DE69816090T2

DE69816090T2 - Antimikrobielle zusammensetzung, die haloperoxidase und quellen für wasserstoffperoxid, halogenid und ammoniak enthält

Info

Publication number: DE69816090T2
Application number: DE69816090T
Authority: DE
Inventors: Charlotte Johansen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-08-12
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2018-08-13
Also published as: CN1265561A; EP1003376B1; AU8623198A; US6251386B1; DE69816090D1; US20010009664A1; JP2001515017A; BR9811156A; CA2298788A1; EP1003376A1; WO1999008531A1; ID23661A; US6818212B2; ATE243938T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine sehr wirksame enzymatische Zusammensetzung, die Mikrobenzellen oder Mikroorganismen, insbesondere Mikrobenzellen oder Mikroorganismen, die in Wäsche, auf harten Oberflächen, in Wassersystemen, auf der Haut, auf Zähnen oder Schleimhäuten vorliegen, abtöten oder hemmen und Nahrungsmittelprodukte, Kosmetika, Farben, Beschichtungen usw. konservieren können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verschiedene enzymatische, antimikrobielle Zusammensetzungen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel offenbart WO 94/04127 stabilisierte Zahnpastazusammensetzungen, die antimikrobiell wirksame Konzentrationen von Hypothiocyanitionen erzeugen können. Die Zusammensetzungen enthalten eine Oxidoreduktase, die Wasserstoffperoxid und ein Peroxidaseenzym erzeugen kann, wodurch gewöhnlich im Speichel vorliegende Thiocyanationen zu Hypothiocyanitionen oxidiert werden können. Geeignete Peroxidasen schließen Lactoperoxidase, Myeloperoxidase, Speichelperoxidase und Chlorperoxidase ein.
In EP-A-0 500 387 sind enzymatische, antimikrobielle Zusammensetzungen offenbart, die eine Haloperoxidase, z. B. Myeloperoxidase, eosinophile Oxidase, Lactoperoxidase und Chlorperoxidase umfassen, die sich in Gegenwart von Pero xid und Halogenid selektiv an die Mikroorganismen binden und deren Wachstum hemmen.
WO 95/27046 offenbart eine antimikrobielle Zusammensetzung, die eine Vanadiumchlorperoxidase, Halogenidionen und Wasserstoffperoxid oder ein Wasserstoffperoxid-bildendes Mittel umfasst.
WO 96/38548 offenbart eine antimikrobielle Zusammensetzung, die eine Haloperoxidase, ein Halogenidion, ein Peroxid-bildendes Mittel und eine Aminosäureart umfasst.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Zusammensetzung zum Abtöten oder Hemmen von Mikrobenzellen, d. h. zur Desinfektion oder Konservierung bereitzustellen, die leicht zu verwenden und eine wirksame Alternative zu bekannten Desinfektions- und Konservierungszusammensetzungen und -verfahren ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Überraschend wurde gefunden, dass die vereinte Wirkung einer Haloperoxidase, einer Wasserstoffperoxidquelle, einer Halogenidquelle und einer Ammoniumquelle zu einer bisher unbekannten synergistischen, antimikrobiellen Wirkung führt.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung auf der Basis dieser Funde einen ersten Aspekt bereit, in welchem die enzymatische, antimikrobielle Zusammensetzung eine Haloperoxidase, eine Wasserstoffperoxidquelle, eine Halogenidquelle und eine Ammoniumquelle umfasst, wobei die Zusammensetzung zu einer bisher unbekannten synergistischen, antimikrobiellen Wirkung führt.
