JP4896130B2 - 新規ｋ０４−０１４４物質およびそれらの製造法 - Google Patents

Description

本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む細菌に対して抗菌作用を示すＫ０４−０１４４Ａ物質、Ｋ０４−０１４４Ｂ物質およびＫ０４−０１４４Ｃ物質のいずれかである新規Ｋ０４−０１４４物質およびそれらの製造法に関する。

黄色ブドウ球菌は、人や動物の皮膚、消化管内などの体表面に常在するグラム陽性球菌で、健常な人に対しては無害であるが、術後患者や新生児、高齢者のように免疫力の低下した場合に発症し、皮膚の切創や刺創に伴う化膿症などの皮膚軟部組織感染症から、肺炎、腹膜炎、敗血症、髄膜炎などに至る様々な重症感染症に加え、エンテロトキシンや毒素性ショック症候群毒素−１などの毒素産生による食中毒やショック症候群、腸炎などを引き起こす。重篤化する例も少なくなく、最悪の場合死に至るケースもある。近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、院内感染の主な原因菌として社会的問題となっている。この病原菌は、β−ラクタム系抗生物質など種々の薬剤に対する耐性を有しており、現在ＭＲＳＡ感染症の治療には、グリコペプチド系のバンコマイシンやアミノグリコシド系のアルベカシンといった抗生物質が使用されている。この他には、近年新たに開発されたキヌプリスチン／ダルホプリスチン合剤やオキサゾリジノン系抗生物質リネゾリドがある。
現在ＭＲＳＡに対して有効な薬剤として用いられているバンコマイシンやアルベカシンは、第８脳神経障害による聴力障害などの副作用を有することが知られている。また、グリコペプチド系抗生物質はショック、腎毒性、ｒｅｄ ｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅといった副作用を引き起こし、臨床で投与する際には血中濃度のモニタリングを行うなど、慎重に投与する必要がある。さらに、最近ではＭＲＳＡの多剤耐性化に加え、主たる治療薬であるバンコマイシンに対しても低感受性となった菌も報告されている。従って、新しい抗生物質の出現や新しい治療法の開拓か望まれている。実際新しい治療法として、β−ラクタム系抗生物質同士、もしくはβ−ラクタム系抗生物質と他の作用点の異なる抗生物質の併用療法が行われている（長谷川裕美ら、抗菌薬投与の科学、２６４−２７３、１９９８年）。また、それ自身では抗菌活性をほとんど示さないが、β−ラクタム系抗生物質の効力を回復あるいは活性化させる作用を有する物質が報告されている。例えば、特表平９−５０９６７７号に開示された茶エキスまたはその活性フラクション（ポリフェノール化合物類）やステフォン類の化合物（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０５６２５）があげられる。

このような背景のもと、ＭＲＳＡに対して抗菌活性を示す新しい構造を有する新規な抗生物質を提供することは重要である。また、ＭＲＳＡに対するβ−ラクタム系抗生物質の活性を増強する薬剤は、β−ラクタム抗生物質の投与量を減量させ、投与期間を短縮させることにより耐性菌出現の頻度を低減させることが期待される。また同時に、作用の異なる２つの薬剤を併用することにより、薬剤耐性を克服することも期待される。
本発の目的は、ＭＲＳＡ感染症やβ−ラクタム系抗生物質耐性を含む多剤耐性菌を起因とする感染症の新しい治療薬を提供するものである。

本発明者らは、微生物の生産する代謝産物を対象にＭＲＳＡに対して抗菌活性を示す化合物あるいはＭＲＳＡに対するβ−ラクタム系抗生物質の活性を増強する化合物を探索した結果、新たに土壌から分離した放線菌Ｋ０４−０１４４株の培養液中に目的の活性を示す物質が産生されていることを見いだした。次いで、該培養物から目的の活性を示す物質を単離精製したところ、３種の抗ＭＲＳＡ抗生物質と１種のβ−ラクタム系抗生物質の活性を増強する化合物を得た。このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、抗ＭＲＳＡ抗生物質をＫ０４−０１４４Ａ物質、Ｋ０４−０１４４Ｂ物質およびＫ０４−０１４４Ｃ物質、そしてβ−ラクタム系抗生物質の活性を増強する活性物質をＫ０４−０１４４Ｄ物質と称することにした。またこれらすべてをＫ０４−０１４４物質と称することとした。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記の式［Ｉ］
で表されるＫ０４−０１４４Ａ物質、下記の式［ＩＩ］
で表されるＫ０４−０１４４Ｂ物質、下記の式［ＩＩＩ］
で表されるＫ０４−０１４４Ｃ物質、および下記の式［ＩＶ］
で表されるＫ０４−０１４４Ｄ物質のいずれかであるＫ０４−０１４４物質である。
本発明はまた、ストレプトミセス属に属し、Ｋ０４−０１４４物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＫ０４−０１４４物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０４−０１４４物質を採取する新規Ｋ０４−０１４４物質の製造法である。
本発明は、さらに微生物、ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ０４−０１４４（ＮＩＴＥ ＢＰ−１０７）である。
