DE10054082A1

DE10054082A1 - Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substraten mit H2O2

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Publication number: DE10054082A1
Application number: DE10054082A
Authority: DE
Inventors: Stephan Luetz; Christian Wandrey; Eberhard Steckhan; Andreas Liese
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2002-05-16
Also published as: WO2002036794A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substraten. Bei der Umsetzung von organischen Substraten mit H¶2¶O¶2¶ mittels Enzymen besteht das Problem, daß die Enzyme im Reaktionsverlauf durch das aggressive H¶2¶O¶2¶ desaktiviert werden. Es wird daher erfindungsgemäß ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substraten zur Verfügung gestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das für die Reaktion notwendige H¶s¶O¶2¶ auf elektrochemischem Wege hergestellt wird. Überraschenderweise unterliegt das Enzym bei diesem Verfahren keiner Desaktivierung durch H¶2¶O¶2¶, und zwar auch dann nicht, wenn die stationäre Konzentration an H¶2¶O¶2¶ derselben Konzentration entspricht, welche durch konventionelle Verfahren herbeigeführt wird. Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist in Figur 1 angegeben.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substraten mit H₂O₂ nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Bei der oxidativen Synthese insbesondere von organi schen Zielverbindungen werden Substrate häufig mit H₂O₂ oxidiert. Bei diesen Reaktionen werden auch Katalysato ren eingesetzt, welche zu Produkten der gewünschten Re gio- oder Stereoselektivität führen. Bei der stereose lektiven organischen Synthese spielen insbesondere En zyme als Katalysatoren eine wichtige Rolle.

Sulfoxide sind zum Beispiel wertvolle chirale Baustei ne, die durch katalytische Synthese hergestellt werden können. Sie können in einer Vielzahl asymmetrischer, chemischer Synthesen als chirales Auxiliar oder diri gierende Gruppe eingesetzt werden. Ebenso können sie Bestandteil von Wirkstoffen in der Pharmazie sein. Chemische Synthesen für chirale Sulfoxide sind bereits zahlreich beschrieben (Kagan, H. et al. (1990), Synlett 11: 643-650). Wie allgemein in der Herstellung chiraler Verbindungen, sind auch zur Synthese von Sulfoxiden Biotransformationen eingesetzt worden (Holland, H. et al. (1999), J. Mol. Catal. B. 6: 463-471), insbesondere Haloperoxidasen: z. B. vanadiumhaltige Bromoperoxidasen (Allenmark, S. et al. (1998), Tetrahedron 54: 15293- 15304; Allenmark, S. et al. (2000), Biocatalysis and Biotransformation 18: 79-86). Wegen ihrer Selektivität interessant ist Chloroperoxidase aus Leptoxyphium fuma go. So setzt sie im Gegensatz zu anderen Peroxidasen Arylalkylsulfide bevorzugt zum (R)-Sulfoxid um, während andere Peroxidasen das (S)-Produkt bilden (Allenmark et al. (1996), Tetrahedron: Asymmetry 7: 1089-1094; Sheldon, R. (1997), Tetrahedron 53: 13813-13220). Hierbei werden mit einer Reihe von Arylalkylsulfiden und Alkylalkylsulfiden hohe Ausbeuten und hohe optische Reinheiten erzielt.

Ein großes Problem bei allen bisher bekannten Umsetzun gen mit Chloroperoxidase und anderen enzymatischen und nicht enzymatischen Katalysatoren ist jedoch deren rasche Desaktivierung durch das Oxidationsmittel. Meistens wird hierbei Wasserstoffperoxid verwendet. Die Reaktionsparameter sind bereits für die Oxidation ver schiedener Sulfide mittels Chloroperoxidase optimiert worden (Deurzen, M. et al. (1997), Biotechnology & Bio engineering 55: 283-288). Nach der Verfahrensweise von Deurzen bietet es sich an, bei einem pH-Wert von 5 (Ka liumphosphat-Puffer 100 mM) und einer Temperatur von 25°C zu arbeiten. Es werden 30 Volumen-% tert-Butanol als Cosolvens verwendet. Für ein kontinuierliches Ver fahren wird hierbei eine sensorgesteuerte Wasserstoff peroxid-Dosierung verwendet, die eine H₂O₂-Konzentra tion von 50 µM ermöglicht.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse einer zeitabhängigen Ak tivitätsmessung der Chloroperoxidase in einem für die Sulfoxidation relevanten Puffersystem bei einer Was serstoffperoxid-Konzentration von nur 50 µM unter den von Deurzen, M. et al. (1997), Biotechnology & Bioengineering 55: 283-288, beschriebenen Bedingungen.

