WO1995029190A1 - Multirepresentation d'un analogue peptidique du substrat de la dppiv, notamment de type kpr, afin d'inhiber l'entree du hiv dans les cellules - Google Patents

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WO1995029190A1
WO1995029190A1 PCT/FR1995/000528 FR9500528W WO9529190A1 WO 1995029190 A1 WO1995029190 A1 WO 1995029190A1 FR 9500528 W FR9500528 W FR 9500528W WO 9529190 A1 WO9529190 A1 WO 9529190A1
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hiv
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tass
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Ara Hovanessian
Christian Callebaut
Bernard Krust
Etienne Jacotot
Sylviane Muller
Jean-Paul Briand
Gilles Guichard
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Institut Pasteur
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    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present application relates to inhibitors of infection by an HIV retrovirus, comprising a peptide analog of the DPPIV substrate or / and of motifs conserved in the V3 loop of the envelope glycoprotein of a HIV type retrovirus.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • retroviruses So far two distinct but related types of retroviruses, the HIV-1 type and the HIV-2 type have been identified.
  • Infection of CD4 + T lymphocytes, onocytes and macrophages by HIV requires the interaction of the virus env gene products with the cellular CD4 receptor (Klatzman D, et al. Nature 1984; 312: 767-768).
  • the HIV env gene codes for a precursor polyprotein which is cleaved by a cellular protease, leading to the production of extracellular or surface (SU) and transmembrane (TM) glycoproteins (Eiden LE, et al. Immunol. Today 1992 13 : 201-206).
  • the surface protein through non-covalent interactions with the transmembrane protein, is exposed on the surface of infected cells or on the surface of viral particles.
  • the CD4 receptor is a glycoprotein composed of an amino-terminal extracellular region containing four domains related to the immunoglobulin family and of a carboxy-terminal region containing the transmembrane and cytoplastic domains (Eiden et al).
  • the first a-terminal domain of the CD4 molecule appears to be the main binding site for HIV surface proteins. Consequently, this bond induces a change in conformation of the SU-TM complex (complex formed by surface and transmembrane glycoproteins) allowing the interaction of the amino-terminal domain of the transmembrane protein with the cell membrane, thus causing the fusion of viral and cell membranes (Marsh M, et al Immunol.
  • V3 loop contains 35 to 41 amino acids whose cysteines at the two ends are linked, by a disulfide bridge forming a loop.
  • the V3 loop contains conserved basic residues and in addition the sequence near the bound cysteines is similar in most isolates.
  • the inventors are interested in a particular sequence of the V3 loop of the surface glycoprotein of the envelope of the HIV-1 retrovirus, distinct from those which have been the subject of experiments in the prior art, and in the corresponding sequences.
  • HIV-2 and SIV retroviruses They observed that a very large number of identified isolates of HIV, in particular HIV-1 (more than 90%) exhibit a peptide motif constituted by the amino acid sequence Gly-Pro-Gly (Glycine - Proline - Glycine or according to the one-letter code GPG) and more particularly a Gly-Pro motif, preserved. This GP or GPG motif also remains unchanged in vivo for several years in individuals infected with HIV-1, while other substitutions appear in the V3 loop (Holmback et al. J. Virol. 1993, 67: 1612-1619).
  • the inventors have demonstrated that a surface cellular protein interacts with the glycoproteins of the HIV or SIV envelope, in particular at the level of the V3 loop and is capable of cleaving it. This cleavage would take place at a site not identified as such until the present invention.
  • the surface cellular protein is dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) also called antigen or CD26 receptor (Barclay AN, et al. (1993). Facts book. London: Harcourt Brace Jovanich).
  • DPPIV / CD26 is also called: DPIV, DAPIV, SGP-115/107, Tal and Tal03.
  • DPPIV is a cell surface protease (EC 3.4.14.5) which generally has exopeptidase activity and under certain conditions endopeptidase activity (Nagatsu T, et al. Anal. Bioche. 1976; 74: 466-476 - Kudo M, et al J. Bioche. 1985; 97: 1211-1218 - Kenny AJ, et al. Biochem. J. 1976; 155: 169-182).
  • X can be an amino acid residue, in particular Glycine (Gly), Alanine (Ala), Lysine (Lys), Arginine (Arg), Glutamic Acid (Glu), Aspartic Acid (Asp) or even Proline (Pro).
  • the CD26 antigen is widely expressed as a 110 to 120 kDa transmembrane glycoprotein, which is identical to the cell surface serine protease called dipeptidyl peptidase IV.
  • This enzyme which is generally considered as an exopeptidase, cleaves dipeptides in the amino-terminal part of polypeptide substrates, since the penultimate residue is a proline residue; that is to say, this enzyme allows the cleavage of X-P-polypeptide, P being a Proline residue, when X is a free N-terminal amino acid (Kudo M, et al. J. Biochem. 1985; 97 : 1211-1218).
  • DPPIV has been described as capable of catalyzing an "endopeptidase-like" cleavage, after a "GP-like” dipeptide motif within synthetic peptides (Kenny AJ, et al. Biochem. J. 1976; 155: 169 -182) and to bind to collagen (Beauvois B, et al. I. Marcel Dekker (Eds.) New York, 1991). DPPIV binds collagen but this binding of DPPIV to collagen does not affect its enzymatic activity (Hanski C, et al. Exp. Cell Res. 1988; 178: 64-72), thus suggesting the existence of attachment and catalytic in different areas of DPPIV / CD26.
  • DPPIV is a glycoprotein comprising several oligosaccharide chains linked to N residues.
  • This enzyme exists in a wide variety of tissues including in lymphoid and non-lymphoid organs (Gorrel MD, et al. Cell.
  • DPPIV is a co-receptor for HIV, which is capable of binding the V3 loop, and / or other regions in the glycoproteins of the SU and TM viral envelope. This step concerning the interaction of the SU / TM complex with DPPIV / CD26 is essential for the penetration of HIV into CD4 T cells.
  • the subject of the invention is therefore inhibitors of infection by an HIV retrovirus, comprising a plurality of motifs capable of being recognized by an ectoprotein (on the surface of cells) in particular by the CD26 receptor (also called the DPPIV enzyme). reasons all being carried by a peptide matrix or not authorizing their multiple presentation to the enzyme. In what follows, reference will be made to all of these motifs thus presented to the enzyme under the expression "repeated motifs”.
  • the matrix allowing the multiple presentation of a chosen motif is defined in relation to its ability to make the above motif accessible.
  • peptide (s) as used in the present context, whether it is “repeating peptide motifs" or the “peptide matrix”, is understood to cover both purely peptide molecules (in so far as they are based on natural amino acid residues) and molecules derived from the preceding ones by replacing all or part of its natural amino acid residues by optical isomers of these amino acids natural or even by "non-peptide” groups (leading for example to "pseudo-peptides”), provided that these replacements do not entail a significant alteration of the relevant properties of said repeating units (in particular their ability to be recognized by the DPPIV) or matrix (in particular capacity for presentation of said repeating motifs to the enzyme).
  • the peptide matrix carrying the "repeated motifs" contains amino acid residues having a reactive function which is not engaged in a peptide bond with neighboring amino acid residues, these reactive functions involved in fixing said repeated patterns on this matrix.
  • the peptide matrix comprises amino acid residues of lysine type (K), the aforementioned repeat units then being grafted onto the epsilon-a groups ino of at least part of these lysine residues.
  • amino acid residues can also be used for the grafting of the aforementioned repeating units, such as arginine or also glutamyl residues which carry a carboxyl function not engaged in peptide bonds with other amino acids of the matrix.
  • the matrix can be synthetic and therefore prepared by chemical synthesis, in particular by using solid phase synthesis as described by Merrifield.
  • a first molecule of interest in the context of carrying out the invention is, for example, characterized in that the peptide matrix comprises the following amino acid sequence: K X., KX 2 X 3 in which X : is preferably , lysine, valine, alanine or glutamic acid or isoleucine, X 2 and X 3 represent glycine or proline and are different from each other.
  • the repeating units can in this case be linked to the e-amino functions of the lysine residues, in particular by peptide bonds, and can be presented in the same plane or on the contrary in different planes. Likewise, these reasons can be linked same side of the matrix with respect to the lysine residue or in opposite manner.
  • amino acid residue X ⁇ can, if necessary, be deleted.
  • peptide matrices of interest for the production of the molecules of the invention include an amino acid chain chosen from the following sequences
  • the amino acids contained in the peptide matrix are in the dextrorotatory form.
  • the peptide bonds between the amino acids of the matrix are modified in particular to improve their resistance to hydrolysis by proteases in vivo.
  • the number of repeat units linked to the lysine residue of the matrix can vary considerably.
  • This number can be determined according to the number of lysine residues present on the peptide matrix and can be adapted so as to optimize their capacity to inhibit the entry of the virus into lymphocytes in vivo, and taking into account the influence of presence of an increased number of patterns on the possible in vivo toxicity of the molecules thus obtained.
  • the number of repeated patterns presented by the matrix is between 2 and 8, preferably between 4 and 6 patterns, for example 5 patterns.
  • the number of amino acids contained in the repeated motif will be taken into account to determine the number of motifs linked to the peptide matrix.
  • modifications of the bonds between the amino acids of the repeating units and / or of the peptide matrix can be of different natures.
  • a suitable modification can be carried out at the level of the peptide bond, in order to prevent the cleavage of this bond and therefore in order to decrease or suppress the sensitivity to peptidases.
  • D enantiomers may be preferred in the context of the invention rather than molecules having an L configuration.
  • these two charges will be separated by at least one neutral amino acid residue such as Gly, Pro, Ala.
  • the patterns will for example have as sequence, RP, KP, PK, PR, RK, KR, KPR, RPK, PKR, PRK, KER, KGQ, KGR, RPR, RPG, AHxPR, pyrKR, RPGR, KPGR, KPRG, GPGR, IPIG, GPGRAF, KRPGNK, RPGNK, KRPRQ, KPRQAG
  • a particularly preferred molecule (involving only "real" peptide bonds) for carrying out the invention corresponds to the following formula: RRRR
  • the repeated patterns linked to the lysine residues of the peptide matrix can be similar or of different nature.
  • repeating units can be chosen such that they comprise both a B epitope and a T epitope of the external envelope glycoprotein of an HIV retrovirus.
  • the molecule is characterized in that the peptide matrix is replaced by a functionally equivalent molecule chosen from polyamines, for example Tris (2-aminoethyl) amino or dendrimers (R. olf , Frequency Chemistry p. 13-17, Large molecules).
  • a functionally equivalent molecule chosen from polyamines, for example Tris (2-aminoethyl) amino or dendrimers (R. olf , Frequency Chemistry p. 13-17, Large molecules).
  • the subject of the invention is moreover a composition capable of inhibiting infection due to a human retrovirus of HIV type, in particular of HIV-1 or HIV-2 type, characterized in that it comprises, as active principle, a molecule above defined.
  • Such a composition is in particular defined by its capacity to inhibit the interaction between the CD26 cell receptor (DPPIV) and the external envelope glycoprotein of a HIV-type retrovirus, this interaction manifesting the inability then acquired by the retrovirus to penetrate into CD4 lymphocytes, as evidenced by the absence of syncitia formation and induction of apoptosis, as observed in control cultures.
  • DPPIV CD26 cell receptor
  • the mechanism of action of the inhibitors according to the invention does not normally involve an inhibition of the enzymatic activity of DDPIV, which is normally not affected.
  • the invention also relates to the use of a molecule as defined above for the preparation of a medicament for the treatment of an infection due to a human retrovirus of HIV type, in particular by preventing the fusion of cell membranes.
  • composition characterized in that it comprises, as active principle, a molecule as defined above.