本発明の前記の式［Ｉ］、［ＩＩ］、［ＩＩＩ］、および［ＩＶ］で表される新規Ｋ０４−０１４４物質を生産するために使用される菌株としては、一例として、本発明者らによって沖縄県石垣島の土壌から新たに分離されたストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ０４−０１４４株があげられる。
本菌株の菌学的性状を示すと次のとおりである。
（Ｉ）形態的性質
栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸はイースト・麦芽エキス寒天培地やグリセロール・アスパラギン寒天培地で豊富に着生し、白色からグレーの色調を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸上に２０ケ以上の胞子の連鎖が認められ、その形態は螺旋状で、胞子の大きさは約１．０ ｘ １．０μｍの円筒状である。胞子の表面は平滑である。菌核、胞子のうおよび遊走子は見出されない
（ＩＩ）各種培地上での性状
イー・ビー・シャーリング（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）とデー・ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー、１６巻、３１３頁、１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を次表に示す。色調は標凖色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察の結果である。
培養性状
（ＩＩＩ）生理学的諸性質
（１）メラニン色素の生成
（イ）チロシン寒天 陰性
（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天 陰性
（ハ）トリプトン・イースト液 陰性
（ニ）単純ゼラチン培地（２１〜２３℃） 陰性
（２）硝酸塩の還元 陰性
（３）ゼラチンの液化（２１〜２３℃）（単純ゼラチン培地） 陰性
（４）スターチの加水分解 陽性
（５）脱脂乳の凝固（３７℃） 陽性
（６）脱脂乳のペプトン化（３７℃） 陽性
（７）生育温度範囲 １２〜４２℃
（８）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
利用する：Ｄ−グルコース、メリビオース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ラムノース
やや利用する：Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、ラフィノース、Ｄ−フラクトース、シュークロース
（９）セルロースの分解 陰性
（ＩＶ）化学分類学的性状
細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ_６）とＭＫ−９（Ｈ_８）である。
（Ｖ）結論
以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ_６）とＭＫ−９（Ｈ_８）である。胞子連鎖の形態は螺旋状で、長い胞子鎖を形成し、胞子の表面は平滑である。培養上の諸性質としては、栄養菌糸は褐色の色調を呈し、気菌糸は白色からグレー系の色調を呈する。メラニン色素は産生しない。
これらの結果から、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー、４巻、１９８９年に基づくストレプトミセス属に属する菌種であると考えられる。
微生物の国際寄託
本菌株は、ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ０４−０１４４として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、郵便番号２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号（２−５−８ Ｋａｚｕｓａｋａｍａｔａｒｉ Ｋｉｓａｒａｚｕ−ｓｈｉ，Ｃｈｉｂａ−ｋｅｎ ２９２−０８１８ Ｊａｐａｎ）に所在する独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ａｇｅｎｃｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ（ＮＰＭＤ）に寄託した。寄託日は２００５年６月３０日、受託番号はＮＩＴＥ ＢＰ−１０７である。
理化学的性状
次に、本発明のＫ０４−０１４４物質の理化学的性状について説明する。
１．Ｋ０４−０１４４Ａ物質
（１）性状 ：白色粉末
（２）分子式：Ｃ_６４Ｈ_１０３Ｎ_４Ｏ_３３Ｐ
ＨＲ Ｎｅｇ．ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ−Ｈ］⁻計算値１４８５．６２０６、実測値１４８５．６１６４
（３）分子量：１４８７
Ｎｅｇ．ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ−Ｈ］⁻１４８５を観測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第１図に示すとおりであり、末端吸収を示す
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第２図に示すとおりであり、νｍａｘ３３９９、２９６０、１７２２、１６７３、１３８２、１０６８ｃｍ^−１等に特徴的な吸収極大を示す
