WO1996004262A1

WO1996004262A1 - Nouvel antibiotique et procede de production de ce dernier

Info

Publication number: WO1996004262A1
Application number: PCT/JP1995/001552
Authority: WO
Inventors: Reiji Takeda; Shigetada Hidaka; Shinobu Kobayashi; Yoshio Hayase; Mamoru Ozaki; Hiroshi Nakai
Original assignee: Shionogi & Co., Ltd.
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-08-04
Publication date: 1996-02-15
Also published as: ATE213235T1; CA2173342A1; NZ290947A; AU691642B2; ES2172591T3; EP0727420B1; DE69525439T2; AU3190795A; US5707838A; EP0727420A1; EP0727420A4; DE69525439D1

Description

明細書新規抗生物質およびその製造方法発明の詳細な説明

産業上の利用分野

本発明は、医学又は獣医学の分野にて有用な新規化合物、その製造方法及びそれを含有する医薬に関する。

従来技術

マイコプラズマは、ヒ卜のみならず豚、牛、緬羊等の家畜、鶏、七面鳥、キジ等の家禽、昆虫、及び植物に至るまで広い範囲に亙って分布しておりそれぞれの動物に対応して多くの菌種が存在する。

ヒ卜のマイコプラズマでは、肺炎や上気道炎の起炎菌として、又、最近では、マイコプラズマ感染と他の疾患、特に A I D S発症との関連が注目されている。

ブタでは流行性肺炎、鶏では呼吸器性マイコプラズマ症、伝染性滑膜炎、七面鳥では気のう炎、伝染性副鼻腔炎等をひき起こす。これらの病気は、マイコプラズマ単独ではなく、他の微生物、例えば細菌、ウィルスと協同して合併症を伴うことがある。この場合、症状は単独感染に比べて重篤となり長期化の経過をたどるため、経済的な損失は極めて大きくなる。

また、マイコプラズマは、家畜、家禽のみならず、様々な研究に用いられているマウス、ラット、モルモット等の実験小動物、組織培養細胞中の汚染にも極めて重要な位置を占めるものである。

発明が解決しょうとする課題

マイコプラズマに対する対策としては、マイコプラズマは構造的に細胞壁を欠く特徴を持つ点から、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質が主に汎用されている。しかし、マクロライド系の薬剤は長年使用されてきた事から、耐性を示す菌株が多数出現し、また、テトラサイクリン系の薬剤についても、その効果は低下してきている。

課題解決のための手段

今回、シュート"モナス *エスピー ( P seudomonas sp. ) から産生される新規物質を見いだし、それがマイコプラズマに抗感染活性を示す物質であることが判明した。つまり、本発明の新規物質はマイコプラズマ症の予防、治療の対策に極めて有望と考えられる。

本発明の化合物は式：

[式中、 Mは 2価または 3価の金属イオン、 Xは O Hまたは〇^eである] で示される。

本発明の化合物は式：

9 -

[式中、各記号は前記と同意義である]

で示される立体構造を有することができる。

Mで示される 2価または 3価の金属イオンとしては、 Zn^{2 +}、 Cu²\ Fe²~^{3 +}、 Co²⁺、 Ni²⁺、 Mn²~³\ Cd²⁺、 Mg²\ Ca²\ S T² Ba²\ V²~³\ Cr²⁺、 Al³\ Sn²\ Pb^{2 +}または Ag^{2 +}などが挙げられる。このうち、好ましくは、 Zn^{2 +}、 Cu²\ Fe²~³\ Co^{2 +}、 Ni²⁺、 Mn²~³\ Cd^{2 +}であり、 Zn²⁺、 Cu²\ Fe³*、 Co^{2 +}、 Ni^{2 +}がさらに好ましい。本明細書では、 Mが Cu²⁺である化合物を B 05 7— 2 50 A (Cu体）と、 Mが Zn²⁺である化合物を B 05 7— 250 B (Zn体）と、 Mが Fe³* である化合物を B 05 7— 25 0 C (Fe体）と、 Mが Co である化合物を B 0 5 7— 250 D (Co体）と、 Mが Ni^{2 +}である化合物を B 0 5 7 - 2 δ 0 E (Ni体）と呼称する。尚、これら 5つの化合物を総称する場合には B 05 7— 250化合物なる用語を用いる。新規 B 05 7— 25 0 化合物の理化学的性質を以下に列記する。

1 ) B 0 5 7 - 250 A (Cu体）

•分子式： C₂₇H₃₇N₃〇₄ S₃Cu

• マススペクトル（S I MS) ： m/z 62 7 (M + H) ⁺ •結晶 ·色：綠色の針状晶

•紫外部吸収スぺクトル：図 1参照

UV A^{M e 0H} _m. x (rnn) : 223, 275, 375

UVA^{M e 0H+ N a 0H}™. x (nm) : 275. 375

UV^Me0H+HC'_m" (nm) : 221, 265

- I R ^{K B r} _m. x cm"¹ : 3414, 2926. 2666, 1589 cm-¹ (図 2参照）

•施光度： [な]²³。一 1369.2±136° (c O.104%, Me OH)