Die Zusammensetzung der Erfindung ist als antimikrobieller Zusatzstoff nützlich, wo immer ein Zusatzstoff, z. B. zur Konservierung für Nahrungsmittel, Getränke, Kosmetika, Deodorants, Kontaktlinsenprodukte, Nahrungsmittelzusätze oder Enzymzusammensetzungen; als Desinfektionsmittel zur Verwendung z. B. auf Haut, Haar, Mundhöhle Schleimhäuten, Wunden, Verletzungen oder im Auge von Mensch und Tier; zum Abtöten von Mikrobenzellen in Wäsche und zum Einbringen in Reinigungszusammensetzungen oder Desinfektionsmittel zur Reinigung von harten Oberflächen, zur Wasserbehandlung oder zur Desinfektion benötigt wird.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung in weiteren Aspekten ein Verfahren zum Hemmen von in Wäsche vorliegenden Mikroorganismen, wobei die Wäsche mit einer diese Zusammensetzung umfassenden Einweich-, Wasch oder Spüllösung behandelt wird; ein Verfahren zum Hemmen von Mikrobenwachstum auf einer harten Oberfläche, wobei die Oberfläche mit dieser Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird; ein Verfahren zum Hemmen von in Industriewasserleitungen vorliegenden Mikrobenzellen und ein Verfahren zum Abtöten von Mikrobenzellen, die auf Haut, Haar, Mundhöhle Schleimhäuten, Wunden, Verletzungen oder im Auge von Mensch und Tier vorliegen oder zum Hemmen des Wachstums davon, wobei die abzutötenden oder zu hemmenden Zellen auf der Haut, Schleimhaut, den Zähnen, der Wunde oder Verletzung mit dieser Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird, bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme der beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht, in welchen
1 eine Kalibrierungskurve für den Wachstum von Pseudomonas aeruginosa ATCC 10146 in TSB bei 25°C, siehe Beispiel 1, zeigt,
2 ein Diagramm einer ansprechenden Oberfläche für die antibakterielle Aktivität gegenüber Staphylococcus epidermidis bei Zugabe von Natriumchlorid und/oder Ammonium zu dem Reaktionsmedium, siehe Beispiel 1, zeigt,
3 die bakterizide Aktivität der Curvularia-Haloperoxidase, kombiniert mit Iodid und Ammoniumsulfat (_: KI und NH₄)₂SO₄; ---: KI, siehe Beispiel 2, zeigt,
4 die bakterizide Aktivität der Curvularia-Haloperoxidase, kombiniert mit Bromid und Ammoniumsulfat (_: KBr und NH₄)₂SO₄; ---: KBr), siehe Beispiel 2, zeigt,
5 die bakterizide Aktivität der Curvularia-Haloperoxidase (rCvP), kombiniert mit Chlorid und Ethanolamin, siehe Beispiel 4, zeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „antimikrobiell" bedeuten, dass eine bakterizide und/oder bakteriostatische und/oder fungizide und/oder fungistatische Wirkung und/oder eine viruzide Wirkung besteht, wobei
der Begriff „bakterizid" als die Fähigkeit zum Abtöten von Bakterienzellen verstanden werden soll,
der Begriff „bakteriostatisch" als die Fähigkeit des Hemmens von Bakterienwachstum, d. h. als Wachstumshemmung von Bakterienzellen verstanden werden soll,
der Begriff „fungizid" als die Fähigkeit zum Abtöten von Pilzzellen verstanden werden soll,
der Begriff „fungiostatisch" als die Fähigkeit des Hemmens von Pilzwachstum, d. h. als Wachstumshemmung von Pilzzellen verstanden werden soll,
der Begriff „viruzid" als die Fähigkeit zum Inaktivieren eines Virus verstanden werden soll.
Der Begriff „Mikrobenzellen" bedeutet Bakterien- oder Pilzzellen, und der Begriff „Mikroorganismus" bedeutet einen Pilz (einschließlich Hefen) oder ein Bakterium.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „den Wachstum von Mikrobenzellen hemmend" bedeuten, dass die Zellen in nicht wachsendem Zustand vorliegen, d. h. dass sie sich nicht vermehren können.
Der Begriff „harte Oberfläche" bedeutet wie hier verwendet eine beliebige Oberfläche, die für Mikroorganismen im Wesentlichen nicht durchlässig ist. Beispiele für harte Oberflächen sind Oberflächen, die aus Metall, z. B. Edelstahl, Kunststoffen, Kautschuk, Pappe, Glas, Holz, Papier, Stoff, Beton, Stein, Marmor, Gips und Keramikmaterialien hergestellt sind, die gegebenenfalls z. B. mit Farbe, Email und dgl. beschichtet sein können. Die harte Oberfläche kann auch eine Prozessausrüstung, z. B. ein Kondensationsturm, eine osmotische Membran, eine Wasserbehandlungsanlage, eine Molkerei, eine nahrungsmittelbearbeitende Anlage, eine chemische oder pharmazeutische Prozessanlage sein. Demzufolge ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einem herkömmlichen Vor-Ort-Reinigungs-System („cleaning-in-place system"; C-I-P) nützlich.
Haloperoxidase
Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll der Begriff „Haloperoxidase" ein Enzym bedeuten, das aus der Gruppe, bestehend aus Chloridperoxidase (EC 1.11.1.10), Bromidperoxidase und Iodidperoxidase (EC 1.11.1.8) ausgewählt ist.