（６）比旋光度［α］_Ｄ ^２４＋６．７°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性：メタノールや水に可溶、クロロホルムやヘキサンに不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中で、バリアン社製、４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した。第３図にプロトン核磁気共鳴スペクトルを、また第４図にカーボン核磁気共鳴スペクトルを示した。水素の化学シフト（ｐｐｍ）および炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δ_Ｈ：０．９７（６Ｈ），１．２６（３Ｈ），１．３８（２Ｈ），１．４１（３Ｈ），１．６０（３Ｈ），１．６２（３Ｈ），１．６７（３Ｈ），１．７８（３Ｈ），１．９０（２Ｈ），２．０２（２Ｈ），２．０４（３Ｈ），２．０５（３Ｈ），２．１０（４Ｈ），２．１３（１Ｈ），２．１７（１Ｈ），２．７０（１Ｈ），３．２４（１Ｈ），３．３１（２Ｈ），３．３４（１Ｈ），３．４６（１Ｈ），３．５１（１Ｈ），３．５５（３Ｈ），３．６０（３Ｈ），３．６９（３Ｈ），３．８１（１Ｈ），３．９０（２Ｈ），４．１０（２Ｈ），４．１８（３Ｈ），４．２９（３Ｈ），４．３８（１Ｈ），４．４３（１Ｈ），４．４５（１Ｈ），４．４７（２Ｈ），４．６７（２Ｈ），５．０６（１Ｈ），５．１０（１Ｈ），５．１４（１Ｈ），５．２８（１Ｈ），５．３８（１Ｈ），５．４５（１Ｈ），５．９３（１Ｈ）ｐｐｍ
δ_Ｃ：１６．１，１６．４，１７．８，１８．０，２３．３，２３．５，２４．０，２６．０，２７．７，２７．９，２７．９，３２．４，３２．７，３３．５，３５．９，３６．５，４０．９，４２．９，５５．７，５６．９，６２．５，６６．９，６８．５，６９．４，７１．６，７１．６，７２．２，７２．６，７３．８，７３．８，７４．０，７４．１，７４．７，７５．０，７５．２，７５．４，７６．４，７８．０，７８．２，７８．３，７９．７，８２．４，８６．１，９６．２，１０３．２，１０４．３，１０４．７，１０５．０，１０９．３，１２２．７，１２３．５，１２５．４，１２６．８，１３２．２，１３７．４，１４１．６，１４２．６，１５１．１，１５９．２，１７３．５，１７３．８，１７４．２，１７４．６，１７５．１ｐｐｍ
以上のように、Ｋ０１−０１４４Ａ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、Ｋ０１−０１４４Ａ物質は前述の式［Ｉ］で表される化学構造であることが決定された。
２．Ｋ０１−０１４４Ｂ物質
（１）性状 ：白色粉末
（２）分子式：Ｃ_５８Ｈ_９３Ｎ_４Ｏ_２８Ｐ
ＨＲ Ｎｅｇ．ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ−Ｈ］⁻計算値１３２３．５６５６、実測値１３２３．５６３６
（３）分子量：１３２５
Ｎｅｇ．ＥＳＩ−ＭＡ（ｍ／ｚ）［Ｍ−Ｈ］⁻１３２３を観測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第５図に示すとおりであり、末端吸収を示す
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第６図に示すとおりであり、νｍａｘ３３９９、２９２３、１７１６、１６７５、１３７８、１０６８ｃｍ^−１等に特徴的な吸収極大を示す
（６）比旋光度［α］_Ｄ ^２４＋４．０°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性：水、メタノールやジメチルスルフォキシドに可溶、アセトン、クロロホルムやｎ−ヘキサンに不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中で、バリアン社製、４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した。第７図にプロトン核磁気共鳴スペクトルを、また第８図にカーボン核磁気共鳴スペクトルを示した。水素の化学シフト（ｐｐｍ）および炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δ_Ｈ：０．９７（６Ｈ），１．２６（３Ｈ），１．３８（２Ｈ），１．４２（３Ｈ），１．６０（３Ｈ），１．６１（３Ｈ），１．６７（３Ｈ），１．７７（３Ｈ），１．９１（２Ｈ），２．０２（５Ｈ），２．０３（３Ｈ），２．１０（６Ｈ），２．７０（２Ｈ），３．３３（２Ｈ），３．５６（３Ｈ），３．５８（１Ｈ），３．６０（１Ｈ），３．６４（３Ｈ），３．８４（３Ｈ），４．０９（１Ｈ），４．１２（１Ｈ），４．１５（１Ｈ），４．１７（１Ｈ），４．２０（２Ｈ），４．２８（１Ｈ），４．３７（１Ｈ），４．４４（１Ｈ），４．４５（２Ｈ），４．６７（２Ｈ），５．０４（１Ｈ），５．１０（２Ｈ），５．１４（１Ｈ），５．２９（１Ｈ），５．３８（１Ｈ），５．４５（１Ｈ），６．０４（１Ｈ）ｐｐｍ
