活性測定を行ったところ、図１１に示
したようにｐＨ４〜１０の広範囲のｐＨにおいて酸化反
応が速やかに進行した。
ダーゼとの混合 試薬として市販されているポリフェノールオキシダーゼ
（Rigidoporus zonalis 由来、 TaKaRa （株）から入
手）と、実施例８記載の凍結乾燥品を混合したものを用
いて様々なｐＨで活性測定を行ったところ、図１１に示
したようにｐＨ４〜１０の広範囲のｐＨにおいて酸化反
応が速やかに進行した。
【００４９】実施例１１：脱酸素剤 フェノール性化合物として50ｍＭのＬ−アスコルビン酸
・Ｎａを使用し、ｐＨ9.0 、温度25℃において、実施例
８記載のスティルベラ・ｓｐ．（Stilbella sp. ）SD31
01（受託番号FERM P-15963）から得た凍結乾燥物を10ｐ
ｐｍの濃度で作用させ、マノメータで酸素消費速度を測
定したところ、反応開始後１時間目の溶存酸素濃度は、
反応開始時の0.4 ％に減少しており、高い脱酸素能を有
することが示された。
・Ｎａを使用し、ｐＨ9.0 、温度25℃において、実施例
８記載のスティルベラ・ｓｐ．（Stilbella sp. ）SD31
01（受託番号FERM P-15963）から得た凍結乾燥物を10ｐ
ｐｍの濃度で作用させ、マノメータで酸素消費速度を測
定したところ、反応開始後１時間目の溶存酸素濃度は、
反応開始時の0.4 ％に減少しており、高い脱酸素能を有
することが示された。
【００５０】
【発明の効果】以上詳細に説明した通り、本発明によ
り、アルカリ側に至適反応ｐＨを有する新規なポリフェ
ノールオキシダーゼ及びこのようなポリフェノールオキ
シダーゼを菌類培養物から製造する方法が提供される。
また、本発明のスティルベラ・ｓｐ．（Stilbella sp.
）SD3101、サゲノメラ・ｓｐ．（Sagenomella sp. ）S
D3102、スタキリジウム・ｓｐ．（Stachylidiumsp.）SD
3103は本発明のポリフェノールオキシダーゼの製造に有
効である。また、本発明のポリフェノールオキシダーゼ
を用いることにより、有効な着色物質の処理、紙、パル
プもしくは繊維の処理、微生物もしくはウィルスの処
理、または、洗浄処理等の方法や脱酸素剤、洗剤組成物
が提供される。
り、アルカリ側に至適反応ｐＨを有する新規なポリフェ
ノールオキシダーゼ及びこのようなポリフェノールオキ
シダーゼを菌類培養物から製造する方法が提供される。
また、本発明のスティルベラ・ｓｐ．（Stilbella sp.
）SD3101、サゲノメラ・ｓｐ．（Sagenomella sp. ）S
D3102、スタキリジウム・ｓｐ．（Stachylidiumsp.）SD
3103は本発明のポリフェノールオキシダーゼの製造に有
効である。また、本発明のポリフェノールオキシダーゼ
を用いることにより、有効な着色物質の処理、紙、パル
プもしくは繊維の処理、微生物もしくはウィルスの処
理、または、洗浄処理等の方法や脱酸素剤、洗剤組成物
が提供される。
【図１】SD3101の生産するポリフェノールオキシダーゼ
のｐＨプロファイル。
のｐＨプロファイル。
【図２】SD3102の生産するポリフェノールオキシダーゼ
のｐＨプロファイル。
のｐＨプロファイル。
【図３】SD3103の生産するポリフェノールオキシダーゼ
のｐＨプロファイル。
のｐＨプロファイル。
【図４】SD3101の生産するポリフェノールオキシダーゼ
の温度プロファイル。
の温度プロファイル。
【図５】SD3102の生産するポリフェノールオキシダーゼ
の温度プロファイル。
の温度プロファイル。
【図６】SD3103の生産するポリフェノールオキシダーゼ
の温度プロファイル。
の温度プロファイル。
【図７】SD3101の生産するポリフェノールオキシダーゼ
の温度安定性を示すグラフ。
の温度安定性を示すグラフ。
【図８】SD3102の生産するポリフェノールオキシダーゼ
の温度安定性を示すグラフ。
の温度安定性を示すグラフ。
【図９】SD3103の生産するポリフェノールオキシダーゼ
の温度安定性を示すグラフ。
の温度安定性を示すグラフ。
【図１０】ポリフェノールオキシダーゼのｐＨ安定性を
示すグラフ。
示すグラフ。
【図１１】ポリフェノールオキシダーゼ混合物のｐＨプ
ロファイル。
ロファイル。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 米田 正 千葉県千葉市緑区大野台１丁目１番１号 昭和電工株式会社 総合研究所内 (72)発明者 青木 裕文 千葉県千葉市緑区大野台１丁目１番１号 昭和電工株式会社 総合研究所内 (72)発明者 大野 律子 千葉県千葉市緑区大野台１丁目１番１号 昭和電工株式会社 総合研究所内
Claims (23)
- 【請求項１】 以下の特性： （１）作用：ポリフェノールを酸化する； （２）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．２付近に至適反応ｐＨを
有する； （３）至適反応温度：５０℃付近に至適反応温度を有す
る； （４）分子量：ＧＦＣ分析により測定した分子量が約７
６，０００； （５）等電点：等電点電気泳動により測定した等電点が
約６．６；を有するポリフェノールオキシダーゼ。 - 【請求項２】 スティルベラ（Stilbella ）属菌類が生
産する、請求項１記載のポリフェノールオキシダーゼ。 - 【請求項３】 スティルベラ（Stilbella ）属菌類がス
ティルベラ・sp. （Stilbella sp.）SD3101（受託番号F
ERM P-15963）である請求項２記載のポリフェノールオ
キシダーゼ。 - 【請求項４】 以下の特性： （１）作用：ポリフェノールを酸化する； （２）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．５付近に至適反応ｐＨを
有する； （３）至適反応温度：５０℃付近に至適反応温度を有す
る； （４）分子量：ＧＦＣ分析により測定した分子量が約３
３，０００； （５）等電点：等電点電気泳動により測定した等電点が
約５．９；を有するポリフェノールオキシダーゼ。 - 【請求項５】 サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類が生
産する、請求項４記載のポリフェノールオキシダーゼ。 - 【請求項６】 サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類がサ
ゲノメラ・sp. （ Sagenomella sp.）SD3102（受託番号
FERM P-15964）である請求項５記載のポリフェノールオ
キシダーゼ。 - 【請求項７】 以下の特性： （１）作用：ポリフェノールを酸化する； （２）至適反応ｐＨ：ｐＨ８．２付近に至適反応ｐＨを
有する； （３）至適反応温度：５０℃付近に至適反応温度を有す
る； （４）分子量：ＧＦＣ分析により測定した分子量が約５
