CN101300333B - 使用非血红素卤素过氧化物酶由羧酸酯底物酶催化制备过酸 - Google Patents

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Abstract

提供了由羧酸酯制备过氧羧酸的方法。更具体地说是使羧酸酯在原位与无机过氧化物在具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶的存在下反应生成过氧乙酸，其中所述过水解酶催化剂来源于乳酸杆菌。

Description

使用非血红素卤素过氧化物酶由羧酸酯底物酶催化制备过酸
本申请请求享有2005年10月6日登记的美国临时申请No.60/724,106的优先权。 
                      发明领域
本发明涉及过酸的生物合成和原位酶催化领域。具体地说是，用具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶(haloperoxidase)由羧酸酯底物制备过酸。 
背景技术
已经报导，过酸组合物是有效的抗微生物试剂。用其对坚硬表面、肉制品、活植物组织和卫生器材进行清洁、灭菌和/或消毒以抵抗不受欢迎的微生物的生长的方法已经有所描述(US 6,545,047，US6,183,807，US 6,518,307，US 20030026846和US 5,683,724)。还有报导表明，过酸可以有效地用于制备洗衣店去污用漂白组合物(US3,974,082，US 5,296,161和US 5,364,554)。 
过酸可以通过羧酸与过氧化氢的化学反应来制备(参见OrganicPeroxides，Daniel Swern编辑，第1卷，第313-516页；Wiley Interscience，New York)。强无机酸，例如浓硫酸，通常能够催化所述反应。过氧化氢与羧酸的反应是平衡反应，所以使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸或者除去水是有利于过酸的产生的。化学反应制备过酸存在几个缺点：a)为了有利于制备过酸而使用高浓度的羧酸会导致在使用含有过酸的溶液时会产生不受欢迎的气味，2)随着时间的推移过酸在溶液中通常是不稳定的，所以在使用前的储存期间溶液中过酸的浓度会降低，和3)由于使用浓硫酸作催化剂所以所得制剂通常是强酸性的。 
克服化学制备过酸的缺点的一种方式是使用酶催化剂来代替强酸催化剂。酶催化剂的使用使得能够在使用和/或应用的时候快速地制备过酸，从而避免了与过酸溶液储存和过酸溶液浓度随时间改变有关的问题。通过与过氧化氢直接进行化学反应制备过酸一般需要使用高浓度的羧酸，而酶催化制备过酸则不需要使用这样的高浓度的羧酸，其 中所述酶催化的反应能够使用羧酸酯底物在比化学反应通常使用的羧酸浓度低的多的浓度下进行。酶反应可以在很大的pH值范围内进行，其取决于给定pH值下的酶的活性和稳定性以及给定pH值下底物对过水解作用的特异性。 
酯酶、脂肪酶和一些蛋白酶能够催化烷基酯的水解从而制备出相应的羧酸(式1)。 
式1 
Figure S2006800372135D00021
一些酯酶、脂肪酶或蛋白酶显示出过水解活性，能够从烷基酯催化合成过酸(式2)。 
式2 
Figure S2006800372135D00022
O.Kirk等人(Biocatalysis，11：65-77(1994))研究了水解酶(脂肪酶、酯酶和蛋白酶)催化酰基底物与过氧化氢的过水解反应形成过氧羧酸的能力，其报导在含水体系中过水解反应进展的效率极低。此外，他们发现脂肪酶和酯酶能够将过羧酸分解为相应的羧酸和过氧化氢。作者推断酯酶、脂肪酶和蛋白质通常不适合液相环境中的简单酯的过水解催化，所述简单酯例如辛炔酸甲酯和三辛精。 
US 3,974,082描述了通过将所要漂白的材料与含有能够释放氧气的无机过氧化物、酰基烷基酯和能够水解酯的酯酶或脂肪酶的水溶液相接触来制备洗衣店去污用漂白组合物。 
US 5,364,554描述了一种活化的氧化体系，该体系能够使用蛋白酶类酶、过氧化氢源和酯底物在含水溶液中原位产生过酸，其中所述酯底物优选不能化学地过水解。还公开了漂白的方法和形成过酸的方法。 
US 5,296,161描述了在含水溶液中制备过酸，其中所述含水溶液中包含一种或多种特异性的酯酶和脂肪酶、过氧化氢源和适合用在漂白组合物中的功能化酯底物。然而，其所制得的过酸的浓度通常不能满足许多商业消毒剂应用的需要。 
大多数已知的用酶催化剂由相应的羧酸酯制备过酸的方法不能产生并积聚足够高浓度的过酸以在各种应用中进行有效的消毒。最近报导有几种蛋白酶和脂肪酶的组合物能够在原位产生过酸(例如过乙酸)并且所产生的过酸的浓度适合用作消毒剂和/或商业漂白剂(US11/413,246)。然而，仍然需要发现其他的能够用于在原位制备过酸的酶催化剂。 
卤素过氧化物酶广泛地存在于自然界，通常发现于动物、植物、细菌、真菌和藻类中。首次发现的卤素过氧化物酶据报导含有血红素作为辅基或辅助因子。后来，有许多非血红素卤素过氧化物酶得到了鉴定，这些非血红素卤素过氧化物酶主要来自于细菌。 
卤素过氧化物酶能够催化卤离子(X＝Cl，Br或I)在过氧化氢存在下的氧化以生成相应的次卤酸，所述次卤酸是一种反应性氧类物质，已经报导其具有比过氧化氢更好的抗微生物活性(式3)。 
式3 
对来自吡咯菌素假单胞菌(Pseudomonas pyrrocinia)的非血红素卤素过氧化物酶进行植物重组表达已经被报导能够提高对病原体抵抗力(Jacks等人，US 6,703,540)。Jacks等人报导重组表达的非血红素卤素过氧化物酶还显示能够催化乙酸和过氧化氢之间的反应，形成抗微生物剂过乙酸。转基因植物中次卤酸和过乙酸产量的增加与病原体抵抗力的增加有关。然而，后来报导在表达吡咯菌素假单胞菌非血红素卤素过氧化物酶的转基因植物中对真菌病原体黄曲霉(Aspergillusflavus)的抵抗力的增加可能并不是由于过乙酸的形成，因为在将所述底物氧化为过乙酸酯之前，酶饱和所需的底物(过氧化氢或乙酸酯)的浓度是致命(对真菌病原体)的(Jacks等人，J.Agric.Food Chem.48：4561-4564(2000)；Jacks等人，J.Agric.Food Chem.，50：706-709(2002))。 
所要解决的问题是提供一种在原位酶催化制备过酸的方法并且所 制得的过酸的浓度适合用于各种消毒应用。优选地，用于制备过酸组合物的底物应该是相对无毒且便宜的，例如羧酸酯。 
                      发明简介
上述问题已经通过发现非血红素卤素过氧化物酶在无机源过氧源(例如过氧化氢)和羧酸酯底物的存在下能够在原位制备足以用作消毒剂和/或漂白剂浓度的过酸。 
在本发明的一个方面，提供了一种水酶催化方法，所述方法能够用非血红素卤素过氧化物酶与所选择的底物结合在原位产生过酸，所述方法包括： 
a)提供一组过酸反应组分，所述组分包括： 
1)底物，其选自： 
i)具有以下结构的酯 
Figure S2006800372135D00041
其中R1＝C1到C10的直链或支链烷基，所述烷基任选地被羟基或C1到C4的烷氧基取代，并且R2＝C1到C10的直链或支链烷基，(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH，并且n＝1到10； 
ii)具有以下结构的甘油酯 
其中R1＝C1到C10的直链或支链烷基，所述烷基任选地被羟基或C1到C4的烷氧基取代，并且R3和R4各自为H或R1C(O)； 
2)过氧源；和 
3)具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶； 
b)在含水反应条件下合并所述反应组分，借此，在反应组分合 并约5分钟到约2小时内产生过酸组合物，其中所产生的过酸的浓度至少为500ppb。 
在本发明的另一方面，提供了一种减少坚硬表面或无生命物体上的活微生物种群的方法，所述方法为在过酸反应组分合并后的48小时内使坚硬表面或无生命物体与由上述方法制备的过酸组合物接触，该方法使活微生物种群减少了至少3-log，优选至少4-log，更优选至少5-log，最优选至少6-log。在进一步的方面，在与将要处理的表面或无生命物体接触之前，任选地将由上述方法制备的过酸组合物稀释到所需的有效浓度。 
在本发明进一步的方面，还提供了编码具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶的核酸片段。 
                    生物学序列简述
以下序列描述和附于此的序列表符合37C.F.R.§1.821-1.825所列的指导专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列披露的规定，并且是按照World Intellectual Property Organization(WIPO)Standard(世界知识产权组织标准)ST.25(1998)以及EPC和PCT的序列表要求(实施细则5.2和49.5(一至二)，以及第208节和附录C的审查指南(Administrative Instructions))。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C.F.R.§1.822的规定。 