  • This pharmaceutical composition can be used for the treatment or prevention of infection with the HIV retrovirus, in particular as a munogenic composition, in particular as a vaccine.
  • TASP type template assembled synthetic protein
  • the matrix is used to form a covalent anchoring region of a peptide (for example the peptide KPR) which inhibits, in time that monomer at a relatively high molarity (10 M), the entry of HIV into CD4 + cells.
  • a peptide for example the peptide KPR
  • DCM Dichloromethane
  • TFA trifluoroacetic acid
  • N, N-dimethylformamide (DMF) and diisopropylethylamine (DIEA) were purchased from SDS (Peypin, France).
  • Tert-butyl-methyl-ether MTBE
  • benzotriasolyl-oxy-tris dimethylamino
  • BOP reagent benzotriasolyl-oxy-tris
  • HOBt hydroxybenzotriazole
  • the protected amino acids come from Neosystem (Strasbourg, France).
  • the PAM Boc Cys resin (4 Me Bzl) comes from A.B.I. (Roissy, France).
  • Hydrogen fluoride comes from Prodair (Strasbourg, France).
  • the protective side chain groups used were: the cyclohexyl ester (Glu 4), the chlorobenzyloxycarbonyl (Lys 9), the t-butyloxycarbonyl (Lys 3, 5, 8).
  • the lysine at position 10 was introduced in the form of a Boc Lys Boc derivative.
  • the cycle used for the incorporation of each amino acid derivative is as follows:
  • the Boc protecting groups of the matrix PAM resin were cleaved in 60% TFA / DCM for 1 min (prewash) and 30 min, then the resin was washed with DCM and DMF.
  • the new resin substitution was 3 meq / g (0.5 mmol of amino groups in the reaction vessel).
  • the elongation of the peptide chains was obtained using 4 eq in excess of Fmoc Arg (Pmc), Fmoc Gly and Fmoc Lys (Boc).
  • the deprotection time of the Fmoc protection groups was increased to 3 ⁇ 7 min in 25% of a piperidine / DMF mixture.
  • the resin was washed with DCM and dried under nitrogen.
  • the resin-bound peptide (620 mg) finally obtained was tested with 10 ml of HF and 1 ml of anisol at 0 ° C for 45 min. After removal of the hydrogen fluoride in vacuo, the resin was washed with ether and the peptide was eluted with 8 ml of pure TFA and precipitated again with MTBE. After centrifugation, the centrifugation pellet was dissolved in 10 ml of water and lyophylized. f) Analysis and purification of the molecule The homogeneity of the final product was checked by means of an analytical step on a reverse phase column of the C18 nucleoside type (150 x 4.6 mm) using a TEAP buffer system. The linear gradient detected at 201 nm was 1 to 21% in 20 min.
  • ALBA 2 Lys (Z (N0 2 ) -pyrrolidid HCL K: Lys; P: Pro; R: Arg Compared to ALBA 2, molecule 5 (KPR) TASS is 5,000 to 10,000 times less active for the inhibition of DPP IV activity.
  • HIV-1 LAI The entry of HIV-1 LAI was tested by infection of CEM cells for 1 h. The extracellular virus was eliminated by treatment with trypsin and the internalization of HIV was followed by testing the concentration of p25 (Callebaut et al, 1993, cited above).
  • molecule 5 (KPR) TASS is a powerful inhibitor of the entry of HIV.
  • the IC 50 value is approximately 10 ⁇ M.
  • 5 (KPR) TASS is 500 times more active. It should be noted that at 200 ⁇ M of 5 (KPR) TASS, the DPP IV enzymatic activity is not affected at all.
  • CEM cells were incubated (37 ° C, 30 min) with different concentrations (200, 100, 50, 25 and 5 ⁇ M) of 5 (KPR) TASS before infection with HIV-1 LAI.
  • the cells infected in the presence of the inhibitor were then cultured for 4 days and the production of virus was tested by monitoring the concentration of p25 in the culture supernatant.
  • the production of HIV was considerably inhibited by the molecule 5 (KPR) TASS and this inhibition was dependent on the dose: more than 90% inhibition at 20 ⁇ M and around 50% inhibition at 5 to 10 ⁇ M .
  • 5 (KPR) TASS As the production of the virus was inhibited by 5 (KPR) TASS, the formation of syncytia was also inhibited.
  • 5 (KPR) TASS is an entry inhibitor, as demonstrated in section c (i.e. by inhibiting fusion of viral and cell membranes) and further show that 5 (KPR) TASS is also an inhibitor of syncytia formation by preventing fusion of the membranes of infected cells with neighboring cells.
  • the molecule 5 (KPR) TASS has no toxic effect on cell growth
  • the cells (CEM clone 13; CEM 174, HUT 78) were incubated (37 "C, 30 min) with different concentrations (80, 40, 20 and 10 ⁇ M) of 5 (KPR) TASS before infection with HIV-2 ROD, HIV-2 EHO and SIV mac.
  • the infected cells in the presence of the inhibitor were then cultured for 4 days, and virus production was tested by observing • 1 reverse transcriptase activity in the culture supernatant.
  • the HIV-2 and SIV production was significantly inhibited by 5 (KPR) TASS, and 50% inhibition doses were estimated to be approximately 10-20 ⁇ M from 5 (KPR) TASS.
  • g) 5 (KPR) TASS inhibits induction of cell death or apoptosis
  • DPP IV activity inhibitors are not necessarily inhibitors of HIV entry
  • ALBA 2 H-Lys- [Z (NO 2 )] -pyrrolidide
  • DPP IV activity at the cell surface is 90% inhibited at 20 ⁇ M and 50% at 1 ⁇ M.
  • ALBA 2 exerts an effect neither on the entry of HIV, nor on the. syncytia formation, nor on the induction of apoptosis, even at a concentration of 50 ⁇ M.
  • the concentration of 100 ⁇ M is toxic to cells.
  • the TASS molecule 5 (KPR) which exerts only a weak effect on the DPP IV activity, considerably blocks the infection of cells by HIV.
  • IC 50 dose of the inhibitor required for 50% inhibition
  • TASS CEM cells were incubated (37 ° C, 30 min) before 1 • infection with HIV-1 LAI with different concentrations (from 50 to 0.5 ⁇ M). The cells infected in the presence of the inhibitor were then cultured for 4 days and the production of virus was evaluated by measuring the concentration of p25 in the culture supernatant.
  • the table below indicates the concentration of the peptide which gives at least 90% and 50% inhibition of the production of the virus.
  • MOLT cells a line of human T lymphocytes (CD4 + and CD26 +) were incubated (5 min at room temperature) with or without the addition of 50 ⁇ M of 5 (KPR) TASS or 50 ⁇ M of ALBA 2 (which inhibits the enzymatic activity but not the entry of the virus).
  • Antibodies were then added such as MAb 1F7 anti CD26, MAb BA5 another anti CD26 antibody (Immunotech) which does not affect the entry of HIV, MAb OKT4 anti-CD4 (Ortho Diagnostics Systems), MAb ALBl anti CD45 ( Immunotech) (tyrosine kinase associated with CD26) and the cells are incubated at 4 ° C for 1 h.
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting analysis
  • MAb 1F7 and MAb BA5 see the figure providing the characteristic spectra resulting from the analysis by FACS for the recognition of CD26 (by MAb 1F7 and MAb BA5), CD4 (by MAb OKT4) and CD45 (by MAb ALB1) on the surface of MOLT cells in the absence or presence of 5 (KPR) TASS (cited as S13) and ALBA2.
  • glycoprotein complex forming the envelope of the virus and comprising the surface protein SU (gpl20) and the transmembrane protein TM (gp41), plays an important role in HIV infection; gpl20 contains the CD4 binding site, and gp41 the peptide motif necessary for the membrane fusion process.
  • gpl20 and gp41 forms a conformational complex which is essential for the two main functions of the gpl20 / 41 complex; the entry of the core of the virus into the cells by fusion of the viral and cell membranes, and the induction of the cytopathogenic effect by fusion of the membranes of the infected cells (expressing the gpl20 / gp41 complex on the surface) with those neighboring cells.
  • gpl20 / gp41 complex on the surface of infected cells leads to an interaction with the CD4 molecules of neighboring uninfected cells, which results in a cytopathogenic effect characteristic of HIV (Laurent-Crawford et al., 1993, AIDS Res. Hum Retroviruses _, 761-773): formation of syncytia (multinucleated cells generated by the fusion of infected cells with uninfected cells) and / or cell death by apoptosis (chromatin fragmentation at the level of internucleosomal links).
  • 5 (KPR) TASS is a potential inhibitor of HIV entry and infection. It presents very little effect, even if it can even be observed, on the enzymatic activity DPP IV. Thus it can be thought that 5 (KPR) TASS acts mainly on the recognition site of the substrate (that is to say the V3 loop of gpl20) without affecting the catalytic site of the CD26 molecule.
  • 5 (KPR) TASS acts mainly on the recognition site of the substrate (that is to say the V3 loop of gpl20) without affecting the catalytic site of the CD26 molecule.
  • One of the explanations for the higher activity of 5 (KPR) TASS compared to the monomer KPR could be found in the fact that the molecule CD26 would exist in the form of a multimer hence hence also a more efficient presentation of a multimer more efficient KPR type.
  • the KPR residue in the TASS molecule can also be replaced by other peptides to form variants of this inhibitor, for example: RPK, RPR, PKR, KGR.
  • the tripeptide KPR is one of the motifs conserved in the V3 loop, precisely found in the C-terminal part of the V3 loop of certain HIV-2. Due to the presence of the dipeptide KP, KPR could serve as a substrate for the enzyme DPPIV / CD26. Furthermore, we have shown that the tripeptide KPR monomer at 10 mM inhibits the entry of HIV and also inhibits the activity of DPPIV. On these data, we have shown here that the multimeric presentation of this tripeptide KPR (for example 5 (KPR-TASS) considerably increases the effectiveness of this molecule to inhibit the entry of HIV, the formation of syncytia and the induction of apoptosis.
  • KPR type of peptide 5
  • TASS appear to interact with CD26 in an area that constitutes one epitope of the antibody onoclonal anti-CD26 MAb 1F7.
  • Example of the inhibitory effect of various multimeric synthetic peptides (corresponding to the TASS molecule or to modified forms of the TASS molecule), on HIV-1 LAI infection in CEM cells.
  • CEM cells were incubated (15-30 minutes, 37 ° C) with the different peptides before infection with the HIV-1 LAI strain (60 minutes, 37 ⁇ C). The cells were then centrifuged and suspended in a fresh culture medium containing the various inhibitors. Syncytia formation was followed on days 3 and 4 after infection (post-infection (pi)) and the culture supernatants were tested to determine their concentration of major core protein of HIV, p24 / p25 . A very good correlation has been observed between the inhibition of syncytia formation and the production of HIV (ie the concentration of p24 / p25).
  • the TASS matrix is composed of the following residues: KKKGPKEKGC.
  • KKKGPKEKGC a modified TASS matrix was used in which the proline residue (P) had been modified by a residue G in accordance with the following sequence: KKKGGKEKGC. This last sequence is called TASS (GG).
  • Another modified TASS molecule corresponding to the sequence KKKKGC was also used. In some cases, the MAP matrix was used for comparison.
  • the different peptide-TASS molecules are active at concentrations in micrograms to block the entry of HIV, infection and formation syncytium.
  • the value of the inhibitory concentration at 50% (IC 50 ) for some of the molecules is between 0.5 and 2 ⁇ M.
  • inhibitor motif would contain the following residues:
  • Two amino acids should be basic residues, for example K or R; K can be replaced by R and vice versa. These two basic residues could occupy any one of positions l, 2 or 3 (see example N ⁇ l, 16, 21, 25 and 33).