Eine Chloridperoxidase ist ein Enzym, das Chlorid-, Bromid- und Iodidionen unter Verbrauch von H₂O₂ oxidieren kann.
Eine Bromidperoxidase ist ein Enzym, das Bromid- und Iodidionen unter Verbrauch von H₂O₂ oxidieren kann.
Eine Iodidperoxidase ist ein Enzym, das Iodidionen unter Verbrauch von H₂O₂ oxidieren kann.
Erfindungsgemäß werden Vanadiumhaloperoxidasen bevorzugt. Vanadiumperoxidasen unterscheiden sich von anderen Haloperoxidasen dahingehend, dass die prosthetische Gruppe in diesen Enzymen Strukturmerkmale aufweisen, die ähnlich zu Vandat (Vanadium V) sind, wohingegen die anderen Haloperoxidasen Hemeperoxidasen sind. Die in WO 95/27046 offenbarten Vanadiumhaloperoxidasen werden bevorzugt.
Haloperoxidasen bilden eine Klasse von Enzymen, die Halogenide (X = Cl^–, Br^– oder I^–) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid zu den entsprechenden unterhalogenierten Säuren (HOX), gemäß H₂O₂ + X^– + H⁺ → H₂O + HOX oxidieren können.
Liegt eine geeignete nukleophile Verbindung vor, erfolgt eine Reaktion mit HOX, die eine antimikrobielle Wirkung zeigt.
Haloperoxidasen wurden aus verschiedenen Organismen isoliert: Säugern, Seetieren, Pflanzen, Algen, einer Flechte, Pilzen und Bakterien (als Querverweis siehe Biochimica et Biophysica Acta 1161, 1993, S. 249–256). Es ist allgemein anerkannt, dass Haloperoxidasen die Enzyme sind, die für die Bildung von halogenierten Verbindungen in der Natur verantwortlich sind, obwohl andere Enzyme beteiligt sein können.
Haloproxidasen wurden aus vielen verschiedenen Pilzen, insbesondere aus der Pilzgruppe Dematia-Hyphomyceten, wie Caldariomyces, z. B. C. fumago, Alternaria, Curvularia, z. B. C. verruculosa und C. inaequalis, Drechslera, Ulocladium und Botrytis isoliert (siehe U.S.-Patent Nr. 4,937,192).
Erfindungsgemäß wird eine Haloperoxidase, die von Curvularia, insbesondere C. verruculosa wie C. verruculosa CBS 147.63 oder C. verruculosa CBS 444.70 erhältlich ist, bevorzugt. Curvulolaria-Haloperoxidase und die rekombinante Herstellung davon sind in WO 97/04102 beschrieben.
Haloperoxidase wurde auch als Bakterien wie Pseudomonas, z. B. P. pyrrocinia (siehe z. B. The Journal of Biological Chemistry 263, 1988, S. 13725–13732) und Streptomyces, z. B. S. aureofaciens (siehe z. B. Structural Biology 1, 1994 S. 532-537) isoliert.
Bromidperoxidasen wurden aus Algen isoliert (siehe U.S.-Patent Nr. 4,937,192).
Bei der Verwendung kann die Konzentration der Haloperoxidase variiert werden, um die gewünschte antimikrobielle Wirkung im gewünschten Zeitrahmen zu erzielen. Jedoch wird die Haloperoxidase erfindungsgemäß gewöhnlich in einer Konzentration von 0,01–100 mg Enzymprotein pro Liter, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,05–50 mg Enzymprotein pro Liter, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,5–10 mg Enzymprotein pro Liter zugesetzt.
Wasserstoffperoxidquellen
Erfindungsgemäß kann das für die Reaktion mit der Haloperoxidase benötigte Wasserstoffperoxid auf verschiedene Wege erzielt werden: Es kann sich hierbei um Wasserstoffperoxid oder eine Waserstoffperoxidvorstufe, wie z. B. Percarbonat oder Perborat oder eine Peroxycarbonsäure oder ein Salz davon handeln, oder es kann sich hierbei um ein Wasserstoffperoxid-bildendes Enzymsystem, wie z. B. eine Oxidase oder deren Substrat handeln. Nützliche Oxidasen können z. B. eine Glucoseoxidase, eine Glyceroloxidase oder eine Aminosäureoxidase sein. Ein Beispiel für eine Aminosäureoxidase ist in WO 94/25574 angegeben.