SEQ ID NO：1是引物#1的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：2是引物#2的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：3是引物#3的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：4是用引物#1和引物#2由恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)5B(NRRL-18668)基因组DNA扩增的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：5是用引物#1和引物#3由恶臭假单胞菌5B(NRRL-18668)基因组DNA扩增的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：6是引物#4的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：7是引物#5的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：8是引物#6的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：9是来自恶臭假单胞菌5B(NRRL-18668)的非血红素卤素过氧化物酶编码区核苷酸序列。 
SEQ ID NO：10是来自恶臭假单胞菌5B(NRRL-18668)的非血红 素卤素过氧化物酶的推导核苷酸序列。 
SEQ ID NO：11是引物#7的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：12是引物#8的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：13是来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58 
Figure S2006800372135D00061
的非血红素卤素过氧化物酶(“AtuA1”)的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：14是来自根癌土壤杆菌C58 
Figure S2006800372135D00062
的非血红素卤素过氧化物酶(“AtuA1”)的氨基酸序列。 
SEQ ID NO：15是引物#9的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：16是引物#10的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：17是来自根癌土壤杆菌C58 的非血红素卤素过氧化物酶(“AtuA2”)的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：18是来自根癌土壤杆菌C58 
Figure S2006800372135D00064
的非血红素卤素过氧化物酶(“AtuA2”)的氨基酸序列。 
SEQ ID NO：19是引物#11的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：20是引物#12的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：21是来自根癌土壤杆菌C58 
Figure S2006800372135D00065
的非血红素卤素过氧化物酶(“AtuA3”)的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：22是来自根癌土壤杆菌C58 
Figure S2006800372135D00066
的非血红素卤素过氧化物酶(“AtuA3”)的氨基酸序列。 
SEQ ID NO：23是引物#13的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：24是引物#14的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：25是引物#15的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：26是引物#16的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：27是来自根癌土壤杆菌C58 
Figure S2006800372135D00067
的非血红素卤素过氧化物酶(“AtuA4”)的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：28是来自根癌土壤杆菌C58 
Figure S2006800372135D00068
的非血红素卤素过氧化物酶(“AtuA4”)的氨基酸序列。 
SEQ ID NO：29是引物#17的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：30是引物#18的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：31是引物#19的核苷酸序列。 
SEQ ID NO：32是引物#20的核苷酸序列。 
发明详述 
本文提供了由羧酸酯底物使用具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶在原位产生过酸的含水酶催化方法。 
在本发明的另一方面，提供了一种减少坚硬表面或无生命物体上的活微生物种群的方法，所述方法为在过酸反应组分合并后48小时内使坚硬表面或无生命物体与由上述方法制备的过酸组合物接触，该方法使活微生物种群减少了至少3-1og，优选至少4-log，更优选至少5-log，最优选至少6-log。 
在本公开文本中使用了许多术语和缩写。除非另有明确的说明，否则其使用的定义如下。 
如本文中所使用的，术语“包含”的意思如权利要求中所指，是表示所描述特征、整数、步骤或组分的存在，但并不排除其中还存在或加入了一种或多种其他的特征、整数、步骤、组分或基团。 
如本文中所使用的，术语“过酸”的含义与过氧酸(peroxyacid)、过氧羧酸、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸和过氧化酸(peroxoic acid)相同。 
如本文中所使用的，术语“过乙酸”的缩写为“PAA”，其含义与过氧乙酸、乙烷过氧化酸(ethaneperoxoic acid)和所有其它CAS登记号为79-21-0的同义词的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“过氧源(source of peroxygen)”的意思是指能够向含水反应混合物提供过氧化氢的过氧化合物(即，“过氧源(peroxygen source)”，其选自过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过氧化氢、过氧化氢-尿素加合物(CAS#124-43-6)以及它们的混合物。 
如本文中所使用的，术语“一醋精”与单乙酸甘油酯(glycerol monoacetate)、甘油一乙酸酯(glycerin monoacetate)和甘油基单乙酸酯(glyceryl monoacetate)的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“二醋精”的含义与二乙酸甘油酯(glycerol diacetate)；甘油二乙酸酯(glycerin diacetate)，甘油基二乙酸酯(glyceryl diacetate)和所有其它CAS登记号为25395-31-7的同义词的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“三醋精”的含义与三乙酸甘油酯(glycerintriacetate)；甘油三乙酸酯(glycerol triacetate)；甘油基三乙酸酯(glyceryl triacetate)，1，2，3-三乙酰氧丙烷，1，2，3-丙三醇三乙酸酯和所有其它CAS登记号为102-76-1的同义词的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“一丁精(monobutyrin)”的含义与单丁酸甘油酯(glycerol monobutyrate)，甘油一丁酸酯(glycerinmonobutyrate)和甘油基一丁酸酯(glyceryl monobutyrate)的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“二丁精(dibutyrin)”的含义与甘油二丁酸酯(glycerol dibutyrate)和甘油基二丁酸酯(glyceryl dibutyrate)的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“三丁精(tributyrin)”的含义与甘油三丁酸酯(glycerol tributyrate)，1，2，3-三丁酰基甘油和所有CAS登记号为60-01-5的其它同义词的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“一丙精(monopropionin)”的意思与单丙酸甘油酯(glycerol monopropionate)、甘油一丙酸酯(glycerinmonopropionate)和甘油基一丙酸酯(glyceryl monopropionate)的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“二丙精(dipropionin)”的意思与甘油二丙酸酯(glycerol dipropionate)和甘油基二丙酸酯(glyceryldipropionate)的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“三丙精(tripropionin)”的含义与甘油基三丙酸酯(glyceryl tripropionate)，甘油三丙酸酯(glyceroltripropionate)，1，2，3-三丙酰基甘油和所有其它CAS登记号为139-45-7的同义词的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“醋酸乙酯”的含义与乙酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙烷酸乙酯(ethyl ethanoate)、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙酸的乙基酯和所有其它CAS登记号为141-78-6的同义词的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“乳酸乙基酯”的含义与乳酸乙酯和所有其它CAS登记号为97-64-3的同义词的含义相同。 
