WO1995025955A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung der toxizität sowie deren anwendung - Google Patents

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WO1995025955A1
WO1995025955A1 PCT/CH1995/000055 CH9500055W WO9525955A1 WO 1995025955 A1 WO1995025955 A1 WO 1995025955A1 CH 9500055 W CH9500055 W CH 9500055W WO 9525955 A1 WO9525955 A1 WO 9525955A1
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mobility
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test
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Rudolf Portmann
Mathias Leumann
Stefan Thommen
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Schweizerische Eidgenossenschaft Vertreten Durch Das Ac-Laboratorium Spiez Der Gruppe Für Rüstungsdienste
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/18—Water
    • G01N33/186—Water using one or more living organisms, e.g. a fish

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the toxicity of water-soluble or water-miscible substances.
  • the invention also relates to a suitable device for carrying out the method and an application of the method.
  • a device is to be created which permits automation of the method and rationalizes its evaluation and allows it to be documented in a meaningful manner.
  • this object is achieved in that a change in the mobility and / or the size of at least two individuals is determined by a type of test organism in an aqueous medium under the influence of at least one toxic substance in at least two time intervals, wherein at least one reference measurement and at least one further measurement take place after the addition of the toxic substances.
  • the term "mobility” used in the patent claim has been adopted from solid state physics and describes the “movement activity” and in particular the "mobility” of the test organisms, which is most easily observed in aqueous media as its "shift in location” per unit of time.
  • This mobility can also be applied to the observation of the function of individual organs of the test organisms.
  • Such toxicity determinations can be carried out in parallel to the mobility, but also separately from this, with the same apparatus.
  • small organisms can be used to determine the toxicity of substances by measuring the influence of individual and / or combinations of substances on the change in these animals. Such measurements can massively reduce the number of tests on suffering laboratory animals.
  • Another advantage of the process is its simplicity and quick handling, as well as its cost-effectiveness.
  • the concept of toxicity is not limited to poisoning in the usual sense; it can be extended to any recognizable effect (reaction) on a living organism.
  • the device for carrying out the method is characterized in that an image acquisition unit is provided which carries out the object recognition and a sequential recording of the position of the object, in at least one plane, at predeterminable time intervals, that the image acquisition unit has an evaluation arrangement with a computer and display devices, which carry out a statistical evaluation of the mobility of the organisms in relation to the existing toxicity.
  • the image acquisition unit is designed to be mechanically displaceable and guided over the samples to be examined.
  • a change in mobility is considered to be a distance covered by the test organism per time interval.
  • the toxicity determined according to the invention is - as shown in claim 4 - a relative toxicity, based on a standard toxicity.
  • the invention is expediently applied using lower animals as test organisms. Organisms that live in water are particularly suitable for this because their mobility is easiest to observe.
  • Performing the test using Artemia salina nauplii is not influenced by seasonal dependency, feeding and rearing, but it is influenced by the ambient temperature and the time factor, so that only automated procedures can be considered as professional means of examination.
  • Artemia salina forms cysts under bad living conditions (eggs that are locked in the early gastrula stage) and can thus be stored for many years.
  • Free-floating rotators can also be used.
  • water fleas for special examinations, for example when checking carcinogenic substances, water fleas (Cladocera) are preferred, as they allow observations over two generations in a simple manner.
  • the mobility of the test organisms can be determined purely optically with the aid of a microscope, a slowdown in mobility and / or an inactivation of the test organism being observed under the influence of the toxic substance.
  • the measurement - as shown in claim 10 - is carried out using a microtiter plate, as described in detail, for example, in Swiss Patent Application No. 03 141 / 93-6 (not previously published).
  • the water-soluble substances to be determined are dissolved in water or an artificial seawater in the vessels described above, and the test organism is added and their reactions are evaluated electronically.
  • the process sequence can be significantly optimized by the systematic pipetting described in claim 14; Potential sources of error can thereby be largely eliminated.
  • the device provided for carrying out the method allows the observed images to be easily evaluated by conventional EDP means;
  • a relative mean speed of the test organisms can be determined by the quotient formation of all distances covered per time interval and per image, or the acceleration values can also be determined by the second derivative.
  • a so-called CCD shutter camera according to claim 18 is particularly suitable for carrying out the method, since at present only such cameras are able to deliver sufficiently sharp and evaluable images.
  • the arrangement of two cameras proposed in claim 19 allows the movements of the test organisms to be observed and measured in three dimensions.
  • test organisms in a test arrangement could in principle be recorded simultaneously and evaluated individually, cf. Claim 20.
  • the toxicity determination as has been tested in detail with Artemia salina nauplii, enables the relative toxicity of substances in an aqueous medium to be clarified, ie. of water-soluble substances but also of substances which can be dissolved using solubilizers such as Acetone have been made water soluble. But it also enables - as shown in claims 23 to 25 - information about the toxic effects of substances on aquatic fauna, especially insecticides and pesticides. Characteristic lethal dose curves can also be recorded by periodic measurements at the same time intervals and with increasing concentration of the toxic doses, which allow conclusions to be drawn about the nature of the toxic substance and contribute to exploring the mechanism of action of the substance or the combination of substances.
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of an electro-optical image acquisition unit with a characteristic test organism for determining its mobility
  • FIG. 2 shows an overall view of a device with an image acquisition unit and evaluation arrangement
  • FIG. 3 shows a partial sectional view through the device cabinet FIG. 2, orthogonal to the front plate,
  • FIG. 4 is a partial sectional view through the device of FIG. 2 parallel to the front panel
  • FIG. 6 shows a flowchart which shows the program sequence for the automated determination of the mobility of test organisms
  • FIG. 7 shows a characteristic mean, temporal decrease in speed of living test organisms in three selected toxic solutions, observed over a period of 10 hours
  • Fig. 8 shows a toxicity test with Artemia salina in one
  • Fig. 10 is a video recording of a group of living test organisms in an aqueous medium at the beginning of
  • FIG. 10 shows a further video recording of the group of still living test organisms.
  • FIG. 10 after 24 hours, during which part of the medium has evaporated
  • FIG. 13 shows the measurement of up to 6 titer plates according to the diagram in FIG. 12,
  • 16 shows the intervals provided for measuring an individual container, the time periods between the individual measurements being determined by the transport mechanism of the camera and 17 shows a sequence evaluation of all processes which are necessary in order to be able to evaluate an individual vessel in a titer plate.
  • 1 denotes a video camera (CCD shutter camera; Sony type XC-77RR-CE).
  • the optics 2 placed on the electronic camera 1 is a macro lens (Sony type CM50).
  • the video camera 1 is arranged vertically on a C-arm 4a - 4c on two supports 3, 3 'in a manner known per se.
  • the C-arm rests on a commercially available positioning unit 5, an XY cross table with two feed units (company ISEL Automation D-6419 Eiterfeld) with corresponding stepper motors, which have a displacement length of 400 mm in the X direction or 300 mm in the Y direction.
  • a light distributor 6 is arranged in the C-arm vertically above the optics 2 of the camera 1 and is fed by a light source (not shown here) via a light guide 7.
  • the video signals VS are routed upwards via a signal line 9, cf. 3, 4.
  • the entire device for observing and evaluating test organisms is combined in an image acquisition and evaluation unit 10, 10 ', designated by 10 in FIG. 2.
  • a sample space can be loaded with experiments via two doors 12a, 12b.
  • a further monitor 13 is arranged on a rotatable stand, which records the images in the equipment cabinet 11 located video camera.
  • FIG. 3 shows the interior of the device cabinet, the orientation of the section being determined by the position of the doors 12a, 12b, cf. Fig. 2, is given.