Es kann vorteilhaft sein, enzymatisch gebildetes Wasserstoffperoxid zu verwenden, da diese Quelle unter den biologisch maßgeblichen Bedingungen zu einer relativ geringen Wasserstoffperoxidkonzentration führt. Geringe Wasserstoffperoxidkonzentrationen führen zu einer Geschwindigkeitszunahme der Haloperoxidase-katalysierten Reaktion.
Erfindungsgemäß kann die für die Reaktion mit der Haloperoxidase benötigte Wasserstoffperoxidquelle in einer Konzentration zugesetzt werden, die einer Wasserstoffperoxidkonzentration im Bereich von 0,01–1000 mM, vorzugsweise im Bereich von 0,1–100 mM entspricht.
Halogenidquellen
Erfindungsgemäß kann die für die Reaktion mit der Haloperoxidase benötigte Halogenidquelle auf vielen verschiedenen Wegen, z. B. durch Zugabe eines Halo genidsalzes erzielt werden: Es kann sich hierbei um Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumbromid, Kaliumbromid, Natriumiodid oder Kaliumiodid handeln.
Die Konzentration der Halogenidquelle entspricht typischerweise 0,01–1000 mM und liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05–500 mM.
Ammoniumquellen
Bei Zugabe einer Ammoniumquelle zu der antimikrobiellen Zusammensetzung (Haloperoxidase, Wasserstoffperoxid, Halogenid), werden Halogenidamine gebildet, die eine 100%ige bakterizide Aktivität des Enzymsystems bewirken.
Wir beobachteten folglich, dass eine synergistische Wirkung zwischen dem Halogenid und der in der Zusammensetzung vorliegenden Ammoniumquelle besteht (siehe Beispiel 1,2 und 4).
Bei der verwendeten Ammoniumquelle kann es sich um Verbindungen der Formel
handeln, wobei die Substituentengruppen R1 und R2, die gleich oder unterschiedlich sein können, unabhängig voneinander beliebige der folgenden Reste darstellen: Wasserstoff, Halogenid, Sulfat, Phenyl, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen oder eine substituierte geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen, wobei die Substituentengruppe an C₃-C₁₈ lokalisiert ist und einen beliebigen der folgenden Reste darstellt: Hydroxy, Halogen, Formyl, Carboxy und Ester und Salze hiervon, Carba moyl, Sulfo und Ester und Salze hiervon, Sulfamoyl, Nitro, Amino, Phenyl, C₁-C₅-Alkoxy, Carbonyl-C₁-C₅-alkyl, Aryl-C₁-C₅-alkyl.
Wie hier verwendet, können die Ammoniumverbindungen in ihrer kationischen Form vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist R1 Wasserstoff.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist R1 Wasserstoff und R2 ein Alkohol (Aminoalkohol), z. B. Ethanolamin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Ammoniumquelle ein Ammoniumsalz, z. B. ein beliebiges, auf dem Fachgebiet bekanntes Ammoniumsalz, z. B. Diammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumbromid oder Ammoniumiodid.
Erfindungsgemäß kann die für die Reaktion mit der Haloperoxidase benötigte Ammoniumquelle in einer Konzentration zugesetzt werden, die einer Ammoniumkonzentration im Bereich von 0,01–1000 mM, vorzugsweise im Bereich von 0,05–500 mM entspricht.
Die Zusammensetzung
Die Zusammensetzung, die die Haloperoxidase, die Wasserstoffperoxidquelle, die Halogenidquelle und die Ammoniumquelle umfasst, kann als Feststoff oder Flüssigkeit formuliert werden.
Wird sie als Feststoff formuliert, können alle Bestandteile z. B. als Pulver, Granulat oder geliertes Produkt miteinander vermischt werden.
Werden andere Zusammensetzungen als diejenigen in trockener Form und nur in dem Fall verwendet, wird es bevorzugt, ein zweiteiliges Formulierungssystem zu verwenden, in welchem das Wasserstoffperoxid von den anderen Bestandteilen getrennt ist.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann ferner Hilfsstoffe wie Netzmittel, Verdickungsmittel, Puffer, Stabilisatoren, Parfum, Farbmittel, Füllstoffe und dgl. umfassen.