δ_Ｃ：１６．１，１６．３，１７．８，１８．０，２３．１，２３．３，２４．０，２６．０，２７．７，２７．８，２７．９，３２．４，３２．７，３３．４，３６．０，３６．５，４０．９，４２．９，５５．９，５６．７，６０．８，６７．０，６７．７，７１．６，７２．１，７２．６，７３．７，７３．８，７３．９，７４．０，７４．６，７５．１，７６．０，７６．３，７７．９，７９．９，８１．５，８６．４，９６．５，１０３．４，１０４．６，１０５．２，１０９．３，１２２．８，１２３．５，１２５．４，１２６．８，１３２．２，１３７．４，１４１．７，１４２．４，１５１．１，１５９．２，１７３．２，１７３．７，１７４．１，１７４．７，１７４．９ｐｐｍ
以上のように、Ｋ０４−０１４４Ｂ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、Ｋ０４−０１４４Ｂ物質は前述の式［ＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
３．Ｋ０４−０１４４Ｃ物質
（１）性状 ：白色粉末
（２）分子式：Ｃ_５８Ｈ_９４Ｎ_５Ｏ_２７Ｐ
ＨＲ Ｎｅｆ．ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ−Ｈ］⁻計算値１３２２．５８０９、実測値１３２２．５７９５
（３）分子量：１３２４
Ｎｅｇ．ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ−Ｈ］⁻１３２２を観測
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第９図に示すとおりであり、末端吸収を示す
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第１０図に示すとおりであり、νｍａｘ３４００、２９２５、１６７７、１６４８、１４００、１０６６ｃｍ^−１等に特徴的な吸収極大を示す
（６）比旋光度［α］_Ｄ ^２４＋３．７°（ｃ＝０．１、メタノール）
（７）溶剤に対する溶解性：水、メタノールやジメチルスルフォキシドに可溶、アセトン、クロロホルムやｎ−ヘキサンに不溶
（８）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中で、バリアン社製、４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した。第１１図にプロトン核磁気共鳴スペクトルを、また第１２図にカーボン核磁気共鳴スペクトルを示した。水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δ_Ｈ：０．９７（６Ｈ），１．２５（３Ｈ），１．３８（２Ｈ），１．４２（３Ｈ），１．６０（３Ｈ），１．６１（３Ｈ），１．６７（３Ｈ），１．７６（３Ｈ），１．９１（２Ｈ），２．０１（６Ｈ），２．０４（２Ｈ），２．１１（６Ｈ），２．７０（２Ｈ），３．３４（２Ｈ），３．５６（４Ｈ），３．６４（４Ｈ），３．７２（１Ｈ），３．８４（２Ｈ），４．０６（１Ｈ），４．１１（３Ｈ），４．１７（１Ｈ），４．２１（２Ｈ），４．４２（１Ｈ），４．４３（１Ｈ），４．４５（１Ｈ），４．５３（１Ｈ），４．６７（２Ｈ），５．０８（１Ｈ），５．１２（１Ｈ），５．１４（１Ｈ），５．３１（１Ｈ），５．３５（１Ｈ），５．３８（ Ｈ），５．９９（１Ｈ）ｐｐｍ
δ_Ｃ：１６．１，１６．４，１７．８，１７．９，２３．１，２３．３，２３．９，２６．０，２７．７，２７．９，２７．９，３２．３，３２．６，３３．４，３６．０，３６．５，４０．９，４２．９，５６．５，５６．７，６１．０，６７．２，６７．６，７０．７，７２．３，７２．８，７３．５，７３．７，７３．９，７４．０，７４．４，７５．７，７６．０，７６．０，７８．３，７９．４，８１．６，８５．１，９６．２，１０３．５，１０３．９，１０４．９，１０９．３，１２２．６，１２３．５，１２５．４，１２６．８，１３２．２，１３７．３，１４１．６，１４２．１，１５１．１，１５９．２，１７３．７，１７３．７，１７３．７，１７４．０，１７４．７ｐｐｍ
以上のように、Ｋ０４−０１４４Ｃ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、Ｋ０４−０１４４Ｃ物質は前述の式［ＩＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
４．Ｋ０４−０１４４Ｄ物質
（１）性状 ：白色粉末
（２）融点 ：１３８℃
（３）分子式：Ｃ_２５Ｈ_４１ＮＯ_５Ｓ
ＨＲ ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ−Ｈ＋２Ｎａ］^＋計算値５１２．２４２３、実測値５１２．２４１６
（４）分子量：４６７
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ−Ｈ＋２Ｎａ］^＋５１２を観測
（５）紫外部吸収スペクトル：メタノール溶液中で測定した紫外部吸収スペクトルは第１３図に示すとおりであり、２３２ｎｍで吸収極大を示す
（６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第１４図に示すとおりであり、νｍａｘ３４２７、２９２７、２８６４、１６４１、１６０４、１３９８、１１２４、１０７８ｃｍ^−１等に特徴的な吸収極大を示す
（７）比旋光度［α］_Ｄ ^２５＋２６．８°（ｃ＝０．１、メタノール）
（８）溶剤に対する溶解性：メタノールや水に可溶、クロロホルムやヘキサンに不溶