•溶解性：メタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルムに可溶

水、アセトン、酢酸ェチル、 n—へキサン、ベンゼンに不溶 •呈色反応：沃素、 KMn0₄に陽性

•薄層クロマトグラフィー： Rf値は 0.34 (条件は以下の注 1) •高速液体クロマトグラフィー：保持時間は 11.6分（条件は以下の注 2)

). B057-250B (Zn体）

'分子式： C₂₇H₃₇N₃0₄ S₃Zn (X線構造解析より決定） • マススペクトル（S I MS) ： m/z 628 (M+H) ⁺

•融点： 226〜228°C (分解）

•結晶 ·色：無色菱形板状晶

•紫外部吸収スペクトル：（図 3参照）

U V A^{Me 0H} _{m a} x nm (ε)： 238 nm ( ε = 19.900) 、 264 (肩. £ = 12, 900) 、 366η"£ = 5， 530)

UV A^{M e 0H+ N i 0}"_{m a} x (nm) : 275.375nm UV^{Me0H + HC,} _mai (nm)： 221, 26 δηπι

• I R ^ΚΒ " cnr¹ _: 3430, 2963, 2658, 1648， 1590 cm-¹ (図 4参照）

• 'Η—核磁気共鳴スぺクトル及び¹³ C—核磁気共鳴スぺクトル：帰属データを以下の表 1及び化学式で表す。

•施光度： [ひ] ²⁴ D + 53.2±0.9° (c O.990%, MeOH)

B 057— 250— Bの， H及び'， C NMRケミカル:

(C D C h ( 7.5mgZ0.6ml) 中、

14.18 CH! 0.935

CH₂ 1.40

Λ 13Γ f Jc- ul

fi-i l \

1

L \Ί\ ΔΔ <Λ \ Ή R1 6.657 (d, 7.38)

/.U4U (【' A

4 ？ (d ~ 1601 o {a,

5a (t

5 33.62 (t, 126.2) 〗

5c 22.63 (【， 127.0)

5d 31.96 (t, 123.1) ^ ί .HU Π\ )

e 14 (n pa g u.yj-> (t, o.y4)

ノ

7 172.74 (s)

g 35 1 21

o

si ll CH 15101 3.940 (d, 10.39)

iQ 〗4フ ()\ 2. loo / ( ,[, l nU.oU), Z.O-jy (t-liKe, o.o ooj

19 3.068 (t, 7.56)

I q 2.351 (s)

77.2 (maybe d) 3.607 (d, E

14-OH 10.293 (br) ε

15 44.92 (s)

15a 29.04 (q, 129.7) 1.617 (s)

15b 25.41 (q. 128.8) 1.260 (s)

16 18237 (s)

17 38.19 (t₍ 147.0) 3.196 (d, 11.96), 3.763 (d, 11.96)

18 86.04 (s)

19 24.27 (q, 128.8) 1.601 (s)

20 177.12 (s)

•溶解性：メタノール、ェタノール、ジクロロメタン、クロロホルムに可溶

水、アセトン、酢酸ェチル、 n—へキサン、ベンゼンに不溶 •呈色反応：沃素、 KMn0₄に陽性、ニンヒドリン反応は陰性 •薄層クロマトグラフィー：尺£値は0.47 (条件は以下の注 1) •高速液体クロマ卜グラフィー：保持時間は 14.2分（条件は以下の注 2)

) B 057 - 250 C (Fe体）

•分子式： C_:7H₃₆N₃0₄ S₃Fe マススペクトル（S I MS) ： m/z 619 (M + H)'

構造：

•色：赤褐色のオイル状（結晶化してない）

•紫外部吸収スぺクトル：図 5参照

UV A^{Me 0H} _m. x (nm)： 218 , 239 nm

U y _A M.o_H+N. oH_{m a x (nm)} ： 219 , 239 nm

UV^Me0H+Hcl _m,_x (nm)： 221 , 242 nm

- I R ^^KBr _n., cm"¹ : 3433, 2927. 1664 cnr¹ (図 6参照）

•溶解性：メタノール、ェタノ一ル、ジクロロメタン、クロロホルムに可溶

•薄層クロマトグラフィー： Rf値は 0.65 (条件は以下の注 1) •高速液体クロマトグラフィー：保持時間は 15.7分（条件は以下の注 2)

1) 薄層クロマトグラフィー条件

薄層板：シリカゲル 60 F ₂₅₄ (メルク社製， No.5715) 展開溶媒：クロロホルム：メタノール（ 9 ： 1 , v/v)

