CN101365798B - 新型k04-0144物质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明，在培养基中培养以属于具有生产K04-0144物质的能力的链霉菌属的K04-0144株为代表的微生物，从其培养液中收集的K04-0144A、B和C物质由于具有对甲氧西林抗性黄色葡萄球菌(MRSA)为代表的革兰氏阳性菌具有强抗菌活性，因此可用作MRSA传染病和由包括β-内酰胺抗生物质抗性在内的多种药物抗性菌引起的传染病的治疗药物。而且，同样从其培养液中收集的新的K04-0144D物质与作为抗菌剂使用的β-内酰胺抗生物质一起使用具有增强其效果的作用，因此可用作甲氧西林抗性黄色葡萄球菌(MRSA)传染病和由包括β-内酰胺抗生物质抗性在内的多种药物抗性菌引起的传染病的治疗药物。

Description

新型K04-0144物质及其制备方法
技术领域
本发明涉及对包括甲氧西林(methicillin)抗性黄色葡萄球菌(MRSA)在内的细菌显示出抗菌作用的K04-0144A物质、K04-0144B物质和K04-0144C物质，以及通过与作为抗菌剂使用的β-内酰胺抗生物质并用来增强抗MRSA活性的K04-0144D物质中的任意一种新型K04-0144物质，及其制备方法。
背景技术
黄色葡萄球菌是一种通常存在于人和动物的皮肤、消化道内等的体表的革兰氏阳性球菌，对健康人无害，但在如术后患者和新生儿、高龄者这样的免疫力降低的情况下发病，除了伴随皮肤的切割和创伤的脓症等皮肤软组织传染病，甚至到肺炎、腹膜炎、败血症、髓膜炎等各种重症感染病之外，还引起由肠道毒和中毒性休克综合症毒素-1等毒素产生而导致的食物中毒和休克综合症、肠炎等。重症化的病例并不少，最严重的情况下还存在导致死亡的病例。近年来，甲氧西林抗性黄色葡萄球菌(MRSA)作为医院内感染的主要致病菌成为了社会问题。这种病原菌对β-内酰胺类抗生素等各种药物具有抗性，现在在MRSA感染病的治疗中，使用糖肽类的万古霉素和氨基糖苷类的阿贝卡星(Arbekacin)等抗生素。此外，也有近年来新开发的奎奴普汀/达福普汀(quinupristin/dalfopristin)合剂和唑烷酮类抗生素利奈唑胺(linezolid)。
已知现在作为对MRSA有效的药物使用的万古霉素和阿贝卡星具有由于第8脑神经损伤而导致的听力损伤等副作用。而且，糖肽类抗生素引起休克、肾毒性、红人综合症等副作用，临床给药时需要进行血中浓度的检测等慎重的给药。而且，最近，还报道了MRSA的多药抗性性化，以及对主要治疗药万古霉素具有低敏感性的菌。因此，期待新抗生素的出现和新疗法的开拓。作为实际的新疗法，进行了β-内酰胺类抗生素之间或β-内酰胺类抗生素与其它作用点的不同的抗生素的联合疗法(长谷川裕美等，抗菌药给药的科学，264-273，1998年)。而且，报道了其自身基本没显示出抗菌活性，但具有使β-内酰胺类抗生素的效力恢复或使之活化的作用的物质。例如，可以列举特表平9-509677号中公开的茶提取物或其活性部分(多酚化合物类)或思第芬(Stemphone)类的化合物(PCT/JP2006/305625)。
发明要解决的问题
在这种背景下，提供对MRSA显示出抗菌活性的具有新结构的新抗生素十分重要。而且，希望增强针对MRSA的β-内酰胺类抗生素的活性的药剂通过使β-内酰胺类抗生素的给药量减少，缩短给药时间从而使得抗性菌出现的频率降低。与此同时，还希望通过联合使用作用不同的两种药物，克服药物抗性。
本发明的目的是提供MRSA感染病和包括β-内酰胺类抗生素抗性在内的多药剂抗性菌导致的感染病的新型治疗药。
用于解决问题的方法
本发明人等对于以微生物产生的代谢产物作为对象显示出对MRSA的抗菌活性的化合物或对增强对MRSA的β-内酰胺类抗生素的活性的化合物进行研究，结果发现新从土壤中分离的放线菌K04-0144株的培养液中产生了显示出目的活性的物质。然后，从该培养物中分离纯化显示出目的活性的物质，获得了3种抗MRSA抗生素和1种增强β-内酰胺类抗生素的活性的化合物。由于以往并不了解具有这种化学结构的物质，因此将抗MRSA抗生素称为K04-0144A物质，K04-0144B物质和K04-0144C物质，并将增强β-内酰胺类抗生素的活性的活性物质称为K04-0144D物质。而且，把全部这类物质称为K04-0144物质。