（９）プロトン及びカーボン核磁気共鳴スペクトル：重メタノール中で、バリアン社製、４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータで測定した。第１５図にプロトン核磁気共鳴スペクトルを、また第１６図にカーボン核磁気共鳴スペクトルを示した。水素の化学シフト（ｐｐｍ）及び炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
δ_Ｈ：０．８４（５Ｈ），０．９１（４Ｈ），１．００（３Ｈ），１．１４（１Ｈ），１．２０（１Ｈ），１．３５（２Ｈ），１．６３（４Ｈ），１．７５（３Ｈ），１．９８（３Ｈ），２．１３（１Ｈ），２．４２（１Ｈ），２．６３（１Ｈ），２．７７（１Ｈ），２．８２（１Ｈ），３．０２（１Ｈ），３．８２（１Ｈ），４．４１（１Ｈ），４．８６（１Ｈ），５．０３（１Ｈ），５．５５（２Ｈ），６．３５（１Ｈ）ｐｐｍ
δ_Ｃ：１２．０，１６．０，１９．３，２２．３，２２．８，２４．４，２７．８，３４．０，３４．１，３７．７，３９．２，３９．８，４１．１，４３．０，５３．７，５５．２，５５．８，７２．３，７８．８，１１０．１，１３３．２，１３７．６，１４３．１，１７２．５，１７７．４ｐｐｍ
以上のように、Ｋ０４−０１４４Ｄ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、Ｋ０４−０１４４Ｄ物質は前述の式［ＩＶ］で表される化学構造であることが決定された。
生物学的性状
次に、本発明のＫ０４−０１４４物質の生物学的性状について詳細に述べる。
Ｋ０４−０１４４Ａ、Ｂ及びＣ物質の抗菌活性
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定は寒天平板希釈法（日本化学療法標凖法、ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ ２９巻 ７６−７９頁 １９８１年）に凖じて行った。
試験菌として、臨床分離されたメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ株を含む２７種の菌を用いた。それぞれの被験菌はＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ（２．１％ ｗ／ｖ）（ＤＩＦＣＯ）培地中３７度で２０時間培養後、同培地で菌数を約１０^６／ｍＬ相当に懸濁し、接種用菌液として用いられた。作成した菌液はマイクロプランターを用いて１２８μｇ／ｍｌより２倍希釈した各濃度段階のＫ０４−０１４４Ａ、Ｂ及びＣ物質を含むＭＨＡ培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ ２．１％（ｗ／ｖ）、Ａｇａｒ １．５％）に塗抹し、３７度にて２０時間培養後、菌の生育の有無を肉眼で確認することによってＭＩＣを算出した。また比較対象としてバンコマイシン、アルベカシン及びリネゾリドを用いた。その結果を下記第１表にまとめた。
上記のようにＫ０４−０１４４Ａ、Ｂ及びＣ物質はＭＲＳＡを含むグラム陽性菌に対して、既存薬剤（バンコマイシン、アルベカシン及びリネゾリド）と同等あるいはそれ以上の強さでその生育を阻害することが明らかとなった。
カイコを用いたＭＲＳＡ感染モデルでの活性評価
動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏ ＭＲＳＡ感染モデルの代替法としてカイコを用いた感染系が報告されている（Ｋａｉｔｏら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．３２巻，１８３−１９０頁，２００２年）。この方法に従いＫ０４−０１４４Ａ物質の効果を測定した。
試験菌として、臨床分離されたＭＲＳＡ（Ｋ２４株）を用いた。ＭＲＳＡをＬＢ−１０培地（ＤＩＦＣＯ）中で３７度で１８時間静置培養し、５齢２日目のカイコ（約２ｇ、愛媛蚕種社、日本国）の背脈管に５０μｌ接種した。Ｋ０４−０１４４Ａ物質を１ｍｇ／ｍｌに調整し、５頭のＭＲＳＡ感染カイコの背脈管より注射器を用いて５０μｌ（２５ｍｇ／ｋｇ）投与した。判定は接種後７２時間飼育し、この間観察されるサンプル投与および非投与群との生存率を比較した。何も接種しなかったカイコ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）並びに、Ｋ０４−０１４４Ａ物質のみを２５ｍｇ／ｋｇ投与したカイコは少なくとも７２時間後まですべて生存していたことから、この条件ではＫ０４−０１４４Ａ物質はカイコに全く毒性を示さないことを確認した。またＭＲＳＡ菌液５０μＬを接種したカイコは接種７２時間後までにすべて死亡した。このような条件下、Ｋ０４−０１４４Ａ物質を２５ｍｇ／ｋｇで投与したカイコはＭＲＳＡ接種７２時間後でもすべて生存していた。同様にバンコマイシン２５ｍｇ／ｋｇで投与したカイコもＭＲＳＡ接種７２時間後すべて生存していた。
このように、カイコを用いたＭＲＳＡ感染実験でもＫ０４−０１４４Ａ物質の有効性が示された。
Ｋ０４−０１４４Ｄ物質によるイミペネム活性増強作用
１．ペーパーディスク法によるイミペネム活性増強作用の評価方法