如本文中所使用的，术语“适当的含水反应条件”是指在其中反应物和过水解酶催化剂能够接触的条件。本文提供了适于反应的组分和条件，并且本领域技术人员能够预期适合于所述方法的组分和条件的变化范围。 
如本文中所使用的，术语“过水解”的定义是所选择底物与过氧化物形成过酸的反应。一般地，是使无机过氧化物与所选择的底物在催化剂的存在下反应产生过酸。如本文中所使用的，术语“化学过水解”包括在反应中底物(过酸的前体)与过氧化氢源发生了结合的过水解反应，其中所述过酸是在不存在酶催化剂的情况下形成的。如本文中所使用的，术语“酶催化过水解”是指用酶辅助或催化进行的过水解反应。 
如本文中所使用的，“非血红素卤素过氧化物酶”、“卤素过氧化物酶”、“HPO”和“细菌卤素过氧化物酶”是指能够在卤离子和过氧化氢的存在下催化各种底物的卤化的非血红素卤素过氧化物酶，所述卤素过氧化物酶可以进一步分为氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)、溴过氧化物酶或碘过氧化物酶(E.C.1.11.1.8)。已经显示，非血红素卤素过氧化物酶能够催化酰基羧酸类的过氧化反应生成过酸(US6,703,540；Jacks等人，上文，2000；Jacks等人，上文，2002)。如本文中所描述的，本发明提供了几种在适当的含水反应条件下对多种羧酸酯底物显示具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶。 
如本文中所使用的，“恶臭假单胞菌5B”是保藏在NorthernRegional Research Lab(NRRL)保藏编号为NRRL-18668的恶臭假单胞菌株(US 5,811,286)。所述Northern Regional Research Lab已经更名为National Center for Agriculture，USDA Research(Peoria，IL)。 
如本文中所使用的，“根癌土壤杆菌”是指根癌土壤杆菌菌株C58(Goodner等人，Science，294(5550)：2323-2328(2001))。该菌株也被称为放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)，该菌株能够从AmericanType Culture Collection 
Figure S2006800372135D00091
获得，保藏标记号为ATCC 33970。 
如本文中使用的，术语“过水解酶催化剂”在本文中是指以过水解活性为特征的酶催化剂(非血红素卤代过水解酶)。所述酶催化剂可以是全微生物细胞、通透化微生物细胞(复数)、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。如本文中所描述的，非血红素卤素过氧化物酶显示对羧酸酯具有过水解活性。 
如本文中使用的，术语“过水解酶活性”是指每单位质量(例如，毫克)蛋白、细胞干重或固定化催化剂重量的催化活性。对催化剂的过水解酶活性的比较是与细胞干重或蛋白催化剂重量成比例地确定 的。 
如本文中所使用的，“一个单位的酶活性”或“一个单位的活性”或“U”的定义是在规定温度下每分钟制备1μmol过酸产品所需的酶活性的数值。 
如在本文中所使用的，术语“消毒”是指净化从而破坏并预防病原性微生物生长的过程。正如本文中所使用的，术语“消毒剂”是指能够通过破坏、抵消或抑制携带病原的微生物的生长而实现消毒的试剂。一般消毒剂被用于处理无生命物体或表面。如本文中所使用的，术语“抗菌剂”是指能够抑制携带病原的微生物生长的化学试剂。 
如本文中所使用的，术语“杀病毒剂”和“杀毒剂”是指能够抑制或破坏病毒的试剂。显示出具有抑制或破坏病毒的能力的试剂被称作具有“杀病毒”或“杀毒”活性。过酸具有杀病毒活性。适合用于本发明的本领域已知的典型可选择杀病毒剂包括，例如，醇类、醚类、氯仿、甲醛、苯酚类、β-丙内酯、碘、氯气、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶和洗涤剂。 
如本文中所使用的，术语“杀生物剂”是指能够使微生物灭活或能够破坏微生物的化学试剂，其一般是广谱的。显示出能够使微生物灭活或能够破坏微生物的化学试剂被称为具有“杀生物”活性。过酸具有杀生物活性。适合用于本发明的本领域已知的典型可选择杀生物剂包括，例如，氯气、二氧化氯、氯异氰脲酸酯、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺、氯代酚醛树脂、铜盐、有机-硫化合物和季铵盐。 
如本文中所使用的，短语“最小杀生物浓度”是指能够在特定接触时间内使目标微生物活种群发生所期望的减少的杀生物剂最小浓度，其中所述减少是致死的、不可逆的。有效性可以通过处理之后活微生物的log10减少来衡量。在一方面，处理之后活细胞的目标减少量为3-log的减少，更优选为4-log的减少，最优选至少为5-log的减少。在另一方面，最小杀生物浓度是活微生物细胞的6-log的减少。 
如本文中所使用的，修饰本发明或本发明使用的组分或反应物的数量的术语“约”是指，例如通过在实际作业中制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理方法；通过这些操作过程中的偶然误差；通过制备组合物或实施方法时使用的组分在制备、来源或纯度方面的差异等而产生的数值大小的改变。对于由特殊初始混合物而获得的组合 物来说，术语“约”还包括由于不同平衡条件而导致有所不同的量。无论是否有术语“约”修饰，权利要求均包括所述数量的等同物。 
由羧酸酯和过氧化氢酶-催化制备过酸的合适的反应条件 
本发明的一个方面提供了制备含有过酸的含水混合物的方法，所述方法是通过使羧酸酯与无机过氧化物在具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶催化剂的存在下反应而实现的，其中所述无机过氧化物不限于为过氧化氢、过硼酸钠或过碳酸钠。 
合适的羧酸酯底物具有选自以下结构的化学式： 
a)具有以下化学式的酯 
Figure S2006800372135D00111
其中R1＝C1到C10的直链或支链烷基，所述烷基任选地被羟基或C1到C4的烷氧基取代，并且R2＝C1到C10的直链或支链烷基，(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH，并且n＝1到10；和 
b)具有以下结构的甘油酯 
其中R1＝C1到C10的直链或支链烷基，所述烷基任选地被羟基或C1到C4的烷氧基取代，并且R3和R4各自为H或R1C(O)。 
在一方面，羧酸酯底物选自乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、2-乙酰基柠檬酸三乙酯、葡萄糖五乙酸酯、葡糖酸内酯、甘油酯(单、二和三酸甘油酯)例如单乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯(1，2，3-丙三醇二乙酸酯)、三醋精(三乙酸甘油酯)、单丙酸甘油酯、二丙酸甘油酯、三丙酸甘油酯(三丙酸甘油基酯)、一丁酸甘油酯、二丁酸甘 油酯(二丁酸甘油基酯)、三丁酸甘油酯(三丁酸甘油基酯)和他们的混合物。 
另一方面，羧酸酯底物选自单乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、二丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、一丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。仍然在另一方面，羧酸酯底物选自二乙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。 
酶底物(羧酸酯)是以足以通过酶-催化过水解制备所需浓度的过酸的浓度存在于反应混合物中的。在所附的实施例中已经显示，对于制备所期望浓度的过酸来说存在优选的酶底物和酶催化剂组合。羧酸酯不必完全溶解在反应混合物中，但其应具有足够的溶解度以使所述酯能够通过酶催化剂转化为相应的过酸。羧酸酯底物以0.05wt％到40wt％的反应混合物的浓度存在于反应混合物中，优选以0.1wt％到20wt％的反应混合物的浓度存在，更优选以0.5wt％到10wt％的反应混合物的浓度存在。 
过氧源可以包括，但不限于，过氧化氢、过硼酸盐、过磷酸盐、过碳酸盐以及他们的混合物。过氧化合物在反应混合物中的浓度可以在0.1wt％到约50wt％，优选1wt％到约40wt％，更优选2wt％到约30wt％的范围之内。 