本发明基于这种发现而完成，为下式[I]表示的K04-0144A物质，
下式[II]表示的K04-0144B物质，
下式[III]表示的K04-0144C物质，
以及下式[IV]表示的K04-0144D物质
Figure S2006800476793D00041
中的任一种K04-0144物质。
本发明还是一种新型K04-0144物质的制造方法，该方法在培养基中培养属于链霉菌属的、具有生产K04-0144物质的微生物，使K04-0144物质在培养物中积累，从该培养物中收集K04-0144物质。
本发明还是微生物-链霉菌属(Streptomyces sp.)的种K04-0144(NITE BP-107)。
作为用于生产本发明的前式[I]、[II]、[III]和[IV]表示的新型K04-0144物质使用的菌株，作为其中一例，可以列举由本发明人等从冲绳县石垣岛的土壤中新分离的链霉菌属(Streptomyces sp.)的种K04-0144株。
本菌株的菌体学性状如下所示。
(I)形态的性质
营养菌丝在各种琼脂培养基上很发达，没有观察到断裂。气生菌丝大量着生于酵母·麦芽提取物琼脂培养基和甘油·天冬酰胺琼脂培养基中，呈现出白色至灰色的颜色。通过显微镜下的观察，在气生菌丝上发现20个以上的孢子的连锁，其形态为螺旋状，孢子的大小为约1.0×1.0μm的圆柱状。孢子的表面平滑。没有发现菌核、孢子和游动孢子。
(II)各种培养基上的性状
按照E.B.Shirling和D.Gottlieb的方法(Internationaljournal of systematical Bacteriology，16卷，313页，1966年)制备的本生产菌的培养性状示于下表。使用colour harmony manual第4版(美国芝加哥的container corporation，1958年)作为标准色，确定颜色，色片名和其代码一起记载括弧内。以下只要不是特别提到，就是27℃，第二周时的各培养基中的观察结果。
培养性质
Figure S2006800476793D00061
(III)生理学的各种性质
(1)黑色素的生成
(a)酪氨酸琼脂                           阴性
(b)蛋白胨·酵母·铁琼脂                 阴性
(c)胰蛋白胨·酵母液                     阴性
(d)单纯明胶培养基(21-23℃)              阴性
(2)硝酸盐的还原                         阴性
(3)明胶的液化(21-23℃)(单纯明胶培养基)  阴性
(4)淀粉的加水分解                       阳性
(5)脱脂乳的凝固(37℃)                   阳性
(6)脱脂乳的蛋白胨化(37℃)               阳性
(7)生长稳定范围                         12-42℃
(8)碳源的利用性(Pridham-Gottlieb琼脂培养基)
利用：D-葡萄糖，蜜二糖，D-甘露醇，L-鼠李糖
或利用：L-阿拉伯糖，D-木糖，棉子糖，D-果糖，蔗糖
(9)纤维素的分解                         阴性
(IV)化学分类学的性状
细胞壁的二氨基庚二酸是LL型，主要甲基萘醌类是MK-9(H6)和MK-9(H8)。
(V)结论
以上，该菌的菌学性质的概况如下所示。细胞壁中的二氨基庚二酸是LL型，主要甲基萘醌类是MK-9(H6)和MK-9(H8)。孢子连锁的形状呈螺旋状，形成长孢子链，孢子的表面平滑。培养上的各种性质，营养菌丝呈褐色，气生菌丝呈白色至灰色系的颜色。不产生黑色素。
根据这些结果，基于《伯杰氏系统细菌学手册》(BERGEY’S MANUALOF Systematic Bacteriology)，第4卷，1989年，认为其是属于链霉菌属的菌种。
微生物的国际保藏