試験菌として、臨床分離されたメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）Ｋ２４株を用いた。ＭＲＳＡ Ｋ−２４株は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ（２．１％ ｗ／ｖ）（ＤＩＦＣＯ）３７度、２０時間培養後、同培地で０．５Ｍｃ ＦＡＲＡＮＤ（約１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）相当に懸濁し、ＭＨＡ培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ ２．１％（ｗ／ｖ）、Ａｇａｒ １．５％）および同組成の培地にイミペネム（日本国、萬有製薬社、チエナム筋注用力価０．５）を試験菌の生育に影響を与えない濃度、すなわち最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した培地に塗抹した。塗抹は米国臨床検査標準化委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ，ＮＣＣＬＳ）法に従い、滅菌綿棒（日本国、川本産業社）を用いて行った。試験菌に対する各培地上での抗菌活性は、ペーパーディスク法（薄手、６ｍｍ：ＡＤＶＡＮＴＥＣＨ社）にて、３７℃で２０時間後の阻止円径の直径を単位ｍｍで表記した。その結果、第２表に示すように１μｇディスク条件下にて、Ｋ０４−０１４４Ｄ物質それ自身では阻止円が測定されなかったのに対して、イミペネム存在下では、１５ｍｍの阻止円が測定され、イミペネム活性増強作用が確認された。
２．微量液体希釈法による各種抗菌剤に対する活性増強作用の評価方法
ペーパーディスク法による評価で強いイミペネム活性増強作用を示したＫ０４−０１４４Ｄ物質に関しては、微量液体希釈法に従いイミペネムに加えその他抗菌剤を含む活性増強を評価した。その他薬剤としては、バンコマイシン（日本国、和光純薬社）、ストレプトマイシン（日本国、明治製菓社）およびシプロフロキサシン（日本国、和光純薬社）を使用した。評価は、日本化学療法学会標準法（ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ ３８巻、１０３〜１０５頁、１９９０年）を一部改変して行った。
９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（米国、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の各ｗｅｌｌに、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ（２．１％ ｗ／ｖ）を８５μｌ添加した後、あらかじめ滅菌水で段階希釈しておいたイミペネムを各ｗｅｌｌに最終濃度４．８ ｘ １０^−４から２５６μｇ／ｍｌとなるように５μｌ添加した。さらに、これら各ｗｅｌｌに、Ｋ０４−０１４４Ｄ物質自身では生育に影響を与えない最終濃度１６μｇ／ｍｌとなるように水溶液５μｌを添加した。よく混合した後、試験菌ＭＲＳＡを上記同様に０．５Ｍｃ ＦＡＲＡＮＤ（約１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）相当に懸濁し、これを同培地て１０倍に希釈した接種菌液を各ｗｅｌｌに５μｌ接種した。３７℃で２０時間培養後、ｗｅｌｌの中で菌の発育が肉眼的に認められない最小の薬剤濃度をもってＭＩＣとした。各種抗菌剤単独時のＭＩＣおよび各種抗菌剤とＫ０４−０１４４Ｄ物質併用時のＭＩＣは第３表に示すとおりでり、イミペネムでは、３２μｇ／ｍＬから０．０３μｇ／ｍＬまで１０２４倍の活性増強が確認された。一方、バンコマイシン、ストレプトマイシンおよびシプロフロキサシンにおいては、活性増強作用が確認されないことから、Ｋ０４−０１４４Ｄ物質の活性増強作用はβ−ラクタム抗生物質に特異的に作用することが明らかとなった。

第１図は本発明によるＫ０４−０１４４Ａ物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液中）を示したものである。
第２図は本発明によるＫ０４−０１４４Ａ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第３図は本発明によるＫ０４−０１４４Ａ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）を示したものである。
第４図は本発明によるＫ０４−０１４４Ａ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）を示したものである。
第５図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｂ物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液中）を示したものである。
第６図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｂ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第７図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｂ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）を示したものである。
第８図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｂ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）を示したものである。