Bedingt durch die rasche Desaktivierung des Enzyms im o. g. Puffersystem konnten zwar Umsetzungen durchgeführt werden, jedoch mit einer geringen Reaktionsstabilität des Biokatalysators. Die Reaktionsstabilität kann als maximale Zykluszahl angegeben werden (ttn, engl. total turnover number = Stoffmenge Produkt/Stoffmenge ver brauchtes Enzym). Einige Ergebnisse zeigt Tabelle 2, für die ebenfalls die Reaktionsbedingungen von Deurzen, M. et al. (1997), Biotechnology & Bioengineering 55: 283-288, gelten.

Bekannt ist, daß zur Erhöhung der Reaktionsstabilität eine in situ Erzeugung von Wasserstoffperoxid beiträgt. Hierzu sind zwei Ansätze bekannt. Zum einen ein Verfah ren, bei dem Sauerstoff mit chemischen Mitteln redu ziert wird (Sheldon, R. et al. (1999), J. Mol. Catal. B 6: 453-461), wobei jedoch stets eine stöchiometrische Menge Nebenprodukt anfällt. Ebenso kann Wasserstoff peroxid durch die Oxidation von Glucose mit Sauerstoff und Glucose Oxidase durchgeführt werden (US Patent 4,284,723); die Enzyme können auch coimmobilisert wer den (Sheldon, R. et al. (2000), Biotechnology and Bioengineering 69: 286-291), was jedoch einen hohen verfahrenstechnischen Aufwand darstellt und ebenso kostenintensive Nebenreaktionen bei leicht erhöhter Stabilität um den Faktor 2 in Kauf nimmt. Bei der chemischen in situ Erzeugung von H₂O₂ wird aus stöchio metrischen Gründen stets eine relativ hohe Konzentrati on an H₂O₂ gebildet, welche bei empfindlichen Katalysa toren oder Enzymen zu einer schnellen Desaktivierung führt.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur katalytischen Oxidation von Substraten mittels H₂O₂ zu schaffen, bei dem die Aktivität des Katalysators nicht durch das H₂O₂ herabgesetzt wird, die Aktivität des Katalysators also über lange Reaktionszeiträume konstant erhalten bleibt und welches kostengünstig und nicht aufwendig in der Verfahrensweise ist. Als Kataly sator im Sinne der Erfindung ist ein Enzym zu verste hen, welches ein Substrat umsetzt. Im weiteren Sinne ist darunter aber auch ein Mikroorganismus zu verste hen, welcher das Substrat biokatalytisch mittels eines Enzyms umsetzt.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf gabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr mög lich, Substrate in einer für den Katalysator schonungs vollen Weise mit H₂O₂ zu oxidieren. Das Verfahren ist kostengünstig, da auf teure Oxidationsreagenzien ver zichtet werden kann. Auf viele Verfahrensschritte kann verzichtet werden, da keine Nebenprodukte gebildet wer den, die abgetrennt werden müssen.

Die Figur und die Tabellen zeigen eine mögliche Vor richtung zur Durchführung des Verfahrens sowie einige Beispiele für den Stand der Technik und erfindungsgemä ße Parameter und Ergebnisse.

Es zeigt:

Fig. 1 eine Vorrichtung;

Fig. 2 Graphik zum Aktivitätsverlauf nach dem Stand der Technik;

Fig. 3 Umsatz- bzw. Aktivitätsverlauf für Beispiel 1;

Fig. 4 Umsatz-Zeitverlauf für Beispiel 2;

Fig. 5 Umsatz-Zeitverlauf für Beispiel 3;

Fig. 6 Vergleich der ttn-Werte zum Stand der Technik für kontinuierliche Reaktionen nach Beispiel 3.

