WO2002036794A1 - Verfahren zur enzymatischen oxidation von substraten mit h2o¿2? - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a method for the enzymatic oxidation of substrates with H 2 0 according to the preamble of claim 1.
- sulfoxides are valuable chiral building blocks that can be produced by catalytic synthesis. They can be used in a variety of asymmetric, chemical syntheses as chiral auxiliaries or directing groups. They can also be part of active ingredients in pharmacy. Chemical syntheses for chiral sulfoxides have already been described in large numbers (Kagan, H. et al. (1990), Synlett 11: 643-650). As is generally the case in the production of chiral compounds, biotransformations have also been used for the synthesis of sulfoxides (Holland, H. et al. (1999), J. Mol. Catal. B. 6: 463-471), in particular haloperoxidases: e.g. B.
- Arylalkyl sulfides prefer to convert to (R) sulfoxide, while other peroxidases form the (3) product (Allenmark et al. (1996), Tetrahedron: Asymmetry 7: 1089-1094; Sheldon, R. (1997), Tetrahedron 53: 13813 -13,220). High yields and high optical purities are achieved with a number of arylalkyl sulfides and alkylalkyl sulfides.
- Table 1 shows the results of a time-dependent activity measurement of chloroperoxidase in one for the Buffer system relevant to sulfoxidation at a hydrogen peroxide concentration of only 50 ⁇ M below that of Deurzen, M. et al. (1997), Biotechnology & Bioengineering 55: 283-288.
- An enzyme which converts a substrate is to be understood as a catalyst in the sense of the invention. In a broader sense, this also means a microorganism that biocatalytically converts the substrate using an enzyme.
- FIG.l A device Fig.2 graphic of the course of activity after
- Fig.4 Turnover-time curve for example 2
- Fig.5 Turnover-time curve for example 3
- Fig.6 Comparison of the ttn values with the status of
- Table 3a List of the radicals R x and R 2 for an inventive substrate of the general formula R ⁇ -SR 2
- Table 3b Substrates which are epoxidized by chloroperoxidase.
- Table 3c Examples of substrates in the chloroperoxidase-catalyzed reaction in the presence of halide ions.
- Table 3d Examples of substrates in the chloroperoxidase-catalyzed reaction in the absence of halide ions.
- Table 4 Test results
- Table 5 Test results
- Figure 1 shows a device suitable for performing the method. It consists of a reactor 1, which is equipped with a stirrer 2 and in which the reagents and the catalyst 3 are located.
- the reactor 1 has a substrate inflow 4 which is controlled by a control unit 5 and an outflow 6 which leads via a membrane filter 7 into a bubble trap 8 which is connected to a polarimeter 9 which is used as a measuring instrument for the yield of the reaction serves.
- the reactor 1 is fed by an oxygen supply 10 which is connected to the reactor 1 by a mass flow meter 11 via a line 12.
- the polarimeter 9 and the mass flow meter 11 are connected to a data processing system 13.
- a cathode 14 and a counter electrode 15 protrude into the reactor 1, which bring about a current input into the reactor 1.
- H 2 0 2 production rate which is precisely matched to the prevailing synthesis conditions can be achieved.
- the stationary concentration of H 2 0 2 is therefore low right from the start, especially if the surface before the cathode is formed over a large area, so that the spatial distribution of the H 2 0 2 formed is very large from the start.
- there is never a stationary and or selective concentration which is so high that the enzyme or the microorganism which carries out the reaction is deactivated can.
- the reaction process is favored by the constant stirring.
- Figure 2 shows the time course of activity in% for a reaction system according to Table 1 according to the prior art with 30% tert.
- Deactivation rate 1.8% min " 1 .
- Abscissa x activity [%] chloroperoxidase (CPO) ordinate y: [t / min]
- FIG. 3 shows the result for example 1 according to the invention:
- Abscissa x conversion [%] of thioanisole ordinate y: time [h]
- the electrochemical production of the H 2 0 2 does not necessarily have to take place in the reactor 1, but can also take place outside the reactor, the H 2 0 2 formed subsequently being introduced into the reactor 1, but the H 2 0 2 production is in the reactor 1 preferred. It is essential to the invention that the H 2 0 2 is formed in such a concentration or is present in such a concentration that a catalyst sensitive to H 2 0 2 is not deactivated. This is usually the case if the electrolysis is carried out with H 2 0 2 production rates which are less than or equal to the amount H 2 0 2 which the catalyst can convert.
- the production rate of H 2 0 2 is at most as high as the K m value of the biocatalyst for the specific reaction.
- reaction conditions can be specified in which a graphite electrode with a surface area of 6 cm 2 has a current density of 0.1-5 mAcrrf 2 , or 0.3-1.0 mAcm "2 and at CPO of 0.5 mAcm " 2 into the reaction system.
- these values are not to be interpreted restrictively, since the most favorable current density for the special case depends on a large number of parameters, such as concentration of the individual components and thus the speed of the reaction and the instability of the enzyme with respect to H 2 0 2 .
- the electrolysis is best carried out with H 2 0 2 production rates that are less than or equal to the amount of H 2 0 2 that the catalyst can convert.
- a K m value of ⁇ 100 ⁇ M can be assumed for sulfoxidation.
- Sensitive catalysts in the sense of the invention are enzymes which are deactivated in the presence of H 2 0 2 .