  • residue P could be deleted or replaced by a residue G to obtain an active motif (N ° 15 and 30) but replacement with a type E residue would reduce the inhibitory action (see N ° 16).
  • the ⁇ -amino group of the motif does not play a crucial role since it can be acetylated (see No. 35) without the inhibitory activity being reduced considerably. Likewise the introduction of an acid pyroglutamigue at position 1 does not affect the inhibitory activity (see No. 27).

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Abstract

L'invention concerne une molécule comportant une pluralité des motifs répétés, notamment du type KPR, susceptibles d'être reconnus par une ectoprotéine (à la surface des cellules) notamment par le récepteur CD26 (encore appelé enzyme DPPIV) ces motifs étant tous portés par une matrice peptidique autorisant leur présentation multiple à l'enzyme et présentant une affinité pour celle-ci. Cette molécule constitue le principe actif d'une composition inhibant l'entrée de HIV dans des cellules, notamment pour le traitement d'une infection due à ce rétrovirus.

Description

MULTIREPRESENTATION D'UN ANALOGUE PEPTIDIQUE Du SUBSTRAT DE LA DPPIV/ NOTAMMENT DE TYPE KPR, AFIN D'INHIBER L'ENTREE DU HIV DANS LES CELLULES
La présente demande concerne des inhibiteurs de l'infection par un rétrovirus HIV, comportant un analogue peptidique du substrat de la DPPIV ou/et des motifs conservés dans la boucle V3 de la glycoprotéine d'enveloppe d'un rétrovirus du type HIV.
Le virus humain de 1*immuno-déficience (HIV) est l'agent étiologique du syndrome d•immuno-déficience acquise (SIDA) et de troubles qui lui sont apparentés. Jusqu'à présent deux types distincts mais apparentés de rétrovirus, le type HIV-1 et le type HIV-2 ont été identifiés. L'infection des lymphocytes T CD4+, des onocytes et des macrophages par HIV, nécessite 1'interaction des produits du gène env du virus avec le récepteur CD4 cellulaire (Klatzman D, et al. Nature 1984 ; 312:767-768).
Le gène env de HIV code pour une polyprotéine précurseur qui est clivée par une protéase cellulaire, conduisant à la production de glycoprotéines extra¬ cellulaires ou de surface (SU) et transmembranaires (TM) (Eiden LE, et al.Immunol. Today 1992 13:201-206). La protéine de surface, par le biais d'interactions non covalenteε avec la protéine transmembranaire est exposée à la surface des cellules infectées ou à la surface des particules virales.
Le récepteur CD4 est une glycoprotéine composée d'une région extracellulaire amino-terminale contenant quatre domaines apparentés à la famille des immunoglobulineε et d'une région carboxy-terminale contenant les domaines transmembranaire et cytoplas ique (Eiden et al) . Le premier domaine a ino- terminal de la molécule CD4 apparaît être le site principal de liaison des protéines de surface de HIV. En conséquence, cette liaison induit un changement de conformation du complexe SU-TM (complexe formé par les glycoprotéines de surface et transmembranaires) permettant l'interaction du domaine amino-terminal de la protéine transmembranaire avec la membrane cellulaire, causant ainsi la fusion des membranes virale et cellulaire (Marsh M, et al Immunol. Today 1988 ; 8:369-371) ; Eiden LE et al. Immunol. Today 1992 ; 13:201-206 ; Putney S. et al TIBS 1992 ; 17:191-196). Cependant avant la fusion, la protéine de surface pourrait subir une modification par clivage protéolytique, qui dans le cas de la protéine de surface de HIV-1 (GP120) semble -même si la preuve directe n'en a pas encore été rapportée- avoir lieu au niveau du troisième domaine variable, communément appelé "boucle V3", c'est-à-dire le domaine principal de neutralisation (PND) (Moore JP, et al AIDS 1991 ; 5:S21-S33) .
Différentes observations ont jusqu'à présent permis de penser que la boucle V3 joue un rôle critique dans 1•infection par HIV-1 :
1) Des anticorps neutralisants produits naturellement chez des patients séropositifs pour HIV-1 sont principalement dirigés contre la boucle V3 (Goudsmit J, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 ; 85:4478-4482),
2) Des anticorps monoclonaux spécifiques de la boucle V3 n'affectent pas la liaison de la gpl20 au récepteur CD4 mais bloquent le processus de fusion (Kinney-Thomas E, et al. AIDS 1988 ; 2:25-29) ;
3) Des mutations dans la boucle V3 génèrent des virions dont le caractère infectieux est réduit (Grimaila RJ, et al. J. Virol, 1992 ; 66:1875-1883) ;
4) Des mutations dans la boucle V3 modifient le tropisme cellulaire (Chesebro B, et al. J. Virol. 1992 ; 66:6547-6554) et suscitent une modification dans le phénotype de HIV en tant que virus induisant un syncytium ou n'induisant pas un syncytium (De Jong JJ, et al. J. Virol. 1992 ; 66:6777-6780). La boucle V3 contient de 35 à 41 acides aminés dont les cystéines aux deux extrémités sont reliées, par un pont disulfure formant une boucle. La boucle V3 contient des résidus basiques conservés et en outre la séquence à proximité des cystéines liées, est similaire dans la plupart des isolats. (Cléments GJ, et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1991 ; 7:3-16). Par conséquent, il semble qu'il existe une pression de sélection pour conserver les séquences spécifiques dans la boucle V3. Les anticorps monoclonaux dirigés contre des peptides (15-mer) représentant le sommet ("crown") de la boucle V3 ont la capacité de neutraliser HIV-1 (Langedijk JPM, et al. J. Gen. Virol. 1991 ; 72:2519-2526), cela suggère que les résidus d'acides aminés du sommet de la boucle sont impliqués dans les interactions fonctionnelles de la boucle V3.
Jusqu'à présent aucune preuve directe n'a pu être établie concernant le fait que le clivage de la boucle V3 serait essentiel pour l'infection par HIV, bien que la gpl20 purifiée ait pu être clivée en fragments de 50 et 70 kDa par différentes protéases : la trombine et la tryptase clivent le site tryptique (GPGR i AFVT) , alors que la cathepsine E clive un site chymotrypsine-like (GPGRAF -I- VT) (Cléments GJ, et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1991 ; 7:3-16).
Les inventeurs se sont intéressés à une séquence particulière de la boucle V3 de la glycoprotéine de surface de l'enveloppe du rétrovirus HIV-1, distincte de celles qui ont fait l'objet d'expériences dans l'art antérieur, et aux séquences correspondantes des rétrovirus HIV-2 et SIV. Ils ont observé qu'un très grand nombre d*isolats identifiés de HIV, notamment HIV-1 (plus de 90%) présentent un motif peptidique constitué par la séquence d'acides aminés Gly-Pro-Gly (Glycine - Proline - Glycine ou selon le code à une lettre GPG) et plus particulièrement un motif Gly-Pro, conservé. Ce motif GP ou GPG reste en outre inchangé in vivo pendant plusieurs années chez des individus infectés par HIV-1, alors que d'autres substitutions apparaissent dans la boucle V3 (Holmback et coll. J. Virol. 1993, 67:1612-1619).
De plus, l'ensemble des isolats identifiés de HIV-1, HIV-2 et SIV présentent à l'extrémité N- terminale de la boucle V3 un motif dipeptidique conservé RP (Arginine - Proline) . Par ailleurs, pour HIV-2 et SIV, on trouve .aussi un motif dipeptidique conservé RP (Arginine-Proline) ou KP (Lysine- Proline) , à l'extrémité C-terminale de la boucle V3. Par ailleurs, pour SIV MND, on trouve aussi un motif dipeptidique EP (Acide glutamique - Proline) dans la boucle V3.
En dehors de la boucle V3, dans le cas de HIV-1, on trouve plusieurs motifs conservés, par exemple les séquences IPI (Isoleucine-Proline-Isoleucine) , GPC (Glycine-Proline-Cystéine) ,PPG(Proline-Proline-Glycine) , situés respectivement aux acides aminés 185 et 208,de SU et 411 de TM, par rapport à la séquence consensus de Myers et al (1992) .
Les inventeurs ont démontré qu'une protéine cellulaire de surface interagit avec les glycoprotéines de l'enveloppe de HIV ou de SIV, en particulier au niveau de la boucle V3 et est susceptible de la cliver. Ce clivage aurait lieu en un site non identifié comme tel jusqu'à la présente invention. La protéine cellulaire de surface est la dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) également appelée antigène ou récepteur CD26 (Barclay AN, et al. (1993). Facts book. London : Harcourt Brace Jovanich) . Dans la littérature, la DPPIV/CD26 est également appelée : DPIV, DAPIV, SGP-115/107, Tal et Tal03. La DPPIV est une protéase de surface cellulaire (EC 3.4.14.5) qui possède en général une activité d'exopeptidase et dans certaines conditions une activité d'endopeptidase (Nagatsu T, et al. Anal. Bioche . 1976 ; 74:466-476 - Kudo M, et al J. Bioche . 1985 ; 97:1211-1218 - Kenny AJ, et al. Biochem. J. 1976 ; 155:169-182). Son activité enzymatique peut être testée par le clivage de dipeptides synthétigues couplés au substrat chromogène p-nitroanilide (para-nitroanilide) , ces peptides ayant une séquence X-Pro-p-nitroanilide, pour produire un peptide X-Pro et de la p-nitroaniline (Nagatsu T, et al. Anal. Biochem 1976 ; 74:466-476) X pouvant être un résidu acide aminé, notamment Glycine (Gly) , Alanine (Ala) , Lysine (Lys) , Arginine (Arg) , Acide Glutamique (Glu) , Acide Aspartique (Asp) ou même Proline (Pro) .
L'antigène CD26 est largement exprimé sous la forme d'une glycoprotéine transmembranaire de 110 à 120 kDa, gui est identique à la serine protéase de surface cellulaire appelée dipeptidyl peptidase IV. Cette enzyme qui est généralement considérée comme une exopeptidase, clive des dipeptides dans la partie amino-terminale de substrats polypeptidiques, dès lors que l'avant-dernier résidu est un résidu proline ; c'est-à-dire que cette enzyme permet le clivage de X- P-polypeptide, P étant un résidu Proline, lorsque X est un acide aminé N-terminal libre (Kudo M, et al. J. Biochem. 1985 ; 97:1211-1218). En outre, la DPPIV a été décrite comme capable de catalyser un clivage "endopeptidase-like", après un motif dipeptidique "GP- like" au sein de peptides synthétiques (Kenny AJ, et al. Biochem. J. 1976 ; 155:169-182) et de se fixer au collagène (Beauvois B, et al. I. Marcel Dekker (Eds.) New York, 1991) . La DPPIV lie le collagène mais cette liaison de la DPPIV au collagène n'affecte pas son activité enzymatique (Hanski C, et al. Exp. Cell Res. 1988 ; 178:64-72), suggérant ainsi l'existence de sites d'accrochage et catalytique dans différents domaines de DPPIV/CD26.