本菌株，作为链霉菌属K04-0144，根据专利手续上的微生物保藏的国际承认的相关布达佩斯条约，位于邮政编码292-0818日本千叶县目更津市kazusa镰足2-5-8(2-5-8Kazusa kamatari Kisarazu-shi，Chiba-ken 292-0818日本)的独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(International Administrative Agency NationalInstitute of Technology and Evaluation Patent MicroorganismsDepositary(NPMD))。保藏日为2005年6月30日，保藏号为NITEBP-107。
理化的性状
接着，对本发明的K04-0144物质的理化学性质进行说明。
1.K04-0144A物质
(1)性状：白色粉末
(2)分子式：C64H103N4O33P
HR Neg.ESI-MS(m/z)[M-H]-计算值1485.6206，实测值1485.6164
(3)分子量：1487
在Neg.ESI-MS(m/z)观测[M-H]-1485
(4)紫外部吸收光谱：在甲醇溶液中测定的紫外部吸收光谱示于图1，显示出末端吸收。
(5)红外部吸收光谱：用溴化钾片剂法测定的红外部吸收光谱示于图2，在v max 3399，2960，1722，1673，1382，1068cm-1等出显示出极大吸收
(6)比旋光度[α]D 24+6.7°(c＝0.1，甲醇)
(7)对溶剂的溶解性：可溶于甲醇和水，不溶于氯仿和己烷
(8)质子和碳核磁共振光谱：重甲醇中，Varian公司制，400MHz核磁共振光谱仪进行测定。第3图中表示了质子核磁共振光谱，第4图中表示了碳核磁共振光谱。氢的化学位移(ppm)和碳的化学位移(ppm)如下所示。
δH：0.97(6H)，1.26(3H)，1.38(2H)，1.41(3H)，1.60(3H)，1.62(3H)，1.67(3H)，1.78(3H)，1.90(2H)，2.02(2H)，2.04(3H)，2.05(3H)，2.10(4H)，2.13(1H)，2.17(1H)，2.70(1H)，3.24(1H)，3.31(2H)，3.34(1H)，3.46(1H)，3.51(1H)，3.55(3H)，3.60(3H)，3.69(3H)，3.81(1H)，3.90(2H)，4.10(2H)，4.18(3H)，4.29(3H)，4.38(1H)，4.43(1H)，4.45(1H)，4.47(2H)，4.67(2H)，5.06(1H)，5.10(1H)，5.14(1H)，5.28(1H)，5.38(1H)，5.45(1H)，5.93(1H)ppm
δC：16.1，16.4，17.8，18.0，23.3，23.5，24.0，26.0，27.7，27.9，27.9，32.4，32.7，33.5，35.9，36.5，40.9，42.9，55.7，56.9，62.5，66.9，68.5，69.4，71.6，71.6，72.2，72.6，73.8，73.8，74.0，74.1，74.7，75.0，75.2，75.4，76.4，78.0，78.2，78.3，79.7，82.4，86.1，96.2，103.2，104.3，104.7，105.0，109.3，122.7，123.5，125.4，126.8，132.2，137.4，141.6，142.6，151.1，159.2，173.5，173.8，174.2，174.6，175.1ppm
对如上所示的K01-0144A物质的各种理化学性状和光谱数据进行详细研究，结果测定K01-0144A物质是前述的式[I]表示的化学结构。
2.K01-0144B物质
(1)性状：白色粉末
(2)分子式：C58H93N4O28P
HR Neg.ESI-MS(m/z)[M-H]-计算值1323.5656，实测值1323.5636
(3)分子量：1325
在Neg.ESI-MA(m/z)观测[M-H]-1323
(4)紫外部吸收光谱：在甲醇溶液中测定的紫外部吸收光谱示于第5图，显示出末端吸收
(5)红外部吸收光谱：用溴化钾片剂法测定的红外部吸收光谱示于第6图，在v max 3399，2923，1716，1675，1378，1068cm-1等出显示出极大吸收