2) 高速液体クロマトグラフィー

カラム： S TR— OD S_M, I D 4. 6題 x 2 5 0mm, 島津テクノリサーチ製

移動相：メタノール：水（7 ： 3， v/v)

検出： UV 235nm

温度： 4 0 °C

) B 05 7 - 250 D (Co体）

•外観：茶色粒状晶

•融点（て）： 25 1〜253

•分子式： C₂₇H₃₇N₃0₄ S₃Co

•マススぺクトル（S IMS) ： ni/z 623 (M + H) ⁺

• UV A^Mt0H _m,xnni ( ε ) : 202 (22, 800) 、 23 7 (25, 500)、 26 5 ( 1 8, 300)、 33 7 (5, 600) (図 7に示す）

♦ I Rン ^{ΚΒ r} _m,ズ cnr¹ : 2962、 2926、 28 1 3、 1 642、 1 589、 1 446、 1 408、 1 209、 1 08 8、 802 (図 8 に示す）

•施光度： [な] ²³。 + 28. 4 ±0. 7° ( c 0. 9 5， MeOH) '溶解性：メタノール、クロ口ホルムに可溶

水に不溶

) B 05 7 - 250 E (Ni体）

•外観：綠色菱形板状晶

•融点（°C) ： 2 8 7〜2 88

•分子式： C ₂₇H₃₇N₃'0₄S₃Ni • マススペクトル（S IMS) ： m/z 622 (M+H) +

• UV A^MeOH _maxnm (£) : 202 (21, 300) 、 235 (24.

800)、 265 (15, 600)、 370 (4.700) (図 9に示す）

• I Rレ「… ¹ : 2960、 2925、 2871、 1639、 1 593、 1445、 1405、 1206、 1091、 800 (図 1 0に示す）

•施光度： [C ²³D +197.6±4. 9° (c 0.49， MeOH) •溶解性：メタノール、クロ口ホルムに可溶

水に不溶

本発明の B 057— 250化合物はシユードモナス厲に属し、式：

[式中、 M。は Cu^{2 +}、 Zn²'、または Fe^{3 +}、Xは OHまたは◦ である] で示される化合物を産生する微生物、例えばシユードモナス ·エスピー seudomonas sp. ) No.57— 250菌株を培養し、培養物から該化合物を抽出採取し、所望により該化台物を溶液状態で 2価または 3価の金厲ィォンを含む溶液と混合することにより製造される。

本発明はさらに、このシユードモナス · エスピー No.57 - 250株に関する。本明細害では、この菌株を No.57— 250菌株と略称する。この菌株の特徴を以下に示す。

1. 靈

グラム陰性、桿菌であり、大きさは0.5〜0.6 111>< 2.0〜3.0 111 である。

1本以上の極鞭毛を有し、運動性がある。

2. 培養所見

1) 肉汁培地における培養

菌体の生育はやや遅く、わずかに黄味白色沈澱が認められた。

2) 肉汁寒天穿刺培養

穿刺線に沿って糸状の生育が認められ、培地表面に菌体が広がっていた。

ガスの発生及び色素の生成は認められなかった。

3) 肉汁寒天斜面培養

菌体の生育はやや遅い。菌体は黄味白色で鈍い光沢を有し湿っていた。隆起は偏平であった。透明度は培養初期では半透明であり、培養時間が経過するにつれて不透明となった。ガスの発生及び色素の生成は認められな力、つた。

4) 肉汁寒天平板培地上での培養

菌体の生育はやや遅い。コロニーは小型、点状、黄味白色半透明である。その後、コロニーは成長し円型、不透明な黄味白色を呈する。隆起は偏平または凸円状となる。ガス及び可溶性色素の生成は認められなかつた。 3. 生理学的及び生化学的諸性状