Tabelle 1: Aktivitäts-Zeitverlauf nach dem Stand der Technik

Tabelle 2: Restaktivität für verschiedene Verfah renstypen nach dem Stand der Technik

Tabelle 3a: Liste der Reste R₁ und R₂ für ein er findungsgemäßes Substrat der allgemei nen Formel R₁-S-R₂

Tabelle 3b: Substrate, welche durch Chloroperoxi dase epoxidiert werden.

Tabelle 3c: Beispiele für Substrate bei der chlo roperoxidasekatalysierten Reaktion bei Anwesenheit von Halogenidionen.

Tabelle 3d: Beispiele für Substrate bei der chlo roperoxidasekatalysierten Reaktion bei Abwesenheit von Halogenidionen.

Tabelle 4: Versuchsergebnisse

Tabelle 5: Versuchsergebnisse

Tabelle 6: Versuchsergebnisse

Tabelle 7: Versuchsergebnisse

Im Folgenden soll die Erfindung erläutert werden:
Fig. 1 zeigt eine für die Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung. Sie besteht aus einem Reaktor 1, der mit einem Rührer 2 ausgestattet ist und in dem sich die Reagenzien und der Katalysator 3 befinden. Der Re aktor 1 besitzt einen Substratzufluß 4, der über eine Regeleinheit 5 gesteuert ist und einen Abfluß 6, der über ein Membranfilter 7 in eine Blasenfalle 8 führt, die mit einem Polarimeter 9 in Verbindung steht, wel ches als Meßinstrument für die Ausbeute der Reaktion dient. Der Reaktor 1 wird durch einen Sauerstoffvorrat 10 gespeist, der mit einem Massenflußmesser 11 über eine Leitung 12 mit dem Reaktor 1 verbunden ist. Das Polarimeter 9 und der Massenflußmesser 11 sind mit einer Datenverarbeitungsanlage 13 verbunden. In den Reaktor 1 ragen eine Kathode 14 und eine Gegenelektrode 15, die einen Stromeintrag in den Reaktor 1 bewirken. Durch die gezielte Steuerung der Stromstärke kann eine genau an die jeweils vorliegenden Synthesebedingungen angepaßte H₂O₂-Produktionsgeschindigkeit erreicht wer den. Die stationäre Konzentration an H₂O₂ ist daher von Anfang an gering, insbesondere dann, wenn die Oberfläche der Kathode großflächig ausgebildet ist, so daß die räumliche Verteilung des gebildeten H₂O₂ von Anfang an sehr groß ist. Im Gegensatz zur konventionellen Zudo sierung von H₂O₂ in konzentrierten oder bereits ver dünnten Lösungen entsteht in keinem Zeitpunkt eine sta tionäre und oder punktuelle Konzentration, die so hoch ist, daß das Enzym oder der Mikroorganismus, welcher die Umsetzung durchführt, desaktiviert werden kann. Weiterhin wird der Reaktionsprozeß durch das ständige Rühren begünstigt.

Fig. 2 zeigt den Zeitverlauf der Aktivität in % für ein Reaktionssystem gemäß Tabelle 1 nach dem Stand der Technik mit
30% tert.-Butanol: Puffergemmisch t_1/2 = 36 min^-1 [H₂O₂] = 50 µM. Desaktivierungsrate 1,8% min^-1.
Abszisse x: Aktivität [%] Chloroperoxidase (CPO)
Ordinate y: [t/min]

Fig. 3 zeigt das Ergebnis für das erfindungsgemäße Beispiel 1:
Ordinate x: Umsatz . von Thioanisol; Aktivität o von CPO in [%]
Abszisse y: Zeit [min]

Fig. 4 zeigt das Ergebnis für Beispiel 2:
Abszisse x: Umsatz [%] von Thioanisol
Ordinate y: Zeit [h]