本文中所描述的酶催化剂是非血红素卤素过氧化物酶家族的成员(例如氯过氧化物酶[E.C.1.11.1.10]，溴过氧化物酶和碘过氧化物酶[E.C.1.11.1.8])。具有催化作用的三联体(丝氨酸97：天冬氨酸229：组氨酸258)已经被报导是使该族蛋白具有卤化活性的原因(Pelletier等人，Biochimica et Biophysica Acta 1250：149-157(1995))。本发明非血红素卤素过氧化物酶包含该三联体，虽然来自根癌土壤杆菌(AtuA2；SEQ ID NO：18)的本发明非血红素卤素过氧化物酶中的一个似乎具有47个氨基酸的N端延伸。当不存在47个氨基酸的N端延伸时，AtuA2含有特有的三联体，该三联体使其具有卤化活性。特别地，用于本发明的酶是对羧酸酯底物具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶。 
在一方面，酶催化剂是来源于原核生物或从原核生物中分离出来的非血红素卤素过氧化物酶。在另一方面，所述非血红素卤素过氧化物酶是来源于细菌或从细菌分离中分离出来的。在另一方面，非血红素卤素过氧化物酶来源于选自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和土壤 杆菌属(Agrobacterium sp.)的生物。在进一方面，非血红素卤素过氧化物酶的来源选自恶臭假单胞菌和根癌土壤杆菌。在优选的方面，非血红素卤素过氧化物酶的来源选自恶臭假单胞菌5B(NRRL-18668)和根癌土壤杆菌C58(ATCC 33970)。 
在一方面，用于本发明的核酸分子是那些编码下述非血红素卤素过氧化物酶的核酸分子，所述非血红素卤素过氧化物酶与选自SEQ IDNO：10，14，18，22和28的氨基酸序列具有至少80％的同一性。在另一方面，本方法使用的编码非血红素卤素过氧化物酶的核酸分子与本文所报导的氨基酸序列具有至少85％，优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至又更加优选至少98％，最优选至少99％的同一性。在进一步的实施方式中，本方法使用的编码非血红素卤素过氧化物酶的核酸序列表示为选自SEQ ID NOs：10，14，18，22和28的氨基酸序列。 
在进一步的实施方式中，适合于本方法的编码非血红素卤素过氧化物酶的核酸序列与本文所提供的序列具有至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至又更加优选95％，甚至又更加优选98％，更优选至少99％的核酸序列同一性。在另一方面，适合于本方法的编码非血红素卤素过氧化物酶的核酸序列具有选自SEQ ID NOs：9，13，17，21和27的核酸序列。 
已经报导有许多酶催化剂(全细胞，部分纯化或纯化的)具有过氧化氢酶活性(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶能够将过氧化氢转化为氧气和水。一方面，过水解催化酶的过氧化氢酶活性是不足的。另一方面，可以向反应混合物中加入过氧化氢酶抑制剂。过氧化氢酶抑制剂的例子包括，但不限于，叠氮化钠和羟胺硫酸盐。本领域技术人员能够根据需要调节过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度一般在0.1mM到约1M；优选约1mM到约50mM；更优选约1mM到约20mM的范围内。在一个方面，叠氮化钠的浓度一般在约20mM到约60mM的范围内，而羟胺流散盐的浓度一般在约0.5mM到约30mM的范围内，优选约10mM。在优选的实施方式中，酶催化剂不具有显著的过氧化氢酶活性或者通过操作使其过氧化氢酶活性得到减少或消除。用于重组表达本发明过水解酶的宿主细胞可以选自那些缺乏过氧化氢酶活性的宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)菌株UM2(CGSC7156))。在进一步的实施方式中，宿主细胞内的过氧化氢酶活性可以 通过用熟知的技术破坏负责过氧化氢酶活性的基因(复数)的表达而得到调低或消除，所述技术包括但不限于转位子诱变、RNA反义表达、目标诱变和随机诱变。 
选择酶催化剂在含水反应混合物中的浓度以获得所期望的反应速率，所述浓度还取决于酶催化剂的具体催化活性。用作催化剂的可溶解酶在过水解反应物中的重量一般在0.05mg到10mg酶每mL总反应物体积的范围内，优选0.10mg到2.0mg酶每mL。还可以用本领域技术人员熟知的方法将酶固定在可溶解或不可溶解的支持物上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，编辑；Humana出版，Totowa，NJ，USA；1997。固定化酶的使用使催化剂能够在后续反应中被回收和再利用。能够用于本申请的酶催化剂的其他形式包括全微生物细胞、细胞提取物和部分纯化的酶。这些其他形式的催化剂也可以用以上参考的方法固定。 
在一方面，由羧酸酯的化学过水解和酶催化过水解结合产生的过酸的浓度足以在期望pH下提供漂白或消毒用有效浓度的过酸。在另一方面，本方法提供了通过结合酶和酶底物制备所需有效浓度的过酸的方法，其中在不加入酶的情况下，所制备的过酸的浓度会显著地降低。虽然有时候通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应会导致酶底物的明显化学过水解，但是化学过水解所产生的过酸的浓度可能不足以在所需应用中提供有效浓度的过酸，而通过向反应混合中加入适当的过酶催化剂能够使总过酸浓度得到显著的增加。 
由羧酸酯的酶催化过水解产生的过酸的浓度至少为500ppb过酸，优选至少为1ppm过酸，更优选至少为2ppm过酸，甚至更优选至少为4ppm过酸，甚至更加优选至少5ppm，最优选至少8ppm。为了制备所期望的过酸浓度较低的混合物，可以任选地用水或主要由水组成的溶液来稀释含有过酸的产物混合物。制备所期望浓度的过酸所需要的反应时间不超过约二小时，优选不超过约30分钟，更优选不超过约10分钟，最优选不超过约5分钟。过酸的浓度可以继续增加到高于最初所预期的在不超过约2小时内产生的过酸浓度，以至于反应混合物在至少48小时时才产生最高过酸浓度。 
对反应温度进行选择以控制反应速率和酶催化活性的稳定性。反应的温度可以在刚好高于反应混合物的冰点(约0℃)到约65℃的范 围内，优选的反应温度范围是从约5℃到约35℃。 
含有过酸的最终反应混合物的pH为约1到约10，优选约2到约7.5，更优选约3到约7，甚至更优选约3.5到约6.5。反应的pH和最终反应混合物的pH可以通过加入适当的缓冲剂来控制，所述缓冲剂包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。缓冲剂的浓度为0.1mM到1.0M，优选1mM到100mM，最优选10mM到50mM。 
在另一方面，酶催化过水解产物可以含有另外的组分，所述另外的组分能够提供合乎需要的功能。在一方面，所述的合乎需要的功能包括能够将该材料用于漂白应用中。这些另外的组分包括但不限于，乳化剂和表面活性剂。乳化剂的例子包括聚乙烯醇和聚维酮。表面活性剂的例子，包括a)非离子表面活性剂例如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基化或丙氧基化的直线或枝状一级和二级醇和脂肪族氧化膦，b)阳离子表面活性剂例如季铵化合物，特别是氮原子上连有C8-C20烷基并且另外连有三个C1-C2烷基的季铵化合物，c)阴离子表面活性剂例如链烷基羧酸类(例如C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸盐、链烷基磺酸盐(例如十二烷基磺酸钠)或直链或支链烷基苯磺酸盐、链烯基磺酸盐，以及d)两性和两性离子表面活性剂例如氨基羧酸类、氨基二羧酸类和烷基甜菜碱(alkybetaines)。另外的组分可以包括香料、染料、过氧化氢稳定剂(例如1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(Dequest 2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO))，酶活性稳定剂(例如，聚乙二醇(PEG))，洗涤增效助剂和金属螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))。 
在原位酶催化制备过酸
本含水酶催化方法能够在原位制备对杀生物和/或杀病毒应用有效浓度的过酸。制得的过酸非常具有反应性并且不稳定，通常其浓度会随时间降低。因此，使多种反应组分保持分离也许是合意得，尤其是对于制剂的至少一种组分是液体的制剂来说。在一方面，可以将过氧化氢源从底物或酶中，优选从两者中分离出来。所述分离可以使用多种技术来完成，所述技术包括但不限于使用多间隔室状分配器(multicompartment chambered dispensers)(US 4,585,150)，并且接着对酶催化剂与所存在的底物进行物理混合以引发含水酶催化过水解反 应。可以将酶催化剂固定在反应室内部，也可以在与作为处理目标的表面和/或物体接触之前将其从包含过酸的反应产物中分离出来(例如通过过滤等)。酶催化剂可以存在于液体基质或者固体形式的基质(即粉末，片剂)中或者被包埋在固体基质的内部，接着将所述基质与底物混合以用于引发酶催化过水解反应。在进一步的方面，酶催化剂可以包含在可溶解或多孔的袋的内部，所述袋可以被加入到含水底物基质中以用于引发酶催化过水解。 
用于测定过酸和过氧化氢浓度的HPLC分析方法
在本方法中可以使用多种分析方法来分析反应物和产物，所述方法包括但不限于，本发明实施例中所述的滴定，高效液相色谱(HPLC)，气相色谱(GC)，质谱(MS)，毛细管电泳(CE)，U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627(1997))和2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(ABTS)试验(S.Minning等人Analytics Chimica Acta 378：293-298(1999)和WO 2004/058961 A1)。 
过酸的最小杀生物浓度的测定