第９図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｃ物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液中）を示したものである。
第１０図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｃ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第１１図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｃ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）を示したものである。
第１２図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｃ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）を示したものである。
第１３図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｄ物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液中）を示したものである。
第１４図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｄ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第１５図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｄ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）を示したものである。
第１６図は本発明によるＫ０４−０１４４Ｄ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中）を示したものである。

以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものでない。
Ｋ０４−０１４４物質の製造法
１）Ｋ０４−０１４４Ａ、ＢおよびＣ物質の製造法
寒天斜面培地（スターチ１．０％（日本国、関東化学社）、エヌ・ゼット・アミン０．３％（日本国、和光純薬社）、酵母エキス０．０２％（日本国、オリエンタル酵母社）、肉エキス０．１％（日本国、極東製薬工業社）、炭酸カルシウシム０．３％（日本国、関東化学社）、寒天１．２％（日本国、清水食品社）ｐＨ７．０に調製）で培養したＫ０４−０１４４株を、種培地（スターチ２．４％（日本国、関東化学社）、グルコース０．１％（日本国、和光純薬社）、ペプトン０．３％（日本国、極東製薬工業社）、酵母エキス０．５％（日本国、オリエンタル酵母社）、ＣａＣＯ_３０．４％（日本国、関東化学社）ｐＨ６．０に調製）１００ｍＬを分注した５００ｍＬ容三角フラスコに一白金耳ずつ接種し、２７℃で３日間ロータリーシェイカー（２１０ｒｐｍ）で培養した後、生産培地（グルコース０．５％（日本国、和光純薬社）、コーンスティプパウダー０．５％（日本国、マルコー社）、オートミール１．０％（日本国、日本食品製造社）、ファーマメディア１．０％（日本国、イワキ社）、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５％（日本国、関東化学社）、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５％（日本国、和光純薬社）、トレース塩溶液０．１％（ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１％（日本国、関東化学社）、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ０．１％（日本国、関東化学社）、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１％（日本国、関東化学社）、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．１％（日本国、関東化学社）、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ０．１％（日本国、関東化学社）、ｐＨ７．０に調製）５０Ｌを入れた９０Ｌ容ジャーファーメンターに１％植菌し、２７℃で６日間培養した。
培養終了後、この培養液５０Ｌをシャープレス遠心機で遠心して上清と菌体に分けた。上清をＨＰ−２０カラム（Φ１０ ｘ ２０ｃｍ、三菱化学社、日本国）にかけ、水１．５Ｌで洗浄後、活性成分を１００％メタノールで溶出し、減圧下濃縮して凍結乾燥した。得られた粗物質２７ｇのうち１５ｇを少量の水に溶解してＯＤＳカラム（Φ５ ｘ ２８ｃｍ、センシュー科学、日本国）にて精製を行った。４０％メタノールの溶液でＯＤＳカラムを洗浄したのち、メタノール精製水（２：３、３：２、４：１、１００：０）の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィーを行い、各溶出液４Ｌを１００ｍＬ ｘ ４０本で分画した。活性画分（１００：０フラクション番号４からフラクション番号９）を濃縮乾固することで、褐色粉末物質４５０ｍｇを得た。これを少量のメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ、２０φ ｘ ２５０ｍｍ、センシュー科学、日本国）により精製を行った。５０％アセトニトリル水溶液（１０ｍＭ酢酸アンモニウ厶ｐＨ３、蟻酸により調整）を移動相とし、８ｍＬ／分の流速において、ＵＶ２１０ｎｍの吸収をモニターした。保持時間２１分、２３分、及び３８分に活性を示すピークを観察し、これらのピークを分取した。分取液はアンモニア水でｐＨを７とし、減圧濃縮した。さらに脱塩を目的に残渣水溶液をＯＤＳカラムに吸着し水洗後メタノール溶液で溶出し、濃縮乾固することによりＫ０４−０１４４Ａ物質及びＫ０４−０１４４Ｂ物質は部分精製画分として、またＫ０４−０１４４Ｃ物質は活性画分として収量１９．４ｍｇ単離した。