Fig. 5 zeigt das Ergebnis für Beispiel 3:
Abszisse x: Umsatz [%] von Thioanisol
Ordinate y: Zeit [h]

Fig. 6 zeigt das Ergebnis für Tabelle 5:
Abszisse x: ttn [10³]
Ordinate y: ttn Werte links Stand der Technik, rechts erfindungsgemäß

Erfindungsgemäß wird nun bei einer katalytischen Oxida tion eines Substrates Sauerstoff in die Lösung einge leitet, welcher durch die Kathode zu H₂O₂ reduziert wird. Die elektrochemische Herstellung des H₂O₂ muß nicht zwingend im Reaktor 1 erfolgen, sondern kann auch außerhalb des Reaktors stattfinden, wobei das gebildete H₂O₂ anschließend in den Reaktor 1 eingeleitet wird, jedoch ist die H₂O₂-Herstellung im Reaktor 1 bevorzugt. Erfindungswesentlich ist hierbei, daß das H₂O₂ in einer solchen Konzentration gebildet wird, bzw. in einer sol chen Konzentration vorliegt, daß ein gegenüber H₂O₂ empfindlicher Katalysator nicht desaktiviert wird. Dies ist in der Regel dann der Fall, wenn die Elektrolyse mit H₂O₂-Produktionsraten durchgeführt wird, die gerin ger oder gleich sind als die Menge H₂O₂, die der Kata lysator umsetzen kann. In dieser bevorzugten Verfah rensweise ist die Produktionsräte von H₂O₂ maximal so hoch, wie es dem K_m-Wert des Biokatalysators für die spezifische Reaktion entspricht. Beispielhaft können Reaktionsbedingungen angegeben werden, bei denen eine Graphitelektrode einer Oberfläche von 6 cm² eine Stromdichte von 0,1-5 mAcm^-2, oder 0,3-1,0 mAcm^-2 und bei CPO von 0,5 mAcm^-2 in das Reaktionssystem einträgt. Diese Werte sind jedoch nicht beschränkend auszulegen, da die für den Spezialfall günstigste Stromdichte von einer Vielzahl von Parametern, wie Konzentration der Einzel komponenten und damit der Geschwindigkeit der Umsetzung und der Instabilität des Enzyms gegenüber H₂O₂ abhängt. Im Allgemeinen gilt jedoch, daß die Elektrolyse am Besten mit H₂O₂-Produktionsraten durchgeführt wird, die geringer oder gleich sind als die Menge H₂O₂, die der Katalysator umsetzen kann. Bei der Sulfoxidation kann von einem K_m-Wert von < 100 µM ausgegangen werden.

Empfindliche Katalysatoren im Sinne der Erfindung sind Enzyme, die in Gegenwart von H₂O₂ desaktiviert werden. Beispiele hierfür sind Oxidoreduktasen, wie Peroxida sen, NADH-Peroxidase (1.11.1.1.), NADPH-Peroxidase (1.11.1.2.), Fatty acid peroxidase (1.11.1.3.), Myeloperoxidase (1.11.1.7.), Glutathione peroxidase (1.11.1.9.), L-ascorbate peroxidase (1.11.1.11.), Mangan Peroxidase (1.11.1.13) (die Numerierung entspricht der CPO-Nomenklatur (1.11.1.10), besonders bevorzugt die Haloperoxidasen, Chloroperoxidasen, Brom operoxidasen, Jodoperoxidasen.

In dem erfindungsgemäßen Reaktionssystem können sich auch zwei oder mehrere Katalysatoren bzw. Enzyme befin den, die nebeneinander ablaufende oder in einer Nach folge ablaufende Reaktionen katalysieren. Die Katalysa toren können sowohl frei in der Lösung vorliegen, als auch an Festphasen immobilisiert sein. Nach dem Stand der Technik wird die Immobilisierung häufig dann verwendet, wenn ein Katalysator bzw. Enzym kinetisch an fällig gegen Desaktivierung ist, zum Beispiel bedingt durch chemische Reaktion des Katalysators mit einer der im System befindlichen Komponenten. Das erfindungsge mäße Verfahren trägt dazu bei, daß auf eine Immobili sierung an einem Festkörper verzichtet werden kann, zu mindest um den Katalysator vor Desaktivierung zu schüt zen. Es kann jedoch aus anderen verfahrenstechnischen Gründen vorteilhaft sein, eine Immobilisierung an einer Polymermatrix vorzunehmen, da eine Zurückgewinnung des Katalysators so leichter möglich ist.