- Examples include oxidoreductases such as peroxidases, NADH peroxidase (1.11.1.1.), NADPH peroxidase (1.11.1.2.), Fatty acid peroxidase (1.11.1.3.), Myeloperoxidase (1.11.1.7.), Glutathione peroxidase (1.11 .1.9.), L-ascorbate peroxidase (1.11.1.11.), Manganese peroxidase (1.11.1.13) (the numbering corresponds to the CPO nomenclature (1.11.1.10), particularly preferably the haloperoxidases, chloroperoxidases, bromoperoxidases, iodoperoxidases
- the reaction system according to the invention can also contain two or more catalysts or enzymes which catalyze reactions which occur side by side or which take place in a succession.
- the catalysts can either be present freely in the solution or can be immobilized on solid phases. According to the prior art, immobilization then often applies when a catalyst or enzyme is kinetically susceptible to deactivation, for example due to the chemical reaction of the catalyst with one of the components in the system.
- the process according to the invention contributes to the fact that immobilization on a solid can be dispensed with, at least in order to protect the catalyst from deactivation.
- organic solvents can be used as cosolvents in concentrations of, for example, 1 to 50% or preferably 10 to 30%, particularly preferably 15%. , can be used.
- solvents such as tert. -Butanol, PEG 600,
- reaction conditions for enzymatic catalysis are preferably chosen so that a pH of 3-8 is present. Particularly preferred pH values are 4.5-5.5. The most favorable reaction conditions are in a temperature range between 5 and 30 ° C, reaction temperatures between 15 and 25 ° C are particularly preferred.
- the substrates appropriate for the catalysts can be used as substrates in the reactions. In principle, these are not limited to individual examples, but some substrates are listed in Tables 3a to d as examples for the
- Reactions can be used. These substrates listed by way of example can be used, for example, for reactions with peroxidases, general oxidoreductases. Of course, they can also be used in enzyme reactions of other enzymes that convert these substrates.
- organic substrates such as sulfides, olefins, olefin esters, aromatic olefins, alkynes, cyclopropane, substituted cyclopropane, sulfoxides, thiols, carboxylic acids, heteroaromatics, aromatics, halogen-substituted aromatics, phenols, o-, m-, p-alkylsub come - Substituted phenols, aniline, N-di or monoalkyl-substituted aniline or alcohols into consideration.
- Ri a component from the group consisting of alkyl, aryl, phenyl, alkyl-substituted aryl (tolyl), halogen-substituted aryl- (m-chlorophenyl, p-chlorophenyl, m-bromophenyl-, p-bromophenyl), m-methoxyphenyl, p -Methoxy-phenyl, p-nitrophenyl, hetero-substituted aryl (5, 6, 7-membered aromatic rings with 0, S, N, e.g. thiophene)
- R 2 a component from the group alkyl (methyl, ethyl, n-propyl)
- Alkyl is to be understood for both R 1 and R 2 straight-chain and branched hydrocarbon chains, the components also having heteroatoms, such as, for. B. O, N, F, Cl, Br and I may be substituted. Examples include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl and t-butyl.
- Aryl is understood to mean aromatic systems, including heteroaromatics, and substituted aromatic systems.
- a reaction according to formula 2 can be given as an example.
- the only by-product is water.
- the method according to the invention is therefore particularly inexpensive and environmentally friendly.
- the process can be carried out in the customary reactors which are additionally provided with an electrode arrangement and an oxygen gas supply.
- So can e.g. B. conventional stirred reactors can be used in batch or continuous operation.
- microorganisms are used as biocatalysts which carry out the oxidation of the substrate by an enzymatic reaction, then it is also advantageous according to the method according to the invention that the microorganism is not attacked by H 2 O.
- the enzyme may be overexpressed in the microorganism.
- Example 1 Oxidation of thioanisole with chloroperoxidase and electrochemically generated
- Chloroperoxidase was purchased (e.g. Sigma
- Table 4 shows the results of this analysis. It can be seen from this that the sulfide used has been converted almost completely to the sulfoxide after 40 minutes.
- Example 2 Oxidation of thioanisole with chloroperoxidase and electrochemically generated
- Table 5 shows the results of this analysis. It can be seen from this that the sulfide used in each case has been converted almost completely to the sulfoxide after a maximum of 360 minutes.
- the reaction was interrupted between run 2 and run 3.
- the process according to the invention made it possible to achieve an enormous increase in the stability of chloroperoxidase (reaction over 29 hours), it being possible to achieve a ttn of 1,100,000 (factor 7 compared to known processes).
- Example 3 Oxidation of thioanisole with chloroperoxidase and electrochemically generated hydrogen peroxide in a continuous stirred reactor
- Chloroperoxidase was purchased (e.g. Sigma C-0287), dissolved in a buffer mixture (potassium phosphate 0.1 M; pH 4.5; 30 vol% t-BuOH), thioanisole was added, the solution was gassed with oxygen and the reaction was carried out Electrolysis (working electrode graphite (9 cm 2 ), galvanostatic 0.4 mA / cm 2 ) started.
- the reactor used for this is outlined in Figure 1.
- Table 6 shows the results of this analysis. This shows that a continuous turnover of ⁇ 50% is achieved after the start-up phase.
- Concentrations of less than 50 ⁇ M H 2 0 2 are generated. Even if the amount of charge introduced into the reaction solution leads to a stationary concentration of 50 ⁇ M H 2 0 2 , which is also achieved according to the prior art, the deactivation of the enzyme is prevented, so that for the process according to the invention, even at the same stationary concentration of H 2 0 2 as in the prior art, a better result, ie no deactivation of the enzyme is observed.