Nützliche Netzmittel sind oberflächenaktive Mittel, d. h. nichtionische, anionische, amphoterische oder zwitterionische oberflächenaktive Mittel.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann ein Konzentratprodukt oder Fertigprodukt sein. Bei der Verwendung wird das Konzentratprodukt typischerweise mit Wasser verdünnt, um ein Medium mit wirksamer antimikrobieller Aktivität, das auf den zu desinfizierenden oder zu konservierenden Gegenstand aufgetragen wird, wonach man es mit den vorliegenden Mikroorganismen reagieren lässt, bereitzustellen.
Der optimale pH-Wert ist gewöhnlich ein Kompromiss zwischen optimaler Stabilität und optimaler Aktivität der fraglichen Haloperoxidase. Jedoch kann die Erfindung vorteilhafterweise bei einem relativ hohen pH-Wert durchgeführt werden, da angenommen wird, dass die bakteriziden Aktivitäten bei hohen pH-Werten optimal sind.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann auch als zweiteiliges System formuliert werden, in welchem es sich bei einem Teil um die Haloperoxidase und die Ammoniumquelle und bei dem anderen Teil um die Wasserstoffperoxidquelle handelt, wobei die Halogenidquelle dann aus Leitungswasser erhalten wird oder auf andere Weise natürlich vorliegt.
Verwendungen
Die Zusammensetzung der Erfindung kann in eine Detergens- oder Reinigungszusammensetzung eingebracht werden, die mehrere in Detergens- oder Reinigungszusammensetzungen nützliche Enzymarten, vorzugsweise mindestens ein weiteres Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Carbohydrasen, Amylasen, Cutinasen, Peroxidasen, Oxidasen, Laccasen, Cellulasen, Xylanasen und Lipasen, umfasst.
Bei Verwendung zur Konservierung für Nahrungsmittel, Getränke, Kosmetika wie Lotionen, Cremes, Gels, Salben, Seifen, Shampoos, Weichspülern, Antischweißmittel, Deodorants, Mundwasser, Kontaktlinsenprodukte, Enzymformulierungen oder Nahrungsmittelzusätze kann die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete Zusammensetzung z. B. in die nicht konservierten Nahrungsmittel, Getränke, Kosmetika, Kontaktlinsenprodukte, Nahrungsmittelzusätze oder entzündungshemmenden Mittel in einer zum Abtöten oder Wachstumshemmen von Mikrobenzellen wirksamen Menge eingebracht werden.
Folglich kann die im Verfahren der Erfindung verwendete Zusammensetzung als Desinfektionsmittel, z. B. bei der Behandlung von Akne, Infektionen der Augen oder im Mund, Hautinfektionen, in Antischweißmitteln oder Deodorants, in Fußbadsalzen, zur Reinigung und Desinfektion von Kontaktlinsen, harten Oberflächen, Zähnen (Mundhygiene), Wunden, Verletzungen und dgl. nützlich sein.
Im Allgemeinen wird erwogen, dass die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Reinigung, Desinfektion oder Hemmung von Mikrobenwachstum auf einer harten Oberfläche nützlich ist Beispiele für Oberflächen, die mit der Zusammensetzung der Erfindung vorteilhaft in Kontakt gebracht werden können, sind Oberflächen von verwendeten Prozessausrüstungen, z. B. Molkereien, chemischen oder pharmazeutischen Prozessanlagen, Wassersanitärsystemen, Anlagen zur Papierzellstoffverarbeitung, Wasserbehandlungsanlagen und Kondensations türmen. Die Zusammensetzung der Erfindung sollte in einer Menge verwendet werden, die zur Reinigung, Desinfektion oder Hemmung von Mikrobenwachstum auf der fraglichen Oberfläche wirksam ist.
Ferner wird erwogen, dass die Zusammensetzung der Erfindung vorteilhaft in einem Vor-Ort-System (C-I-P) zur Reinigung einer Prozessausrüstung von beliebiger Art verwendet werden kann.
Das Verfahren der Erfindung kann zudem zur Reinigung von Oberflächen und Kochutensilien in Anlagen zur Nahrungsmittelbearbeitung und in einem beliebigen Bereich, in welchem Nahrungsmittel hergestellt oder serviert werden, wie in Krankenhäusern, Schwesternheimen, Restaurants, insbesondere Fast-Food-Restaurants, Feinkostgeschäften und dgl. verwendet werden. Es kann auch als antimikrobielles Mittel in Nahrungsmittelprodukten verwendet werden und wäre als antimikrobielles Mittel für Oberflächen von Käsesorten, Früchten und Gemüse und Nahrungsmitteln auf Salatbars nützlich.