Die enzymatischen Umsetzungen werden in wäßriger Lösung durchgeführt, jedoch können zur Steigerung der Sub stratlöslichkeit, insbesondere von organischen Substra ten, organische Lösungsmittel als Cosolventien einge setzt werden, die in Konzentrationen von beispielsweise 1 bis 50% oder vorzugsweise 10 bis 30%, besonders be vorzugt 15%, eingesetzt werden können. Beispielhaft können Lösungsmittel wie tert.-Butanol, PEG 600, 2-Butanon, Ethylenglykol, 2-Propanol, Aceton, Ethanol, 2-Butanol, PEG 20000, Ethylenglycolmonobuthylester ge nannt werden.

Die Reaktionsbedingungen für enzymatische Katalysen werden vorzugsweise so gewählt, daß ein pH-Wert von 3-8 vorliegt. Besonders bevorzugte pH-Werte liegen bei 4,5- 5,5.

Die günstigsten Reaktionsbedingungen finden sich in einem Temperaturbereich zwischen 5 und 30°C, besonders bevorzugt sind Reaktionstemperaturen zwischen 15 und 25°C.

Als Substrate können in den Reaktionen die, für die Ka talysatoren, entsprechenden Substrate eingesetzt wer den. Diese sind grundsätzlich nicht auf einzelne Bei spiele beschränkt, jedoch sind in den Tabellen 3a bis d beispielhaft einige Substrate angeführt, die für die Reaktionen eingesetzt werden können. Diese beispielhaft aufgeführten Substrate können zum Beispiel für Reaktio nen mit Peroxidasen, allgemeiner Oxidoreduktasen, ein gesetzt werden. Natürlich können sie auch bei Enzymre aktionen anderer Enzyme eingesetzt werden, die diese Substrate umsetzen.

Generell kommen organische Substrate, wie Sulfide, Olefine, Olefinester, aromatische Olefine, Alkine, Cyc lopropan, substituiertes Cyclopropan, Sulfoxide, Thio le, Carbonsäuren, Heteroaromaten, Aromaten, halogensub stituierte Aromaten, Phenole, o-, m-, p-alkylsub stituierte Phenole, Anilin, N-Di oder monoalkylsubsti tuiertes Anilin oder Alkohole in Betracht.

In einem Ausführungsbeispiel gemäß Formel 1 kann die stereoselektive Oxidation von Sulfiden zu Sulfoxiden mittels Chloroperoxidase (E.C. 1.11.1.10), die nach einer anderen Nomenklatur mit CAS [9055-20-39] bezeich net wird, beschrieben werden.

Formel 1

R₁ = eine Komponente aus der Gruppe Alkyl, Aryl, Phe nyl, alkylsubstituiertes Aryl (Tolyl), halogensubstitu iertes Aryl-(m-Chlorphenyl, p-Chlorophenyl, m-Bromo phenyl-, p-Bromophenyl), m-Methoxyphenyl, p-Methoxy phenyl; p-Nitrophenyl, heterosubstituiertes Aryl (5,6,7-gliedrige aromatische Ringe mit O, S, N, z. B. Thiophen)
R₂ = eine Komponente aus der Gruppe Alkyl (Methyl, Ethyl, n-Propyl)

Die Substrate können einer Formel aus allen Unterkombi nationen von R₁ und R₂ entsprechen oder Verbindungen sein, bei denen R1 = R2 ist, oder Substrate sein, bei denen R₁ und R₂ Bestandteil eines cyclischen Systems (z. B. Thiochroman, 2,3-Dihydro[b]Benzothiophen) ist.