(1) 酸素要求性：有り

(2) 最適生育温度： 30°C (28°C, 37 °Cでは良く生育し、 10 てでは生育が遅い。また、 4°C、 41°Cでは生育しない。）

( 3 ) 最適生育 pH： pH7 (pH 5〜 8では生育した力 H 4及び P H 9では生育しない）

(4) 脱窒反応：陰性

(5) 硝酸塩の還元：陰性

(6) ォキシダーゼテス卜：陽性

(7) ゥレアーゼテスト：陽性

(8) カタラーゼテス卜：陽性（弱）

(9) ゼラチンの液化：陰性

(10) デンプンの分解：陰性

(11) メチルレツドテスト：陰性

(12) V— Pテスト：陰性

(13) インドール生成：陰性

(14) H₂ S生成：陰性 -

(15) クェン酸利用能：陽性

(クリステンセン培地，及びシモンズ培地）

(16) T ween 80の加水分解能：陽性（遅）

(17) エスクリンの加水分解能：陰性

(18) アルギニンの加水分解能：陰性

(19) リジンの脱炭酸能：陰性

(20) オル二チンの脱炭酸能：陰性 (21) /3—ガラクトシダーゼ：陰性

(22) ミルクの凝固：陰性

(23) ミルクのペプトン化：陰性

(24) 0— Fテス卜：酸化（遅）

(25) PHBの蓄積：陰性

(26) キノンの種類： Q8

(27) 蛍光色素：陰性

(28) 糖からの酸生成能

D—グルコース、 D—ガラクト一ス、 D—キンロースから酸を生成し、 D—フルクトース、マルトース、 D—マンニトール、ラクトース、シユークロース、 D—ァラビノース、 D—ソルビトール、 D—マンノース、 D— トレハロースからは酸を生成しない。

(29) 炭素源の資化能

単一の炭素源として D—グルコース、 D—ガラクトース、 D—キン口一ス、イノシトールコハク酸、乳酸を資化して菌体を形成することができる

—方、 D—フルクトース、マルトース、 D—マンニトール、ラク卜一ス、シユークロース、 D—ァラビノース、 D—ソルビトール、 D—マンノース、 D—トレハロース、ゲラニオール、いバリン、 β—了ラニン、 DL—ァルギニン、ベタイン、メタノールを資化しなかった。

1種類の炭素源を含む無機塩培地での No.57- 250菌株の生育は非常に遅く、弱いものである。

本菌は好気性のグ.ラム陰性桿菌であり、 1本以上の極鞭毛を用 L、て運動を行う。カタラーゼ微陽性であってォキシダ一ゼを有する。 0— Fテストは弱いものではあったが酸化であった。

これらの結果より見れば、本菌はシユードモナス厲に帰属すると判断される。そこで更にシユードモナス厲の種についてバージーズ ·マニュアル ' ォブ · システマティック ·バクテリオ口ジー第 1卷（Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1 ) に記載の諸性状と比較したところ、一致するもの及び近似のものを発見することはできなかった。よって本菌をシユードモナス ·エスピー No.57 - 250と命名した。

本菌株は茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 F E RM P— 14235として寄託され（受託曰：平成 6年 3月 17曰）、平成 7年 6月 22日にブダぺス卜条約に基づく国際寄託に移管された（受託番号 FERM B P— 5143) 。

一般的説明

本発明の B 057— 250化合物を製造するための手法を一般的に説明する。

1 ) 培養方法

シュ一ドモナス ·エスピー（ P seudomonas sp. ) No.57 - 2 δ 0の培養は、数種類の組成の液体培地中で実施することができる。 Β 057— 2 50化合物（Cu体、 Ζπ体、 Fe体）の産生に有用である培地には、炭素源として、例えば、グルコースが、また窒素源として、例えば、酵母ェキス、大豆粉、ファーマメディアなどが含まれる。その他に、培地の調製にあたり、炭酸カルシウム、亜鉛、銅、鉄、などの金属塩類が必要に応じて使用される。消泡剤、例えばポリプロピレングリコールは必要に応じて添加することができる。培養は通常好気的に行われ、通気攪拌培養が好適である。培養温度は微生物が発育し B 057— 250化合物（Cu体、 Zn体、 Fe体）を生産する範囲で適宜変更できるが、特に好ましいのは 23〜2 8°Cである。 pHは 7付近が好ましく、培養時間は通常 24〜48時間程度であって、 B 057— 250化台物（Cu体、 Zn体、 Fe体）が最高力価に達する時間を見計らって適当な時間に培養を終了する。

2) 抽出法

B 057— 250化合物（Cu体、 Zn体、 Fe体）を採取する方法は一般の醱酵生産物を採取する方法に準じて行えばよく、たとえば培養液を酢酸ェチルあるいはクロ口ホルム等の非親水性有機溶媒で抽出するか、あるいは培養ろ液を多孔性合成高分子樹脂（HP— 20) 等に吸着させ、メタノールあるいはアセトンで溶出し、得られた溶出液を減圧濃縮後、酢酸ェチル等の有機溶媒を加えて抽出すればよい。

得られた粗製物質は、さらに脂溶性物質の精製において通常用いられている公知の方法、例えばシリカゲル等の担体を用いるカラムクロマトグラフィ一および薄層クロマトグラフィ一あるいは分子ふるい（LH— 20等）によるカラムクロマトグラフィ一の組み合わせにより精製することができる o

得られた精製物質をさらに各種混合溶媒から析出させることにより B0 57 - 250化合物の結晶が得られる。混合溶媒系としてメタノール一水、エタノール一水、メタノール一酢酸ェチル等がある。

3) B 057— 250金厲錯体の製造

B 057-250B (Zn体）は 2価または 3価の他の金属イオンと置換して別の錯体を生成する。該 2価または 3価の金属イオンとしては、前記の Mで示される金属イオンとして例示したものと同様のものが挙げられる。