(6)比旋光度[α]D 24+4.0°(c＝0.1，甲醇)
(7)对溶剂的溶解性：可溶于水，甲醇和二甲基亚砜，不溶于丙酮，氯仿和n-己烷
(8)质子和碳核磁共振光谱：重甲醇中，Varian公司制，400MHz核磁共振光谱仪进行测定。第7图中表示了质子核磁共振光谱，第8图中表示了碳核磁共振光谱。氢的化学位移(ppm)和碳的化学位移(ppm)如下所示。
δH：0.97(6H)，1.26(3H)，1.38(2H)，1.42(3H)，1.60(3H)，1.61(3H)，1.67(3H)，1.77(3H)，1.91(2H)，2.02(5H)，2.03(3H)，2.10(6H)，2.70(2H)，3.33(2H)，3.56(3H)，3.58(1H)，3.60(1H)，3.64(3H)，3.84(3H)，4.09(1H)，4.12(1H)，4.15(1H)，4.17(1H)，4.20(2H)，4.28(1H)，4.37(1H)，4.44(1H)，4.45(2H)，4.67(2H)，5.04(1H)，5.10(2H)，5.14(1H)，5.29(1H)，5.38(1H)，5.45(1H)，6.04(1H)ppm
δC：16.1，16.3，17.8，18.0，23.1，23.3，24.0，26.0，27.7，27.8，27.9，32.4，32.7，33.4，36.0，36.5，40.9，42.9，55.9，56.7，60.8，67.0，67.7，71.6，72.1，72.6，73.7，73.8，73.9，74.0，74.6，75.1，76.0，76.3，77.9，79.9，81.5，86.4，96.5，103.4，104.6，105.2，109.3，122.8，123.5，125.4，126.8，132.2，137.4，141.7，142.4，151.1，159.2，173.2，173.7，174.1，174.7，174.9ppm
对如上所示的K04-0144B物质的各种理化学性状和光谱数据进行详细研究，结果测定K04-0144B物质是前述的式[II]表示的化学结构。
3.K04-0144C物质
(1)性状：白色粉末
(2)分子式：C58H94N5O27P
HR Neg.ESI-MS(m/z)[M-H]-计算值1322.5809，实测值1322.5795
(3)分子量：1324
在Neg.ESI-MS(m/z)观测[M-H]-1322
(4)紫外部吸收光谱：在甲醇溶液中测定的紫外部吸收光谱示于第9图，显示出末端吸收
(5)红外部吸收光谱：用溴化钾片剂法测定的红外部吸收光谱示于第10图，在v max 3400，2925，1677，1648，1400，1066cm-1等出显示出极大吸收
(6)比旋光度[α]D 24+3.7°(c＝0.1，甲醇)
(7)对溶剂的溶解性：可溶于水，甲醇和二甲基亚砜，不溶于丙酮，氯仿和n-己烷
(8)质子和碳核磁共振光谱：重甲醇中，Varian公司制，400MHz核磁共振光谱仪进行测定。第11图中表示了质子核磁共振光谱，第12图中表示了碳核磁共振光谱。氢的化学位移(ppm)和碳的化学位移(ppm)如下所示。
δH：0.97(6H)，1.25(3H)，1.38(2H)，1.42(3H)，1.60(3H)，1.61(3H)，1.67(3H)，1.76(3H)，1.91(2H)，2.01(6H)，2.04(2H)，2.11(6H)，2.70(2H)，3.34(2H)，3.56(4H)，3.64(4H)，3.72(1H)，3.84(2H)，4.06(1H)，4.11(3H)，4.17(1H)，4.21(2H)，4.42(1H)，4.43(1H)，4.45(1H)，4.53(1H)，4.67(2H)，5.08(1H)，5.12(1H)，5.14(1H)，5.31(1H)，5.35(1H)，5.38(H)，5.99(1H)ppm