- the process according to the invention is particularly suitable for the stereoselective synthesis of organic compounds, since it does not reduce the yield of enantiomerically pure product and the advantage of the enzymatic reaction over other non-enantioselective methods is retained. It can therefore preferably be used for the synthesis of chiral products and other valuable substances.
- Table 1 Time-dependent activity determination of the
- Table 3a List of the radicals R and R 2 for an inventive substrate of the general formula R ⁇ -SR 2
- Table 3d Examples of substrates in the chloropero- xidase-catalyzed reaction in the absence of halide ions
- Table 5 Time dependence of the formation of methylphenyl sulfoxide in the reaction of thioanisole with chloroperoxidase in a repetitive batch
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substraten. Bei der Umsetzung von organischen Substraten mit H2O2 mittels Enzymen besteht das Problem, dass die Enzyme im Reaktionsverlauf durch das aggressive H2O2 desaktiviert werden. Es wird daher erfindungsgemäss ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substraten zur Verfügung gestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das für die Reaktion notwendige H2O2 auf elektrochemischem Wege hergestellt wird. Überraschenderweise unterliegt das Enzym bei diesem Verfahren keiner Desaktivierung durch H2O2, und zwar auch dann nicht, wenn die stationäre Konzentration an H2O2 derselben Konzentration entspricht, welche durch konventionelle Verfahren herbeigeführt wird. Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist in Figur 1 angegeben.
Description
B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substraten mit H202
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substraten mit H20 nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Bei der oxidativen Synthese insbesondere von organischen Zielverbindungen werden Substrate häufig mit H202 oxidiert. Bei diesen Reaktionen werden auch Katalysatoren eingesetzt, welche zu Produkten der gewünschten Re- gio- oder Stereoselektivität führen. Bei der stereose- lektiven organischen Synthese spielen insbesondere Enzyme als Katalysatoren eine wichtige Rolle.
Sulfoxide sind zum Beispiel wertvolle chirale Bausteine, die durch katalytische Synthese hergestellt werden können. Sie können in einer Vielzahl asymmetrischer, chemischer Synthesen als chirales Auxiliar oder dirigierende Gruppe eingesetzt werden. Ebenso können sie Bestandteil von Wirkstoffen in der Pharmazie sein. Chemische Synthesen für chirale Sulfoxide sind bereits zahlreich beschrieben (Kagan, H. et al . (1990), Synlett 11: 643-650) . Wie allgemein in der Herstellung chiraler Verbindungen, sind auch zur Synthese von Sulfoxiden Biotransformationen eingesetzt worden (Holland, H. et al. (1999), J. Mol. Catal . B. 6: 463-471), insbesondere Haloperoxidasen: z. B. vanadiumhaltige Bromoperoxidasen
(Allenmark, S. et al . (1998), Tetrahedron 54: 15293- 15304; Allenmark, S. et al . (2000), Biocatalysis and Biotransformation 18: 79-86). Wegen ihrer Selektivität interessant ist Chloroperoxidase aus Leptoxyphium fuma- go . So setzt sie im Gegensatz zu anderen Peroxidasen
Arylalkylsulfide bevorzugt zum (R) -Sulfoxid um, während andere Peroxidasen das (3) -Produkt bilden (Allenmark et al. (1996), Tetrahedron: Asymmetry 7: 1089-1094; Sheldon, R. (1997), Tetrahedron 53: 13813-13220). Hierbei werden mit einer Reihe von Arylalkylsulfiden und Alkylalkylsulfiden hohe Ausbeuten und hohe optische Reinheiten erzielt.
Ein großes Problem bei allen bisher bekannten Umsetzungen mit Chloroperoxidase und anderen enzymatischen und nicht enzymatischen Katalysatoren ist jedoch deren rasche Desaktivierung durch das Oxidationsmittel . Meistens wird hierbei Wasserstoffperoxid verwendet . Die Reaktionsparameter sind bereits für die Oxidation verschiedener Sulfide mittels Chloroperoxidase optimiert worden (Deurzen, M. et al . (1997), Biotechnology & Bioengineering 55: 283-288) . Nach der Verfahrensweise von Deurzen bietet es sich an, bei einem pH-Wert von 5 (Kaliumphosphat-Puffer 100 itiM) und einer Temperatur von 25 °C zu arbeiten. Es werden 30 Volumen-% tert-Butanol als Cosolvens verwendet. Für ein kontinuierliches Verfahren wird hierbei eine sensorgesteuerte Wasserstoffperoxid-Dosierung verwendet, die eine H202-Konzentration von 50 μM ermöglicht.
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse einer zeitabhängigen Aktivitätsmessung der Chloroperoxidase in einem für die
Sulfoxidation relevanten Puffersystem bei einer Wasserstoffperoxid-Konzentration von nur 50 μM unter den von Deurzen, M. et al . (1997), Biotechnology & Bioengineering 55: 283-288, beschriebenen Bedingungen.
Bedingt durch die rasche Desaktivierung des Enzyms im o.g. Puffersystem konnten zwar Umsetzungen durchgeführt werden, jedoch mit einer geringen Reaktionsstabilität des Biokatalysators. Die Reaktionsstabilität kann als maximale Zykluszahl angegeben werden (ttn, engl . total turnover nu ber = Stoffmenge Produkt / Stoffmenge verbrauchtes Enzym ) . Einige Ergebnisse zeigt Tabelle 2, für die ebenfalls die Reaktionsbedingungen von Deurzen, M. et al . (1997), Biotechnology & Bioengineering 55: 283-288, gelten.