Es kann auch als Konservierungsmittel oder Desinfektionsmittel in Farben auf Wasserbasis verwendet werden.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist auch zur Mikrobenbekämpfung in Wasserleitungen und zur Desinfektion von Wasser, insbesondere zur Desinfektion von Industriewasser nützlich.
Die vorliegende Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen veranschaulicht.
BEISPIEL 1
Antibakterielle Aktivität von Haloperoxidase gegenüber P. aeruginosa und S. epidermidis Die antibakterielle Aktivität von rekombinanter Peroxidase von Curvularia verruculosa (rCvP), wie in WO 97/04102 hergestellt, erhältlich von Novo Nordisk A/S, DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark, wurde mit den folgenden Verstärkungsmitteln, Natriumchlorid und Diammoniumsulfat, getestet.
Die antibakterielle Aktivität einer Haloperoxidase wurde in MES-Puffer (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) (pH 6,0) gegenüber Pseudomonas aeruginosa ATCC 10146 und Staphylococcus epidermidis DSM 20 042 mit Natriumchlorid als Elektronendonor und unter Zugabe von Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor in Gegenwart von NH₄ ⁺ getestet. Die Zellen (etwa 10⁶ cfu/ml) wurden mit dem Enzym 15 Min. bei 40°C inkubiert.
Die bakterizide Aktivität wurde durch Inkubation in Malthus bestimmt. Die durch das Malthus-Gerät gemessene Nachweiszeit wurde durch eine Kalibrierungskurve in cfu/ml umgewandelt.
Entweder direkte oder indirekte Malthus-Messungen wurden beim Zählen der gesamten überlebenden Zellen verwendet (Malthus Flexi M2060, Malthus Instrument Limited). Durch die direkten Messungen wurde der Zellstoffwechsel durch Leitfähigkeitsmessungen im Wachstumssubstrat bestimmt. Bei den indirekten Messungen wurden 3 ml Wachstumsmedium in die Außenkammer der indirekten Malthus-Zellen und 0,5 ml sterile KOH (0,1 M) in die Innenkammer überführt. Die Zellsuspensionen wurden nach Enzymbehandlung in die Außenkammer der Malthus-Zelle überführt. Beim Wachsen der Zellen in der Außenkammer erzeugten sie CO₂, das sich in der KOH in der Innenkammer löste, womit die Leitfähigkeit der KOH geändert wurde. Die Menge an durch die atmenden, die Enzymbehandlung überlebenden Zellen wurde zum Schätzen der Anzahl von lebensfähigen Zellen verwendet.
Ist die Leitfähigkeitsänderung durch das Malthus messbar, wird eine Nachweiszeit (dt) aufgezeichnet. Die dts wurden in Koloniezählungen unter Verwendung einer Kalibrierungskurve in Bezug auf cfu/ml zu dt (1) umgewandelt.
Die antibakterielle Aktivität einer Haloperoxidase (1 mg/l) mit NaCl wurde bei pH 6 bei NaCl-Konzentrationen über 20 mM beobachtet, wobei die antibakterielle Aktivität mit zunehmenden NaCl-Konzentrationen anstieg, jedoch bei etwa 100 mM ein Scheitelpunkt erreicht wurde (abhängig vom pH-Wert, der Temperatur, den Teststämmen usw.). Wasserstoffperoxid wurde zu der Endkonzentration von 0,5 mM zugesetzt. Die Verwendung von 200 mM NaCl als Elektronendonor führte zu einer Reduzierung von lebenden Zellen (beider Stämme) von 10⁶ cfu/ml auf etwa 10³ cfu/ml.
Eine deutliche synergistische Wirkung wurde zwischen NaCl und (NH₄)₂SO₄ beobachtet. Die Kombination von NaCl und (NH₄)₂SO₄ führte zu einer 100% tödlichen Aktivität gegenüber beiden Stämmen (Ab. 2) bei einer Konzentration von etwa 3 mM NH₄ ⁺.
BEISPIEL 2
Antibakterielle Aktivität von rekombinanter Haloperoxidase von Curvularia verruculosa unter Verwendung von verschiedenen Verstärkungsmitteln
Die antibakterielle Aktivität einer Haloperoxidase (1 mg/l) wurde in MES-Puffer (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) (pH 6,0 gegenüber Staphylococcus epidermidis DSM 20 042 mit Kaliumiodid und Kaliumbromid als Elektronendonor und unter Zugabe von Wasserstoffperoxid (auf eine Endkonzentration von 0,5 mM) als Elektronenakzeptor in Gegenwart von NH₄ ⁺ getestet. Die Zellen (etwa 10⁶ cfu/ml) wurden mit dem Enzym 15 Min. bei 40°C inkubiert. Die bakterizide Aktivität wurde durch Inkubation in Malthus bestimmt (siehe Beispiel 1).