  • the C-arm 4a, 4b, 4c with its components, FIG. 1 can be seen; likewise the positioning unit 5 and the light guide 7, which is connected to a conventional light source 8.
  • a titer plate arrangement 21 which receives samples with test organisms.
  • the whole is supplied by a commercially available, uninterruptible power supply 22, FIGS. 3 and 4. All the signals necessary for controlling the positioning unit 5 are generated in a controller 23.
  • the video signals VS are routed to a conventional camera control device in the control computer 15.
  • peripheral devices such as printers, plotters, etc., which can be connected to the PC, are not shown.
  • FIG. 5 shows the titer plate arrangement 21 arranged in the sample space 20 with its most essential components.
  • the arrangement 21 consists of a frame screwed into the equipment cabinet 11 with openings 24, in which six microtiter plates 24.1 - 24.6 with 96 vessels each can be inserted and which contain one sample with test organisms (approximately 12 Artemia salina) per vessel.
  • a protective cover (not shown) prevents the samples from being disturbed by exposure to dust and / or heat radiation, etc .; the individual titer plates are also covered with a transparent plastic to reduce the evaporation effect.
  • the mobility of test organisms can be measured with the device described above. The easiest way to do this is to determine the speed of locomotion of the organisms in a test solution, the relative speed being related to a control solution (without toxic substance).
  • the user is expediently guided by a PC program when designing the experiment. This asks about the number of concentrations (in mol or percent) and parallel determinations, blank values, controls and their arrangement, as well as about the placement of the experiment in the respective vessels of the multi-vessel arrangement. Furthermore, the program requires information on the name of the test substance, its molecular weight, the highest concentration to be tested and the choice of the linear or logarithmic dilution series. After entering the total volume for the test, the volume in which the test organisms (e.g. Artemia salina) and the test substance are added, the program calculates the amount of test substance required for the experiment. After recording the weighed quantity, the required dilutions can now be made directly under the guidance of the program. The pipetting is made easier by an optical aid on the screen.
  • test organisms e.g. Artemia salina
  • a preferred seawater solution contains 2800 mg NaCl, 342 mg MgS0 -7H 2 0, 234 mg MgCl -6H 2 0, 122 mg CaCl 2 -2H 2 0, 20 mg NaHC ⁇ 3, 74 mg KC1 per 100 ml distilled water.
  • the number of test organisms that are in the artificial seawater solution mixed with the substance to be examined is determined by an electro-optical determination.
  • the electro-optical determination is basically carried out as follows:
  • the samples are placed in the microtiter plate containing the test in the automatic analyzer described.
  • an electronic camera drives under the individual measuring stations of the microtiter plate and takes 12 to 36 images.
  • the respective sample is illuminated from above.
  • a camera with shutter speed control must be used.
  • the lens of this camera is designed in such a way that on the one hand the picture is taken to fill the format, and on the other hand the entire depth of the liquid (approx. 1 cm) can be depicted sharply.
  • the lighting takes place via a light guide, which is fastened in parallel to the C-arm together with the camera.
  • the resolution of the images was optimized in such a way that the entire analysis can be carried out with a minimum of pixels.
  • a resolution of 256 by 256 pixels was chosen. This resolution allows the outlines of the organisms to be clearly recognized. A measurement and evaluation time of approximately three minutes per microtiter plate (with 96 wells) is also taken, ie. reached about 2 seconds per measuring station.
  • the data is saved on a floppy disk and can now be used directly with a PC grams can be evaluated.
  • the data are also displayed graphically and the characteristic toxicity values are determined directly. These data are now stored in a database in such a way that they are available at any time for comparison purposes.
  • microtiter plates which consist of transparent material.
  • the interfacial tension on the surface of the liquid can be adjusted by means of a multi-vessel arrangement composed of two materials with different physical properties, so that it is at least approximately planar.
  • the bottoms of the multi-vessel arrangement are preferably made of transparent material (CH application No. 03 141 / 93-6), for example polystyrene or a copolymer of a polystyrene, and the walls are made of a material which is not very translucent, for example polyolefins or polytetrafluoroethylene. that do not cause meniscus formation or protein adsorption.
  • the image sequences are recorded with a constant time interval ⁇ t, namely online, the values being binarized and buffered in a known manner: denoted by B-S.
  • the measurement window radius is then determined, depending on the liquid level: Ro denotes.
  • an object name is given and the object parameters are determined for all images within the measurement window, ie. the center of gravity coordinates, the relative area, the circumference and the number visually (electro- Niche) detectable holes in the object are measured in each vessel for identification: O-Pl.
  • O-CL object count
  • O-v average speed of the organisms, the instantaneous coordinate of the area center of gravity in the silhouette of the organism serving as the measurement reference.
  • Typical mean velocities of the Artemia salina of 5-10 " ⁇ m / s to 6-10-3 m / s were determined in a solution of artificial sea water described below.
  • the meaningfulness of the measurement can be optimized by an appropriate image evaluation by adapting the measurement method. For example, instead of observing the speed of locomotion, the specific mobility of individual organs of the organism can be observed; in addition, cyclical movements can be line highlighted from the speed measurement or more easily recorded and analyzed.
  • the number of dead Artemia salina is calculated on the basis of the measurement of the speed of the test organisms according to the method described above, a determined speed of zero meaning a dead animal.
  • the curve shown in FIG. 8 is an average of four independent test series over a concentration range of paraoxon in artificial sea water over three decades.
  • the mean value of the LC5 Q values measured in this way at a temperature of 22 * C is 5.9-10 " ⁇ mol / 1 with a maximum scatter of 33%.
  • FIG. 9 shows the speed v of the Artemia salina test organisms measured in a series of tests for 30 min. after addition of the paraoxon solutions with increasing concentrations. There are two drastic decreases in speed here. The second decrease, at about 1-10 -4 mol / 1 paraoxone, corresponds to the LC5 Q - ert, which can be seen from the superimposed lethal dose curve.
  • the significant first decrease in speed is about 1 ' 1Q "" mol / 1 Paraoxon and corresponds to the "Effect Concentration" EC50. This determines an indication of the function of the toxic substance. Characteristic video recordings can be seen in FIG. 10 (at the start of the experiment) and FIG. 11 (end of the experiment after 24 hours). In the second picture, the dead, ie. unmoved animals, electronically suppressed in a manner known per se and therefore invisible on the monitor 13, FIG. 2.
  • a radius Rx is additionally entered in FIG. 11, which indicates a possible evaporation of liquid with a resultant reduction in the measurement window radius; shown in dashed lines.
  • FIGS. 12-17 the action / time diagram FIG. 12 showing the entire process flow.
  • This diagram is designated I - V in the individual stages, the process steps on the abscissa being able to be read out in the order of their duration.
  • FIGS. 13 to 17 relate to all of the process stage IV, which is noted in each action / time diagram for reasons of clarity.
  • FIG. 13 shows the typical sequence when recording a series of measurements with up to six titer plates, measurements being carried out every "hourly" for 24 hours. This series of measurements corresponds to position IV in FIG. 12.
  • FIG. 16 shows the sequential image acquisition per vessel, a maximum duration of 20 ms being provided for this in practice.
  • FIG. 17 shows the sequence evaluation, namely with S1 the evaluable radius of the vessel, with S2 the center of gravity ordinates of all test organisms (in picture 1) and the center of gravity coordinates of all organisms in picture n which are determined by the image processing.
  • the other sequences are S5, the combination of all images to form a result image which only contains dead organisms and the sequence S6, the counting of the dead organisms by means of image processing.
  • the method can also be combined with conventional analysis methods, so that the measurement duration is shortened and the meaningfulness of the measurement can also be confirmed without the need for complex test series.