Unter Alkyl sind sowohl für R₁ und R₂ geradkettige als auch verzweigte Kohlenwasserstoffketten zu verstehen, wobei die Komponenten auch mit Heteroatomen, wie z. B. O, N, F, Cl, Br und I substituiert sein können. Bei spielhaft können Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, t-Butyl genannt werden.

Unter Aryl sind aromatische Systeme, eingeschlossen He teroaromaten, und substituierte aromatische Systeme zu verstehen.

Beispielhaft kann eine Umsetzung nach Formel 2 ange führt werden.

Formel 2

Überraschend hat sich gezeigt, daß die Chloroperoxidase aus Leptoxyphium fumago (E.C. 1.11.1.10) entgegen allen bisherigen Experimenten in der Lage ist, kontinuierlich Oxidationen von Sulfiden durchzuführen, wenn die Be reitstellung des Oxidationsmittels erfindungsgemäß durch kathodische Reduktion von Sauerstoff erfolgt. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine bequeme Ein stellung der Dosierrate über die Stromdichte, und als Nebenprodukt fällt ausschließlich Wasser an. Das erfin dungsgemäße Verfahren ist daher insbesondere kosten günstig und umweltfreundlich.

Chloroperoxidase ist z. B. in der Lage, Thioanisol (Me thylphenylsulfid) bei einer Limitierung der Wasser stoffperoxid-Dosierung durch das erfindungsgemäße Ver fahren in einer Konzentration von 3,7 g/L Thioani sol (= 20 mM) in einem Volumen von 50 mL innerhalb von 5 Stunden vollständig umzusetzen.

Das Verfahren kann in den üblichen Reaktoren durchge führt werden, die zusätzlich mit einer Elektrodenanord nung und einer Sauerstoffbegasung versehen sind. So können z. B. herkömmliche Rührreaktoren in diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Betriebsweise einge setzt werden.

Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens vermin dert sich der kostenintensive Katalysatorverbrauch deutlich.

Werden als Biokatalysatoren Mikroorganismen eingesetzt, die die Oxidation des Substrates durch eine enzymati sche Reaktion durchführen, so ist es gemäß dem erfin dungsgemäßen Verfahren ebenfalls vorteilhaft, daß der Mikroorganismus nicht durch H₂O₂ angegriffen wird. In dem Mikroorganismus kann das Enzym überexprimiert sein.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von speziellen Beispielen näher beschrieben:

Beispiel 1 Oxidation von Thioanisol mit Chloropero xidase und elektrochemisch generiertem Wasserstoffperoxid im Rührreaktor

Chloroperoxidase wurde käuflich erworben (z. B. Sigma C-0287), in Puffergemisch gelöst (Kaliumphosphat 0,1 M; pH 4,5; 30 Vol% t-BuOH), Thioanisol zugegeben, die Lö sung mit Sauerstoff begast und die Umsetzung durch Elektrolyse gestartet.
Ansatz: 5 mL Reaktionsvolumen
0,1 mmol Thioanisol
15 U Chloroperoxidase (0,28 nmol)

Nach 10, 20, 35 und 55 Minuten wurden jeweils Proben entnommen und mittels gaschromatographischer (GC-)Analyse der Gehalt an restlichem Substrat und an Sulfoxid ermittelt (Fig. 3).

Analysebedingungen für die Gaschromatographie

Kapillarsäule: HP1 (Länge 12 m, ∅ = 0,25 mm), Träger gas: Stickstoff, Injektor: Split, 200°C, Detektor: FID, 250°C, Säulentemperatur: 60°C (0,5 min), 20°C.min^-1, 200°C (2 min)

Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse dieser Analytik. Daraus geht hervor, daß das eingesetzte Sulfid nach 40 Minuten praktisch vollständig zum Sulfoxid umgesetzt worden ist.

Nach der Umsetzung wurden noch 73% Enzymaktivität wie dergefunden, was einer ttn von 360.000 entspricht (Fak tor 2,4 gegenüber bekannten Verfahren).