Bekannt ist, daß zur Erhöhung der Reaktionsstabilität eine in situ Erzeugung von Wasserstoffperoxid beiträgt . Hierzu sind zwei Ansätze bekannt. Zum einen ein Verfah- ren, bei dem Sauerstoff mit chemischen Mitteln reduziert wird (Sheldon, R. et al . (1999), J. Mol. Catal. B 6: 453-461), wobei jedoch stets eine stöchiometrische Menge Nebenprodukt anfällt. Ebenso kann Wasserstoffperoxid durch die Oxidation von Glucose mit Sauerstoff und Glucose Oxidase durchgeführt werden (US Patent
4,284,723); die Enzyme können auch coimmobilisert werden (Sheldon, R. et al . (2000), Biotechnology and Bioengineering 69: 286-291), was jedoch einen hohen verfahrenstechnischen Aufwand darstellt und ebenso kostenintensive Nebenreaktionen bei leicht erhöhter Stabilität um den Faktor 2 in Kauf nimmt. Bei der
chemischen in situ Erzeugung von H202 wird aus stöchio- metrischen Gründen stets eine relativ hohe Konzentration an H202 gebildet, welche bei empfindlichen Katalysatoren oder Enzymen zu einer schnellen Desaktivierung führt .
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur katalytischen Oxidation von Substraten mittels H202 zu schaffen, bei dem die Aktivität des Katalysators nicht durch das H202 herabgesetzt wird, die Aktivität des Katalysators also über lange Reaktionszeiträume konstant erhalten bleibt und welches kostengünstig und nicht aufwendig in der Verfahrensweise ist. Als Katalysator im Sinne der Erfindung ist ein Enzym zu verste- hen, welches ein Substrat umsetzt. Im weiteren Sinne ist darunter aber auch ein Mikroorganismus zu verstehen, welcher das Substrat biokatalytisch mittels eines Enzyms umsetzt.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr mög- lieh, Substrate in einer für den Katalysator schonungsvollen Weise mit H202 zu oxidieren. Das Verfahren ist kostengünstig, da auf teure Oxidationsreagenzien verzichtet werden kann. Auf viele Verfahrensschritte kann verzichtet werden, da keine Nebenprodukte gebildet wer- den, die abgetrennt werden müssen.
Die Figur und die Tabellen zeigen eine mögliche Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens sowie einige Beispiele für den Stand der Technik und erfindungsgemäße Parameter und Ergebnisse.
Es zeigt :
Fig.l Eine Vorrichtung Fig.2 Graphik zum Aktivitätsverlauf nach dem
Stand der Technik
Fig.3 Umsatz- bzw. Aktivitätsverlauf für
Beispiel 1. Fig.4: Umsatz-Zeitverlauf für Beispiel 2 Fig.5: Umsatz-Zeitverlauf für Beispiel 3 Fig.6: Vergleich der ttn-Werte zum Stand der
Technik für kontinuierliche Reaktionen nach Beispiel 3
Tabelle 1: Aktivitäts-Zeitverlauf nach dem Stand der Technik
Tabelle 2 : Restaktivität für verschiedene Verfahrenstypen nach dem Stand der Technik
Tabelle 3a: Liste der Reste Rx und R2 für ein er- indungsgemäßes Substrat der allgemeinen Formel Rχ-S-R2
Tabelle 3b: Substrate, welche durch Chloroperoxidase epoxidiert werden.
Tabelle 3c : Beispiele für Substrate bei der chlo- roperoxidasekatalysierten Reaktion bei Anwesenheit von Halogenidionen.
Tabelle 3d: Beispiele für Substrate bei der chlo- roperoxidasekatalysierten Reaktion bei Abwesenheit von Halogenidionen. Tabelle 4 : Versuchsergebnisse Tabelle 5: Versuchsergebnisse
Tabelle 6: Versuchsergebnisse Tabelle 7 : Versuchsergebnisse
Im Folgenden soll die Erfindung erläutert werden:
Figur 1 zeigt eine für die Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung. Sie besteht aus einem Reaktor 1, der mit einem Rührer 2 ausgestattet ist und in dem sich die Reagenzien und der Katalysator 3 befinden. Der Re- aktor 1 besitzt einen Substratzufluß 4, der über eine Regeleinheit 5 gesteuert ist und einen Abfluß 6, der über ein Membranfilter 7 in eine Blasenfalle 8 führt, die mit einem Polarimeter 9 in Verbindung steht, welches als Meßinstrument für die Ausbeute der Reaktion dient. Der Reaktor 1 wird durch einen Sauerstoffvorrat 10 gespeist, der mit einem Massenflußmesser 11 über eine Leitung 12 mit dem Reaktor 1 verbunden ist. Das Polarimeter 9 und der Massenflußmesser 11 sind mit einer Datenverarbeitungsanlage 13 verbunden. In den Reaktor 1 ragen eine Kathode 14 und eine Gegenelektrode 15, die einen Stromeintrag in den Reaktor 1 bewirken. Durch die gezielte Steuerung der Stromstärke kann eine genau an die jeweils vorliegenden Synthesebedingungen angepaßte H202-Produktionsgeschindigkeit erreicht wer- den. Die stationäre Konzentration an H202 ist daher von Anfang an gering, insbesondere dann, wenn die Oberflä-
ehe der Kathode großflächig ausgebildet ist, so daß die räumliche Verteilung des gebildeten H202 von Anfang an sehr groß ist. Im Gegensatz zur konventionellen Zudo- sierung von H202 in konzentrierten oder bereits ver- dünnten Lösungen entsteht in keinem Zeitpunkt eine stationäre und oder punktuelle Konzentration, die so hoch ist, daß das Enzym oder der Mikroorganismus, welcher die Umsetzung durchführt, desaktiviert werden kann. Weiterhin wird der Reaktionsprozeß durch das ständige Rühren begünstigt.