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Abstract

Ein Verfahren zur Bestimmung der Toxizität von wasserlöslichen bzw. mit Wasser mischbaren Substanzen bezweckt, quantitative Aussagen über die toxische Wirkung der Substanzen zu erzielen; es stellt einen Beitrag zur Verminderung der Zahl der bisher notwendigen Versuche mit Säugetieren dar. Verfahrensgemäss wird durch wenigstens zwei Messungen die Veränderung der Beweglichkeit und/oder der Grösse von Testorganismen in einem wässrigen Medium unter dem Einfluss von wenigstens einer toxischen Substanz festgestellt. Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens besteht aus einer Bilderfassungseinheit, welche die Objekterkennung und eine sequenzielle Aufnahme des Objekts in wenigstens einer Ebene in vorbestimmten Zeitintervallen vornimmt, wobei der Bilderfassungseinheit eine Auswerteanordnung mit einem Rechner und Darstellungsgeräten nachgeschaltet ist, welche eine statistische Auswertung der Beweglichkeit und/oder der Grösse der Organismen vornehmen, in Relation zur vorhandenen Toxizität. Anwendung findet das Verfahren insbesondere zur Bestimmung von toxischen Einflüssen auf die Ökologie, insbesondere die Wasserfauna, sowie zur Feststellung von Nebenwirkungen und Kontraindikationen von Pharmazeutika und Nahrungsmitteln.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Toxizität sowie deren Anwendung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Toxizität von wasserlöslichen bzw. mit Wasser mischbaren Substanzen.
Ebenso bezieht sich die Erfindung auf eine geeignete Vor¬ richtung zur Durchführung des Verfahrens sowie eine An¬ wendung des Verfahrens.
Es ist notorisch bekannt, dass Lebewesen unter dem Einfluss von toxischen Substanzen in ihrer Vitalität beeinträchtigt werden. Dies genügt zum Nachweis des Vorhandenseins derarti¬ ger Substanzen, erlaubt aber keine Rückschlüsse auf das Mass der Toxizität und/oder auf die Substanz.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu schaf¬ fen, das eine quantitative Aussage über die Toxizität von Substanzen erlaubt und zumindest beiträgt zur Verminderung von heute noch üblichen, langwierigen Versuchen mit Säuge¬ tieren im Rahmen notwendiger Sicherheitsprüfungen.
Zudem soll eine Vorrichtung geschaffen werden, welche eine Automatisierung des Verfahrens erlaubt und dessen Auswertung rationalisiert und diese aussagekräftig dokumentieren lässt .
Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass eine Veränderung der Beweglichkeit und/oder der Grosse von wenigstens zwei Individuen von einer Art Testorganismen in einem wässrigen Medium, unter dem Einfluss von wenigstens einer toxischen Substanz, in wenigstens zwei Zeitinterval¬ len, festgestellt wird, wobei wenigstens eine Referenzmes¬ sung und wenigstens eine weitere Messung, nach der Zugabe der toxischen Substanzen, erfolgen. Der im Patentanspruch verwendete Begriff "Beweglichkeit" wurde von der Festkörperphysik übernommen und beschreibt die "Bewegungsaktivität" und insbesondere die "Mobilität" der Testorganismen, die in wässrigen Medien am einfachsten als deren "Ortsverschiebung" pro Zeiteinheit beobachtet wird.
Diese Beweglichkeit kann aber auch auf die Beobachtung der Funktion einzelner Organe der Testorganismen angewandt wer¬ den.
Eine erhöhte Frequenz der Beweglichkeit einzelner Organe lässt auf eine spezifische Toxizität schliessen, wobei die resultierende "Ortsverschiebung" der Organismen nicht zwin¬ gend beeinflusst ist.
Bei das Zellwachstum hemmenden Substanzen liefert die Beob¬ achtung bzw. Messung der Grosse der Testorganismen in Funk- tion der Zeit ein Mass für diese spezifische Art der Toxizi¬ tät.
Derartige Toxizitätsbestimmungen lassen sich parallel zur Beweglichkeit, aber auch von dieser getrennt, mit den glei¬ chen apparativen Mitteln ausführen.
Nach der Erfindung lassen sich Kleinlebewesen zur Bestimmung der Toxizität von Substanzen verwenden, indem der Einfluss von einzelnen und/oder von Kombinationen von Substanzen auf die Veränderung an diesen Tieren gemessen wird. Durch solche Messungen lässt sich die notwendige Anzahl Versuche an lei- denden Labortieren massiv verringern.
Bevorzugt wird zur Erhöhung der Aussagekraft der Messungen eine Vielzahl von voneinander getrennten Gruppen gleicharti¬ ger Testorganismen beobachtet und pro Gruppe gemeinsam aus¬ gewertet.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens liegt in der Einfachheit und raschen Handhabung sowie in seiner Kostengünstigkeit . Der Begriff der Toxizität ist jedoch nicht auf Giftwirkung im üblichen Sinne beschränkt; er kann auf jede erkennbare Wirkung (Reaktion) auf einen lebenden Organismus ausgedehnt werden.
Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Bilderfassungseinheit vorgesehen ist, welche die Objekterkennung und eine sequenzielle Auf¬ nahme der Lage des Objekts, in wenigstens einer Ebene, in vorbestimmbaren Zeitintervallen vornimmt, dass der Bild- erfassungseinheit eine Auswerteanordnung mit einem Rechner und Darstellungsgeräten nachgeschaltet ist, welche eine statistische Auswertung der Beweglichkeit der Organismen vornehmen, in Relation zur vorhandenen Toxizität.
Im einfachsten Fall wird dabei die Bilderfassungseinheit me- chanisch verschiebar ausgestaltet und über die zu untersu¬ chenden Proben geführt.
Als Veränderung der Beweglichkeit wird - wie in Anspruch 2 dargestellt - eine durch den Testorganismus pro Zeitinter¬ vall zurückgelegte Wegstrecke gewertet.
Signifikante Werte der Beweglichkeit können durch die in An¬ spruch 3 spezifizierte Beschleunigung, berechnet aus den Ge¬ schwindigkeitswerten, gewonnen werden.
Die gemäss der Erfindung ermittelte Toxizität ist - wie in Anspruch 4 dargestellt - eine relative Toxizität, bezogen auf eine Standard-Toxizität.
Sowohl die Bestimmung der Bewegungsgeschwindigkeit als auch die Berechnung der resultierenden Beschleunigungswerte und/oder von Änderungen in der Grosse der Organismen können in einer Ebene als auch dreidimensional durchgeführt werden, je nach apparativem Aufwand. Daraus lassen sich in einfach¬ ster Weise charakteristische Messkurven aufzeichnen, die für die Einflussnahme von Stoffen auch auf höhere Lebewesen in¬ terpretierbar sind.
Die Erfindung wird zweckmässigerweise unter Verwendung von niederen Tieren als Testorganismen angewandt. Besonders ge- eignet sind hierfür Organismen die im Wasser leben, da ihre Beweglichkeit am einfachsten beobachtbar ist.
Die Testdurchführung unter Verwendung von Artemia salina Nauplien ist weder durch jahreszeitliche Abhängigkeit noch durch Fütterung und Aufzucht beeinflusst, wohl aber durch die Umgebungstemperatur und den Faktor Zeit, sodass nur automatisierte Verf hrensabläufe als professionelle Unter- suchungsmittel in Frage kommen.
Durch eine Erhöhung der Umgebungstemperatur gegenüber der Normaltemperatur wird erwartungsgemäss eine Zunahme der Be- weglichkeit der Testorganismen festgestellt.