La DPPIV est une glycoprotéine comportant plusieurs chaînes oligosaccharidiques liées à des résidus N. La séquence hydrophobe près de l'extrémité amino-terminale (peptide signal) de cette ectoenzyme, fonctionne comme un domaine d'ancrage à la membrane, les 6 acides aminés N-terminaux formant un domaine cytoplas ique et l'extrémité carboxy-terminale de la protéine constituant le domaine extracellulaire (Ogata S, et al. J. Biol. Che . 1989 ; 264:3596-3601 - Hong W, et al. J. Cell Biol. 1990 ; 111:323-328). Cette enzyme existe dans une grande variété de tissus y compris dans des organes lymphoides et non-lymphoïdes (Gorrel MD, et al. Cell. Immunol. 1991 ; 134:205-215). Elle est exprimée sur les membranes apicales de cellules épithéliales (bordures en brosse et surfaces canaliculaires) , endothéliales, certains lymphocytes T, des cellules folliculaires dendritiques et des macrophages (Gorrel MD, et al Cell. Immunol. 1991 ; 134:205-215 - McCaughan et al. 1990 Hepatology 11, 547-558. - Sannes PL, et al J. Histochem. Cytochem. 1983 ; 31:684-690). L'activité enzymatique a été détectée sur différentes lignées cellulaires humaines d'origine T et B, de même que sur des monocytes du sang périphérique (Beauvois B, et al. I. Marcel Dekker (Eds.) New York, 1991). L'expression de DPPIV/CD26 est faible dans les lymphocytes T au repos, mais elle augmente considérablement après leur activation; pour cette raison, DPPIV/CD26 est considéré comme un antigène d'activation des lymphocytes T.
On utilisera indifféremment les expressions DPPIV ou CD26 dans la suite du texte.
L'identification d'un nouveau mécanisme impliquant le récepteur CD26 comme médiateur de l'infection chez l'homme par un rétrovirus du SIDA, et plus particulièrement son implication dans l'entrée du rétrovirus dans les cellules telles que les lymphocytes T, les monocytes et les macrophages, permet de définir de nouveaux moyens pour lutter contre 1•infection par un rétrovirus HIV ou SIV, et en particulier donne accès à de nouveaux inhibiteurs de l'infection des cellules par le rétrovirus.
Les inventeurs ont plus particulièrement montré que la DPPIV est un co-récepteur pour HIV, qui est susceptible de lier la boucle V3, et/ou d'autres régions dans les glycoprotéines de l'enveloppe virale SU et TM. Cette étape concernant l'interaction du complexe SU/TM avec DPPIV/CD26 est essentielle pour la pénétration de HIV dans les cellules T CD4.
L'invention a donc pour objet des inhibiteurs de l'infection par un rétrovirus HIV, comportant une pluralité de motifs susceptibles d'être reconnus par une ectoprotéine (à la surface des cellules) notamment par le récepteur CD26 (encore appelé enzyme DPPIV) ces motifs étant tous portés par une matrice peptidique ou non autorisant leur présentation multiple à l'enzyme. Dans ce qui suit, il sera fait référence à l'ensemble de ces motifs ainsi présentés à l'enzyme sous l'expression "motifs répétés".
La matrice permettant la présentation multiple d'un motif choisi, est définie par rapport à sa capacité à rendre accessible le susdit motif.
Il est important de remarquer que l'expression "peptidique(s)", telle qu'utilisée dans le présent contexte, qu'il s'agisse des "motifs répétés peptidiques" ou de la "matrice peptidique", s'entend comme couvrant tant des molécules purement peptidiques (en tant qu'elles sont à base de résidus d'acides aminés naturels) que des molécules dérivées des précédentes par remplacement de tout ou partie de ses résidus d'acides aminés naturels par des isomères optiques de ces acides aminés naturels ou même par des groupes "non peptidiques" (conduisant par exemple à des "pseudo-peptides") , dès lors que ces remplacements n'entraînent pas une altération sensible des propriétés pertinentes desdits motifs répétés (notamment leur capacité à être reconnus par l'enzyme DPPIV) ou de la matrice (notamment capacité de présentation desdits motifs répétés à l'enzyme).
Selon un premier mode de réalisation des produits de l'invention la matrice peptidique portant les "motifs répétés" contient des résidus d'acides aminés possédant une fonction réactive non engagée dans une liaison peptidique avec des résidus voisins d'acides aminés, ces fonctions réactives intervenant dans la fixation desdits motifs répétés sur cette matrice. De préférence, la matrice peptidique comprend des résidus d'acides aminés de type lysine (K) , les susdits motifs répétés étant alors greffés sur les groupes epsilon- a ino d'une partie au moins de ces résidus lysine.
D'autres résidus d'acides aminés peuvent également être mis en oeuvre pour le greffage des susdits motifs répétés, tels que l'arginine ou encore des résidus glutamyle qui porterune fonction carboxyle non engagée dans les liaisons peptidiques avec d'autres acides aminés de la matrice.
La matrice peut être synthétique et par conséquent préparée par synthèse chimique notamment en utilisant la synthèse en phase solide telle que décrite par Merrifield.
Une première molécule intéressante dans le cadre de la réalisation de l'invention est par exemple caractérisée en ce que la matrice peptidique comprend l'enchaînement d'acides aminés suivant : K X., K X2 X3 dans lequel X: est, de préférence, la lysine, la valine, l'alanine ou l'acide glutamique ou l'isoleucine, X2 et X3 représentent la glycine ou la proline et sont différents l'un de l'autre.
Les motifs répétés peuvent dans ce cas être liés aux fonctions e-amino des résidus lysine, notamment par des liaisons peptidiques, et peuvent être présentés dans un même plan ou au contraire dans des plans différents. De même ces motifs peuvent être liés du même côté de la matrice par rapport au résidu lysine ou de façon opposée.
Le résidu d'acides aminés X^ peut, le cas échéant, être supprimé.
D'autres matrices peptidiques intéressantes pour la réalisation des molécules de l'invention, comprennent un enchaînement d'acides aminés choisi parmi les séquences suivantes
K X, K G P
K *1 K K G P
K Xi K G P K X4 K
K Xi K G P K X* K G c,
K Xi K G G K X4 K G c,
K K
Figure imgf000011_0001
K Xi K G P
K Xi K P G
K Xi K K P G
K Xi K K G C
K Xi K P G K X4 K
K Xi K P G K X4 K G C
K K
Figure imgf000011_0002
K X, K X4 K X, K G C dans lesquels X1 est facultatif et peut être la lysine, la valine, l'alanine, l'acide glutamique ou 1'isoleucine et X_, est facultatif et peut être l'acide glutamique, la valine, l'alanine ou l'isoleucine.
Ces matrices permettent la présentation de l'espace selon des configurations variées des motifs répétés.
La présence d'un résidu C à l'extrémité COOH- terminale, et/ou de résidus G et C au niveau de la matrice permet le couplage spécifique éventuel à une structure de type "carrier" ou à des liposomes. Ainsi les motifs répétés peuvent être liés au résidu lysine suivant un plan, certains se trouvant le cas échéant perpendiculaires les uns par rapport aux autres ou de chaque côté de la matrice.
De préférence, les acides aminés contenus dans la matrice peptidique sont sous la forme dextrogyre.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les liaisons peptidiques entre les acides aminés de la matrice sont modifiées notamment pour améliorer leur résistance à l'hydrolyse par les protéases in vivo.
Le nombre de motifs répétés liés au résidus lysine de la matrice peut varier considérablement.
Ce nombre peut être déterminé en fonction du nombre de résidus lysine présents sur la matrice peptidique et peut être adapté de façon à optimiser leur capacité à inhiber l'entrée du virus dans les lymphocytes in vivo, et en tenant compte de l'influence de la présence d'un nombre accru de motifs sur l'éventuelle toxicité in vivo des molécules ainsi obtenues. Avantageusement, le nombre de motifs répétés présentés par la matrice est compris entre 2 et 8, de préférence entre 4 et 6 motifs, par exemple 5 motifs.
Le cas échéant, il sera tenu compte du nombre d'acides aminés contenus dans le motif répété pour déterminer le nombre de motifs liés à la matrice peptidique.
Les modifications des liaisons entre les acides aminés des motifs répétés et/ou de la matrice peptidique peuvent être de différentes natures. Une modification appropriée peut être réalisée au niveau de la liaison peptidique, afin d'empêcher le clivage de cette liaison et donc afin de diminuer ou de supprimer la sensibilité aux peptidases.
Les techniques habituelles de modification des liaisons peptidiques peuvent être mises en oeuvre. On citera notamment sans caractère limitatif les modifications de la liaison peptidique -CONH- conduisant à la formation d'une liaison réduite (CH NH) , rétro inverso (NHCO) , méthylène-oxy (CH2-0) , thiométylène (CH2-S) , carba (CH2CH2) , cétométhylène (CO-CH2) , hydroxyéthylène (CHOH-CH2) ou Aza (N-N) .
Le cas échéant on pourra préférer l'utilisation dans le cadre de l'invention des énantiomères D plutôt que des molécules ayant une configuration L.
Les motifs répétés préférés utilisés pour réaliser les molécules de l'invention devront renfermer au moins deux et avantageusement trois charges positives que l'on pourra choisir parmi les possibilités suivantes :
- le groupement α, NH2 du motif
- le groupement α, NH2 de l'a aminohexanoic acid
- le groupement e aminé de la lysine et le groupement «5 aminé de l'ornithine et plus généralement les groupements a , β , -y, δ et e aminés (acide a , 7 diaminobutyrique ; acide 7, β diamino propionique)
- le groupement guanidino de l'arginine.
Avantageusement ces deux charges seront séparées par au moins un résidu acide aminé neutre tel que Gly, Pro, Ala. Les motifs auront par exemple pour séquence, RP, KP, PK, PR, RK, KR, KPR, RPK, PKR, PRK, KER, KGQ, KGR, RPR, RPG, AHxPR, pyrKR, RPGR, KPGR, KPRG, GPGR, IPIG, GPGRAF, KRPGNK, RPGNK, KRPRQ, KPRQAG
Les séquences ci-après désignées sont décrites au moyen du code dit à une lettre utilisé pour désigner les acides aminés selon le tableau suivant : Code à une lettre Acide Aminé
A Alanine
R Arginine
N Asparagine
D Acide Aspartique
C Cystéine
Q Glutamine
E Acide Glutamique
G Glycine
H Histidine
I Isoleucine
L Leucine
K Lysine
M Méthionine
F Phényalanine
P Proline
S Serine
T Thréonine
W Thryptophane
Y Tyrosine
V Valine
AHx Acide aminohexanoique pyr Acide pyroglutamique Pour les besoins de cette description on a eu (ou aura encore) recours au "code" suivant :
X N•importe quel acide aminé ou un acide aminé variable
Une molécule particulièrement préférée (ne faisant intervenir que des "vraies" liaisons peptidiques) pour la réalisation de l'invention répond à la formule suivante : R R R R
P P P P
K K K K 5 (KPR) TASS
R P K - K K K G P K E K G C
Selon une variante, les motifs répétés liés aux résidus lysine de la matrice peptidique peuvent être semblables ou de nature différente.
Ainsi on pourra tenir compte dans le choix des motifs répétés liés à la matrice peptidique des variations de la séquence de la boucle V3 de différents isolats du rétrovirus HIV.
De plus, ces motifs répétés peuvent être choisis de façon telle qu'ils comprennent à la fois un épitope B et un épitope T de la glycoprotéine externe d'enveloppe d'un rétrovirus HIV.
Selon une autre variante de réalisation de l'invention, la molécule est caractérisée en ce que la matrice peptidique est remplacée par une molécule fonctionnellement équivalente choisie parmi les polyamines, par exemple le Tris (2-aminoethyle) aminé ou des dendrimères (R. olf, Fréquence Chimie p. 13-17, Molécules de grande taille) .
L'invention a par ailleurs pour objet une composition susceptible d'inhiber l'infection due à un rétrovirus humain de type HIV, notamment de type HIV-1 ou HIV-2, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, une molécule ci-dessus définie.