Beispiel 2 Oxidation von Thioanisol mit Chloropero xidase und elektrochemisch generiertem Wasserstoffperoxid im Rührreaktor mit Produktextraktion im repetitive batch

Verfahren gemäß Beispiel 1. Nach vollständiger Umset zung wird das Produkt mit Essigsäureethylester extra hiert, neues Substrat zugegeben und die. Elektrolyse fortgesetzt.
Ansatz: 50 mL Reaktionsvolumen
4.1 mmol Thioanisol
50 U Chloroperoxidase (0,93 nmol)

Die Elektrolyse wird nach entsprechendem Ladungsfluß unterbrochen, Proben entnommen und mittels gaschromatographischer (GC-)Analyse der Gehalt an restlichem Substrat und an Sulfoxid ermittelt. Die verschiedenen Versuchsläufe sind in Fig. 4 dargestellt. Der La dungsfluß pro Lauf betrug 193 C (Coulomb).

Analysebedingungen für die Gaschromatographie

Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse dieser Analytik. Daraus geht hervor, daß das jeweils eingesetzte Sulfid nach maximal 360 Minuten praktisch vollständig zum Sulfoxid umgesetzt worden ist.

Zwischen Lauf 2 und Lauf 3 war die Reaktion unterbro chen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte eine enorme Stabilitätssteigerung der Chloroperoxidase er zielt werden (Umsetzung über 29 Stunden), wobei eine ttn von 1.100.000 erreicht werden kann (Faktor 7 gegen über bekannten Verfahren).

Beispiel 3 Oxidation von Thioanisol mit Chloroperoxi dase und elektrochemisch generiertem Was serstoffperoxid im kontinuierlichen Rührre aktor

Chloroperoxidase wurde käuflich erworben (z. B. Sigma C-0287), in Puffergemisch gelöst (Kaliumphosphat 0,1 M; pH 4,5; 30 Vol% t-BuOH), Thioanisol zugegeben, die Lö sung mit Sauerstoff begast und die Umsetzung durch Elektrolyse (Arbeitselektrode Graphit (9 cm²), galvano statisch 0,4 mA/cm²) gestartet. Der hierzu verwendete Reaktor ist in Fig. 1 skizziert.
Ansatz: 50 mL Reaktorvolumen
1 L 20 mmol Thioanisol in Puffergemisch
400 U Chloroperoxidase (7 nmol)

Der Reaktorauslauf wird fraktioniert gesammelt und mit tels gaschromatographischer (GC-)Analyse der Gehalt an restlichem Substrat und an Sulfoxid ermittelt.

Analysebedingungen für die Gaschromatographie

Kapillarsäule: Cyclodex β-1P (Länge 50 m, ∅ = 0,32 mm), Trägergas: Helium, Injektor: Split, 200°C, Detektor: FID, 250°C, Säulentemperatur 40°C (5 min), 20°C.min^-1 160°C (5 min)

Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse dieser Analytik. Daraus geht hervor, daß nach der Anlaufphase ein kontinuierli cher Umsatz von ~ 50% erreicht wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konnten kontinu ierliche Umsetzungen über einen Zeitraum von 65 Stunden durchgeführt werden, was gegenüber der anfangs (Tab. 1) gezeigten starken Desaktivierungsrate eine erhebliche Verbesserung darstellt. Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet zum ersten Mal eine kontinuierliche stereose lektive Oxidation von Sulfiden mit Chloroperoxidase ohne signifikate Desaktivierung. Die Reaktionsstabili tät (ttn 260.000) konnte um den Faktor 14 gegenüber kontinuierlichen Verfahren mit herkömmlicher Dosier technik gesteigert werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können stationäre Konzentrationen von weniger als 50 µM H₂O₂ erzeugt wer den. Auch wenn die in die Reaktionslösung eingetragene Ladungsmenge zu einer stationären Konzentration von 50 µM H₂O₂ führt, die nach dem Stand der Technik eben falls erreicht wird, ist die Desaktivierung des Enzyms unterbunden, so daß für das erfindungsgemäße Verfahren, selbst bei gleicher stationärer Konzentration von H₂O₂ wie bei dem Stand der Technik, ein besseres Ergebnis, das heißt keine Desaktivierung des Enzyms beobachtet wird.