Um wiederholbare Resultate zu erreichen ist es empfehlens¬ wert, die Messungen bei 22 *C +/- 1 'C durchzuführen und zu normieren. Dieser Wert lässt sich mit apparativen Mitteln relativ leicht konstant halten und verhindert zudem eine zu hohe Verdunstung bzw. Wasserdampfbildung bei Langzeitbe¬ obachtungen.
Artemia salina bildet unter schlechten Lebensbedingungen Zy¬ sten (Eier, die im frühen Gastrulastadium arretiert sind) und so über viele Jahre aufbewahrt werden können.
Dementsprechend ist es sehr zweckmässig - wie in Anspruch 5 dargestellt - die Untersuchungen unter Verwendung von Kiemenfüssern (Euphyllopoda) wie Artemia salina Nauplien (in Embryonal-Stadien 3 und 4 mit einer Grosse von ca. 0,9 - 1,15 mm) in Meerwasser durchzuführen.
Ebenfalls sind freischwimmende Rotatorien (Ploima) gemäss Anspruch 6 einsetzbar. Für spezielle Untersuchungen, beispielsweise bei der Über¬ prüfung karzinogener Stoffe, sind Wasserflöhe (Cladocera) , Anspruch 7, bevorzugt, da sie in einfacher Weise Beobachtun¬ gen über zwei Generationen ermöglichen.
Nachdem Artemia salina ein Meerwassertier ist, stellt künst¬ liches Meerwasser eine adäquate Umgebung für die Messung dar, Anspruch 8.
Um eventuelle unkontrollierte Reaktionen zwischen der toxi¬ schen Substanz mit Meer- und/oder Leitungswasser auszu- schliessen, kann es vorteilhaft sein Süsswasserarten der Kiemenfüsser in künstliches Süsswasser, bestehend aus de¬ stilliertem Wasser mit Natriumbicarbonat, einzusetzen. Eben¬ so empfiehlt sich der Einsatz von künstlich hergestelltem Meerwasser.
Andere Organismen, wie Kaulquappen etc. können erfindungs- ge äss ebenfalls verwendet werden.
Die Bestimmung der Beweglichkeit der Testorganismen kann - gemäss Anspruch 9 - rein optisch mit Hilfe eines Mikroskops erfolgen, wobei unter dem Einfluss der toxischen Substanz eine Verlangsamung der Beweglichkeit und/oder eine Inakti- vierung des Testorganismus zu beobachten ist.
Obwohl diese Messungen mit einem Mikroskop bei einer gerin¬ gen Anzahl Proben durchaus möglich sind, empfiehlt es sich bereits hier, aus Gründen einer angestrebten Sicherheit und Standardisierung automatisierte Untersuchungsmittel ein¬ zusetzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Messung - wie im Anspruch 10 dargestellt - unter Verwen¬ dung einer Mikrotiterplatte, wie sie beispielsweise im (bis- her nicht publizierten) schweizerischen Patentgesuch Nr. 03 141/93-6 im einzelnen beschrieben ist. Zur bevorzugten elektrooptischen Instrumentalanalyse, An¬ spruch 11, werden in die oben beschriebenen Gefässe die zu ermittelnden wasserlöslichen Substanzen in Wasser bzw. einem künstlichen Meerwasser gelöst und der Testorganismus zuge- setzt und deren Reaktionen elektronisch ausgewertet.
Es wird dabei die Veränderung der Beweglichkeit der Test¬ organismen pro Gefäss gemittelt und mit bereits früher er- fassten Werten verglichen. Entsprechende Korrelationen er¬ lauben quantitative Aussagen über die vorhandene Toxizität, Anspruch 12.
Die obigen Untersuchungen sollen zweckmässigerweise immer unter den selben Bedingungen - wie in Anspruch 13 darge¬ stellt - durchgeführt werden, da das Resultat durch die Tem¬ peratur beeinflusst wird.
Der Verfahrensablauf lässt sich durch das in Anspruch 14 be¬ schriebene systematische Zupipettieren massgeblich optimie¬ ren; potentielle Fehlerquellen lassen sich dadurch weitge¬ hend eliminiern.
Die zur Durchführung des Verfahrens vorgesehene Vorrichtung erlaubt eine einfache Auswertung der beobachteten Bilder durch übliche EDV-Mittel; durch die in Anspruch 16 erwähnte Quotientenbildung aller zurückgelegten Wegstrecken pro Zei¬ tintervall und pro Bild lässt sich eine relative mittlere Geschwindigkeit der Testorganismen bestimmen bzw. durch die zweite Ableitung auch deren Beschleunigungswerte.
Von besonderer Bedeutung ist eine Unterscheidung zwischen bewegten und nicht bewegten Objekten, da sich viele Test¬ organismen einerseits während der Beobachtungsdauer häuten und diese abgestossenen Häute zu Fehlerfassungen führen kön- nen; andererseits müssen die bereits gestorbenen Tiere festgestellt und aus der Rechnung eliminiert werden, An¬ spruch 17. Besonders geeignet zur Durchführung des Verfahrens ist eine sogenannte CCD-Shutter-Kamera nach Anspruch 18, da zurzeit nur derartige Kameras in der Lage sind, genügend scharfe und auswertbare Bilder zu liefern.
Durch die in Anspruch 19 vorgeschlagene Anordnung von zwei Kameras lassen sich die Bewegungen der Testorganismen in drei Dimensionen beobachten und vermessen.
Bei einem genügend grossen apparativen Aufwand, dh. bei Ver¬ wendung entsprechender Kameras und genügend grosser Bildda- tenspeicher und ausreichend schneller Rechner könnten grund¬ sätzlich alle in einer Versuchsanordnung befindlichen Test¬ organismen gleichzeitig aufgenommen und einzeln ausgewertet werden, vgl. Anspruch 20.
Eine rationelle automatisierte Beobachtung und Auswertung von TestOrganismen kann mit den Angaben nach Anspruch 21 oder 22 realisiert werden, vorausgesetzt, dass der verwen¬ dete Transportmechanismus erschütterungsfrei arbeitet.
Die in den Ansprüchen 23 - 25 aufgezeigten Anwendungen be¬ ziehen sich auf aktuelle Bedürfnisse des Umweltschutzes bzw. der Lebensmitteltechnologie und Pharmaindustrie. Selbst¬ verständlich sind weitere Applikationen denkbar, die auch andere Gebiete der Biologie betreffen.
Die Toxizitätsermittlung, wie sie eingehend mit Artemia sa¬ lina Nauplien erprobt wurde, ermöglicht die Abklärung der relativen Toxizität von Substanzen in einem wässrigen Me¬ dium, dh. von wasserlöslichen Substanzen aber auch von Sub¬ stanzen, die mit Hilfe von Lösungsvermittlern wie zB. Aceton wasserlöslich gemacht wurden. Sie ermöglicht aber auch - wie in den Ansprüchen 23 bis 25 dargestellt ist - einen Auf- schluss über die toxische Wirkung von Substanzen auf die Wasserfauna, insbesondere von Insektiziden und Pestiziden. Im weiteren lassen sich durch periodische Messungen in glei¬ chen Zeitintervallen und mit steigender Konzentration der toxischen Dosen durchgeführte Messungen charakteristische Letaldosis-Kurven aufzeichnen, welche Rückschlüsse auf die Art des toxischen Stoffes zulassen und zur Ergründung des Wirkmechanismus des Stoffes oder der Stoffkombination beitragen.
Nachfolgend werden anhand von Zeichnungen Ausführungsbei- spiele der Erfindung näher dikutiert.
Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer elektroopti- schen Bilderfassungseinheit mit einem charakteri¬ stischen Testorganismus zur Bestimmung von dessen Beweglichkeit,
Fig. 2 eine Gesamtansicht eines Gerätes mit Bilderfas¬ sungseinheit und Auswerteanordnung,
Fig. 3 eine Teilschnittdarstellung durch den Geräte¬ schrank Fig. 2, orthogonal zur Frontplatte,
Fig. 4 eine Teilschnittdarstellung durch das Gerät Fig. 2 parallel zur Frontplatte,
Fig. 5 eine Titerplattenanordnung zur Aufnahme von sechs Probenplatten,
Fig. 6 ein Flussdiagramm, welches den Programmablauf zur automatisierten Bestimmung der Beweglichkeit von Testorganismen aufzeigt,
Fig. 7 eine charakteristische mittlere, zeitliche Ge¬ schwindigkeitsabnahme von lebenden Testorganismen in drei ausgewählten toxischen Lösungen, beobach¬ tet über einen Zeitraum von 10 Stunden, Fig. 8 einen Toxizitätstest mit Artemia salina in einer
Paraoxon Lösung, wobei in der Abszisse die Konzen¬ tration und in der Ordinate der Anteil toter Orga¬ nismen aufgetragen sind,
Fig. 9 einen weiteren Toxizitätstest, wobei hier die Ge¬ schwindigkeit der Testorganismen in Funktion der Konzentration von Paraoxon, zusammen mit einer überlagerten Letalitätsdosiskurve dargestellt ist,
Fig. 10 eine Videoaufnahme einer Gruppe von lebenden Test- Organismen in einem w ssrigen Medium zu Beginn der
Beobachtung,
Fig. 11 eine weitere Videoaufnahme der Gruppe von noch le¬ benden Testorganismen Fig. 10 nach 24 Stunden, wo¬ bei ein Teil des Mediums verdunstet ist,
Fig. 12 ein Aktions/Zeitdiagramm welches die Vorbereitung, Durchführung und Auswertung der Messung der Beweg¬ lichkeit von Testorganismen aufzeigt,
Fig. 13 die Messung von bis zu 6 Titerplatten nach dem Diagramm Fig. 12,
Fig. 14 die Messung von bis zu 10 Platten, wobei für eine Platte eine Zeitdauer von bis zu 10 Minuten zuge¬ lassen ist,
Fig. 15 sequentiell ablaufende Einzelmessungen, darge¬ stellt im Zeitintervall der Messung einer Platte,
Fig. 16 die zum Messen eines einzelnen Behälters vorgese¬ henen Intervalle, wobei die Zeiträume zwischen den Einzelmessungen durch den Transportmechanismus der Kamera bestimmt sind und Fig. 17 eine Sequenzauswertung aller Abläufe die notwendig sind, um ein einzelnes Gefäss in einer Titerplatte auswertbar zu registrieren.
In Figur 1 ist mit 1 eine Videokamera (CCD-Shutter-Kamera; Firma Sony Typ XC-77RR-CE) bezeichnet. Die auf die elektro¬ nische Kamera 1 aufgesetzte Optik 2 ist ein Makro-Objektiv (Sony Typ CM50) . Die Videokamera 1 ist auf zwei Supports 3,3' in an sich bekannter Weise vertikal an einem C-Arm 4a - 4c angeordnet. Der C-Arm ruht auf einer handelsüblichen Positionierungs-Einheit 5, ein XY-Kreuztisch mit zwei Vor¬ schubeinheiten (Firma ISEL Automation D-6419 Eiterfeld) mit entsprechenden Schrittmotoren, welche eine Verschiebungs¬ länge von 400 mm in X-Richtung bzw. 300 mm in Y-Richtung be¬ wirken.
Zwischen der Optik 2 und dem Lichtverteiler 6 befinden sich Proben P, charakterisiert durch eine Artemia salina 100, welche im Durchlichtverfahren beobachtet wird.
Vertikal oberhalb der Optik 2 der Kamera 1 ist im C-Arm ein Lichtverteiler 6, angeordnet, welche über einen Lichtleiter 7 von einer hier nicht dargestellten Lichtquelle gespeist ist. Die Videosignale VS werden über eine Signalleitung 9 nach oben geführt, vgl. Fig. 3, Fig. 4.
Die gesamte Vorrichtung zur Beobachtung und Auswertung von Testorganismen ist in einer Bilderfassungs- und Auswerteein- heit 10, 10', in Fig. 2, mit 10 bezeichnet, zusammengefasst. In einem Geräteschrank 11 kann über zwei Türen 12a, 12b ein Probenraum mit Experimenten beschickt werden. Auf dem Gerä¬ teschrank 11 befindet sich eine handelsübliche Zentralein¬ heit 15 eines Personal Computers (PC) mit einem ebenfalls üblichen Monitor 14. Neben dem PC ist,, auf einem drehbaren Ständer angeordnet, ein weiterer Monitor 13, welcher die Aufnahmen der im Geräteschrank 11 befindlichen Video-Kamera darstellt. Auf dem Geräteschrank 11 ist eine Ablagefläche 16 für hier nicht gezeichnete, aber für die Bedienung des Gera- tes erforderliche Bedienungs- und Eingabegeräte (Tastatur, Maus etc.) vorgesehen.
Die Schnittdarstellung Fig. 3 zeigt das Innere des Geräte¬ schrankes, wobei die Orientierung des Schnittes durch die Lage der Türen 12a, 12b, vgl. Fig. 2, gegeben ist. Hier sind wiederum der C-Arm 4a, 4b, 4c mit seinen Bestandteilen, Fig. 1 ersichtlich; ebenso die Positionierungseinheit 5 sowie der Lichtleiter 7, welcher mit einer üblichen Lichtquelle 8 ver¬ bunden ist.
In einem durch die Türen 12a, 12b zugänglichen Probenraum 20 befindet sich eine Titerplattenanordnung 21, welche Proben mit Testorganismen aufnimmt. Versorgt ist das Ganze durch eine handelsübliche, unterbrechungsfreie Stromversorgung 22, Fig. 3 und 4. Sämtliche für die Steuerung der Positionie- rungseinheit 5 notwendigen Signale werden in einer Steuerung 23 generiert. Die Videosignale VS werden zu einer üblichen Kamera-Kontrolleinrichtung im Steuer-Computer 15 geführt.
Nicht dargestellt sind die notorisch bekannten Peripheriege¬ räte wie Drucker, Plotter etc., welche an den PC anschliess- bar sind.
In Figur 5 ist die im Probenraum 20 angeordnete Titerplat¬ tenanordnung 21 mit ihren wesentlichsten Bestandteilen ge¬ zeichnet.
Die Anordnung 21 besteht aus einem im Geräteschrank 11 fest- geschraubten Rahmen mit Öffnungen 24, in welchen sechs Mik- rotiterplatten 24.1 - 24.6 mit je 96 Gefässen einsetzbar sind und welche pro Gef ss je eine Probe mit TestOrganismen (zirka 12 Artemia salina) enthalten. Ein nicht dargestellter Schutzdeckel verhindert die Störung der Proben durch Staub- einwirkung und/oder Wärmestrahlungen etc.; ebenso sind die einzelnen Titerplatten zur Reduktion der Verdunstungswirkung mit einem transparenten Kunststoff abgedeckt. Mit der vorgängig beschriebenen Vorrichtung lässt sich die Beweglichkeit von TestOrganismen messen. Am einfachsten ge¬ schieht dies durch die Feststellung der Fortbewegungsge¬ schwindigkeit der Organismen in einer Testlösung, wobei die relative Geschwindigkeit auf eine Kontroll-Lösung (ohne to¬ xische Substanz) bezogen ist.