Une telle composition est en particulier définie par sa capacité à inhiber l'interaction entre le récepteur cellulaire CD26 (DPPIV) et la glycoprotéine externe d'enveloppe d'un rétrovirus du type HIV, cette interaction manifestant l'incapacité alors acquise par le rétrovirus à pénétrer dans les lymphocytes CD4, comme l'atteste l'absence de formation de syncitia et d'induction de l'apoptose, comme on l'observe dans des cultures témoins. Il y lieu de noter que le mécanisme d'action des inhibiteurs selon l'invention ne fait normalement pas intervenir une inhibition de l'activité enzymatique de la DDPIV, laquelle n'est normalement pas affectée.
L'invention vise également l'utilisation d'une molécule telle que définie précédemment pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'une infection due à un rétrovirus humain de type HIV, notamment en empêchant la fusion de membranes cellulaires.
D'une façon générale, entrent dans le cadre de l'invention une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif une molécule telle que définie ci-dessus.
Cette composition pharmaceutique peut être utilisée pour le traitement ou la prévention de l'infection par le rétrovirus HIV, notamment en tant que composition i munogène notamment en tant que vaccin.
D'autres caractéristiques et avantages de 1'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent.
Exemples :
On connait dans l'état de la technique les molécules du type TASP (template assembled synthetic protein) développées pour transférer les caractéristiques spécifiques d'une enzyme à des molécules facilement accessibles et ainsi pour construire de nouvelles protéines et enzymes (Mutter M. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 24 (1985) 639-653).
Sur cette base, une construction a été définie et synthétisée, que l'on a appelée molécule TASS (en anglais, "template assembled synthetic substrate") .
Dans une molécule de ce type, la matrice est utilisée pour former une région d'ancrage covalent d'un peptide (par exemple le peptide K-P-R) qui inhibe, en temps que monomère à une molarité relativement forte (10 M) , l'entrée de HIV dans les cellules CD4+. a) Structure de la molécule R R R R
P P P P K K K K
M M
RPK-KKKGPKEKGC b) Réactifs chimiques
Le dichlorométhane (DCM) et l'acide trifluoroacétique (TFA) ont été obtenus sous forme redistillée auprès de Neosystem (Strasbourg, France) . Le N,N-diméthylformamide (DMF) et le diisopropyléthylamine (DIEA) ont été achetés auprès de SDS (Peypin, France) .
Le tert-butyl-methyl-ether (MTBE) , le benzotriasolyl-oxy-tris (diméthylamino) -phosphonium hexafluorophosphate (réactif BOP) et le hydroxybenzotriazole (HOBt) proviennent de Fluka (Mulhouse, France) . Les acides aminés protégés proviennent de Neosystem (Strasbourg, France) . La résine PAM Boc Cys (4 Me Bzl) vient de A.B.I. (Roissy, France) . Le fluorure d'hydrogène provient de Prodair (Strasbourg, France) .
c) Assemblage de la matrice
Boc Boc Boc Boc
I l I I
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Boc K K K G P K E K G C - PAM Résine
I I I
Clz 0-CHX 4-MeBzl
L'assemblage de la chaîne peptidique protégée a été réalisé en utilisant la méthode de synthèse en phase solide selon Merrifield (1963, J. A . Chem. Soc.
85, 2149-2153) avec un synthétiseur peptidique à canon multiple travaillant en mode semi-automatique (Neimark, J. et Briand J.P. (1993) Peptide Res., 6,219-228). Cent soixante mg (0,1 mmole) de résine PAM Boc Cys (4-MeBzl) (substitution 0,6 meq/g) ont été placés dans un récipient de réaction de 20 ml. La déprotection du groupe protecteur Boc a été réalisée dans 60% de TFA dans du DCM pendant 30 min, puis la résine a été lavée deux fois avec du DCM et trois fois avec 5 ml de DMF. Les acides aminés 2 à 9 utilisés pour construire la matrice ont été protégés en position α-amino avec un groupe Fmoc. Les groupements protecteurs de chaîne latérale utilisés étaient : le cyclohéxyle ester (Glu 4) , le chlorobenzyloxycarbonyle (Lys 9) , le t- butyloxycarbonyle (Lys 3, 5, 8). La lysine en position 10 a été introduite sous forme d'un dérivé Boc Lys Boc. Le cycle utilisé pour l'incorporation de chaque dérivé d'acide aminé est le suivant :
Etape Réactif Durée de l'étape Volume
Déprotection 25% pipéridine 3 x 4 min 5 ml / DMF
Rinçage 5 x DMF 5 x 15 sec 5 ml
Couplage Fmoc acide amme 20 min 2 ml
5 eq
BOP 5 eq
HoBt 5 eq
DIEA 10 eq
Rinçage 3 x DMF 3 x 15 5 ml
Le contrôle avec le test à la ninhydrine a montré que tous les couplages étaient complets en 20 min et aucun recouplage n'a été nécessaire. d) Assemblage multiple du tripeptide KPR sur la matrice
Les groupes protecteurs Boc de la résine PAM de la matrice ont été clivés dans 60% de TFA/DCM pendant 1 min (prélavage) et 30 min, puis la résine a été lavée avec du DCM et du DMF. La nouvelle substitution de la résine était de 3 meq/g (0,5 mmole de groupes aminés dans le récipient de réaction) . L'élongation des chaînes peptidiques a été obtenue en utilisant 4 eq en excès de Fmoc Arg (Pmc) , Fmoc Gly et Fmoc Lys (Boc) . Le temps de déprotection des groupes de protection Fmoc a été élevé à 3 x 7 min dans 25% d'un mélange pipéridine/DMF. A la fin de la synthèse et après la dernière étape de déprotection, la résine a été lavée avec du DCM et séchée sous azote. Les groupes protecteurs Pmc et Boc des dérivés de l'arginine et de la lysine ont ensuite été clivés avec le réactif de King (King, D. Field, C. et Fields, G. (1990) . Int. J. Pept. Protein Res. 36, 255-266) pendant 2h30 et la résine a été lavée à nouveau avec du DCM et séchée sous un flux d'azote. e) Clivage final en présence de fluorure d'hydrogène
Le peptide fixé à la résine (620 mg) finalement obtenu a été testé avec 10 ml de HF et 1 ml d'anisol à 0°C pendant 45 min. Après le retrait du fluorure d'hydrogène sous vide, la résine a été lavée avec de 1•éther et le peptide a été élue avec 8 ml de TFA pur et précipité à nouveau avec du MTBE. Après centrifugation, le culot de centrifugation a été dissous dans 10 ml d'eau et lyophylisé. f) Analyse et purification de la molécule L'homogénéité du produit final a été vérifiée au moyen d'une étape analytique sur une colonne en phase inverse du type C18 nucléoside (150 x 4,6 mm) en utilisant un système tampon TEAP. Le gradient linéaire détecté à 201 nm était de 1 à 21% en 20 min.
Après lyophilisation, 190 mg de la molécule ont été obtenus. 100 mg ont été utilisés pour les expériences d'inhibition, 20 mg ont été utilisés pour être couplés à des liposomes et 70 mg ont été fortement purifiés sur une colonne Delta pak C18. Activité biologique de la molécule 5(KPR)TASS
a) Effet de la molécule 5(KPR)TASS sur l'activité DPP IV
Dans cet essai, l'activité mettant en jeu l'affinité de cette molécule pour que l'enzyme DPPIV n'interfère pas sensiblement avec l'activité enzymatique de la DDPIV, contrairement à l'inhibiteur (ALBA 2) connu pour inhiber cette activité et utilisé à des fins de comparaison, comme en témoignent les résultats des essais comparatifs qui suivent et qui permettent l'appréciation de leurs effets respectifs sur cette activité. Ces effets ont été mesurés par étude du clivage de GP-pNA dans un tampon peptidase, dans les conditions expérimentales décrites par Callebaut et al, 1993, Science, 24 Dec. 1993, appliquées à une lignée de cellules T humaines, CEM, infectée par le virus HIV-1 LAI, et ce en présence de la molécule 5(KPR)TASS et de l'inhibiteur ALBA 2. Les résultats de ces essais apparaissent dans le tableau suivant, relatif aux Valeurs de IC50 des inhibiteurs peptidiques testés, sur l'activité DPP IV
********************************************************************
Peptide Concentration inhibitrice à 50%
****************************************************
Enzyme solubilisée Enzyme à la surface des cellules ********************************************************************
KPR 0,2 mM 10 mM
5(KPR)TASS 1 mM 5 - 10 mM
ALBA 2 0,2 M 1 M
********************************************************************
ALBA 2 : Lys(Z(N02)-pyrrolidid HCL K: Lys; P: Pro; R: Arg Comparé à ALBA 2, la molécule 5(KPR)TASS est 5 000 à 10 000 fois moins active pour l'inhibition de l'activité DPP IV.
b) Inhibition de l'entrée de HIV-1 par la molécule 5(KPR)TASS
L'entrée de HIV-1 LAI a été testée par infection de cellules CEM pendant 1 h. Le virus extracellulaire a été éliminé par traitement avec la trypsine et l'internaiisation de HIV a été suivie en testant la concentration de p25 (Callebaut et al, 1993, précité).
Inhibition de l'entrée de HIV par 5 (KPR)TASS
Peptide p25 internalisée % Inhibition pg/105 cellules
Aucun 280
KPR 5 mM 156 44
KPR lOmM 45 84
5 (KPR)TASS 10 μM 175 38
5 (KPR)TASS 25 μM 111 60
5 (KPR)TASS 50 μM 53 81
5 (KPR)TASS 100 μM 27 90
5 (KPR)TASS 200 μM < 1 > 99
Héparine 100 μg/ml < 1 > 99
Conclusion : la molécule 5 (KPR)TASS est un inhibiteur puissant de l'entrée de HIV. La valeur de la IC50 est d'environ 10 μM. Ainsi comparé au monomère KPR, 5(KPR)TASS est 500 fois plus actif. On notera que à 200 μM de 5 (KPR)TASS, l'activité enzymatique DPP IV n'est pas affectée du tout.
Ces résultats sont à rapprocher de ceux qui ont été rapportés par Schôn et coll. 1991, qui ont constatés que le puissant inhibiteur de l'activité enzymatique de la DDP-IV que représente l'ALBA-2 n'inhibe pas la fonction de la CD26 au cours de 1'activation des cellules T. c) Inhibition de l'infection par HIV-1 par 5 (KPR)TASS
Des cellules CEM ont été incubées (37°C, 30 min) avec différentes concentrations (200, 100, 50, 25 et 5 μM) de 5 (KPR)TASS avant l'infection avec HIV-1 LAI. Les cellules infectées en présence de l'inhibiteur ont ensuite été cultivées pendant 4 jours et la production de virus a été testée en suivant la concentration de p25 dans le surnageant de culture. La production de HIV a été inhibée de façon considérable par la molécule 5 (KPR)TASS et cette inhibition était dépendante de la dose : plus de 90 % d'inhibition à 20 μM et autour de 50 % d'inhibition à 5 à 10 μM. Comme la production du virus était inhibée par 5 (KPR)TASS, la formation de syncytia était également inhibée.
d) 5 (KPR)TASS inhibe la formation de syncytia
Pour démontrer l'effet de 5(KPR) TASS sur la formation syncytia, les cellules CEM ont été d'abord infectées avec HIV-1 LAI avant l'addition de différentes concentrations de 5 (KPR)TASS. La production de virus et la formation de syncytia ont été suivies à 4 jours après l'infection. Comme la molécule 5 (KPR)TASS était ajoutée après l'infection (c'est à dire après l'entrée de HIV dans les cellules), la production de virus n'était pas affectée. Cependant la formation de syncytia était complètement inhibée à 200 μM, était inhibée à 75% à 100 μM et à 50% avec 50 μM de 5 (KPR)TASS.