可以使用J.Gabrielson等人(J.Microbiol.Methods 50：63-73(2002))描述的方法来测定过酸或者过氧化氢和酶底物的最小杀生物浓度(MBC)。所述测定方法是以XTT还原抑制作用为基础的，其中XTT((2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓，一钠，内盐)是一种氧化还原染料，其能够通过490nm或450nm下测定的光密度(OD)的改变来显示微生物的呼吸能力。然而，许多其它方法也可以有效地测定消毒剂和防腐剂的活性，所述其它方法包括但不限于活体平板计数法、直接显微镜计数法、干重法、浊度测定法、吸光度法和生物发光法(参见，例如Brock，Semour S.，Disinfection，Sterilization，and Preservation，第5版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。 
酶催化制备的过酸组合物的应用
根据本方法制备的酶催化形成的过酸可以用于以减少微生物、真菌和病毒污染为目的的各种应用，例如医疗器械(例如内窥镜)、纺织品(例如，服装、毡毯)、食品制品表面、食品贮藏和食品-包装设备、 用于包装食物产品的材料、雏鸡孵化场和外用生长设备、动物围栏和具有微生物的过程废水的去污和/或杀病毒活动。可以将酶-产生的过酸用于灭活蛋白用制剂(例如含有某些蛋白酶制剂)中以提供另外的杀生物活性。在优选的方面中，本发明的过酸组合物能够特别有效地用作无法高压灭菌的医疗器械和食品包装设备用清洁和杀菌剂。可以使用GRAS或食品级的组分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲剂)来制备含过酸的制剂，这样酶-产生的过酸还可以用于动物死体、肉类、水果和蔬菜的去污，或者用于预加工食品的去污。可以将酶-产生的过酸加入到最终形态为粉末、液体、凝胶、固体或气雾剂的产品中。可以将酶-产生的过酸稀释到仍能够提供有效去污作用的浓度。 
包含有效浓度的过酸的组合物可以用于对被病原性微生物和/或病毒污染的(或怀疑被污染的)表面和/或物体进行清洁和消毒，所述清洁和消毒是通过使所述表面或物体与由本发明方法制备的产品接触而进行的。正如本文所使用的，“接触”是指将包含有效浓度的过酸的消毒组合物与怀疑被致病实体污染的表面或无生命物体接触一段足以完成清洁和消毒的时间。接触包括喷雾、处理、浸渍、冲洗、倾注在其上或其内、混合、结合、涂渍、涂覆、施加、粘贴以及其他能够将包含有效浓度过酸的过酸溶液传递给怀疑被污染的表面或无生命物体的方式。包含有效浓度的过酸的组合物还可以含有另外的抗微生物剂、杀病毒剂或杀生物剂。这些试剂与由请求保护的方法制备的过酸相结合，在用于对被病原性微生物、病毒和/或蛋白感染素污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体进行清洁和消毒时可以提供增效和/或协同作用。合适的抗微生物剂包括羧酸酯(例如，对-羟基烷基苯甲酸酯和肉桂酸烷基酯)，磺酸(例如，十二烷基苯磺酸)，碘化合物或具有活性的卤素化合物(例如，卤素单质，卤素氧化物(例如，NaOCl，HOCl，HOBr，CIO2)，碘，互卤化物(interhalides)(例如，一氯化碘，二氯化碘，三氯化碘，四氯化碘，氯化溴，一溴化碘或二溴化碘)，多卤化物，次氯酸盐，次氯酸，次溴酸盐，次溴酸，氯代-和溴代-乙内酰脲，二氧化氯和亚氯酸钠)，有机过氧化物包括过氧化苯甲酰、烷基过氧化苯甲酰，臭氧，纯态氧产生物及其混合物，苯酚衍生物(例如，邻-苯基苯酚，邻-苄基-对-氯酚，叔-戊基苯酚和C1-C6烷基羟基苯甲酸酯)，季铵化合物(例如，烷基二甲基苯甲基氯化铵，二烷基二甲基氯化铵和他们的混合物)， 以及这样的抗微生物剂的混合物，上述抗微生物剂的含量是足以提供所需程度的微生物保护的量。抗微生物剂的有效量包括约0.001wt-％到约60wt-％的抗微生物剂，约0.01wt-％到约15wt-％的抗微生物剂，或者约0.08wt-％到约2.5wt-％的抗微生物剂。 
申请人明确地将所有引用参考文献的全部内容引入到本公开文本中。此外，当数量、浓度或其他数值或参数是作为范围、优选范围或一列较高优选值和较低优选值给出的时，应理解为其明确地公开了所有由任意一对任意上限值或优选值和任意下限值或优选值形成的范围，不论所述范围是否被单独地公开。当本文对数值范围进行描述时，除非另有说明，所述范围意图包括其端点和在该范围内的所有整数和分数。在定义一个范围时，其并不是试图将本发明的范围限定于所描述的具体数值。 
                        一般方法
以下实施例是提供用来证明本发明的优选方面的。本领域技术人员应当可以预见到，实施例中公开的工艺是按照本发明人发现的能够很好地实现本发明的代表性工艺进行的，因此其可以被认为是构成了用于实现本发明的优选方式。然而，本领域技术人员在考虑到本申请公开内容以后应当能够预见，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方式进行许多变化且仍能获得相同或相似的结果。 
PCR参数：
利用PCR扩增来合成核酸分子的方法是本领域所熟知的。PCR试剂是由Roche Diagnostics Corporation(Indianapolis，IN)获得的，按厂家说明书中推荐的方式使用。 
PCR周期参数如下： 
第1步：5分钟，95℃ 
第2步：0.5分钟，95℃(变性) 
第3步：0.5分钟，55℃(逐渐冷却) 
第4步：1分钟，74℃(扩增) 
第2-4步重复循环25次 
除非另有指明，所有的试剂和原料都是从DIFCO Laboratories(Detroit，M1)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，TCI America(Portland，OR)，Roche Diagnostics Corporation(Indianapolis，IN)或Sigma/AldrichChemical Company(St.Louis，MO)获得的。 
说明书中的以下缩写对应于以下测量、工艺、特征或化合物单位：“sec”或“s”的含义是秒(复数)，“min”的含义是分钟(复数)，“h”或“hr”的含义是小时(复数)，“d”的含义是以g/mL表示的密度，“μL”的含义是微升，“mL”的含义是毫升，“L”的含义是升，“mM”的含义是毫克分子的，“M”的含义是摩尔，“mmol”的含义是毫摩尔(复数)，“ppm”的含义是百万分之一，“ppb”的含义是十亿分之一，“wt”的含义是重量，“wt％”的含义是重量百分比，“g”的含义是克，“μg”的含义是微克，“HPLC”的含义是高效液相色谱，“O.D.”的含义是指定波长下的光密度，“dcw”的含义是干细胞重量，“CFU”的含义是菌落数，“ATCC”或 
Figure S2006800372135D00191
的含义是American Type Culture Collection，“U”的含义是过水解酶活性单位，“RPM”的含义是每分钟的转数，“EDTA”的含义是乙二胺四乙酸，“IPTG”的含义是异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷，“CFU”的含义是菌落单位，“XTT”意思是(2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(carboxanilide)内盐；CAS# 111072-31-2)，以及“CGSC”的含义是CoIi Genetic Stock Center(Yale University Escherichia CoIi Genetic Stock Center，New Haven，CT)。 
                        实施例1
恶臭假单胞菌5B非血红素卤素过氧化物酶的克隆
以来自恶臭假单胞菌菌株的公开非血红素卤素过氧化物酶序列为基础设计一系列的PCR引物，所述恶臭假单胞菌菌株包括KT2440，IF-3和MR-2068(分别为， 
Figure S2006800372135D00192
6451702和1360922)。使用来自恶臭假单胞菌5B(NRRL-18668)的基因组DNA的PCR与引物#1(5-GATCTGG TCATCGTCGCCATGCATCAC-3’；SEQ ID NO：1)和引物#2(5’-GCCGA CGACTGGGACGCGCAGATG-3′；SEQ ID NO：2)以及与引物#1和引物#3(5’- ATGAGCTACGTCACCACCAAAGATGG-3′；SEQ ID NO：3)分别生成了大约600bp和700bp的产物。这些产物的核苷酸序列(SEQ ID Nos：4和5)以及相应的推导氨基酸序列被证实与部分非血红素卤素过氧化物酶基因具有同一性。用引物#4(5′-GGCTACGTCGTCGGCATAGTGGTC-3’；SEQ ID NO：6)的基因组测序显示在非血红素卤素过氧化物酶基因的上游存在几百bp的Pst|限制位点。用Pst|连接所述基因组DNA然后进行结扎，使用引物#5(5’-GGTGGAAGTGGATCACCGGTGCATCGC-3′；SEQ ID NO：7)和引物#6(5’-GCCCATTACGATGGCATCGTGGC-3′；SEQ ID NO：8)进行反向PCR。将由该PCR产物获得的核苷酸序列用于解释整个天然恶臭假单胞菌5B非血红素卤素过氧化物酶的编码序列(SEQ ID NO：9)，所述编码序列是对SEQ ID NO：10所示的氨基酸进行的编码。 
                        实施例2
恶臭假单胞菌5B非血红素卤素过氧化物酶在大肠杆菌中的表达