Der Benutzer wird beim Entwerfen des Experiments zweckmässi- gerweise über ein PC-Programm angeleitet. Dieses erfragt über die Anzahl Konzentrationen (in Mol oder Prozent) und Parallelbestimmungen, Leerwerte, Kontrollen und deren Anord¬ nung, sowie über die Plazierung des Experiments in den je¬ weiligen Gefässen der Mehrgefässanordnung. Im weiteren ver¬ langt das Programm Angaben über den Namen der Testsubstanz, deren Molekulargewicht, höchste zu testende Konzentration und Wahl der linearen oder logarithmischen Verdünnungsreihe. Nach Eingabe des Totalvolumens für den Test, des Volumens in dem die Testorganismen (beispielsweise Artemia salina) sowie die TestSubstanz zugesetzt werden, berechnet das Programm die für das Experiment benötigte Menge der Testsubstanz . Nach der Erfassung der abgewogenen Menge können nun direkt unter Führung des Programms, die benötigten Verdünnungen hergestellt werden. Durch eine optische Hilfe auf dem Bild¬ schirm, wird das Zupipettieren erleichtert.
Eine bevorzugte Meerwasserlösung enthält 2800 mg NaCl, 342 mg MgS0 -7H20, 234 mg MgCl -6H20, 122 mg CaCl2-2H20, 20 mg NaHCθ3, 74 mg KC1 auf 100 ml destilliertes Wasser.
Durch eine elektrooptische Bestimmung wird in einem ersten Schritt die Anzahl der Testorganismen bestimmt, welche sich in der mit der zu untersuchenden Substanz versetzten, künst- liehen Meerwasserlösung befinden.
Die Beobachtung des Einflusses der Substanz auf den Organis¬ mus erfolgt über das dargestellte Bildanalysensystem zu vor¬ gewählten Zeitpunkten. Sie gestattet folgende Kriterien zu erfassen: Anzahl der Organismen
Bestimmung, wie viele davon nicht mehr aktiv sind
Ermittlung der durchschnittlichen Beweglichkeit bzw. relativen Bewegungsgeschwindigkeit
- Durchschnittliche Grosse (relative Fläche) der Or¬ ganismen; Berechnung ihres individuellen, lageab¬ hängigen Flächenschwerpunktes .
Die elektrooptische Bestimmung wird grundsätzlich wie folgt durchgeführt:
Die Proben werden in der Mikrotiterplatte, die den Test ent¬ hält, im beschriebenen Analysenautomaten plaziert. Zu den vorgewählten Messzeiten fährt eine elektronische Kamera un¬ ter die einzelnen Messplätze der Mikrotiterplatte und nimmt 12 bis 36 Bilder auf. Gleichzeitig wird die jeweilige Probe von oben beleuchtet. Damit diese Bilder scharf ausfallen, muss mit einer Kamera mit Verschlusszeitsteuerung gearbeitet werden. Das Objektiv dieser Kamera ist so ausgelegt, dass einerseits das Bild formatfüllend aufgenommen wird, ander¬ seits die ganze Tiefe der Flüssigkeit (ca. 1 cm) scharf ab- gebildet werden kann. Die Beleuchtung erfolgt über einen Lichtleiter, der an den C-Arm zusammen mit der Kamera befe¬ stigt parallel fährt. Die Auflösung der Bilder wurde so op¬ timiert, dass mit einem Minimum an Bildpunkten die ganze Analyse durchgeführt werden kann. Dies erlaubt, die Rechen- zeit für die Bildanalyse möglichst tief zu halten. Es wurde eine Auflösung von 256 mal 256 Bildpunkte gewählt. Diese Auflösung gestattet, die Umrisse der Organismen noch eindeu¬ tig zu erkennen. Dabei wird auch eine Meεs- und Auswertezeit von ungefähr drei Minuten pro Mikrotiterplatte (mit 96 Ge- fassen), dh. ungefähr 2 Sekunden pro Messplatz erreicht.
Die Daten werden nach Abschluss der Messung auf einer Dis¬ kette gespeichert und können nun direkt mit einem PC-Pro- gramm ausgewertet werden. Dabei werden die Daten zusätzlich grafisch dargestellt, und die charakteristischen Toxizitäts- werte direkt ermittelt. Diese Daten werden nun in einer Da¬ tenbank so abgespeichert, dass sie jederzeit zu Vergleichs- zwecken zur Verfügung stehen.
Zur Durchführung der obigen Instrumental-Analyse von flüssi¬ gen Proben, werden Mikrotiterplatten verwendet, die aus transparentem Material bestehen. Durch eine, aus zwei Mate¬ rialien unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften zu- sammengefasste Mehrgefässanordnung, lässt sich die Grenzflä¬ chenspannung an der Flüssigkeitsoberfläche einstellen, so dass diese wenigstens annähernd planar ist. Bevorzugterweise werden dabei die Böden der Mehrgef ssanordnung aus transpa¬ rentem Material (CH-Gesuch Nr. 03 141/93-6), beispielsweise Polystyrol oder einem Copolymeren eines Polystyrols gefer¬ tigt und die Wände aus wenig lichtdurchlässigem Material, beispielsweise Polyolefinen oder Polytetrafluorethylen, die keine Meniskusbildung oder Proteinadsorption hervorrufen.
Der oben skizzierte, realisierte Programmablauf in der Vor- richtung gemäss Fig. 1 bis 5 ist aus der Darstellung Fig. 6 zu entnehmen, wobei der Start mit St und das Programmende mit RES = Resultat bezeichnet sind.
Nach dem Start erfolgt eine Aufnahme der Bildsequenzen mit konstantem Zeitintervall Δt, und zwar online, wobei die Werte in bekannter Weise binärisiert und zwischengespeichert werden: Mit B-S bezeichnet.
Anschliessend erfolgt eine Bestimmung des Messfensterradius, abhängig vom Flüssigkeitsstand: Ro bezeichnet.
In einem nächsten Schritt erfolgt eine Objektbezeichnung und eine Bestimmung der Objektparameter bei allen Bildern inner¬ halb des Messfensters, dh. die Schwerpunktkoordinaten, die relative Fläche, der Umfang und die Anzahl visuell (elektro- nisch) feststellbaren Löcher im Objekt werden zur Identi¬ fikation, in jedem Gefäss vermessen: O-Pl.
Danach werden unzulässige Objekte bei allen Bildern elimi¬ niert, wobei das Kriterium durch zulässige Vorgaben von Flä- ehe und Umfang programmiert ist: O-El.
Jetzt wird die Anzahl Testorganismen pro Sequenz zu allen Bilddaten ermittelt, mit O-CL = Objekt-AusZählung bezeich¬ net; dies entspricht der Gesamtzahl lebender Organismen pro Bild.
Durch eine Messung der Geschwindigkeit der Organismen aus allen vorgängig ermittelten Bilddaten wird ein Mittelwert gebildet. Dieser Wert ist in Fig. 6 mit O-v = mittlere Ge¬ schwindigkeit der Organismen bezeichnet, wobei als Messrefe¬ renz jeweils die momentane Koordinate des Flächenschwerpunk- tes in der Silhoutte des Organismus dient.
Anschliessend wird ein Resultatbild auf der Basis von Bild¬ punkten mit deren Koordinaten xi,yi erzeugt und derart nor¬ miert, dass die Zahl 1 ein nicht bewegtes, totes Objekt be¬ deutet. Alle übrigen Bildpunkte xi, yi werden dabei Null (= 0) gesetzt. Bezeichnet ist diese Verfahrensstufe mit R(xi,yi) .