Figur 2 zeigt den Zeitverlauf der Aktivität in % für ein Reaktionssystem gemäß Tabelle 1 nach dem Stand der Technik mit 30% tert . -Butanol : Puffergemmisch tχ/2 = 36 min"1 [H202] = 50μM. Desaktivierungsrate l,8%min"1. Abszisse x: Aktivität [%] Chloroperoxidase (CPO) Ordinate y: [t/min]
Figur 3 zeigt das Ergebnis für das erfindungsgemäße Beispiel 1:
Ordinate x: Umsatz • von Thioanisol;
Aktivität o von CPO in [%] Abszisse y. Zeit [min]
Figur 4 zeigt das Ergebnis für Beispiel 2 :
Abszisse x: Umsatz [%] von Thioanisol Ordinate y: Zeit [h]
Figur 5 zeigt das Ergebnis für Beispiel 3 :
Abszisse x: Umsatz [%] von Thioanisol Ordinate y: Zeit [h]
Figur 6 zeigt das Ergebnis für Tabelle 5 :
Abszisse x: ttn [103]
Ordinate y: ttn Werte links Stand der Technik, rechts erfindungsgemäß
Erfindungsgemäß wird nun bei einer katalytischen Oxidation eines Substrates Sauerstoff in die Lösung eingeleitet, welcher durch die Kathode zu H202 reduziert wird. Die elektrochemische Herstellung des H202 muß nicht zwingend im Reaktor 1 erfolgen, sondern kann auch außerhalb des Reaktors stattfinden, wobei das gebildete H202 anschließend in den Reaktor 1 eingeleitet wird, jedoch ist die H202-Herstellung im Reaktor 1 bevorzugt. Erfindungswesentlich ist hierbei, daß das H202 in einer solchen Konzentration gebildet wird, bzw. in einer sol- chen Konzentration vorliegt, daß ein gegenüber H202 empfindlicher Katalysator nicht desaktiviert wird. Dies ist in der Regel dann der Fall, wenn die Elektrolyse mit H202-Produktionsraten durchgeführt wird, die geringer oder gleich sind als die Menge H202, die der Kata- lysator umsetzen kann. In dieser bevorzugten Verfahrensweise ist die Produktionsrate von H202 maximal so hoch, wie es dem Km-Wert des Biokatalysators für die spezifische Reaktion entspricht . Beispielhaft können Reaktionsbedingungen angegeben werden, bei denen eine Graphitelektrode einer Oberfläche von 6 cm2 eine Strom-
dichte von 0,1-5 mAcrrf2, oder 0,3-1,0 mAcm"2 und bei CPO von 0,5 mAcm"2 in das Reaktionssystem einträgt. Diese Werte sind jedoch nicht beschränkend auszulegen, da die für den Spezialfall günstigste Stromdichte von einer Vielzahl von Parametern, wie Konzentration der Einzelkomponenten und damit der Geschwindigkeit der Umsetzung und der Instabilität des Enzyms gegenüber H202 abhängt. Im Allgemeinen gilt jedoch, daß die Elektrolyse am Besten mit H202-Produktionsraten durchgeführt wird, die geringer oder gleich sind als die Menge H202, die der Katalysator umsetzen kann. Bei der Sulfoxidation kann von einem Km-Wert von < 100 μM ausgegangen werden.
Empfindliche Katalysatoren im Sinne der Erfindung sind Enzyme, die in Gegenwart von H202 desaktiviert werden. Beispiele hierfür sind Oxidoreduktasen, wie Peroxidasen, NADH -Peroxidase (1.11.1.1. ) , NADPH-Peroxidase (1.11.1.2.), Fatty acid peroxidase (1.11.1.3.), Myeloperoxidase (1.11.1.7.), Glutathione peroxidase (1.11.1.9.), L-ascorbate peroxidase (1.11.1.11.), Mangan Peroxidase (1.11.1.13) (die Numerierung entspricht der CPO-Nomenklatur (1.11.1.10), besonders bevorzugt die Haloperoxidasen, Chloroperoxidasen, Bromoperoxidasen, Jodoperoxidasen. In dem erfindungsgemäßen Reaktionssystem können sich auch zwei oder mehrere Katalysatoren bzw. Enzyme befinden, die nebeneinander ablaufende oder in einer Nachfolge ablaufende Reaktionen katalysieren. Die Katalysatoren können sowohl frei in der Lösung vorliegen, als auch an Festphasen immobilisiert sein. Nach dem Stand der Technik wird die Immobilisierung häufig dann ver-
wendet, wenn ein Katalysator bzw. Enzym kinetisch anfällig gegen Desaktivierung ist, zum Beispiel bedingt durch chemische Reaktion des Katalysators mit einer der im System befindlichen Komponenten. Das erfindungsge- mäße Verfahren trägt dazu bei, daß auf eine Immobilisierung an einem Festkörper verzichtet werden kann, zumindest um den Katalysator vor Desaktivierung zu schützen. Es kann jedoch aus anderen verfahrenstechnischen Gründen vorteilhaft sein, eine Immobilisierung an einer Polymermatrix vorzunehmen, da eine Zurückgewinnung des Katalysators so leichter möglich ist.