将来自恶臭假单胞菌5B的非血红素卤素过氧化物酶使用引物#7(5′-G AATTCATGAGCTATGTAACCACGAAGGACGGC-3’；SEQ IDNO：11)和引物#8(5′-GCGGCCGCTTAACTACGGATAAACGCCAGCAAATCCGCAT-3’；SEQ ID NO：12)进行PCR扩增，并亚克隆入 
Figure S2006800372135D00201
(Invitrogen)和 (Invitrogen)以分别产生表达质粒pSW167和pSW169。此外，将来自pSW169的EcoR|片段亚克隆入pET-28a(Novagen；Madison，W1)以产生表达质粒pSW174。用pSW167或pSW169对大肠杆菌TOP10(Invitrogen)进行转化以分别产生菌株TOP10/pSW167和TOP10/pSW169。用pSW174对大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)进行转化以产生菌株BL21/pSW174。根据Invitrogen′s表达协议在TOP10/pSW167，TOP10/pSW169和BL21/pSW174中表达5B非血红素卤素过氧化物酶。基本上，在OD600＝0.5-0.6下用1mM的IPTG在37℃且摇动的条件下诱导细胞3hr。SDS-PAGE分析证实产生了分子量为大约30kDa的蛋白，在对照株(无质粒的宿主)中不存在该分子量带。还用pSW167和pSW169对大肠杆菌FM5(TCC 53911)和大肠杆菌UM2(GSC 7156)进行转化以产生菌株FM5/pSW167， UM2/pSW167，FM5/pSW169和UM2/pSW169。 
                        实施例3
根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)非血红素卤素过氧化物酶 
Figure S2006800372135D00211
在大肠杆菌中的表达 
来自根癌土壤杆菌C58(“C58”)的非血红素卤素过氧化物酶基因( 在本文中也称作“AtuA1”；SEQ ID Nos：13-14)用引物#9(5’-ATGGGCTTCGTAACAACCAAGGACGGCAC-3’；SEQ IDNO：15)和引物#10(5’-TCAGCCCTTGATGAAGGCTAGCAGGTCCTG-3’；SEQ ID NO：16)进行PCR-扩增并亚克隆入 
Figure S2006800372135D00213
(Invitrogen)以产生pSW166质粒。此外，将来自pSW166的EcoR|片段亚克隆入pET-28a(Novagen)以产生表达质粒pSW175。用pSW166转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen)以产生菌株TOP10/pSW166。用pSW175转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)以产生菌株BL21/pSW175。将C58非血红素卤素过氧化物酶通过在OD600＝0.5-0.6下用1mM的IPTG在37℃且摇动条件下诱导3hr从而表达于TOP10/pSW166和BL21/pSW175中。SDS-PAGE分析证实产生了分子量为大约30kDa的蛋白，在对照株(无质粒的细胞)中不存在该蛋白。还用pSW166对大肠杆菌FM5(ATCC53911)和大肠杆菌UM2(CGSC 7156)进行了转化以产生菌株FM5/pSW166和UM2/pSW 166。 
                        实施例4
根癌土壤杆菌非血红素卤素过氧化物酶 
Figure S2006800372135D00214
                  在大肠杆菌中的表达
将来自根癌土壤杆菌C58的非血红素卤素过氧化物酶基因( 
Figure S2006800372135D00215
在本文中也称作“AtuA2”；SEQ ID Nos：17-18)用引物#11(5’-ATGTCGCGTTTCACCACCACTGACGGTACC-3’；SEQID NO：19)和引物#12(5’-TCAGCCGTGGATAAAGGCGAGCACGTCG-3’；SEQ ID NO：20)进行PCR-扩增，并亚克隆入 
Figure S2006800372135D00216
(Invitrogen)和 
Figure S2006800372135D00217
(Invitrogen)中以分别产生表达质粒pSW171和 pSW173。此外，将来自pSW171的EcoR|片段亚克隆入pET-28a(Novagen)中以产生表达质粒pSW176。用pSW171或pSW173转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen)以分别产生菌株TOP10/pSW171和TOP10/pSW173。用pSW176转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)以产生菌株BL21/pSW176。将C58非血红素卤素过氧化物酶通过在OD600＝0.5-0.6下用1mM的IPTG在37℃且摇动条件下诱导3hr而表达于TOP10/pSW171、TOP10/pSW173和BL21/pSW176中。SDS-PAGE分析证实产生了分子量为大约30kDa的蛋白，在对照株(无质粒的宿主细胞)中不存在该蛋白。还用pSW171和pSW173对大肠杆菌FM5(ATCC 53911)和大肠杆菌UM2(CGSC 7156)进行了转化以产生菌株FM5/pSW171、UM2/pSW171、FM5/pSW173和UM2/pSW173。 
                        实施例5
根癌土壤杆菌非血红素卤素过氧化物酶 
                      在大肠杆菌中的表达
将来自根癌土壤杆菌C58的非血红素卤素过氧化物酶基因( 
Figure S2006800372135D00222
在本文中也称作“AtuA3”；SEQ ID Nos：21-22)用引物#13(5’-ATGACAACGATCACCACCAGAGACGGAACG-3’；SEQID NO：23)和引物#14(5’-TCAGGCGTTGATGAAGGTGAGGAGGTCG-3’；SEQ ID NO：24)进行PCR-扩增，并亚克隆入 (Invitrogen)中以产生质粒pSW170。此外，将来自根癌土壤杆菌C58的非血红素卤素过氧化物酶基因 
Figure S2006800372135D00224
用引物#15(5’-CAATTGATGACAACGATCACCACCAGAGACG-3’；SEQ ID NO：25)和引物#16(5’-CAATTGATGACAACGATCACCACCAGAGACG-3’；SEQ ID NO：26)进行PCR扩增，并亚克隆入pET-28a(Novagen)的Mfe|和Not|之间以产生表达质粒pSW177。用pSW170转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen)以产生菌株TOP10/pSW170。将C58非血红素卤素过氧化物酶通过在OD600＝0.5-0.6下用1mM的IPTG在37℃且摇动条件下诱导3hr而表达于TOP10/pSW170和BL21/pSW177中。SDS-PAGE分析证实产生了分子量为大约30kDa的蛋白，在对照株(无质粒的宿主细胞)中不存在这样的蛋白。还用pSW170对大肠杆菌FM5(ATCC 53911)和大肠杆菌UM2(CGSC 7156)进行了转化以产生菌株FM5/pSW170和UM2/pSW170。 
                        实施例6
根癌土壤杆菌非血红素卤素过氧化物酶 
                  在大肠杆菌中的表达
将来自根癌土壤杆菌C58的非血红素卤素过氧化物酶基因( 
Figure S2006800372135D00232
在本文中也称作“AtuA4”；SEQ ID Nos：27-28)用引物#17(5’-ATGGGCTTTGTTAAGACGACAGACGGAACC-3’；SEQID NO：29)和引物#18(5’-TCAGCCCTTGATGAAGGCCAGCAGATCC-3’；SEQ ID NO：30)进行PCR扩增，并亚克隆入 
Figure S2006800372135D00233
(Invitrogen)中以产生质粒pSW172。此外，将来自根癌土壤杆菌C58的非血红素卤素过氧化物酶基因 
Figure S2006800372135D00234
用引物#19(5’-ATGAATTCATGGGCTTTGTTAAGACGACAGACG-3’；SEQ ID NO：31)和引物#20(5’-ATGCGGCCGCTCAGCCCTTGATGAAGGCCAGCAGATC-3’；SEQ ID NO：32)进行PCR扩增，并亚克隆入pET-28a(Novagen)以产生表达质粒pSW178。用pSW172转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen)以产生菌株TOP10/pSW172。用pSW178转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)以产生菌株BL21/pSW178。将C58非血红素卤素过氧化物酶通过在OD600＝0.5-0.6下用1mM的IPTG在37℃且摇动条件下诱导3hr而表达于TOP10/pSW172和BL21/pSW178中。SDS-PAGE分析证实产生了分子量为大约30kDa的蛋白，在对照株(无质粒的宿主细胞)中不存在这样的蛋白。还用pSW172对大肠杆菌FM5(ATCC 53911)和大肠杆菌UM2(CGSC 7156)进行了转化以产生菌株FM5/pSW172和UM2/pSW172。 
                       实施例7
                    细胞浆液的制备