錯体の製造法としては、例えば、シユードモナス 'エスピー No.57 -250菌株の培養液から抽出 ·単離した B 057— 250 B (Zn体）のアルコール（例、メタノール、エタノールなど）溶液に、 2価または 3 価の金属塩（塩化物、硫酸塩、硝酸塩など）の水溶液を添加、攪拌した後、有機溶媒（例えば、クロ口ホルム ·塩化メチレンなど）により抽出して得ることができる。

本発明はさらに、 1つ又はそれ以上の製薬的に許容される担体と共に、本発明の B 0 5 7 - 2 5 0化合物を含有してなる医薬および動物薬を提供する。

本発明の B 0 5 7— 2 5 0化合物は、特にマイコプラズマ症の予防又は治療に有用であるので、抗マイコプラズマ剤として用いることができる。医薬として用いる場合、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与する場合、本発明化合物は通常の剤形、例えば、錠剤、散剤、.顆粒剤、カプセル剤等の固形剤：水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形として用いることができる。非経□¾与による場合、本発明化合物は、水性又は油性懸濁注射剤としてあるいは坐薬として用いることができる。いずれの場合も、その調製に際しては、慣用の賦形剤、結合剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤等の担体を必要に応じて用いることができ、また、他の添加剤、例えば保存剤、安定化剤等を含むものであってもよい。

本発明化合物の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、状態および疾患の種類によっても異なるが、通常、 1曰あたり 5 0〜 1 0 0 O nigであり、これを 1〜5回に分割して投与すればよい。

動物薬として用いる場合には、例えば、鶏、豚、牛などの家禽および家畜動物に対して、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与する場合、一般的には通常使用されている担体（例えば、脱脂米糠、脱脂大豆粉、ふすま、カオリン、タルク、炭酸カルシウム、乳糖、水など）を混合したものを投与するか、あるいはこのように混台したもの、もしくは B 0 5 7 - 2 δ 0化合物単独を動物飼料もしくは水と混台して投与する方法が好ましい。該動物飼料としては、動物の飼料として一般に使用されるものであればいずれでもよく、例えば、とうもろこし、ふすま、米、麦、綿実柏、マイ口、大豆粕、魚粉、脱脂米糠、油脂、アルフアルファ、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、ビタミン

A、ビタミン D、ビタミン E、ビタミンビタミン B₂、ビタミン B₆、ビタミン ₂、ノ、 'ントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸などのビタミン剤、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸亜鉛、ヨウ化カリゥム、硫酸コバルトなどの無機塩等が挙げられ、これらの一部または全部が混合して使用される。

B 0 δ 7- 2 δ 0化合物の飼料中の含有量は、 1日あたり 50〜 200 Ορρπιの範囲が適当である。

非経口投与する場合は、上記医薬として非経口投与する場合と同様の方法で用いることができる。

本発明化合物の投与量は、通常、経口投与の場合、動物の体重 lkg、 1 曰あたり 10〜400mg、非経口投与の場合、動物の体重 lkg、 1曰あたり 5〜20 Omgであり、これを数日間連続投与する。

図面の簡単な説明

図 1は B 057— 25 OAの紫外部吸収スぺクトルを示すグラフである _c 図 2は B 057— 25 OAの赤外部吸収スぺクトルを示すグラフである _c 図 3は B 057— 250 Bの紫外部吸収スぺクトルを示すグラフである _c 図 4は B057— 250 Bの赤外部吸収スぺクトルを示すグラフである _c 図 5は B 057— 250 Cの紫外部吸収スぺクトルを示すグラフである _c 図 6は B 057— 250 Cの赤外部吸収スぺクトルを示すグラフである _c 図 7は B 057— 250 Dの紫外部吸収スぺクトルを示すグラフである _c 図 8は B 057 - 250 Dの赤外部吸収スぺクトルを示すグラフである _c 図 9は BO 57— 250 Eの紫外部吸収スぺクトルを示すグラフである, 図 10は B057— 250 Eの赤外部吸収スぺクトルを示すグラフである o

実施例 1

A. 塑

シユードモナス ·エスピー N 0. 57— 250株 ( Pseudomonas sp. No.57-250) の寒天平板培養（を

_ - i 28°C, 2曰）から 2〜3白金耳

7

種培地 100mlを含む 50 Oral容坂ロフラスコ 2本に接種し、 28°Cで 2 日間振とう（レシプロシェーカー、 200rpmノ分）培養した。その後、 5 Lの生産培地を含む 10 L容ジャーファーメンター 2基に上記種培養液 100mlを各々接種し、 23てで 2日間撹拌培養（撹拌 40 Orpm, 空気 5LZ分）を行った。得られた醱酵液は次項 B.に記載するようにして抽出レた。