Ces résultats confirment que 5(KPR)TASS est un inhibiteur de l'entrée, comme cela a été démontré dans la section c (c'est-à-dire en inhibant la fusion des membranes virales et cellulaires) et montrent de plus que 5(KPR)TASS est aussi un inhibiteur de la formation de syncytia en empêchant la fusion des membranes des cellules infectées avec des cellules voisines.
e) La molécule 5 (KPR)TASS n'a pas d'effet toxique sur la croissance cellulaire
Le nombre de cellules, CEM ayant poussé en l'absence ou en présence de 100 μM de 5 (KPR)TASS était comparable après 3 trois jours de culture.
f) Inhibition de l'infection par HIV-2 et SIV
Les cellules (CEM clone 13 ; CEM 174, HUT 78) ont été incubées (37"C, 30mn) avec différentes concentrations (80, 40, 20 et 10 μM) de 5 (KPR)TASS avant l'infection avec HIV-2 ROD, HIV-2 EHO ou SIV mac. Les cellules infectées en présence de l'inhibiteur ont ensuite été cultivées pendant 4 jours et la production de virus a été testée en observant 1•activité de la transcriptase inverse dans le surnageant de culture. La production de HIV-2 et SIV a été inhibée de façon considérable par la 5 (KPR)TASS. Les doses d'inhibition à 50 % ont été estimées environ à 10-20 μM de la 5(KPR)TASS.
g) 5(KPR)TASS inhibe l'induction de la mort cellulaire ou l'apoptose
Des cellules chroniquement infectées par le HIV-1 (par exemple, les cellules H9/IIIB ; Resnick et al., 1986, K. Infect. Dis. 154, 1027-1030) à cause de l'expression du complexe gpl20/gp41 des glycoprotéines d'enveloppe de HIV, peuvent être utilisées en tant que cellules effectrices pour induire l'apoptose dans des lymphocytes CD4+ (par exemple, les cellules MOLT-4 T4) . En l'espace d'une vingtaine d'heures, de la coculture des cellules H9/IIIB dans MOLT-4-T4, 1'apoptose est détectée dans les cellules M0LT-4 (Laurent-Crawford et al. 1992, in "Rétrovirus of Human AIDS and Related Diseases, pp.35-41, Vllè Colloque des Cent Gardes). 5(KPR)TASS à une concentration de 50-100 μM est capable d'inhiber complètement l'induction de la mort cellulaire ou l'apoptose dans les cellules MOLT-4.
h) Des inhibiteurs de l'activité DPP IV ne sont pas nécessairement inhibiteurs de l'entrée du VIH
ALBA 2 (H-Lys-[Z(N02) ]-pyrrolidide) est un inhibiteur puissant de l'activité DPP IV (Schôn et coll., 1991, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 372, 305-311). L'activité de la DPP IV à la surface des cellules est inhibée à 90 % à 20 μM et à 50 % à 1 μM. Contrairement à cette inhibition de l'activité enzymatique de la DPP IV, ALBA 2 n'exerce un effet ni sur l'entrée du VIH, ni sur la. formation de syncytia, ni sur l'induction de l'apoptose, même à une concentration de 50 μM. La concentration de 100 μM est toxique pour les cellules. Au contraire, la molécule 5(KPR)TASS, qui n'exerce qu'un faible effet sur l'activité DPP IV, bloque considérablement l'infection des cellules par le VIH.
Inhibiteur (IC50) (IC50)
Activité DPP IV Inhibition de l'entrée
ALBA 2 lμM pas d'effet à 50μM
5(KPR)TASS 5mM 5μM
IC50 : dose de l'inhibiteur nécessaire pour une inhibition égale à 50 %
Ces résultats suggèrent que 1•activité catalytique de DPP IV/CD26 n'est pas nécessaire pour son fonctionnement dans l'infection des cellules par le VIH. Par ailleurs, la molécule 5(KPR)TASS qui n'affecte pas l'activité à des concentrations inférieures à 1 M inhibe 1•infection virale à plus de 95 % à une dose de 100 μM et à 50 % à une dose d'environ 5 μM. Une explication logique de ces résultats est que la molécule 5(KPR)TASS a une forte affinité pour un site dans la DPPIV/CD26 (site d'accrochage) qui devrait être indépendant du site catalytique impliqué dans l'activité enzymatique. Du fait que KPR pourrait servir de substrat suggère aussi que le site catalytique et le site d'accrochage interagissent avec des structures peptidiques similaires. i) exemple de différents inhibiteurs pour l'infection par le HIV de type 5(KPR)TASS Les cellules CEM ont été incubées (37°C, 30 min) avant 1•infection avec HIV-1 LAI avec différentes concentrations (de 50 à 0,5 μM) . Les cellules infectées en présence de 1*inhibiteur ont ensuite été cultivées pendant 4 jours et le production de virus a été évaluée en mesurant la concentration de p25 dans le surnageant de culture. Le tableau ci-dessous indique la concentration du peptide qui donne une inhibition d'au moins 90% et 50% de la production du virus.
Concentration du peptide inhibant la production du HIV
Peptide 90% 50%
5(KPR)TASS 20 μM 10 μM
5(KGR)TASS 50 μM N.T.
5(PKR)TASS 50 μM N.T.
5(RPK)TASS 10 μM 1 μM
5(KΦCH2-N-PR) TASS*1 μM 0,5 μM
La liaison peptidique entre KP est réduite. N.T. non testé h) le site de reconnaissance du peptide
5(KPR)TASS dans CD26
Les anticorps 1F7 contre la CD26 (C. Morimoto, DanaFarber Cancer Institute, Boston USA) bloquent l'entrée du virus HIV (Callebaut et al.. Science, 262, 2045-2050) sans inhiber l'activité enzymatique de la CD26. Ces résultats ont suggéré que le site d'interaction de la CD26 avec l'enveloppe du HIV se situe en dehors du site de reconnaissance du substrat de l'activité peptidase de CD26. Cette suggestion est en accord avec l'action de la peptide 5(KPR)TASS gui à la concentration de 50 μM inhibe plus de 90 % de l'entrée du virus sans affecter l'activité enzymatique.
Pour démontrer si le site d'action de la 5(KPR)TASS est le même que celui de l'anticorps 1F7, nous avons effectué l'expérience suivante : les cellules MOLT une lignée de lymphocytes T humain (CD4+ et CD26+) ont été incubées (5 min à température ambiante) avec ou sans addition de 50 μM de 5(KPR)TASS ou 50 μM de ALBA 2 (qui inhibe l'activité enzymatique mais pas l'entrée du virus). Les anticorps ont été ajoutés ensuite tels que MAb 1F7 anti CD26, MAb BA5 un autre anticorps anti CD26 (Immunotech) qui n'affecte pas l'entrée du HIV, MAb OKT4 anti-CD4 (Ortho Diagnostics Systems) , MAb ALBl anti CD45 (Immunotech) (tyrosine kinase associée avec CD26) et les cellules sont incubées à 4°C pendant 1 h. Les cellules sont ensuite lavées et analysées par FACS (abréviation de l'expression anglaise "Fluorescence- activated cell sorting analysis" ou "analyse par fluorescence de catégories de cellules activées") : voir la figure fournissant les spectres caractéristiques résultant de l'analyse par FACS de la reconnaissance du CD26 (par MAb 1F7 et MAb BA5) , CD4 (par MAb OKT4) et CD45 (par MAb ALBl) à la surface des cellules MOLT en l'absence ou en présence de 5 (KPR)TASS (cité comme S13) et ALBA2. Les résultats montrent que 5(KPR)TASS (cité sous le nom S13) inhibe la reconnaissance de CD26 par MAb 1F7 tandis que la reconnaissance de CD26 par MAb BA5 n'est pas affectée, indiquant ainsi que l'épitope de MAb 1F7 "est bien le site d'interaction de 5(KPR)TASS. Il est intéressant de noter que ALBA 2 qui n'affecte pas l'entrée du virus ne modifie pas la reconnaissance de la CD26 par l'anticorps 1F7 ou par BA5.
L'effet de 5(KPR)TASS sur 1»épitope de MAb 1F7 c'est à dire CD26 est spécifique car la reconnaissance des autres antigènes de surface tels que CD4 et CD26 ne sont pas modifiés par 5(KPR)TASS. Conclusion
Le complexe glycoprotéine formant l'enveloppe du virus et comportant la protéine de surface SU (gpl20) et la protéine transmembranaire TM (gp41) , joue un rôle important dans l'infection par le VIH ; la gpl20 contient le site de fixation au CD4, et la gp41 le motif peptidique nécessaire au processus de fusion membranaire. L'association non-covalente de la gpl20 et la gp41 forme un complexe conformationnel qui est essentiel pour les deux fonctions principales du complexe gpl20/41 ; l'entrée du noyau (core) du virus dans les cellules par fusion des membranes virale et cellulaire, et l'induction de l'effet cytopathogène par fusion des membranes des cellules infectées (exprimant le complexe gpl20/gp41 à la surface) avec celles des cellules voisines.
L'expression du complexe gpl20/gp41 à la surface des cellules infectées conduit à une interaction avec les molécules CD4 des cellules voisines non infectées, qui entraîne un effet cytopathogène caractéristigue du VIH (Laurent-Crawford et al., 1993, AIDS Res. Hum. Retroviruses _, 761-773) : formation de syncytia (cellules multinucléées générées par la fusion des cellules infectées avec les cellules non infectées) et/ou la mort cellulaire par apoptose (fragmentation de la chromatine au niveau des liens internucléosomiques) .
Le fait que les différentes fonctions du complexe d'enveloppe gpl20/gp41 : 1) l'entrée virale ; 2) la formation des syncytia ; 3) l'induction de l'apoptose sont inhibées par la molécule 5(KPR)TASS suggère que dans ces différentes fonctions du complexe gpl20/gp41, cette molécule inhibe l'interaction de la boucle V3 avec une protéine de surface, par exemple, la DPPIV/CD26.
5 (KPR)TASS est un inhibiteur potentiel de l'entrée de HIV et de l'infection. Il présente très peu d'effet, à supposer qu'il puisse même être constaté, sur l'activité enzymatique DPP IV. Ainsi on peut penser que 5 (KPR)TASS agit principalement sur le site de reconnaissance du substrat (c'est-à-dire la boucle V3 de la gpl20) sans affecter le site catalytique de la molécule CD26. Une des explications de l'activité plus importante de 5 (KPR)TASS par rapport au monomère KPR pourrait être trouvée dans le fait que la molécule CD26 existerait sous forme d'un multimère d'où également une présentation également plus efficace d'un multimère de type KPR plus efficace.
Le résidu KPR dans la molécule TASS peut également être remplacé par d'autres peptides pour former des variants de cet inhibiteur, par exemple : RPK, RPR, PKR, KGR.
Le tripeptide KPR est un des motifs conservés dans la boucle V3, précisément trouvé dans la partie C-terminale de la boucle V3 de certains VIH-2. En raison de la présence du dipeptide KP, KPR pourrait servir comme un substrat de l'enzyme DPPIV/CD26. Par ailleurs, nous avons démontré que le tripeptide KPR monomère à 10 mM inhibe l'entrée de VIH et aussi inhibe l'activité de la DPPIV. Sur ces données, nous avons ici démontré que la présentation multimérique de ce tripeptide KPR (par exemple 5(KPR-TASS) augmente considérablement l'efficacité de cette molécule pour inhiber l'entrée de VIH, la formation de syncytia et l'induction de l'apoptose. Mais à la concentration (10-200μM) de 5(KPR)TASS quand l'infection virale est inhibée, l'activité enzymatique n'est pas affectée. Ce n'est qu'à une concentration de 1-lOmM de 5(KPR)TASS, que l'activité de la DPPIV est inhibée.