δC：16.1，16.4，17.8，17.9，23.1，23.3，23.9，26.0，27.7，27.9，27.9，32.3，32.6，33.4，36.0，36.5，40.9，42.9，56.5，56.7，61.0，67.2，67.6，70.7，72.3，72.8，73.5，73.7，73.9，74.0，74.4，75.7，76.0，76.0，78.3，79.4，81.6，85.1，96.2，103.5，103.9，104.9，109.3，122.6，123.5，125.4，126.8，132.2，137.3，141.6，142.1，151.1，159.2，173.7，173.7，173.7，174.0，174.7ppm
对如上所示的K04-0144C物质的各种理化学性状和光谱数据进行详细研究，结果测定K04-0144C物质是前述的式[III]表示的化学结构。
4.K04-0144D物质
(1)性状：白色粉末
(2)融点：138℃
(3)分子式：C25H41NO5S
HR FAB-MS(m/z)[M-H+2Na]+计算值512.2423，实测值512.2416
(4)分子量：467
在FAB-MS(m/z)观测[M-H+2Na]+512
(5)紫外部吸收光谱：在甲醇溶液中测定的紫外部吸收光谱示于第13图，在232nm显示出末端吸收
(6)红外部吸收光谱：用溴化钾片剂法测定的红外部吸收光谱示于第14图，在v max 3427，2927，2864，1641，1604，1398，1124、1078cm-1等出显示出极大吸收
(7)比旋光度[α]D 25+26.8°(c＝0.1，甲醇)
(8)对溶剂的溶解性：可溶于甲醇和水，不溶于氯仿和己烷
(9)质子和碳核磁共振光谱：重甲醇中，Varian公司制，400MHz核磁共振光谱仪进行测定。第15图中表示了质子核磁共振光谱，第16图中表示了碳核磁共振光谱。氢的化学位移(ppm)和碳的化学位移(ppm)如下所示。
δH：0.84(5H)，0.91(4H)，1.00(3H)，1.14(1H)，1.20(1H)，1.35(2H)，1.63(4H)，1.75(3H)，1.98(3H)，2.13(1H)，2.42(1H)，2.63(1H)，2.77(1H)，2.82(1H)，3.02(1H)，3.82(1H)，4.41(1H)，4.86(1H)，5.03(1H)，5.55(2H)，6.35(1H)ppm
δC：12.0，16.0，19.3，22.3，22.8，24.4，27.8，34.0，34.1，37.7，39.2，39.8，41.1，43.0，53.7，55.2，55.8，72.3，78.8，110.1，133.2，137.6，143.1，172.5，177.4ppm
对如上所示的K04-0144D物质的各种理化学性状和光谱数据进行详细研究，结果测定K04-0144D物质是前述的式[IV]表示的化学结构。
生物学性状
下面，对本发明的K04-0144物质的生物学性质进行详细的说明。
K04-0144A、B和C物质的抗菌活性
最小发育抑制浓度(MIC)的测定按照琼脂平板稀释法(日本化学疗法标准法，CHEMOTHERAPY第29卷76-79页1981年)进行。
作为试菌，使用包括临床分离的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)株在内的27种菌株。各个待验菌在Mueller-Hinton肉汤(2.1％w/v)(DIFCO)培养基中在37℃培养20小时后，在相同培养基中以相当于约106/ml的菌数悬浮，作为接种用菌液使用。用微量接种仪(microplanter)将制成的菌液由128μg/ml稀释两倍，涂布于含有各浓度阶段的K04-0144A、B和C物质的MHA培养基(Mueller-Hinton broth 2.1％(w/v)，琼脂1.5％)上，37℃培养20小时后，通过用肉眼确认菌生长的有无，计算MIC。而且，使用万古霉素、阿贝卡星，利奈唑胺作为比较对象。其结果汇总于下表1。
表1对K04-0144A、B和C物质的对临床分离株的活性进行评价的结果(MIC)(μg/ml)
Figure S2006800476793D00131
由上可知K04-0144A、B和C物质对含有MRSA的革兰氏阳性菌，以与已有药物(万古霉素、阿贝卡星和利奈唑胺)同等或其之上的强度抑制其生长。
使用蚕在MRSA感染模型中的活性评价