さらに、部分精製画分として得られたＫ０４−０１４４Ａ物質及びＫ０４−０１４４Ｂ物質を分取ＨＰＬＣ（カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ、２０φ ｘ ２５０ｍｍ、センシュー科学社、日本国）により最終精製を行った。４６％アセトニトリル水溶液（１０ｍＭリン酸２水素カリウムｐＨ４．７）を移動相とし、８ｍＬ／分の流速において、ＵＶ２１０ｍｍの吸収をモニターした。保持時間はＫ０４−０１４４Ａ物質が２０分、Ｋ０４−０１４４Ｂ物質が２６分で観察され、これらのピークを分取した。分取液は１０ｍＭのリン酸水素２カリウム水を用いてｐＨ７とし減圧下濃縮した。さらに脱塩を目的に残渣水溶液をＯＤＳカラムに吸着し水洗後メタノール溶液で溶出し、濃縮乾固することによりＫ０４−０１４４Ａ物質及びＫ０４−０１４４Ｂ物質を活性成分としてそれぞれ収量１５．７ｍｇ及び５．８ｍｇ単離した。
２）Ｋ０４−０１４４Ｄ物質の製造法
Ｋ０４−０１４４株をＫ０４−０１４４Ａ−Ｃ物質の製造と同じ生産培地５０Ｌを入れた９０Ｌ容ジャーファーメンターに１％植菌し、２７℃で６日間培養した。
培養終了後、この培養液５０Ｌをシャープレス遠心機で遠心して上清と菌体に分けた。上清をＨＰ−２０カラム（Φ１０ ｘ ２０ｃｍ、三菱化学社、日本国）にかけ、水１．５Ｌで洗浄後、活性成分を１００％メタノールで溶出し、減圧下濃縮して凍結乾燥した。得られた粗物質２７ｇのうち１５ｇを少量の水に溶解してＯＤＳカラム（Φ５ ｘ ２８ｃｍ、センシュー科学社、日本国）にて精製を行った。４０％メタノールの溶液でＯＤＳカラムを洗浄したのち、メタノール精製水（２：３、３：２、４：１、１００：０）の各混合溶媒を展開溶媒とするクロマトグラフィーを行い、各溶出液４Ｌで分画した。活性画分（４：１フラクション）を濃縮乾固することで、褐色粉末物質１３１ｍｇを得た。これを少量のメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＰＥＧＡＳＩＬ ＯＤＳ、２０φ ｘ ２５０ｍｍ、センシュー科学社、日本国）により精製を行った。６０％アセトニトリル水溶液（０．０５％リン酸を含む）を移動相とし、８ｍＬ／分の流速において、ＵＶ２１０ｎｍの吸収をモニターした。保持時間３２分に活性を示すピークを観察し、このピークを分取した。分取液は１Ｎ水酸化ナトリウム水を用いてｐＨを７とし、減圧下濃縮した。さらに脱塩を目的に残渣水溶液をＯＤＳカラムに吸着し水洗後メタノール溶液で溶出し、濃縮乾固することによりＫ０４−０１４４Ｄ物質を活性画分として収量１７．１ｍｇ単離した。

以上のとおり、Ｋ０４−０１４４物質を生産する能力を有するストレプトミセス エスピーに属するＫ０４−０１４４株を代表とする微生物を培地に培養して、その培養液中から採取したＫ０４−０１４４Ａ、Ｂ及びＣ物質は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を初めとするグラム陽性細菌に対して強い抗菌活性を有することから、ＭＲＳＡ感染症やβ−ラクタム抗生物質耐性を含む多剤耐性菌を起因とする感染症に治療薬とて有用であると期待される。また、同様にその培養液中から採取した新規Ｋ０４−０１４４Ｄ物質は、抗菌剤として利用されているβ−ラクタム抗生物質と併用することによりその効果を増強する作用を有することから、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症やβ−ラクタム抗生物質耐性を含む多剤耐性菌を起因とする感染症の治療薬として有用であると期待される。

Claims (3)

1. 下記式［Ｉ］
   で表されるＫ０４−０１４４Ａ物質、下記式［ＩＩ］
   で表されるＫ０４−０１４４Ｂ物質、下記式［ＩＩＩ］
   で表されるＫ０４−０１４４Ｃ物質のいずれかであるＫ０４−０１４４物質。
2. ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）に属し、請求項１記載のＫ０４−０１４４物質を生産する能力を有する微生物である、ストレプトミセス エスピー Ｋ０４−０１４４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ０４−０１４４）（ＮＩＴＥ ＢＰ−１０７）を培地に培養し、培養物中に前記Ｋ０４−０１４４物質を蓄積せしめ、該培養物から前記Ｋ０４−０１４４物質を採取することを特徴とするＫ０４−０１４４物質の製造法。
3. ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｋ０４−０１４４（ＮＩＴＥ ＢＰ−１０７）。