Enfin, les peptides de type 5(KPR)TASS semblent interagir avec CD26 dans une région qui constitue l1épitope de l'anticorps onoclonal anti-CD26, MAb 1F7. Exemple de l'effet inhibiteur de différents peptides synthétiques multimeres (correspondant à la molécule TASS ou à des formes modifiées de la molécule TASS), sur l'infection par HIV-1 LAI dans des cellules CEM.
Des cellules CEM ont été incubées (15-30 minutes, 37°C) avec les différents peptides avant l'infection avec la souche HIV-1 LAI (60 minutes, 37βC). Les cellules ont ensuite été centrifugées et suspendues dans un milieu de culture frais contenant les différents inhibiteurs. La formation de syncytia a été suivie au jours 3 et 4 après l'infection (post¬ infection (p.i)) et les surnageants de cultures ont été testés pour déterminer leur concentration en protéine majeure du noyau (core) de HIV, p24/p25. On a remarqué une très bonne corrélation entre l'inhibition de la formation des syncytia et la production de HIV (c'est-à-dire la concentration de p24/p25) .
La matrice de TASS est composée des résidus suivants : KKKGPKEKGC. Comme contrôle, on a utilisé une matrice TASS modifiée dans laquelle le résidu proline (P) avait été modifié par un résidu G conformément à la séquence suivante : KKKGGKEKGC. Cette dernière séquence est dénommée TASS(GG). Une autre molécule TASS modifiée répondant à la séquence KKKKGC a également été utilisée. Dans certains cas, la matrice MAP a été utilisée dans un but de comparaison.
01 5(KPR)-TASS
99% inhibition à 100 μ 85% inhibition à 25 μM 25-50% inhibition à 10 μM.
03 8( PRG)-MAP
93% inhibition à 50 μM 58% inhibition à 25 μM 18% inhibition à 10 μ 8(RPG)-MAP
50% inhibition à 100 μM 8% inhibition à 50 μM
4 X 2(KPRG)-TASS
99% inhibition à 50 μM 50% inhibition à 10-25 μM
4 X 2(IPIG)-TASS
Pas d'effet à 100 μM
8(GPGRAF)-MAP
98% inhibition à 100 μM 86% inhibition à 50 μM
5(KGR)-TASS
86-99% inhibition à 50 μM
8(KPRG)-TASS
85% inhibition à 50 μM
70% inhibition à 25 μM
50% inhibition à 10 μM
5(KPRQAG)-TASS
Toxique à 100 et 50 μM Pas d'effet à 25 μM
5(IPIG)-TASS
Pas d'effet à 100 μM
2(KGR)-TASS
Pas d'effet à 100 μM
5( GR)-TASS(GG)
Toxique à 100 μM
90-99% inhibition à 50 μM
70% inhibition à 25 μM
5(PKR)-TASε(GG) 99% inhibition à 50 μM 75% inhibition à 25 μM
5(KGQ)-TASS
45% inhibition à 100 μM Pas d'effet à 50 μM
5(KΨCH2-N-PR)-TASS
Cytostatique à 50 μM (35% de cellules en moins) 99% inhibition à 25 μM 99% inhibition à 10 μM 65% inhibition à 1 μM 50% inhibition à 0.5 μM
5(eacetyleKPR)-TASS
Peut être inhibé de 50% à 10 μM
5(PKR)-TASS
95% inhibition à 100 μM
75% ; 60% inhibition à 25 μM
50% inhibition à 10 μM
5(G)-TASS
8% inhibition à 100 μM Pas d'effet à 50 μM
3 (KPR)-TASS
24% inhibition à 100 μM Pas d'effet à 50 μM
Figure imgf000032_0001
99% inhibition à 50 μM 97% inhibition à 25 μM 97% inhibition à 10 μM 50% ; 65% inhibition à 1 μM Pas d'effet à 0.5 μM
5(pyrKR)-TASS
95% inhibition à 50 μM 86% inhibition à 25 μM
66% inhibition à 10 μM
5(cAminohexanoylePR)-TASS 90% inhibition à 50 μM
67% inhibition à 25 μM
66% inhibition à 10 μM
5(KER)-TASS
67% inhibition à 50 μM
50% inhibition à 25 μM
34% inhibition à 10 μM
5(RK)-TASS
96% inhibition à 50 μM
77% inhibition à 25 μM
58% inhibition à 10 μM
Hexanoyl 4(RPK)-TASS
Pas d'effet à 50 μM
5((D)R(D)P(D)K)-TASS 98% inhibition à 50 μM 98% inhibition à 25 μM 98% inhibition à 10 μM 82% inhibition à 5 μM 20% inhibition à 1 μM
5(RPR)-TASS
96% inhibition à 50 μM
95% inhibition à 25 μM
95% inhibition à 10 μM
85% inhibition à 5 μM
10% inhibition à 1 μM
4(RPK)-TASS
71% inhibition à 50 μM
40% inhibition à 25 μM
24% inhibition à 10 μM 035 5(ACRPK)-TASS ( Ac: Acetyl CH3...)
90% inhibition à 50 μM
59% inhibition à 25 μM
20% inhibition à 10 μM
036 5(RPK)-KKKKGC
98% inhibition à 50 μM
98% inhibition à 25 μM
98% inhibition à 10 μM
60% inhibition à 5 μM
35% inhibition à 1 μM
037 5(R-ΦCH2N-PK)-KKKKGC
99% inhibition à 20 μM 99% inhibition à 10 μM 99% inhibition à 5 μM 65% inhibition à 1 μM 50% inhibition à 0.5 μM
038 5((D)R-ΨCH2N-(D)P(D)K)-KKKKGC
99% inhibition à 20 μM 99% inhibition à 10 μM 99% inhibition à 5 μM 82% inhibition à 1 μM 50% inhibition à 0.5 μM
Conclusions :
Ces études structure-fonction suggèrent que la présentation pentavalente des motifs KPR ou RPK correspond à la présentation optimale. La présentation octavalente (voir N° 6 et 10) n'augmente pas 1'activité inhibitrice et la présentation trivalente ou tétravalente conduit à une activité d'inhibition faible (voir N" 23 et 24).
Les différentes molécules peptides-TASS sont actives à des concentrations en microgrammes pour bloquer l'entrer de HIV, l'infection et la formation de syncytium. Avec une infection par HIV-1 LAI à haute dose sur des cellules T de type CEM, la valeur de la concentration inhibitirice à 50% (IC50) pour certaines des molécules (N° 19, 25, 32, 33, 36, 37, 38) est comprise entre 0.5 et 2 μM.
Caractéristiques du motif inhibiteur :
K - P - R ' (D (2) (3)
D'après les exemples précédents, une formule préférée du motif inhibiteur comporterait les résidus suivants :
Deux acides aminés devraient être des résidus basiques, par exemple K ou R ; K pouvant être remplacé par R et vice-versa. Ces deux résidus basiques pourraient occuper l'une quelconque des positions l, 2 ou 3 (voir exemple Nβl, 16, 21, 25 et 33).
- Le résidu P pourrait être délété ou remplacé par un résidu G pour obtenir un motif actif (N°15 et 30) mais le remplacement par un résidu de type E diminuerait l'action inhibitrice (voir N°16).
- Le remplacement d'un résidu basique par un autre résidu hydrophile tel que le résidu Q réduit considérablement l'activité inhibitrice (voir N°18 ; 5(KGQ)-TASS) .
- Le groupe _ amino du résidu K est important puisque l'acétylation de ce groupe réduit considérablement l'action inhibitrice de la molécule (N°20) .
- Le groupe α-amino du motif ne joue pas un rôle crucial puisque qu'il peut être acétylé (voir N°35) sans que l'activité inhibitrice soit réduite considérablement. De même l'introduction d'un acide pyroglutamigue à la position 1 n'affecte pas l'activité inhibitrice (voir N°27) .
- L'introduction du «aminohexanoyl à la position 1 ne réduit pas l'activité de la molécule (voir 28).
- La construction faite avec l'enantiomère D du motif d'inhibition est aussi active que la construction correspondant à la configuration L du motif inhibiteur (voir Nβ32) .
- La réduction de la liaison peptidique entre l'acide aminé 1 et l'acide aminé 2, accroît considérablement l'action inhibitrice de la molécule (N°19, 37, 38).

Claims

REVENDICATIONS
1. Molécule comprenant une pluralité de motifs ou "motifs répétés" susceptibles d'être reconnus par une ectoprotéine (à la surface des cellules) notamment par le récepteur CD26 (encore appelé enzyme DPPIV) ces motifs étant tous portés par une matrice peptidique autorisant leur présentation multiple à l'enzyme et présentant une affinité pour celle-ci.
2. Molécule selon la revendication 1, caractérisée en ce que la matrice peptidique portant les "motifs répétés" contient des résidus d'acides aminés possédant une fonction réactive non engagée dans une liaison peptidique avec des résidus voisins d'acides aminés, ces fonctions réactives intervenant dans la fixation desdits motifs répétés sur cette matrice.
3. Molécule selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend des résidus d'acides aminés de type lysine, les susdits motifs répétés étant alors greffés sur les groupes epsilon- amino d'une partie au moins de ces résidus lysine.
4. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la matrice peptidique comprend l'enchaînement d'acides aminés suivant : K X^ K X2 X3 dans lequel X-, est la lysine, la valine, l'alanine ou l'isoleucine, X2 et X3 représentent la glycine ou la proline et sont différents l'un de l'autre.
5. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la matrice peptidique comprend un enchaînement d'acides aminés choisi parmi les séquences suivantes :
K X, K G P
K X, K K G P
K X, K G P K X4 K
K X, K G P K X4 K G C, K XT K G G K X4 K G C K K
I I
K X, K G P
K X, K P G
K X- K K P G
K X, K K G C
K X, K P G K X4 K
K X1 K P G K X4 K G C
K K
I I
K X., K P G
K X^ K 4 K X^ K
K X, K X4 K X, K G C dans lesquels X^ est facultatif et peut être la lysine, la valine, l'alanine ou l'isoleucine et X4 est facultatif et peut être l'acide glutamique, la valine, l'alanine ou l'isoleucine.
6. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les acides aminés de la matrice sont sous forme dextrogyre ou levogyre.
7. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la matrice peptidique comprend entre 2 et 8 motifs répétés, de préférence entre 4 et 6 motifs, notamment 5 motifs.
8. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les liaisons peptidiques entre tout ou partie des acides aminés des motifs sont modifiées de façon à prévenir leur hydrolyse enzymatique.
9. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le motif répété comprend trois acides aminés dont deux sont des résidus basiques, par exemple K et/ou R.
10. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le motif répété répond à la séquence KPR.
11. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le motif répété comprend une séquence choisie parmi les suivantes ou correspond à l'une de ces séquences :
RP, KP, PK, PR, RK, KR, KPR, RPK, PKR, PRK.
KER, KGQ, KGR, RPR, RPG, AHxPR, pyrKR, RPGR, KPGR,
KPRG, GPGR, IPIG, GPGRAF, KRPGNK, RPGNK, KRPRQ, KPRQAG
12. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule suivante :
R R R R P P P P K K K K
I l I I
R P K - K K K G P K E K G C.
13. Molécule selon l'une quelconque des revendications l à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend plusieurs motifs répétés différents.
14. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que la matrice peptidique est remplacée par une molécule fonctionnellement équivalente choisie parmi les polyamines, par exemple le Tris (2 aminoethyle) aminé ou les dendrimères.