报道了使用蚕的感染系统作为使用动物的体内MRSA感染模型的替代法(Kaito等人，Microbial Pathogenesis.32卷，183-190页，2002年)。按照该方法测定K04-0144A物质的效果。
作为试验菌，使用临床分离的MRSA(K24株)。将MRSA在LB-10培养基(DIFCO)中于37℃静置培养18小时，将50μl接种于5只2天大的蚕(约2g、爱媛蚕种社，日本)的背脉管中。将K04-0144A物质调整为1mg/ml，用注射器从5只MRSA感染蚕的背脉管给药50μ1(25mg/kg)。接种后饲养72小时，比较这期间观察的试样给药和非给药组的存活率，进行判定。任何没有接种的蚕(对照)和只给药了25mg/kg K04-0144A物质至少存活至72小时后，由此确认这种条件下K04-0144A物质对蚕完全没有毒性。而且，接种了50μl MRSA菌液的蚕在接种72小时后全部死亡。这种条件下，以25mg/kg给药了K04-0144A物质的蚕即使在接种MRSA72小时后也全部存活。同样，以25mg/kg给药了万古霉素的蚕即使在接种MRSA72小时后也全部存活。
这样，使用蚕的MRSA感染实验中显示出K04-0144A物质的有效性。
K04-0144D物质的亚胺培南活性增强作用
1.用纸盘(paperdisc)法评价亚胺培南(imipenem)活性增强作用的方法
使用临床分离的甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)K24株作为试验菌。MRSA K-24株在Mueller-Hinton broth(2.1％w/v)(DIFCO)37度培养20小时后，以相当于0.5Mc FARAND(约108CFU/mL)悬浮于相同培养基中，在MHA培养基(Mueller-Hinton broth 2.1％(w/v)，琼脂1.5％)和相同组成的培养基中以不影响试验菌生长的浓度即10μg/ml的终浓度添加亚胺培南(日本，万有制药社，Tienam肌注用效价0.5)，在该培养基中涂抹上述菌液。按照美国临床检查标准化委员会(National Committee for Laboratory Standard，NCCLS)法，用灭菌棉签进行涂布。对试验菌的各培养基上的抗菌活性，按照纸盘法(薄为6mm：ADVANTECH公司)，以mm单位记录37℃20小时后的抑制圈径的直径。其结果，如表2所示的，1μg纸盘条件下，K04-0144D物质其本身也没有测定出抑制圈，与之相对，在亚胺培南存在下，测定出15mm的抑制圈，确认了亚胺培南活性增强作用。
表2通过纸盘法获得的K04-0144D物质亚胺培南活性增强作用的结果
(μg/6mm纸盘)                                                             抑制圈直径(mm)
2.通过微量液体稀释法对各种抗菌剂的活性增强作用进行评价的方法
对于通过用纸盘法进行的评价显示出强亚胺培南活性增强作用的K04-0144D物质，按照微量液体稀释法评价亚胺培南和其它抗菌剂的活性增强。作为其它药剂，使用万古霉素(日本，和光纯药社)，链霉素(日本，明治制果社)和环丙沙星(ciprofloxacin)(日本，和光纯药社)。评价，对日本化学疗法学会标准法(CHEMOTHERAPY 38卷，103-105页，1990年)进行部分改变来进行。
在96孔板(美国，Corning公司制)的各孔中，添加85μlMueller-Hinton broth(2.1％w/v)后，将5μl预先用无菌水分段稀释的亚胺培南以4.8×10-4至256μg/ml的终浓度添加到各孔中。进而，在各孔中，以不影响生长的终浓度16μg/ml在5μl水溶液中添加K04-0144D物质本身。充分混合后，与上述方式同样，将试验菌MRSA以相当于0.5Mc FARAND(约108CFU/mL)悬浮，将其在相同培养基中稀释至10倍，在每孔中接种5μl该稀释的菌液。37℃培养20小时后，以肉眼没有发现孔中的菌的生长的最小药剂浓度作为MIC。各种抗菌剂单独时的MIC以及各种抗菌剂和K04-0144D物质联合使用时的MIC示于表3，32μg/mL至0.03μg/mL亚胺培南，确认了1024倍的活性增强。另一方面，在万古霉素，链霉素和环丙沙星中没有确认活性增强作用，因此清楚了K04-0144D物质的活性增强作用特异性作用于β-内酰胺抗生素。