ここで使用する培地としては、寒天平板培地にはハー卜インフユ一ジョンァガーを、種培地にはハートインフュージョンブロスを、生産培地にはグルコース 1%、酵母エキス 0.5%、炭酸カルシウム 0.3%のものを、それぞれ pH 7.0に調整したものである。種培地は 121°C、 20分間で滅菌し、生産培地は 121°Cで 1時間滅菌したものを用いた。

改良培養法

次に記載する実施例は B化合物（Zn体）の生産量を上げる為に改良した方法であり、前記の実施例に比べ、約 50倍の生産増加であった。

1) シード培養

ペンネッ卜培地（グルコース 1 %。酵母エキス 0.2%、肉エキス 0.1 %、カザミノ酸 0.2%、 pH 7) を 121°C、 20分間ォートクレーブで滅菌した後、シユードモナス、エスピー No. 57— 250菌株を植菌し、ロータリーシェーカーを用いて 28て、 14 Orpmで 18時間培養した。 2)本培養

ジャー（50Lx2、 30 L X 2) に 80Lの醱酵用培地（グルコース 1%、デキストリン 2%、酵母エキス 1%、ファーマメディア 1%、硫酸銅 6水和物 0.0002%、硫酸亜鉛 7水和物 0.01%、 pH6.5) を仕込み、消泡剤ポリプロピレングリコール一 2000を最終濃度 0.0 1%となるように添加した。 121て、 20分間滅菌し、冷却後シードを最終濃度 1%となるように植菌した。その後、次の条件で培養した。

温度 28°C、撹拌 29〜60 Orpnu通気 50 Lジャー： 25LZ分、 3◦ Lジャー： 15 LZ分、培養 42時間

B. 抽出および単離

1) 抗生物質 B 057- 250 Bの抽出および単離

酸酵液 8.5 L (pH8.3) に酢酸ェチルを等童加え、液一液分配抽出を 2回行った。抽出物 760 ragをカラムクロマトグラフィー（シリ力ゲル 140g, 70〜230メッシュ，メルク社製 No. 7734) で分画した。ジクロロメタンメ夕ノール（98 ： 2, v/v) 系溶媒を通過後、ジクロロメタン Zメタノール（95 : 5, v/v) 系溶媒で Bを溶離させ、粗抽出物 1 lmgを得た。つぎに薄層クロマトグラフィ一（シリカゲル薄層板 20 20 cm, 0.5 mm, メルク社製 No.5744 ) で分取精製した。クロ口ホルムズメタノール（9 : 1, v/v)系溶媒で 15 era展開し、 Rf値 0. 5 付近の明青色バンド（紫外線ランプ照射 36 δηπι) をかきとり、クロロホルム Ζメタノール（8 : 2， v/v) 系溶媒で B 057 - 250 Bを抽出した。さらにセフアデックス LH— 20カラム（ I D 15圆 X 87 Oram) で精製を行った。試料を少量のメタノールに溶解し、メタノールで分離を行つた-。 B 057— 250 Bを含むフラクシヨン 6.6 ragをメタノール Z酢酸ェチルの溶媒系で再結晶化、無色菱形板状晶 3.6 nigを得た。融点 226 〜228°C (分解）

2) 抗生物質 B 057— 250 Aおよび Cの抽出および単離

前記 B 057 - 250 Bの製造方法に準じて行えばよい。 A項に記載のようにして入手した醱酵液 8. 5 Lを酢酸ェチルで抽出した後、シリカゲルカラムクロマ卜グラフィーを行い、 B 057— 250 Cはジクロ口メタンメタノール（98 ： 2, v/v) 溶媒系フラクシヨンに、 B 057— 2 50 Aはジクロロメタン/メタノール（9 : 1. v/v) 溶媒系フラクションに溶出させた。その後、分取薄層クロマトグラフィーによりクロ口ホルム /メタノール（9 : 1， v/v) 系溶媒で 15cm展開した。 Aおよびじのバンドはそれぞれ Rf=0.34及び 0.65付近（紫外線ランプ照射）にあり、それらのバンドをかきとった。このあとの精製は分取高速液体クロマトグラフィー（PREP— HPL C) で行った _c カラム： PRE P—〇 D S_M、 I D 2 Ommx 25 Omm、ガードカラム： I D 20 mrax 50 nmi、島津テクノリサーチ製、移動相：メタノール水（75 ： 25, v/v) 、流速： 9ml/分、検出： UV 235nm、温度： 40°C、保持時間 A ： 21分、 B ： 25分、 C ： 28分。