Unter 0-P2 erfolgt wiederum eine Objektbezeichnung und eine Bestimmung der Objektparameter bei allen Bildern innerhalb des Messfensters, dh. die Schwerpunktkoordinaten, die rela- tive Fläche, der Umfang und die Anzahl Objekte im Gefäss werden vermessen.
Danach werden wiederum die unzulässigen Objekte bei allen Bildern eliminiert, wobei das Kriterium durch zulässige Vor¬ gabe von Fläche und Umfang programmiert ist: 0-E2.
Danach werden die verbleibenden, toten Objekte im Resultat¬ bild gezählt: O-CD. Unter RES erfolgt die Auswertung der Ergebnisse mit statis¬ tischen Methoden in an sich bekannter Weise (Probit etc.)
Wie Fig. 7 zeigt, wurden in drei bekannten, ausgewählten to¬ xischen Lösungen, enthaltend Phenobarbital mit Ph bezeich- net, Amphetaminsulfat mit Am und D-Propoxyphen mit Pr be¬ zeichnet. Die Ortsverschiebungen pro Zeiteinheit von Artemia salina wurde als mittlere Geschwindigkeit v ermittelt und aufgezeichnet.
In einer Kontroll-Lösung, dh. in einer nachfolgend beschrie- benen Lösung aus künstlichem Meerwasser, wurden typische mittlere Geschwindigkeiten der Artemia salina von 5-10"^ m/s bis 6-10-3 m/s festgestellt.
Wie aus der Darstellung Fig. 7 zu entnehmen ist, erfolgt im Falle von D-Propoxyphen eine relativ lineare Geschwindig- keitsabnahme über einen Zeitraum von 10 Stunden auf zirka 84 % der ursprünglichen Geschwindigkeit. Bei Amphetaminsulfat resultiert eine Abnahme der Geschwindigkeit auf zirka 65 % der ursprünglichen Geschwindigkeit und bei Phenobarbital auf zirka 80 %.
Es hat sich gezeigt, dass je nach Toxizitätsäquivalentfaktor (Art oder Gruppe oder Klasse des toxischen Stoffes) charak¬ teristische Geschwindigkeitsabnahmen feststellbar sind. Dies kann auf signifikante und damit der Erkennung dienende Wir¬ kungen einzelner Stoffe und Kombinationen von Stoffen ausge- dehnt werden.
Je nach Art der Wirkung des Stoffes auf den Organismus kann durch eine entsprechende Bildauswertung die Aussagekraft der Messung durch eine Anpassung des Messverfahrens optimiert werden. Beispielsweise kann anstelle der Beobachtung der Fortbewegungsgeschwindigkeit die spezifische Beweglichkeit einzelner Organe des Organismus beobachtet werden; ausserdem können zyklische Bewegungen durch die Bildung der ersten Ab- leitung aus der Geschwindigkeitsmessung hervorgehoben bzw. einfacher erfasst und analysiert werden.
Praktisches Beispiel zur Bestimmung der Toxizität von Parao¬ xon:
In Fig. 8 ist der Anteil Z an toten Organismen, bezogen auf 100 % zu Beginn der Messung; bei zunehmender Konzentration C von Paraoxon wird ein Ansteigen von Z festgestellt. Diese Art der Auswertung ermöglicht die notorisch bekannte Bestim¬ mung des LCςQ-Wertes der toxischen Substanz.
Die Anzahl der toten Artemia salina wird aufgrund der Mes¬ sung der Geschwindigkeit der Testorganismen nach dem oben beschriebenen Verfahren berechnet, wobei eine festgestellte Geschwindigkeit Null ein totes Tier bedeutet.
Die in Fig. 8 dargestellte Kurve ist ein Mittelwert von vier unabhängigen Versuchsreihen über einen Konzentrationsbereich von Paraoxon in künstlichem Meereswasser über drei Dekaden. Der Mittelwert der so gemessenen LC5Q-Werte bei einer Tempe¬ ratur von 22 *C beträgt 5,9-10"^ Mol/1 bei einer maximalen Streuung von 33 %.
Fig. 9 zeigt die Geschwindigkeit v der Artemia salina Test- organismen in einer Versuchsreihe gemessen 30 min. nach Zu¬ gabe der Paraoxon-Lösungen mit steigenden Konzentrationen. Es sind hier zwei drastische Abnahmen der Geschwindigkeit ersichtlich. Die zweite Abnahme, bei zirka 1-10-4 mol/1 Pa- raoxon entspricht dem LC5Q- ert, welcher aus der überla¬ gerten Letalitätsdosiskurve entnehmbar ist.
Die signifikante erste Geschwindigkeitsabnahme liegt bei etwa 1'1Q"" mol/1 Paraoxon und entspricht der "Effect Con- centration" EC50. Diese ermittelt eine Indikation der Funk- tion der toxischen Substanz. Charakteristische Videoaufnahmen sind aus Fig. 10 (zu Beginn des Experimentes) und Fig. 11 (Ende des Experimentes nach 24 Stunden) ersichtlich. In der zweiten Aufnahme sind die to¬ ten, dh. unbewegten Tiere, in an sich bekannter Weise elek- tronisch unterdrückt und daher auf dem Monitor 13, Fig. 2, unsichtbar.
In Fig. 11 ist zusätzlich ein Radius Rx eingetragen welcher ein eventuelles Verdunsten von Flüssigkeit mit daraus resul¬ tierender Reduktion des Messfenster-Radius andeutet; gestri- chelt eingezeichnet.
Weitere Einzelheiten im technischen Verfahrensablauf sind den Fig. 12 - 17 zu entnehmen, wobei das Aktions/Zeit¬ diagramm Fig. 12 den gesamten Verfahrensablauf zeigt. Be¬ zeichnet ist dieses Diagramm in den einzelnen Stufen mit I - V, wobei die Verfahrensschritte auf der Abszisse in der Grössenordnung ihrer Zeitdauer herauslesbar sind.
Dabei bedeuten:
I die Vorbereitung der Messreihe mit einer "Setup- Hilfe" am PC zum Beschicken der Titerplatten,
II eine Kalibrierung der Startwerte des Überwachungs¬ programms,
III das Zuführen der toxischen Substanz,
IV die Aufnahme der Messreihe mit dem Überwachungs¬ programm,
v die Auswertung der Messreihe mit statistischen Analysemethoden und Korrelationen zu bisherigen Messungen (Datenbank) . Die nachfolgenden Fig. 13 bis Fig. 17 betreffen all die Ver¬ fahrensstufe IV, was in aus Übersichtlichkeitsgründen in je¬ dem Aktions/Zeitdiagramm vermerkt ist.
Figur 13 zeigt den typischen Ablauf bei der Aufnahme einer Messreihe mit bis zu sechs Titerplatten, wobei im "Stun¬ dentakt" während 24 Stunden gemessen wird. Diese Messreihe entspricht in Fig. 12 der Position IV.
In Fig. 14 ist die Position IV (Aufnahme der Messreihe) im einzelnen dargestellt. Die einzelnen Titerplatten sind hier mit Pl 01 - Pl 06 bezeichnet; die maximale Messdauer ist in praxi auf 10 Minuten begrenzt.
Aus Fig. 15 lassen sich die einzelnen Verfahrensschritte während der Messdauer herleiten. Dabei bedeuten:
al die Erstellung einer Binärisierungsschwelle zur Bildverarbeitung,
a2 die Einstellung bzw. Überprüfung der Fokussierung der Kamera mittels der Bildverarbeitung,
a3 die Prüfung der Orientierung der Titerplatten (zur Festlegung und Berücksichtigung der abnehmenden Konzentrationswerte der Proben) ,
a4 das Vermessen eines ersten Gefässes,
a5 - a7 das Vermessen eines beliebigen bzw. des n-ten Ge¬ fässes .