表3：通过微量液体稀释法获得的K04-0144D物质的亚胺培南活性增强作用的结果
检测菌：MRSA(日本，北里医院分离株)
K04-0144D物质(16μg/mL)：最小发育抑制浓度的1/4浓度
附图的简要说明
图1：是表示本发明的K04-0144A物质的紫外部吸收光谱(甲醇溶液中)的图。
图2：是表示本发明的K04-0144A物质的红外部吸收光谱(溴化钾法)的图。
图3：是表示本发明的K04-0144A物质的质子核磁共振光谱(重甲醇中)的图。
图4：是表示本发明的K04-0144A物质的碳核磁共振光谱(重甲醇中)的图。
图5：是表示本发明的K04-0144B物质的紫外部吸收光谱(甲醇溶液中)的图。
图6：是表示本发明的K04-0144B物质的红外部吸收光谱(溴化钾法)的图。
图7：是表示本发明的K04-0144B物质的质子核磁共振光谱(重甲醇中)的图。
图8：是表示本发明的K04-0144B物质的碳核磁共振光谱(重甲醇中)的图。
图9：是表示本发明的K04-0144C物质的紫外部吸收光谱(甲醇溶液中)的图。
图10：是表示本发明的K04-0144C物质的红外部吸收光谱(溴化钾法)的图。
图11：是表示本发明的K04-0144C物质的质子核磁共振光谱(重甲醇中)的图。
图12：是表示本发明的K04-0144C物质的碳核磁共振光谱(重甲醇中)的图。
图13：是表示本发明的K04-0144D物质的紫外部吸收光谱(甲醇溶液中)的图。
图14：是表示本发明的K04-0144D物质的红外部吸收光谱(溴化钾法)的图。
图15：是表示本发明的K04-0144D物质的质子核磁共振光谱(重甲醇中)的图。
图16：是表示本发明的K04-0144D物质的碳核磁共振光谱(重甲醇中)的图。
用于实施发明的最佳方式
以下列举本发明的实施例具体说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
K04-0144物质的制备法
1)K04-0144A、B和C物质的制备法
在琼脂斜面培养基(淀粉1.0％(日本，关东化学社)、0.3％N-Z胺(日本，和光纯药社)、0.02％酵母提取物(日本，东方酵母社)、0.1％肉提取物(日本，极东制药工业社)、0.3％碳酸钙(日本，关东化学社)、1.2％琼脂(日本，清水食品社)，调整成pH7.0)中培养的K04-0144株用接种环接种于分注了100ml的种培养基(2.4％淀粉(日本，关东化学社)、0.1％葡萄糖(日本，和光纯药社)、0.3％蛋白胨(日本，极东制药工业社)、0.5％酵母提取物(日本，东方酵母社)、0.4％CaCO3(日本，关东化学社)调整成pH6.0)的容积为500mL三角烧瓶中，27℃在旋转摇床(210rpm)中培养3天后，1％接种于加入了50L生产培养基(0.5％葡萄糖(日本，和光纯药社)、0.5％玉米浆粉(日本，Maruko社)、1.0％麦片(日本，日本食品制造社)、1.0％棉子提取物(Pharmamedia)(日本、Iwaki公司)、0.5％K2HPO4(日本，关东化学社)、0.5％MgSO4·7H2O(日本，和光纯药社)、0.1％Tris盐溶液、0.1％FeSO4·7H2O(日本，关东化学社)、0.1％MnCl2·4H2O(日本，关东化学社)、0.1％ZnSO4·7H2O(日本，关东化学社)、0.1％CuSO4·5H2O(日本，关东化学社)、0.1％CoCl2·6H2O(日本，关东化学社)、调整成pH7.0)的溶剂为90L的缸发酵桶中，于27℃培养6天。