将来自LB板的单一菌落，所述LB板含有安比西林(大肠杆菌TOP10)或卡那霉素(大肠杆菌BL21)，转移到2mL的含有50μg/mL安比西林或卡那霉素的Miller′s LB肉汤中，并且在37℃和摇动条件 (250rpm)下培养16-18小时。将50mL含有适当抗生素的Miller′s LB用0.5mL的18hr培养物接种。在37℃和摇动(250rpm)条件下培养细胞直至光密度(OD600)达到0.5。加入1M的IPTG溶液直到最终浓度为1mM并继续培养3小时。通过以7,000rpm的转速离心分离20分钟采集细胞。测量细胞的湿重，并且将细胞球冷冻并存储在-70℃下。此方法可以按比例放大到500mL。 
将非重组细胞列(大肠杆菌和恶臭假单胞菌5B(NRRL-18668))从不含抗生素的LB琼脂上的单一菌落转移到50mL的Miller′s LB中。在37℃和摇动(250rpm)下培养8-18小时。采集条件与重组细胞的相同。 
                          实施例8
            过酸的制备以及在pH 6.5下的检测实验
本实施例描述了制备过酸和测量所制备过酸的量的联合方法。实验在96孔微量滴定板上进行，并使用 
Figure S2006800372135D00241
平板读数器(Molecular Devices Corp.；Sunnyvale，CA)在405nm下进行分析。 
使用2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(ABTS)的氧化来测量过酸的浓度。简单来说就是，将酶催化剂与底物在过氧化氢的存在下混合，从而产生过酸。通过将过酸与ABTS混合，测定所产生的过酸的量。通过在微量滴定板中在405nm下用分光光度法测量氧化的ABTS的浓度。 
将全细胞浆液悬浮在0.1M KH2PO4缓冲液(pH 6.5)中，最终浓度范围是0.04mg/mL到4.0mg/mL细胞湿重。将100μL细胞悬浮液、30μL 0.1M的磷酸盐缓冲液(pK 6.5)、20μL 313mM的过氧化氢和50μL 200mM的底物的混合物在37℃下温育15分钟至24小时。通过从反应混合物中省去过氧化氢并用等体积的去离子水代替来制备对照样品。测试反应混合物的方法是将100μL来自离心的反应混合物的上清液与50μL 1.5M的含有0.03mg/mL碘化钾的乙酸和50μL 1mg/mL的2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(ABTS)在微量滴定板的孔中混合，室温下温育10分钟，并在405nm下测量测试混合物的吸光度。 
                      实施例9
        过酸的制备以及在pH 4.0下的检测实验
本实施例描述了制备过酸和测量所制备过酸的量的联合方法。实验在96孔微量滴定板上进行，并使用 平板读数器在405nm下进行分析。 
将全细胞浆悬浮在0.1M的醋酸钠缓冲液(pH 4.0)中，最终浓度为50mg/mL细胞湿重。将100μL细胞悬浮液，30μL 0.1M醋酸盐缓冲液(pH 4.0)，20μL 313mM过氧化氢和50μL 200mM底物的混合物在37℃温育15分钟至24小时。通过从反应混合物中省去过氧化氢并用等体积的去离子水代替来制备对照样品。检测反应混合物的方法是将100μL来自离心分离后的反应混合物的上清液与50μL 1.5M的含有0.03mg/mL碘化钾的乙酸和50μL 1mg/mL的2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(ABTS)在微量滴定板的孔中混合，室温下温育10分钟，并在405nm下测量被检测混合物的吸光度。 
                          实施例10
通过用大肠杆菌非血红素卤素过氧化物酶转化体使三乙酸甘油酯与过
            氧化氢进行过水解来制备过乙酸(pH 6.5)
按照实施例8中描述的过酸制备的分析方法，使用三乙酸甘油酯和过氧化氢检测以下大肠杆菌转化体的过水解活性。由于在这些克隆体中存在过氧化氢酶，所以必须向反应混合物中加入叠氮化钠(50mM)作为过氧化氢酶抑制剂。在引发反应大约24小时后分析样品(表1)。通过省去加入H2O2进行了每种转化体的对照试验，所有对照试验均产生0ppm的过酸。 
表1. 
  大肠杆菌细胞/质粒ID   使用三乙酸甘油酯制备的过乙  酸，单位ppm
  top10/pSW167  (Ppu5B)   3.8
  top10/pSW169  (Ppu5B)   8.4
  top10/pSW166  (AtuA1)   0.9
  top10/pSW173  (AtuA2)   6.4
  top10/pSW171  (AtuA2)   7.2
  top10/pSW170  (AtuA3)   0.8
  top10/pSW173  (AtuA2)   1.2
  BL21/pSW174  (Ppu5B)   4.6
  BL21/pSW175  (AtuA1)   4.6
  BL21/pSW176  (AtuA2)   10
  BL21/pSW177  (AtuA3)   6
  BL21/pSW178  (AtuA4)   4
  对照(没有H2O2)   0
                          实施例11
通过用大肠杆菌非血红素卤素过氧化物酶转化体使乙酸乙酯与过氧化
          氢进行过水解来制备过乙酸(pH 6.5)
按照实施例8中描述的过酸制备的分析方法，使用乙酸乙酯和过氧化氢检测以下大肠杆菌转化体的过水解活性。由于在这些克隆体中存在过氧化氢酶，所以必须向反应混合物中加入叠氮化钠(50mM)作为过氧化氢酶抑制剂。在引发反应大约24小时后分析样品(表2)。通过省去加入H2O2进行了每种转化体的对照试验，所有对照试验均产生0ppm的过酸。 
表2 
  大肠杆菌细胞/质粒ID   过乙酸  (ppm)
  top10/pSW167  (Ppu5B)   5.4
  top10/pSW169  (Ppu5B)   0.8
  top10/pSW166  (AtuA1)   0
  top10/pSW173  (AtuA2)   0
  top10/pSW171  (AtuA2)   0
  top10/pSW170  (AtuA3)   1.0
  top10/pSW172  (AtuA4)   0.8
  BL21/pSW174  (Ppu5B)   5.6
  BL21/pSW175  (AtuA1)   1
  BL21/pSW176  (AtuA2)   0
  BL21/pSW177  (AtuA3)   0
  BL21/pSW178  (AtuA4)   2
  对照(没有H2O2)   0
                          实施例12
通过用大肠杆菌非血红素卤素过氧化物酶转化体使三乙酸甘油酯与过
        氧化氢进行过水解来制备过乙酸(pH 6.5)
按照实施例8中描述的过酸制备的分析方法，使用三乙酸甘油酯和过氧化氢检测以下大肠杆菌转化体的过水解活性。大肠杆菌宿主UM2是无过氧化氢酶活性的，所以不用向反应物中加入过氧化氢酶抑制剂。在引发反应大约30分钟后分析样品(表3)。通过省去加入H2O2 进行了每种转化体的对照试验，所有对照试验均产生0ppm的过酸。 
表3 
  大肠杆菌细胞/质粒ID   过乙酸  (ppm)
  UM2/pSW166  (AtuA1)   4.3
  UM2/pSW167  (Ppu5B)   2.3
  对照(没有H2O2)   0
                          实施例13
通过用大肠杆菌非血红素卤素过氧化物酶转化体使乙酸乙酯与过氧化
              氢进行过水解来制备过乙酸(pH 6.5)
按照实施例8中描述的过酸制备的分析方法，使用乙酸乙酯和过氧化氢检测以下大肠杆菌转化体的过水解活性。大肠杆菌宿主UM2是无过氧化氢酶活性的，所以不用向反应物中加入过氧化氢酶抑制剂。在引发反应大约30分钟后分析样品(表4)。通过省去加入H2O2进行了每种转化体的对照试验，所有对照试验均产生0ppm的过酸。 
表4 
  大肠杆菌细胞/质粒ID   过乙酸  (ppm)
  UM2/pSW166  (AtuA1)   0.78
  UM2/pSW167  (Ppu5B)   3.6
  对照(没有H2O2)   0
                          实施例14
通过用大肠杆菌非血红素卤素过氧化物酶转化体使乳酸乙酯与过氧化
              氢进行过水解来制备过乳酸(pH 6.5)
按照实施例8中描述的过酸制备的分析方法，使用乳酸乙酯和过氧化氢检测以下大肠杆菌转化体的过水解活性。大肠杆菌宿主UM2是无过氧化氢酶活性的，所以不用向反应物中加入过氧化氢酶抑制剂。在引发反应大约30分钟后分析样品(表5)。通过省去加入H2O2进行了每种转化体的对照试验，所有对照试验均产生0ppm的过酸。 
表5 
  大肠杆菌细胞/质粒ID   过乳酸  (ppm)
  UM2/pSW166  (AtuA1)   0.78
  UM2/pSW167  (Ppu5B)   3.0
  对照(没有H2O2)   0
                          实施例15
通过用大肠杆菌非血红素卤素过氧化物酶转化体使三乙酸甘油酯与过
            氧化氢进行过水解来制备过乙酸(pH 4.0)
按照实施例9中描述的过酸制备的分析方法，使用三乙酸甘油酯 和过氧化氢检测以下大肠杆菌转化体的过水解活性。大肠杆菌宿主UM2是无过氧化氢酶活性的，所以不用向反应物中加入过氧化氢酶抑制剂。在引发反应大约30分钟后分析样品(表6)。通过省去加入H2O2 进行了每种转化体的对照试验，所有对照试验均产生0ppm的过酸。 
表6. 