15. Composition susceptible d'inhiber l'infection due à un rétrovirus humain de type HIV, notamment de type HIV-1 ou HIV-2 ou SIV, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, une molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
16. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle a la capacité d'inhiber l'interaction entre le récepteur cellulaire CD26 ou DPPIV et la glycoprotéine externe d'enveloppe du rétrovirus HIV, de préférence sans affecter l'activité enzymatique de la DPPIV CD26.
17. Utilisation d'une molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour la préparation d'un médicament pour le traitement d'une infection due à un rétrovirus humain de type HIV.
18. Composition selon la revendication 17 caractérisée en ce qu'elle a la capacité d'inhiber l'entrée des particules du VIH en empêchant la fusion des membranes cellulaire et virale.
19. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle a la capacité d'inhiber la fusion des cellules infectées avec des cellules voisines.
20. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'elle a la capacité d'inhiber l'induction de la mort cellulaire par l'apoptose en empêchant l'interaction du complexe des glycoprotéines d'enveloppe gpl20/gp41 avec les cellules cibles.
21. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif, une molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
22. Utilisation d'une molécule selon l'une quelconque des revendications l à 14, pour la préparation d'un médicament capable d'inhiber l'interaction entre le récepteur cellulaire CD26 ou DPPIV et la glycoprotéine externe d'enveloppe du rétrovirus HIV.
23. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif une molécule selon l'une quelconque des revendications l à 14.
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JP7527406A JPH10502337A (ja) 1994-04-22 1995-04-21 Ｈｉｖの細胞侵入を阻害するための、 ｄｐｐｉｖの基質であるペプチド類縁体、特にｋｐｒ型の該類縁体の複合提示
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Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998000439A2 (fr) * 1996-06-28 1998-01-08 Trustees Of Tufts College Composes multivalents pour la reticulation de recepteurs et utilisations associes
WO1998040480A1 (fr) * 1997-03-12 1998-09-17 Institut Pasteur Recepteur membranaire pour retrovirus de vih, utilisations therapeutiques et diagnostiques
US6011155A (en) * 1996-11-07 2000-01-04 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-2-cyanopyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US6100234A (en) * 1997-05-07 2000-08-08 Tufts University Treatment of HIV
US6110949A (en) * 1999-06-24 2000-08-29 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-4-cyanothiazolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US6166063A (en) * 1998-12-10 2000-12-26 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-2-cyanopyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US6172081B1 (en) 1999-06-24 2001-01-09 Novartis Ag Tetrahydroisoquinoline 3-carboxamide derivatives
US6258597B1 (en) 1997-09-29 2001-07-10 Point Therapeutics, Inc. Stimulation of hematopoietic cells in vitro
US6300314B1 (en) 1998-05-04 2001-10-09 Point Therapeutics, Inc. Hematopoietic stimulation
US6355614B1 (en) 1998-06-05 2002-03-12 Point Therapeutics Cyclic boroproline compounds
US6617340B1 (en) 1999-07-29 2003-09-09 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-pyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US6692753B2 (en) 1997-05-07 2004-02-17 Trustees Of Tufts College Potentiation of the immune response
US6825169B1 (en) 1991-10-22 2004-11-30 Trustees Of Tufts College Inhibitors of dipeptidyl-aminopeptidase type IV
US6890904B1 (en) 1999-05-25 2005-05-10 Point Therapeutics, Inc. Anti-tumor agents
US7132443B2 (en) 2001-06-27 2006-11-07 Smithklinebeecham Corporation Fluoropyrrolidines as dipeptidyl peptidase inhibitors
FR2900341A1 (fr) * 2006-04-27 2007-11-02 Centre Nat Rech Scient Utilisation de ligands synthetiques multivalents de la nucleoline de surface pour le traitement du cancer
US9243030B2 (en) 2008-05-22 2016-01-26 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Optically pure compounds for improved therapeutic efficiency
US9487559B2 (en) 2010-10-04 2016-11-08 Elro Pharma Sarl Compositions comprising multivalent synthetic ligands of surface nucleolin and glycosaminoglycans

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1881003A1 (fr) * 2005-04-22 2008-01-23 Japan Crown Cork Co. Ltd. Composé ayant un résidu d'acide aminé ou un résidu de peptide et procédé servant à produire celui-ci
US20090133747A1 (en) * 2005-05-23 2009-05-28 CREDIA JAPAN CO., LTD. ( A juridical person under the laws of Japan) Compound having photosensitization activity, photoelectrode, and photosensitization-type solar cell
WO2007061077A1 (fr) * 2005-11-25 2007-05-31 Credia Japan Co., Ltd. Vehicule pour utilisation dans l'introduction d'acide nucleique, kit pour utilisation dans l'introduction d'acide nucleique, et procede pour l'introduction d'acide nucleique dans une cellule

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028915A1 (fr) * 1993-06-04 1994-12-22 Institut Pasteur INHIBITEURS DE l'INFECTION PAR UN RETROVIRUS HIV, CAPABLES D'INTERAGIR AVEC LE RECEPTEUR CD26
WO1995007929A1 (fr) * 1993-09-13 1995-03-23 Armel S.A. Constructions de peptides a branches multiples destines a etre utilises contre le vih

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028915A1 (fr) * 1993-06-04 1994-12-22 Institut Pasteur INHIBITEURS DE l'INFECTION PAR UN RETROVIRUS HIV, CAPABLES D'INTERAGIR AVEC LE RECEPTEUR CD26
WO1995007929A1 (fr) * 1993-09-13 1995-03-23 Armel S.A. Constructions de peptides a branches multiples destines a etre utilises contre le vih

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. BENJOUAD ET AL.: "Multi-branched peptide constructs (MBPC) of the V3-loop of envelope glycoprotein gp120 inhibit human immunodeficiency virus-induced syncytium formation.", ANTIVIRAL CHEMISTRY AND CHEMOTHERAPY, vol. 5, no. 3, OXFORD, GRANDE BRETAGNE, pages 195 - 196 *
B. FLEISCHER ET AL.: "CD26: a surface protease involved in T-cell activation.", IMMUNOLOGY TODAY, vol. 15, no. 4, AMSTERDAM, PAYS BAS, pages 180 - 184 *
C. CALLEBAUT ET AL.: "L'entrée du VIH dans les cellules CD4+ requiert l'antigène de surface CD26.", ANNALES DE L'INSTITUT PASTEUR, ACTUAL., vol. 5, no. 1, PARIS, FRANCE, pages 41 - 46 *
C. CALLEBAUT ET AL.: "T cell activation antigen, CD26, as a cofactor for entry of HIV in CD4+ cells.", SCIENCE, vol. 262, no. 5142, 24 December 1993 (1993-12-24), WASHINGTON DC, ŸTATS UNIS, pages 2045 - 2050 *
J. FANTINI ET AL.: "Multi-branched peptides based on the HIV-1 V3 loop concensus motif inhibit HIV-1 and HIV-2 infection in CD4+ and CD4- cells.", COMPTES RENDUS DE L'ACADŸMIE DES SCIENCES. SŸRIE III. SCIENCES DE LA VIE., vol. 316, no. 11, PARIS, FRANCE, pages 1381 - 1387 *

Cited By (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7230074B2 (en) 1991-10-22 2007-06-12 Trustees Of Tufts College Inhibitors of dipeptidyl-aminopeptidase type IV
US6825169B1 (en) 1991-10-22 2004-11-30 Trustees Of Tufts College Inhibitors of dipeptidyl-aminopeptidase type IV
US5965532A (en) * 1996-06-28 1999-10-12 Trustees Of Tufts College Multivalent compounds for crosslinking receptors and uses thereof
WO1998000439A3 (fr) * 1996-06-28 2000-08-24 Tufts College Composes multivalents pour la reticulation de recepteurs et utilisations associes
US6875737B1 (en) 1996-06-28 2005-04-05 Trustees Of Tufts College Multivalent compounds for crosslinking receptors and uses thereof
WO1998000439A2 (fr) * 1996-06-28 1998-01-08 Trustees Of Tufts College Composes multivalents pour la reticulation de recepteurs et utilisations associes
US6011155A (en) * 1996-11-07 2000-01-04 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-2-cyanopyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US6124305A (en) * 1996-11-07 2000-09-26 Novartis Ag Use of N-(substituted glycyl)-2-cyanopyrrolidines in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
WO1998040480A1 (fr) * 1997-03-12 1998-09-17 Institut Pasteur Recepteur membranaire pour retrovirus de vih, utilisations therapeutiques et diagnostiques
US6503882B2 (en) 1997-05-07 2003-01-07 Trustees Of Tufts College Treatment of HIV
US6100234A (en) * 1997-05-07 2000-08-08 Tufts University Treatment of HIV
US6692753B2 (en) 1997-05-07 2004-02-17 Trustees Of Tufts College Potentiation of the immune response
US6703238B2 (en) 1997-09-29 2004-03-09 Point Therapeutics, Inc. Methods for expanding antigen-specific T cells
US6258597B1 (en) 1997-09-29 2001-07-10 Point Therapeutics, Inc. Stimulation of hematopoietic cells in vitro
US6300314B1 (en) 1998-05-04 2001-10-09 Point Therapeutics, Inc. Hematopoietic stimulation
US6770628B2 (en) 1998-05-04 2004-08-03 Point Therapeutics, Inc. Hematopoietic stimulation
US7067489B2 (en) 1998-05-04 2006-06-27 Point Therapeutics, Inc. Hematopoietic stimulation
US6355614B1 (en) 1998-06-05 2002-03-12 Point Therapeutics Cyclic boroproline compounds
US6166063A (en) * 1998-12-10 2000-12-26 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-2-cyanopyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US6890904B1 (en) 1999-05-25 2005-05-10 Point Therapeutics, Inc. Anti-tumor agents
US6949514B2 (en) 1999-05-25 2005-09-27 Point Therapeutics, Inc. Anti-tumor agents
US6110949A (en) * 1999-06-24 2000-08-29 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-4-cyanothiazolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US6172081B1 (en) 1999-06-24 2001-01-09 Novartis Ag Tetrahydroisoquinoline 3-carboxamide derivatives
US6617340B1 (en) 1999-07-29 2003-09-09 Novartis Ag N-(substituted glycyl)-pyrrolidines, pharmaceutical compositions containing them and their use in inhibiting dipeptidyl peptidase-IV
US7132443B2 (en) 2001-06-27 2006-11-07 Smithklinebeecham Corporation Fluoropyrrolidines as dipeptidyl peptidase inhibitors
FR2900341A1 (fr) * 2006-04-27 2007-11-02 Centre Nat Rech Scient Utilisation de ligands synthetiques multivalents de la nucleoline de surface pour le traitement du cancer
WO2007125210A2 (fr) 2006-04-27 2007-11-08 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Utilisation de ligands synthetiques multivalents de la nucleoline de surface pour le traitement du cancer ou de l'inflammation
WO2007125210A3 (fr) * 2006-04-27 2008-10-30 Centre Nat Rech Scient Utilisation de ligands synthetiques multivalents de la nucleoline de surface pour le traitement du cancer ou de l'inflammation
EP2540737A1 (fr) * 2006-04-27 2013-01-02 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Utilisation de ligands synthétiques multivalents de la nucléoline de surface pour le traitement de l'inflammation
US8497349B2 (en) 2006-04-27 2013-07-30 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Use of multivalent synthetic ligands of surface nucleolin for treating cancer or inflammation
US9254309B2 (en) 2006-04-27 2016-02-09 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Use of multivalent synthetic ligands of surface nucleolin for treating cancer or inflammation
US9243030B2 (en) 2008-05-22 2016-01-26 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Optically pure compounds for improved therapeutic efficiency
US9487559B2 (en) 2010-10-04 2016-11-08 Elro Pharma Sarl Compositions comprising multivalent synthetic ligands of surface nucleolin and glycosaminoglycans

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