Die Verbesserungen durch diese neue Methode sind in Ta belle 7 zusammengefaßt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für die stereoselektive Synthese von organischen Verbindungen geeignet, da mit ihm die Ausbeute an enantiomerenreinem Produkt nicht gemindert wird, und der Vorteil der enzy matischen Reaktion gegenüber anderen nicht enantiose lektiven Methoden erhalten bleibt.

Tabelle 1

Zeitabhängige Aktivitätsbestimmung der Chloroperoxidase bei einer Wasserstoffpero xid-Konzentration von 50 µM

Tabelle 2

Reaktionsstabilität der Chloroperoxidase für die Sulfoxidation

Tabelle 3a

Liste der Reste R₁ und R₂ für ein erfin dungsgemäßes Substrat der allgemeinen Formel R₁-S-R₂

Tabelle 3b

Substrate, welche durch Chloroperoxidase epoxidiert werden

Tabelle 3c

Beispiele für Substrate bei der chloropero xidasekatalysierten Reaktion bei Anwesen heit von Halogenidionen

Tabelle 3d

Beispiele für Substrate bei der chloropero xidasekatalysierten Reaktion bei Abwesen heit von Halogenidionen

Tabelle 4

Zeitabhängigkeit der Bildung von Methylphe nylsulfoxid bei der Umsetzung von Thioani sol mit Chloroperoxidase

Tabelle 5

Zeitabhängigkeit der Bildung von Methylphe nylsulfoxid bei der Umsetzung von Thioanisol mit Chloroperoxidase im repetitive batch

Tabelle 6

Bildung von Methylphenylsulfoxid bei der Umsetzung von Thioanisol mit Chloroperoxi dase im kontinuierlichen Reaktor

Tabelle 7

Vergleich der kontinuierlichen Verfahren zur Sulfoxidsynthese mit Chloroperoxidase

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Substra ten mit H₂O₂, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat mittels mindestens eines Katalysa tors mit auf elektrochemischem Wege erzeugtem H₂O₂ umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der ein Enzym beinhaltet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine Oxidoreduktase eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3; dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidoreduktase eine Peroxidase eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Peroxidase eine Haloperoxidase eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Haloperoxidase mindestens eine Komponente aus der Gruppe Chloroperoxidase, Bromoperoxidase und Jodoperoxidase eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenzeichnet, daß Chloroperoxidase (E.C. 1.11.1.10) aus Lepto xyphium fumago eingesetzt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat ein organisches Substrat einge setzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Substrat eine Komponente aus der Gruppe der Sulfide, Olefine, Olefinester, aro matische Olefine, Alkine, Cyclopropan, substituier tes Cyclopropan, Sulfoxide, Thiole, Carbonsäuren, Heteroaromaten, Aromaten, halogensubstituierte Aro maten, Phenole, o-, m-, p-alkylsubstituierte Phenole, Anilin, N-Di oder monoalkylsubstituiertes Anilin o der Alkohole eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrat ein Sulfid der Formel 1
eingesetzt wird, bei dem R₁ Alkyl oder Aryl, Hete roaryl, substitutiertes Aryl ist und R₂ Alkyl ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylrest ein Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, i-Propyl-, t-Butylrest ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Alkylrest durch Heteroatome wie O, N, F, Cl, Br, und J substituiert ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß H₂O₂ durch kathodische Reduktion in situ erzeugt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die H₂O₂ Produktionsgeschwindigkeit höchstens so hoch ist, wie es dem K_m-Wert des Biokatalysators entspricht.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet; daß die Reaktion bei einem pH-Wert zwischen 3 und 8 durchgeführt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionslösung ein organisches Lösungsmit tel beigemischt ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel tert.-Butanol verwendet wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von 5 bis 30°C durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von 15 bis 25°C durchgeführt wird.