Die enzymatischen Umsetzungen werden in wäßriger Lösung durchgeführt, jedoch können zur Steigerung der Sub- stratlöslichkeit , insbesondere von organischen Substraten, organische Lösungsmittel als Cosolventien eingesetzt werden, die in Konzentrationen von beispielsweise 1 bis 50% oder vorzugsweise 10 bis 30%, besonders bevorzugt 15%, eingesetzt werden können. Beispielhaft können Lösungsmittel wie tert. -Butanol, PEG 600,
2-Butanon, Ethylenglykol, 2-Propanol, Aceton, Ethanol, 2 -Butanol, PEG 20000, Ethylenglycolmonobuthylester genannt werden.
Die Reaktionsbedingungen für enzymatische Katalysen werden vorzugsweise so gewählt, daß ein pH-Wert von 3-8 vorliegt. Besonders bevorzugte pH-Werte liegen bei 4,5- 5,5.
Die günstigsten Reaktionsbedingungen finden sich in einem Temperaturbereich zwischen 5 und 30 °C, besonders bevorzugt sind Reaktionstemperaturen zwischen 15 und 25 °C.
Als Substrate können in den Reaktionen die, für die Katalysatoren, entsprechenden Substrate eingesetzt werden. Diese sind grundsätzlich nicht auf einzelne Beispiele beschränkt, jedoch sind in den Tabellen 3a bis d beispielhaft einige Substrate angeführt, die für die
Reaktionen eingesetzt werden können. Diese beispielhaft aufgeführten Substrate können zum Beispiel für Reaktionen mit Peroxidasen, allgemeiner Oxidoreduktasen, eingesetzt werden. Natürlich können sie auch bei Enzymre- aktionen anderer Enzyme eingesetzt werden, die diese Substrate umsetzen.
Generell kommen organische Substrate, wie Sulfide, Olefine, Olefinester, aromatische Olefine, Alkine, Cyc- lopropan, substituiertes Cyclopropan, Sulfoxide, Thio- le, Carbonsäuren, Heteroaromaten, Aromaten, halogensubstituierte Aromaten, Phenole, o- , m- , p-alkylsub- stituierte Phenole, Anilin, N-Di oder monoalkylsubsti- tuiertes Anilin oder Alkohole in Betracht.
In einem Ausführungsbeispiel gemäß Formel 1 kann die stereoselektive Oxidation von Sulfiden zu Sulfoxiden mittels Chloroperoxidase (E . C .1.11.1.10) , die nach einer anderen Nomenklatur mit CAS [9055-20-39] bezeich- net wird, beschrieben werden.
Formel 1
Ri = eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Aryl, Phe- nyl, alkylsubstituiertes Aryl (Tolyl), halogensubstituiertes Aryl- (m-Chlorphenyl , p-Chlorophenyl , m-Bromo- phenyl-, p-Bromophenyl) , m-Methoxyphenyl , p-Methoxy- phenyl, p-Nitrophenyl , heterosubstituiertes Aryl (5, 6, 7-gliedrige aromatische Ringe mit 0,S,N, z. B. Thiophen)
R2 = eine Komponente aus der Gruppe Alkyl (Methyl, Ethyl,n-Propyl)
Die Substrate können einer Formel aus allen Unterko bi- nationen von Ri und R2 entsprechen oder Verbindungen sein, bei denen RI = R2 ist, oder Substrate sein, bei denen RI und R2 Bestandteil eines cyclischen Systems (z.B. Thiochroman, 2 , 3-Dihydro [b] Benzothiophen) ist.
Unter Alkyl sind sowohl für Ri und R2 geradkettige als auch verzweigte Kohlenwasserstoffketten zu verstehen, wobei die Komponenten auch mit Heteroatomen, wie z. B. O, N, F, Cl, Br und I substituiert sein können. Beispielhaft können Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, t-Butyl genannt werden.
Unter Aryl sind aromatische Systeme, eingeschlossen He- teroaromaten, und substituierte aromatische Systeme zu verstehen.
Beispielhaft kann eine Umsetzung nach Formel 2 angeführt werden.
Formel 2
Überraschend hat sich gezeigt, daß die Chloroperoxidase aus Leptoxyphium fumago (E.C. 1.11.1.10) entgegen allen bisherigen Experimenten in der Lage ist, kontinuierlich Oxidationen von Sulfiden durchzuführen, wenn die Bereitstellung des Oxidationsmittels erfindungsgemäß durch kathodische Reduktion von Sauerstoff erfolgt . Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine bequeme Ein- Stellung der Dosierrate über die Stromdichte, und als
Nebenprodukt fällt ausschließlich Wasser an. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher insbesondere kostengünstig und umweltfreundlich.
Chloroperoxidase ist z. B. in der Lage, Thioanisol (Me- thylphenylsulfid) bei einer Limitierung der Wasserstoffperoxid-Dosierung durch das erfindungsgemäße Verfahren in einer Konzentration von 3,7 g/L Thioanisol (=20 M) in einem Volumen von 50 mL innerhalb von 5 Stunden vollständig umzusetzen.