これにより、 B057— 250A ： 0.4mg、及び C ： 1.3mgを得た。 3) 改良法で産生した抗生物質 B 057 - 250 Bの抽出および単離培養液約 70 Lを遠心し、上清 66 Lと菌体に分離した。上清は HP— 20を 3.3 kg添加し、室温下で 1時間攪拌した。 HP— 20をメッシュフィルターで濾過後水洗した後、カラムに充塡した _c 脱イオン水 40しで洗浄後、メタノールで溶出して活性画分 12 Lを得た。この画分を減圧濃縮後、酢酸ェチルで抽出した。一方、菌体はメタノールで抽出、過、減圧濃縮した後、酢酸ェチルで抽出した。上清と菌体の各々酢酸ェチル抽出画分を併せ、濃縮乾固して、粗抽出物 11.3gを得た。

粗抽出物はクロ口ホルムにて溶解してシリ力ゲルカラム（シリカゲル 3 50 g、カラム： 50 x 350關）に充填後、クロ口ホルムーメタノール系で展開した。クロ口ホルム 500mlおよびクロ口ホルム一メタノール（9 8 : 2) 1.6 Lで洗浄後、クロ口ホルム一メタノール（9 : 1) 1.3 L で B化合物を含む粗分画物 5.7gを得た。この粗分画物から酢酸ェチルーメタノールで再結晶を繰り返して B化台物の結晶 1.73gを得た。

実施例 2

B 057- 250 D (Co体）の製造

B 057— 250 Bの 5 Omgをメタノール 3ralに溶解した後、 0.5モル濃度のコバルト水溶液 1 mlと水 15 mlを添加し混合撹拌した。その後クロロホルム 15 mlで 2回抽出し、溶媒を減圧下で濃縮乾固した。その残渣は酢酸ェチルーメタノールより再結晶して標記化合物 41.2mgを得た。

使用薬剤の調製法

0.5モル Co溶液： 1.2gの塩化コバルト 6水和物を 10mlの水に溶解

実施例 3

B 057 - 250 E (Ni体）の製造 .

Co体の製造方法と同じであり、標記化合物 38.3mgを得た。

使用薬剤の調製法

0.5モル Ni溶液： 1.2 gの塩化ニッゲル 6水和物を 10mlの水に溶解

試験例 1

化合物の in vitro 抗菌スぺクトル

抗菌力の測定には、日本化学療法学会指定の方法に準じて寒天希釈法を、又はマイコプラズマ属については液体希釈法を用いて最少発育阻止'濃度（M I C. g/ml) を測定した。試験菌の内、セルブリナ（Serpulina) 及びクロストリジゥ厶（Clostridium) については、ガスパック法を用いた嫌気培養を行った。各試験菌の測定用培地には、次の組成のものを用いて測定を行った。

マイコプラズマ（M) の M. gallisepticumには馬血清 12%、ブドウ糖 1%添加 PPLO培地（Difco) 、 M. synoviaeには、豚血清 10%、

/S— NAD 0.01%、ブドウ糖 1 %添加 Frey培地（Gibco) 、 M. ^hy° neumoniaeにはラク卜アルブミン 0.5 %添加ハンクス液に馬血清 10%、

2

25%酵母エキスを 5 %、ブドウ糖 1 %をそれぞれ添加した培地を、 M. pneumoniaeには、馬血清 20%、 25 %酵母エキスを 10 %、ブドウ糖 1 %添加 PPLO培地（Difco) をそれぞれ用いた。また、これらの培地には、色調の変化から菌の増殖を確認するためにフノールレツドを 0.0

25%の割合で加えて使用した。 M I C値は 37°Cで 120〜168時間培養後判定した。

¾ treptococcus agalactiaeには、馬血清 5 %添加ミュ一ラー · ヒン卜ン培地 (Mueller Hinton agar, MH A, Difco) 、 Actinobacillus pi europneumoniaeには、 ^一 NAD 0.05%添加?^^1 (Difco) を用いて、 37°Cで 24〜48時間培養後判定した。

¾ erpulina hyodysenteriaeには、トリプチ力一ゼ * ソィ寒天 (Tryptic ase Soy agar (TSA) , BBL) に緬羊脱繊維血液を 5 %加えた培地を、 Clostridium perfringensには、 GAM培地（ニッスィ）を用いてガスパック法を用いた嫌気培養を行った。判定は、 S erpulina hyodysenter ^では、 37°Cで 96〜120時間、 Clostridium perfringensでは、

37°Cで 24時間培養後判定を行った。

Pasteurella piscicidaにはブレイン · ハート * インフヱ一ジョン寒天 (Brain Heart I nfusion agar, B H I , Difco) に Na CIを 2%添加した培地で、 S treptococcus, sp.には感性ディスク N培地（ニッスィ）を用いて、 2 5 °Cで 2 0〜2 4時間培養後判定を行った。これらの菌以外は- 測定用培地に M H Aを用いて、 3 7 °Cで 2 0〜2 4時間培養後判定を行つた結果（まゝ表 2 ίこ示すよう ίこ Mycoplasma gallisepticunu M. synovia e、 M. hyopneumoniaeおよび M pneumoniaeのマイコプラズマ種に特異的に強い活性を示した。