Eine 100%ige antibakterielle Aktivität der mit Iodid vereinigten Haloperoxidase wurde bei einer Iodidkonzentration von etwa 0,2 mM bestimmt. Wurde Ammonium zugesetzt, wurde eine 100%ige bakterizide Aktivität schon bei einer Konzentration von etwa 0,05–0,1 mM Iodid bestimmt (3).
Eine hohe Bromidkonzentration (> 10 mM) wurde für eine 100%ige bakterizide Aktivität benötigt, jedoch führte die Kombination von Bromid und Ammoniumionen bei einer Bromidkonzentration von über 2,5 mM zu einer 100%igen bakteriziden Aktivität (4).
BEISPIEL 3
Antibakterielle Aktivität von rekombinanter Haloperoxidase von Curvularia verruculosa unter Verwendung von Ammoniumhalogeniden als Elektronendonoren
Die antibakterielle Aktivität einer Haloperoxidase (1 mg/l) wurde in MES-Puffer (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) (pH 6,0 gegenüber Staphylococcus epidermidis DSM 20 042 mit Ammoniumiodid, Ammoniumchlorid oder Ammoniumbromid als Elektronendonoren und unter Zugabe von Wasserstoffperoxid unter Erhalt einer Endkonzentration von 0,5 mM als Elektronenakzeptor getestet. Die Zellen (etwa 10⁶ cfu/ml) wurden mit dem Enzym 15 Min. bei 40°C inkubiert. Die bakterizide Aktivität wurde durch Inkubation in Malthus bestimmt (siehe Beispiel 1).
Die Konzentration an Ammoniumhalogeniden, die für die antibakterielle Aktivität nötig ist, liegt unter der Konzentration an Kalium- oder Natriumhalogeniden, die für dieselbe Aktivität nötig ist (Tabelle 1).
Tabelle 1: Bakterizide Aktivität gegenüber S. epidermidis. Der Elektronendonor wird entweder als Kalium- oder Natriumsalz oder als Ammoniumsalz zugesetzt.
Es ist aus Tabelle 1 ersichtlich, dass, wenn es sich bei den Salzen um ein Ammoniumhalogenidsalz wie Ammoniumiodid, Ammoniumchlorid oder Ammoni umbromid handelt, eine 100%ige bakterizide Aktivität möglich ist. Somit kann die Halogenid- und die Ammoniumquelle ein und dieselbe sein, jedoch liegen die optimalen Konzentrationen des Halogenids und Ammoniums mit verschiedenen Gehalten vor.
BEISPIEL 4
Synergistische, antibakterielle Aktivität von rekombinanter Haloperoxidase von Curvularia verruculosa (rCvP) unter Verwendung von Ethanolamin in Kombination mit Halogeniden Die antibakterielle Aktivität von Haloperoxidase von Curvularia verruculosa (1 mg/l) wurde in HEPES-Puffer (Sigma H3375) (pH 7,0 gegenüber Staphylococcus epidermidis DSM 20 042 mit Chlorid als Elektronendonor, kombiniert mit Ethanolamin (2,5 mM), und unter Zugabe von Wasserstoffperoxid unter Erhalt einer Endkonzentration von 0,5 mM als Elektronenakzeptor getestet. Die synergistische Wirkung wurde unter Verwendung einer Faktorbestimmung von 2⁴ gefunden. Die Zellen (etwa 10⁶ cfu/ml) wurden mit dem Enzym 15 Min. bei 40°C inkubiert. Die bakterizide Aktivität wurde durch Inkubation in Malthus bestimmt (siehe Beispiel 1).
Durch die Zugabe von Ethanol wurde die Aktivität des Enzymsystems deutlich erhöht (siehe 5). Folglich wurde bei Zugabe von Ethanolamin gegenüber Staphylococcus epidermidis eine 100%ige Abtötung erhalten, wohingegen eine Zellenreduzierung von etwa 3 log-Einheiten beobachtet wurde, als kein Ethanolamin zugesetzt wurde.