培养终止后，通过将50L该培养液用Sharpless离心机离心，将上清与菌体分开。将上清上样于HP-20柱(φ10×20cm、三菱化学社、日本)，用1.5L的水清洗后，用100％甲醇洗脱活性成分，减压浓缩，冷冻干燥。将获得的粗物质27g中的15g溶于少量水中，用ODS柱(φ5×28cm、Senshu科学、日本)进行纯化。用40％甲醇的溶液清洗ODS柱后，以甲醇纯化水(2∶3、3∶2、4∶1、100∶0)的各混合溶液作为洗脱剂进行色谱，对4L各洗脱液以100mL×40本分馏。通过浓缩干燥活性级分(100∶0级分编号4至级分编号9)，获得了450mg褐色粉末物质。将其溶解于少量的甲醇中，通过分取HPLC(柱：PEGASIL ODS、20φ×250mm、Senshu科学、日本)进行纯化。以50％乙腈水溶液(10mM醋酸铵pH3，用蚁酸调制)作为流动相，在8mL/分的流速中，监控UV210nm的吸收。观察保持时间21分、23分和38分时呈现活性的峰，分取这些峰。分取液用氨水调整成pH7，减压浓缩。进而，对残渣水溶液目的性脱盐，吸附于ODS柱上，水洗后用甲醇溶液洗脱，通过浓缩干燥，分离K04-0144A物质和K04-0144B物质作为部分纯化级分，并且，分离产量为19.4mg的K04-0144C物质作为活性级分。
再采用分取HPLC(柱：PEGASIL ODS、20φ×250mm、Senshu科学、日本)对作为部分纯化级分获得的K04-0144A物质和K04-0144B物质进行最终纯化。以46％乙腈水溶液(10mM磷酸二氢钾pH4.7)作为流动相，在8mL/分的流速中，监控UV210mm的吸收。在保持时间20分时观察K04-0144A物质、26分时K04-0144B物质，分取这些峰。分取液用氨10mM的磷酸二氢钾水调整成pH7，减压浓缩。进而对残渣水溶液目的性脱盐，吸附于0DS柱上，水洗后用甲醇溶液洗脱，通过浓缩干燥，分别分离产量为15.7mg和5.8mg的K04-0144A物质和K04-0144B物质作为活性级分。
2)K04-0144D的制备方法
将K04-0144株1％接种于装入了50L与K04-0144A-C物质的制造相同的生产培养基的容积为90L的缸发酵桶中，于27℃培养6天。
培养终止后，通过将50L该培养液用Sharpless离心机离心，将上清与菌体分开。将上清上样于HP-20柱(φ10×20cm、三菱化学社、日本)，用1.5L的水清洗后，用100％甲醇洗脱活性成分，减压浓缩，冷冻干燥。将获得的粗物质27g中的15g溶于少量水中，用ODS柱(φ5×28cm、Senshu科学、日本)进行纯化。用40％甲醇的溶液清洗ODS柱后，以甲醇纯化水(2∶3、3∶2、4∶1、100∶0)的各混合溶液作为洗脱剂进行层析，以4L各洗脱液进行分级。通过浓缩干燥活性级分(4∶1级分)，获得了131mg褐色粉末物质。将其溶解于少量的甲醇中，通过分取HPLC(柱：PEGASIL ODS、20φ×250mm、Senshu科学、日本)进行纯化。以60％乙腈水溶液(含0.05％磷酸)作为流动相，在8mL/分的流速中，监控UV210nm的吸收。观察保持时间32分时呈现活性的峰，分取该峰。分取液用1N氢氧化钠调整成pH7，减压浓缩。进而，对残渣水溶液目的性脱盐，吸附于ODS柱上，水洗后用甲醇溶液洗脱，通过浓缩干燥，分离产量为17.1mg的K04-0144D物质作为活性级分。
产业上的利用领域
如上所述，在培养基中培养具有生产K04-0144物质能力的以属于链霉菌属的K04-0144株作为代表的微生物，从其培养物中收集的K04-0144A、B和C物质具有对甲氧西林抗性黄色葡萄球菌(MRSA)为代表的革兰氏阳性菌具有强抗菌活性，因此作为MRSA传染病和，由包括β-内酰胺抗生物质抗性在内的多种药物抗性菌引起的传染病的治疗药物是有用的。而且，同样从其培养液中收集的新的K04-0144D物质与作为抗菌剂使用的β-内酰胺抗生物质一起使用具有增强其效果的作用，因此期待其作为甲氧西林抗性黄色葡萄球菌(MRSA)传染病和，由包括β-内酰胺抗生物质抗性在内的多种药物抗性菌引起的传染病的治疗药物是有用的。

Claims (3)

1.下式[IV]表示的K04-0144D物质
Figure FSB00000741422000011
2.示于式[IV]的K04-0144D物质的制备方法，其特征在于在培养基中培养保藏号为NITE BP-107的链霉菌(Streptomycessp.)K04-0144、使K04-0144D物质在培养物中积累，从该培养物中收集K04-0144D物质。
3.链霉菌(Streptomyces sp.)K04-0144，其保藏号为NITEBP-107。
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