表 2

各種細菌に対する in vitro 成績

M I C ( g/ml)

si験鹵 Ζπ体 Cu体 Co体

Mycoplasma

0.1

gallisepticura S6 0.1 0.2 6.25 3.13

Mycoplasma

gallisepticum 0.2 0.2 0.2 12.5 6.25 w v ~~

. neumoniae Mac ≤0.00625≤0.00625≤0.00625

M. hvopneumoniae

ST - 11 ― ― 0.025 0.05 0.1

Staphylococcus

25 >25 〉25

aureus FDA 209P

Pasteurella

25 〉25 〉25

multocida D-6

F

Bordetella e

25 >2δ >25

bronchiseptica H - 16

Escherichia coli

〉25 >25 >25

NIHJ JC-2

Salmonella enteritidis

〉25 〉25 〉25

8966(PT34) 一 ―

Klebsiella pneumoniae N 〉25 >25 〉25 1 ■ ATCC 27736

Streptococcus

〉25 〉25 〉25

agalactiae ATCC 9925

Actinobacillus

p europneumoniae 6.25-12.5 3.13 12.5

ΝΒ-ϋϋΚΙ)

Clostridium

periringens 6.25 6.25 12.5

ATCC 13124

Serpulina

nvoaysenteriae 〉25 12.5 >25

ATCC 27164

Pasteurella

a) マクロライド耐性株試験例 2

M. gallisepticum接種雜に対する in vivo成糖

B057— 250Bを用いて、マクロライド系薬剤耐性野外分離株 M. gallisepticum (MG) T株に対する効果を強制経口投与法 1回で検討した。

実験方法は、 8日齢ヒナ（雄，レイヤータイプ， 5羽/群）の右気のう内に、 MGを 1羽当り 2.3X 10³ コロニー形成単位（CFU) 接種し- 直ちに B 057— 250 B (メタノールで溶解後、 3%アラビアゴムを加えた）を 7 Omg/kgx 1回、又は 2 Omg/kgx 1回投薬を行った。

対照薬には、巿販の抗マイコプラズマ剤、クロルテトラサイクリン（C TC) とタイ口シン（TS) を 3%アラビアゴムに溶解し投薬を行った。ヒナの剖検は、感染投与後 7曰目に行い、効果判定は、気のう病変の出現とその程度から判断した。結果は、以下の表 3に示されるように、 B05 7— 250 Bは、市販の抗マイコブラズマ剤よりも優れた効果を示す事が確認された。

表 3

MGの気のう内接種雛に対する化合物の効果

試験気のう病変 (右気のう）薬剤名投与量羽数軽度中〜強度化合物 B 2 Omg/kg 1回 5 0 2 3

7 Omg/k x 1回 0 4 1 0

CTC 50 mg/kg X 1回 5 1 1 3

10 Omg/kgx 1回 δ 2 1 2

TS 10 Omg/kgx 1回 0 1 0 4

20 Omg/kgx 1回 δ 0 3 2

感染対照 δ 0 1 4 無感染対照 δ 5 0 0

CTC：クロルテトラサイクリン

T S ：タイ口シン

Claims

請求の範囲式：

[式中、 Mは 2価または 3価の金属イオン、 Xは OHまたは Ο^βである] で示される化合物。

2. 式：

[式中、各記号は前記と同意義である]

で示される化合物である請求項 1に記載の化合物。

3. Μが Zn² Cu²⁺、 Fe²~³\ Co²\ Ni²\ Mn²~³\ Cd²⁺、 Mg²'、

または Ag^{2 +}である請求項 1または 2に記載の化合物。

4. Mが Zn²*、 Cu²\ Fe³\ Co² または Ni²*である請求項 1また 2に記載の化合物。

5. シユードモナス厲に厲し、式

[式中、 M。は Cu²，、 Zn²\ または Fe^{3 +}、Xは〇Hまたは〇^θである] で示される化合物を産生する微生物を培養し、培養物から該化合物を抽出採取し、所望により該化合物を溶液状態で 2価または 3価の金属イオンを含む溶液と混合することにより、該金属を含む化合物を製造することを特徴とする、請求項 1に記載の化合物の製造方法。

6. 請求項 1に記載の化合物の産生能を有するシユードモナス · エスピー N o. 57— 250株（FERM BP— 5143) 。

7. 1つ又はそれ以上の製薬的に許容される担体と共に、請求項 1に記載の化合物を含有してなる医薬。

8. 1つ又はそれ以上の製薬的に許容される担体と共に、請求項 1に記載の化合物を含有してなる動物薬。

9. 1つ又はそれ以上の製薬的に許容される担体と共に、請求項 1に記載の化合物を含有してなる抗マィコプラズマ剤。