Das Verfahren kann in den üblichen Reaktoren durchgeführt werden, die zusätzlich mit einer Elektrodenanordnung und einer Sauerstoffbegasung versehen sind. So
können z. B. herkömmliche Rührreaktoren in diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Betriebsweise eingesetzt werden.
Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens vermin- dert sich der kostenintensive Katalysatorverbrauch deutlich.
Werden als Biokatalysatoren Mikroorganismen eingesetzt, die die Oxidation des Substrates durch eine enzymati- sehe Reaktion durchführen, so ist es gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls vorteilhaft, daß der Mikroorganismus nicht durch H20 angegriffen wird. In dem Mikroorganismus kann das Enzym überexprimiert sein.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von speziellen Beispielen näher beschrieben:
Beispiel 1 : Oxidation von Thioanisol mit Chloropero- xidase und elektrochemisch generiertem
Wasserstoffperoxid im Rührreaktor
Chloroperoxidase wurde käuflich erworben (z. B. Sigma
C-0287), in Puffergemisch gelöst (Kaliumphosphat 0,1 M; pH 4,5; 30 Vol% t-BuOH) , Thioanisol zugegeben, die Lö- sung mit Sauerstoff begast und die Umsetzung durch
Elektrolyse gestartet.
Ansatz: 5 mL Reaktions olu en 0,1 mmol Thioanisol 15 U Chloroperoxidase (0,28 nmol) Nach 10, 20, 35 und 55 Minuten wurden jeweils Proben entnommen und mittels gaschromatographischer
(GC-) Analyse der Gehalt an restlichem Substrat und an Sulfoxid ermittelt (Fig.3).
Analysebedingungen für die Gaschromatographie : Kapillarsäule: HP1 (Länge 12 m, 0=0,25 mm), Trägergas: Stickstoff, Injektor: Split, 200 °C, Detektor: FID, 250 °C, Säulentemperatur: 60 °C (0,5 min), 20 °C-min"1,200 °C (2 min)
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse dieser Analytik. Daraus geht hervor, daß das eingesetzte Sulfid nach 40 Minuten praktisch vollständig zum Sulfoxid umgesetzt worden ist .
Nach der Umsetzung wurden noch 73% Enzymaktivität wiedergefunden, was einer ttn von 360.000 entspricht (Faktor 2 , 4 gegenüber bekannten Verfahren) .
Beispiel 2 : Oxidation von Thioanisol mit Chloropero- xidase und elektrochemisch generiertem
Wasserstoffperoxid im Rührreaktor mit Produktextraktion im repetitive batch
Verfahren gemäß Beispiel 1. Nach vollständiger Umsetzung wird das Produkt mit Essigsäureethylester extra- hiert, neues Substrat zugegeben und die Elektrolyse fortgesetzt .
Ansatz: 50 mL Reaktionsvolumen 4*1 mmol Thioanisol 50 U Chloroperoxidase (0,93 nmol) Die Elektrolyse wird nach entsprechendem Ladungsfluß unterbrochen, Proben entnommen und mittels gaschroma-'
tographischer (GC-) Analyse der Gehalt an restlichem Substrat und an Sulfoxid ermittelt. Die verschiedenen Versuchsläufe sind in Fig. 4 dargestellt. Der Ladungsfluß pro Lauf betrug 193 C (Coulomb) .
Analysebedingungen für die Gaschromatographie: Kapillarsäule: HP1 (Länge 12 m, 0=0,25 mm), Trägergas: Stickstoff, Injektor: Split, 200 °C, Detektor: FID, 250 °C, Säulentemperatur: 60 °C (0,5 min), 20 °C-min~1,200 °C (2 min)
Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse dieser Analytik. Daraus geht hervor, daß das jeweils eingesetzte Sulfid nach maximal 360 Minuten praktisch vollständig zum Sulfoxid umgesetzt worden ist.
Zwischen Lauf 2 und Lauf 3 war die Reaktion unterbrochen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte eine enorme Stabilitätssteigerung der Chloroperoxidase er- zielt werden (Umsetzung über 29 Stunden) , wobei eine ttn von 1.100.000 erreicht werden kann (Faktor 7 gegenüber bekannten Verfahren) .
Beispiel 3: Oxidation von Thioanisol mit Chloroperoxi- dase und elektrochemisch generiertem Wasserstoffperoxid im kontinuierlichen Rührreaktor
Chloroperoxidase wurde käuflich erworben (z. B. Sigma C-0287), in Puffergemisch gelöst (Kaliumphosphat 0,1 M; pH 4,5; 30 Vol% t-BuOH) , Thioanisol zugegeben, die Lösung mit Sauerstoff begast und die Umsetzung durch
Elektrolyse (Arbeitselektrode Graphit (9 cm2) , galvanostatisch 0,4 mA/cm2) gestartet. Der hierzu verwendete Reaktor ist in Figur 1 skizziert.
Ansatz: 50 mL Reaktorvolumen
1L 20 mmol Thioanisol in Puffergemisch 400 U Chloroperoxidase (7 nmol) Der Reaktorauslauf wird fraktioniert gesammelt und mittels gaschromatographischer (GC-) Analyse der Gehalt an restlichem Substrat und an Sulfoxid ermittelt.