Die Darstellung Fig. 16 zeigt die sequentielle Bildaufnahme pro Gefäss, wobei hierfür in praxi eine maximale Zeitdauer von 20 ms vorgesehen ist.
Fig. 17 zeigt die Sequenzauswertung und zwar sind mit Sl der auswertbare Radius des Gefässes, mit S2 die Schwerpunkts-Ko- ordinaten sämtlicher TestOrganismen (im Bild 1) und die Schwerpunkts-Koordinaten sämtlicher Organismen in Bild n be¬ zeichnet, welche durch die Bildverarbeitung bestimmt werden.
In der Folge werden, mit S4 bezeichnet, die Anzahl der Orga- nismen und deren Mittlere Geschwindigkeit aus allen Bildda¬ ten rechnerisch ermittelt.
Die weiteren Sequenzen sind S5, das Kombinieren sämtlicher Bilder zu einem Resultatbild, welches nur tote Organismen enthält und die Sequenz S6, das Auszählen der toten Organis- men mittels der Bildverarbeitung.
Die weitgehend anhand von toxischen Stoffen geführten Un¬ tersuchungen lassen sich generell auf die Bestimmung von Schwellenwerten, Schwellenreizen, Schwellendosen und Kon¬ zentrationen ausdehnen.
Die Verwendung von Kleinlebewesen ermöglicht überdies eine gewaltige Einsparung an Versuchstieren, da deren Zahl durch vorherige Bestimmung der zu testenden Konzentrationen einge¬ schränkt werden kann.
Denkbar ist eine Anwendung des Erfindungsgegenstandes auf weitere, bisher noch nicht erprobte Organismen wie Nematoda (Fadenwürmer) und andere, wie auch im Mikrobereich liegende Organismen.
Ebenfalls kann das Verfahren mit konventionellen Analyseme¬ thoden kombiniert werden, so dass die Messdauer verkürzt und die Aussagekraft der Messung zusätzlich erhärtbar ist, ohne dass aufwendige Versuchreihen erforderlich sind.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Bestimmung der Toxizität von wasserlösli¬ chen bzw. mit Wasser mischbaren Substanzen, dadurch ge- kennzeichnet, dass eine Veränderung der Beweglichkeit und/oder der Grosse von wenigstens zwei Individuen von einer Art Testorganismen in einem wassrigen Medium, un¬ ter dem Einfluss von wenigstens einer toxischen Sub¬ stanz, in wenigstens zwei Zeitintervallen, festgestellt wird, wobei wenigstens eine Referenzmessung und wenig¬ stens eine weitere Messung nach der Zugabe der toxi¬ schen Substanzen erfolgen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Veränderung der Beweglichkeit die durch den Testor- ganismus pro Zeitintervall zurückgelegte Wegstrecke ge¬ wertet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Veränderung der Beweglichkeit die pro Zeitintervall festgestellte Änderung der Geschwindigkeit des Testor- ganismus gewertet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass d'ie ermittelte Toxizität als relative Toxizität gewer¬ tet wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekenn- zeichnet, dass als Testorganismus Kiemenfüsser wie
Artemia salina, Streptocephalus proboscideus eingesetzt werden.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass als Testorganismus frei schwimmende Ro- tatorien wie Brachionus calyciflorus oder Brachionus plicatilis eingesetzt werden.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass als Testorganismus Wasserflöhe wie Daph- nia magna oder Daphnia pulex eingesetzt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als wässriges Medium künstliches Meer- oder Süsswasser eingesetzt wird.
9. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Beweglichkeit und/oder Grosse des Testorganismus mit Hilfe eines Mi- kroskopes beobachtet wird.
10. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Beweglichkeit und/oder Grosse des Testorganismus in einer Mikrotiter¬ platte beobachtet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 10, dadurch gekennzeich¬ net, dass die Veränderung der Beweglichkeit und/oder Grosse des Testorganismus auf elektrooptischem Weg be¬ obachtet und ausgewertet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dass als Mass für die rela- tive Beweglichkeit und/oder Grosse des Testorganismus ein Mittelwert aus allen im gleichen Zeitintervall und unter gleichen Bedingungen beobachteten Organismen be¬ rechnet wird.
13. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung im wassrigen Medium nach einer Einstellung der Temperatur auf einen vorge¬ gebenen, konstanten Wert durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe der toxischen Subs- tanzen durch eine, über einen Bildschirm kontrollierte Zupipettierung vorgenommen wird.
15. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bilderfassungseinheit (10) vorgesehen ist, welche die O jekterkennung und eine sequenzielle Aufnahme der Lage des Objekts (100), in wenigstens einer Ebene, in vorbe¬ stimmbaren Zeitintervallen vornimmt, dass der Bild¬ erfassungseinheit (10) eine Auswerteanordnung (10') mit einem Rechner und Darstellungsgeräten nachgeschaltet ist, welche eine statistische Auswertung der Beweg- lichkeit und/oder Grosse der Organismen vornehmen, in Relation zur vorhandenen Toxizität.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bilderfassungseinheit (10) von wenigstens ei¬ ner, unter den gleichen Bedingungen befindlichen, Gruppe von Testorganismen (100) ein Grauwertbild auf¬ nimmt und dass die nachgeschaltete Auswerteanordnung (10') daraus binäre Schwarz/Weiss-Werte bestimmt und eine sequenzielle Einzelbildauswertung mit einer Angabe der momentanen Koordinaten-Lage der Testorganismen vor- nimmt, welche im Rechner durch einen Vergleich mit ei¬ nem zuvor aufgenommenen Bild und wenigstens einer Quotientenbildung mit dem Zeitintervall zwischen den beiden Bildern, ein Relativmass der Beweglichkeit und/oder Grosse der Organismen berechnet.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteanordnung (10") erfaεste Objekte mit der relativen Beweglichkeit Null einerseits im Bild markiert und andererseits diese im Rechner eliminiert.
18. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bilderfassungseinheit (10) eine einzige CCD- Shutter-Kamera aufweist, welche taktweise über die je¬ weilige Gruppe von Testobjekten (100) unter den glei¬ chen Bedingungen geführt ist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bilderfassungseinheit (10) zwei CCD-Shutter- Kameras aufweist, deren optische Achsen zueinander wenigstens in einem spitzen Winkel angeordnet sind und die Bewegung und/oder Grosse der Testorganismen in drei Dimensionen erfassen.
20. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bilderfassungseinheit (10) stationär ist und dass diese mehrere, unter unterschiedlichen Bedingungen befindliche Gruppen von Testorganismen (100) gleichzei¬ tig erfasst und der Auswertung zuführt .
21. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bilderfassungseinheit (10) stationär ist und dass mehrere, unter unterschiedlichen Bedingungen be- findliche Gruppen von Testorganismen (100) mit konti¬ nuierlicher Geschwindigkeit an dieser vorbeigeführt sind und dass die Bilderfassungseinheit (10) diese Gru¬ ppen sequenziell erfasst und der Auswertung zuführt.
22. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass unter unterschiedlichen Bedingungen befindliche
Gruppen von Testorganismen (100) kreisförmig unter der Bilderfassungseinheit geführt sind.
23. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Bestimmung von toxischen Wirkungen auf die Was- serfauna.
24. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Bestimmung des Einflusses von toxischen Substan¬ zen wie Insektizide und Pestizide auf die Ökologie.
25. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Bestimmung von Nebenwirkungen und Kontrainidika- tionen von Pharmazeutika und Nahrungsmitteln.
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