５，０００； （５）等電点：等電点電気泳動により測定した等電点が
約７．０；を有するポリフェノールオキシダーゼ。 - 【請求項８】 スタキリジウム（Stachylidium）属菌類
が生産する、請求項７記載のポリフェノールオキシダー
ゼ。 - 【請求項９】 スタキリジウム（Stachylidium）属菌類
がスタキリジウム・sp. （Stachylidium s p. ）SD3103
（受託番号FERM P-15965）である請求項８記載のポリフ
ェノールオキシダーゼ。 - 【請求項１０】 スティルベラ（Stilbella ）属菌類を
培養することを特徴とする請求項１記載のポリフェノー
ルオキシダーゼの製造方法。 - 【請求項１１】 スティルベラ（Stilbella ）属菌類が
スティルベラ・sp.（Stilbella sp. ）SD3101（受託番
号FERM P-15963）またはその変異株である請求項１０記
載のポリフェノールオキシダーゼの製造方法。 - 【請求項１２】 サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類を
培養することを特徴とする請求項４記載のポリフェノー
ルオキシダーゼの製造方法。 - 【請求項１３】 サゲノメラ（Sagenomella ）属菌類が
サゲノメラ・sp. （Sagenomella sp. ）SD3102（受託番
号FERM P-15964）またはその変異株である請求項１２記
載のポリフェノールオキシダーゼの製造方法。 - 【請求項１４】 スタキリジウム（Stachylidium）属菌
類を培養することを特徴とする請求項７記載のポリフェ
ノールオキシダーゼの製造方法。 - 【請求項１５】 スタキリジウム（Stachylidium）属菌
類がスタキリジウム・sp. （Stachylidium sp.）SD3103
（受託番号FERM P-15965）またはその変異株である請求
項１４記載のポリフェノールオキシダーゼの製造方法。 - 【請求項１６】 スティルベラ・sp. （Stilbella sp.
）SD3101（受託番号FERM P-15963）。 - 【請求項１７】 サゲノメラ・sp. （Sagenomella sp.
）SD3102（受託番号FERM P-15964）。 - 【請求項１８】 スタキリジウム・sp. （Stachylidium
sp.）SD3103（受託番号FERM P-15965）。 - 【請求項１９】 洗浄剤、洗剤、または界面活性剤、及
び請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリフェノール
オキシダーゼを含むことを特徴とする洗剤組成物。 - 【請求項２０】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴と
する着色物質の漂白処理方法。 - 【請求項２１】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴と
する、微生物またはウィルスの処理方法。 - 【請求項２２】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを作用させることを特徴と
する紙、パルプ、または繊維の処理方法。 - 【請求項２３】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
ポリフェノールオキシダーゼを用いることを特徴とする
脱酸素方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33400496A JPH10174583A (ja) | 1996-12-13 | 1996-12-13 | 酸化酵素、その製造方法及び用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33400496A JPH10174583A (ja) | 1996-12-13 | 1996-12-13 | 酸化酵素、その製造方法及び用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10174583A true JPH10174583A (ja) | 1998-06-30 |
Family
ID=18272427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33400496A Pending JPH10174583A (ja) | 1996-12-13 | 1996-12-13 | 酸化酵素、その製造方法及び用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10174583A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001048135A1 (en) * | 1999-12-23 | 2001-07-05 | Unilever N.V. | Bleaching detergent compositions |
| US7319112B2 (en) | 2000-07-14 | 2008-01-15 | The Procter & Gamble Co. | Non-halogenated antibacterial agents and processes for making same |
| JP2008514824A (ja) * | 2004-09-25 | 2008-05-08 | ▲力▼州摩▲維▼天然▲繊▼▲維▼材料有限公司 | 黄麻を脱ゴム化する方法 |
-
1996
- 1996-12-13 JP JP33400496A patent/JPH10174583A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001048135A1 (en) * | 1999-12-23 | 2001-07-05 | Unilever N.V. | Bleaching detergent compositions |
| US7319112B2 (en) | 2000-07-14 | 2008-01-15 | The Procter & Gamble Co. | Non-halogenated antibacterial agents and processes for making same |
| JP2008514824A (ja) * | 2004-09-25 | 2008-05-08 | ▲力▼州摩▲維▼天然▲繊▼▲維▼材料有限公司 | 黄麻を脱ゴム化する方法 |
| JP4774404B2 (ja) * | 2004-09-25 | 2011-09-14 | ▲力▼州摩▲維▼天然▲繊▼▲維▼材料有限公司 | 黄麻を脱ゴム化する方法 |
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