Claims

Enzymatische antimikrobielle Zusammensetzung, umfassend eine Haloperoxidase, eine Wasserstoffperoxidquelle, eine Halogenidquelle und eine Ammoniumquelle der Formel:
wobei die Substituentengruppen R1 und R2, welche gleich oder unterschiedlich sein können, unabhängig voneinander beliebigen der folgenden Reste darstellen: Wasserstoff, Halogenid, Sulfat, Phenyl, eine geradnetziges oder verzweigtes Alkyl mit von 1 bis 14 Kohlenstoffatomen, oder eine substituierte geradnetzige oder verzweigte Alkylgruppe mit von 1 bis 14 Kohlenstoffatomen, wo die Substituentengruppe an C₃-C₁₈ lokalisiert ist und einen beliebigen der folgenden Reste darstellt: Hydroxy, Halogen, Formyl, Carboxy und Ester und Salze hiervon, Carbamoyl, Sulfo und Ester und Salze hiervon, Sulfamoyl, Nitro, Amino, Phenyl, C₁-C₅-Alkoxy, Carbonyl-C₁-C₅-alkyl, Aryl-C₁-C₅-alkyl.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Haloperoxidase von Pilzen, von Bakterien oder von Algen erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Haloperoxidase von einem Pilz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Caldariomyces, Alternaria, Curvularia, Drechslera, Ulocladium und Botrytis, erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Haloperoxidase von Curvularia erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Haloperoxidase von Curvularia verruculosa erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Haloperoxidase von Curvularia verruculosa CBS 147.63 erhältlich ist, oder die Haloperoxidase immunologisch querreaktiv mit der Haloperoxidase ist, welche von Curvularia verruculosa CBS 147.63 erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Haloperoxidase von einem Bakterium, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas und Streptomyces, erhältlich ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Haloperoxidase eine Vanadiumperoxidase ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Haloperoxidase eine Chloridperoxidase oder eine Bromidperoxidase ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Wasserstoffperoxidquelle Wasserstoffperoxid oder eine Wasserstoffperoxidvorstufe oder ein Wasserstoffperoxid-erzeugendes Enzymsystem oder eine Peroxycarbonsäure oder ein Salz davon ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Halogenidquelle ein Halogenidsalz ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Halogenidquelle Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumbromid, Kaliumbromid, Natriumiodid oder Kaliumiodid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Ammoniumquelle ein Ammoniumsalz ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Ammoniumquelle Diammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumbromid oder Ammoniumiodid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Ammoniumquelle ein Aminoalkohol ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung eine wässrige Zusammensetzung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Konzentration der Haloperoxidase in dem Bereich von 0,01–100 mg Enzymprotein pro Liter beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Konzentration der Wasserstoffperoxidquelle 0,01–1.000 mM entspricht.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Konzentration der Halogenidquelle 0,01–1.000 mM entspricht.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Konzentration der Ammoniumquelle 0,01–1.000 mM entspricht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ein Granulat ist.
Verfahren zum Hemmen von Mikroorganismen, welche in Wäsche vorhanden sind, in welchem die Wäsche mit einer Einweich-, Wasch- oder Spüllösung behandelt wird, welche eine wirksame Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, in welchem die Wäsche in einer Waschmaschine behandelt wird.
Verfahren zum Konservieren eines Kosmetikproduktes, in welchem eine wirksame Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 1 in das Kosmetikprodukt eingebaut wird.
Verfahren nach Anspruch 24, in welchem das Kosmetikprodukt eine Mundwaschzusammensetzung, eine) kosmetisches) Flüssigkeit oder Gel oder Paste, eine Augenlotion, ein Antischweißmittel, ein Deodorant, ein Nasenspray, eine Augensalbe, eine Salbe oder Creme, ein Fußbadsalz ist.
Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Reinigung oder Desinfektion von Kontaktlinsen.
Verfahren zum Reinigen, Desinfizieren oder Inhibieren von Mikroben-Wachstum auf einer harten Oberfläche, in welchem die Oberfläche mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1 in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem die harte Oberfläche eine Verfahrensausrüstung, wie ein Element eines Kondensationsturmes, einer Wasserbehandlungsanlage, einer Molkerei, einer nahrungsmittelbearbeitenden Anlage, einer chemischen oder pharmazeutischen Prozessanlage ist.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem die harte Oberfläche eine Oberfläche einer Wassersanitärausrüstung („water sanitation equipment") ist.
Verfahren nach Anspruch 29, in welchem die harte Oberfläche eine Oberfläche einer Ausstattung für Papierzellstoffbearbeitung ist.
Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1 in einem Vor-On-Reinigungs-System („cleaning-in-place system") ist.
Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Desinfektion von Wassersystemen.