Analysebedingungen für die Gaschromatographie : Kapillarsäule : Cyclodex ß-lP (Länge 50 m, 0 = 0,32 mm), Trägergas: Helium, Injektor: Split, 200 °C, Detektor: FID, 250 °C, Säulentemperatur 40 °C (5 min) , 20 °C-min"1, 160 °C (5 min)
Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse dieser Analytik. Daraus geht hervor, daß nach der Anlaufphase ein kontinuierli- eher Umsatz von ~ 50 % erreicht wird.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konnten kontinuierliche Umsetzungen über einen Zeitraum von 65 Stunden durchgeführt werden, was gegenüber der anfangs (Tab. 1) gezeigten starken Desaktivierungsrate eine erhebliche Verbesserung darstellt. Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet zum ersten Mal eine kontinuierliche stereoselektive Oxidation von Sulfiden mit Chloroperoxidase ohne Signifikate Desaktivierung. Die Reaktionsstabili- tat (ttn 260.000) konnte um den Faktor 14 gegenüber
kontinuierlichen Verfahren mit herkömmlicher Dosiertechnik gesteigert werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können stationäre
Konzentrationen von weniger als 50 μM H202 erzeugt wer- den. Auch wenn die in die Reaktionslösung eingetragene Ladungsmenge zu einer stationären Konzentration von 50 μM H202 führt, die nach dem Stand der Technik ebenfalls erreicht wird, ist die Desaktivierung des Enzyms unterbunden, so daß für das erfindungsgemäße Verfahren, selbst bei gleicher stationärer Konzentration von H202 wie bei dem Stand der Technik, ein besseres Ergebnis, das heißt keine Desaktivierung des Enzyms beobachtet wird.
Die Verbesserungen durch diese neue Methode sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für die stereoselektive Synthese von organischen Verbindungen geeignet, da mit ihm die Ausbeute an enantiomerenreinem Produkt nicht gemindert wird, und der Vorteil der enzymatischen Reaktion gegenüber anderen nicht enantiose- lektiven Methoden erhalten bleibt. Es kann somit bevorzugt zur Synthese chiraler Produkte und anderer Wert- Stoffe eingesetzt werden.
Tabelle 1: Zeitabhängige Aktivitätsbestimmung der
Chloroperoxidase bei einer Wasserstoffperoxid-Konzentration von 50 μM
Tabelle 2: Reaktionsstabilität der Chloroperoxidase für die Sulfoxidation
Tabelle 3a: Liste der Reste R und R2 für ein erfindungsgemäßes Substrat der allgemeinen Formel Rχ-S-R2
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Tabelle 3c : Beispiele für Substrate bei der chloropero- xidasekatalysierten Reaktion bei Anwesenheit von Halogenidionen
Tabelle 3d: Beispiele für Substrate bei der chloropero- xidasekatalysierten Reaktion bei Abwesenheit von Halogenidionen
Tabelle 4: Zeitabhängigkeit der Bildung von Methylphe- nylsulfoxid bei der Umsetzung von Thioanisol mit Chloroperoxidase
Tabelle 5: Zeitabhängigkeit der Bildung von Methylphe- nylsulfoxid bei der Umsetzung von Thioanisol mit Chloroperoxidase im repetitive batch
Tabelle 6: Bildung von Methylphenylsulfoxid bei der Umsetzung von Thioanisol mit Chloroperoxidase im kontinuierlichen Reaktor
Tabelle 7: Vergleich der kontinuierlichen Verfahren zur Sulfoxidsynthese mit Chloroperoxidase
Claims
1. Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substraten mit H202/ dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat mittels mindestens eines Katalysators mit auf elektrochemischem Wege erzeugtem H202 umgesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der ein Enzym beinhaltet .
3. Verfahren nach Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine Oxidoreduktase eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3 ; dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidoreduktase eine Peroxidase eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4 , dadurch gekennzeichnet, daß als Peroxidase eine Haloperoxidase eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, daß als Haloperoxidase mindestens eine Komponente aus der Gruppe Chloroperoxidase, Bromoperoxidase und Jodoperoxidase eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenzeichnet , daß Chloroperoxidase (E. C.1.11.1.10) aus Lepto- xyphium fumago eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat ein organisches Substrat einge- setzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Substrat eine Komponente aus der Gruppe der Sulfide, Olefine, Olefinester, aromatische Olefine, Alkine, Cyclopropan, substituiertes Cyclopropan, Sulfoxide, Thiole, Carbonsäuren, Heteroaromaten, Aromaten, halogensubstituierte Aromaten, Phenole, o- ,m- ,p-alkylsubstituierte Phenole, Anilin, N-Di oder monoalkylsubstituiertes Anilin o- der Alkohole eingesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat ein Sulfid der Formel 1
Rf X
eingesetzt wird, bei dem Rx Alkyl oder Aryl, Hete- roaryl, substitutiertes Aryl ist und R2 Alkyl ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylrest ein Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, i-Propyl-, t-Butylrest ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylrest durch Heteroatome wie O, N, F, Cl, Br, und J substituiert ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß H202 durch kathodische Reduktion in si tu erzeugt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die H202 Produktionsgeschwindigkeit höchstens so hoch ist, wie es dem Km-Wert des Biokatalysators entspricht .
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet; daß die Reaktion bei einem pH-Wert zwischen 3 und 8 durchgeführt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionslösung ein organisches Lösungsmittel beigemischt ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel tert . -Butanol verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von 5 bis 30 °C durchgeführt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von 15 bis 25 °C durchgeführt wird.
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