  大肠杆菌细胞/质粒ID   过乙酸  (ppm)
  UM2/pSW166  (AtuA1)   1.6
  UM2/pSW167  (Ppu5B)   0.75
  对照(没有H2O2)   0
                           实施例16
通过用大肠杆菌非血红素卤素过氧化物酶转化体使乙酸乙酯与过氧化
      氢进行过水解来制备过乙酸(pH 4.0)
按照实施例9中描述的过酸制备的分析方法，使用乙酸乙酯和过氧化氢检测以下大肠杆菌转化体的过水解活性。大肠杆菌宿主UM2是无过氧化氢酶活性的，所以不用向反应物中加入过氧化氢酶抑制剂。在引发反应大约30分钟后分析样品(表7)。通过省去加入H2O2进行了每种转化体的对照试验，所有对照试验均产生0ppm的过酸。 
表7. 
  大肠杆菌细胞/质粒ID   过乙酸  (ppm)
  UM2/pSW166  (AtuA1)   1.3
  UM2/pSW167  (Ppu5B)   0.66
  对照(没有H2O2)   0
                          实施例17
通过用大肠杆菌非血红素卤素过氧化物酶转化体使乳酸乙酯与过氧化
              氢进行过水解来制备过乳酸(pH 4.0)
按照实施例9中描述的过酸制备的分析方法，使用乳酸乙酯和过氧化氢检测以下大肠杆菌转化体的过水解活性。大肠杆菌宿主UM2是无过氧化氢酶活性的，所以不用向反应物中加入过氧化氢酶抑制剂。在引发反应大约30分钟后分析样品(表8)。通过省去加入H2O2进行了每种转化体的对照试验，所有对照试验均产生0ppm的过酸。 
表6. 
  大肠杆菌细胞/质粒ID   过乳酸  (ppm)
  UM2/pSW166  (AtuA1)   1.5
  UM2/pSW167  (Ppu5B)   0.68
  对照(没有H2O2)   0
                          实施例18
通过用恶臭假单胞菌5B非血红素卤素过氧化物酶使三乙酸甘油酯与过
            氧化氢进行过水解来制备过乙酸(pH 6.5)
按照实施例8中描述的过酸制备的分析方法，使用三乙酸甘油酯和过氧化氢检测恶臭假单胞菌5B的过水解活性。在反应混合物中使用大约10mM的羟胺硫酸盐作为过氧化氢酶活性抑制剂。在引发反应大约30分钟后分析样品，制得3.7ppm的过乙酸。 
                          实施例19
通过用恶臭假单胞菌5B非血红素卤素过氧化物酶使乙酸乙酯与过氧化
              氢进行过水解来制备过乙酸(pH 6.5)
按照实施例8中描述的过酸制备的分析方法，使用乙酸乙酯和过氧化氢检测恶臭假单胞菌5B的过水解活性。在反应混合物中使用大约10mM的羟胺硫酸盐作为过氧化氢酶活性抑制剂。在引发反应大约30 分钟后分析样品，制得2.0ppm的过乙酸。 
                          实施例20
通过用恶臭假单胞菌5B非血红素卤素过氧化物酶使乳酸乙酯与过氧化
             氢进行过水解来制备过乳乙酸(pH 6.5)
按照实施例8中描述的过酸制备的分析方法，使用乳酸乙酯和过氧化氢检测恶臭假单胞菌5B的过水解活性。在反应混合物中使用大约10mM的羟胺硫酸盐作为过氧化氢酶活性抑制剂。在引发反应大约30分钟后分析样品，制得3.2ppm的过乳酸。 
Figure IYZ000003985495600011
Figure IYZ000003985495600031
Figure IYZ000003985495600051
Figure IYZ000003985495600061
Figure IYZ000003985495600071
Figure IYZ000003985495600081
Figure IYZ000003985495600091
Figure IYZ000003985495600101
Figure IYZ000003985495600111
Figure IYZ000003985495600121
Figure IYZ000003985495600131
Figure IYZ000003985495600141
Figure IYZ000003985495600151
Figure IYZ000003985495600161
Figure IYZ000003985495600171
Figure IYZ000003985495600181
Figure IYZ000003985495600191
Figure IYZ000003985495600221
Figure IYZ000003985495600231
Figure IYZ000003985495600241
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Claims (7)

1.由羧酸酯底物制备过酸的方法，所述方法包括
a)提供一组过酸反应组分，所述组分包括：
1)羧酸酯底物，其选自：
i)具有以下结构的酯
Figure FSB00000387754900011
其中R1＝C1到C10的直链或支链烷基，所述烷基任选地被羟基或C1到C4的烷氧基取代，并且R2＝C1到C10的直链或支链烷基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH，并且n＝1到10；和
ii)具有以下结构的甘油酯
Figure FSB00000387754900012
其中R1＝C1到C10的直链或支链烷基，所述烷基任选地被羟基或C1到C4的烷氧基取代，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；和
2)过氧源；和
3)具有过水解活性的非血红素卤素过氧化物酶催化剂，所述非血红素卤素过氧化物酶催化剂由分离的核酸分子编码，所述核酸分子编码选自SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：28的氨基酸序列；和
b)在含水反应条件下使所述反应组分合并，其中所述条件包括2到7.5的pH范围，借此在反应组分合并5分钟到2小时的时间内制备得到过酸，所述过酸的浓度至少为500ppb。
2.如权利要求1所述的方法，其中pH小于6.5。
3.如权利要求2所述的方法，其中pH范围小于4.5。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述酯底物选自乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯以及他们的混合物。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述甘油酯选自单乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、单丙酸甘油酯、二丙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、一丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯和他们的混合物。
6.如权利要求4所述的方法，其中所制备的过酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、甲氧基过乙酸、过-β-羟基丁酸以及他们的混合物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所制备的过酸是过乙酸。
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