CN109283210B - 一种应用植物胶琼脂固化而快速简便检测毒性物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是有关于一种快速检测毒性的方法，包括准备一植物胶琼脂及一样品；混合琼脂与样品以形成混合物；以及测定混合物的凝固时间，进而确认样品的细胞毒性。

Description

一种应用植物胶琼脂固化而快速简便检测毒性物质的方法
技术领域
本发明是有关于一种快速检测毒性的方法，尤其是指一种通过植物胶琼脂凝固时间测定样品是否具有毒性的方法，其可降低使用动物或细胞实验，不仅达到保护动物的目的，亦可降低药物、食品或化妆品的毒性测试的成本。
背景技术
依现有国内、国外法规规定，举凡健康食品、新原料、含药的化妆品、医疗器材及医药品，基于人体的安全性，须依据产品原料的不同进行不同的毒理学评估，包含如急性毒性实验、眼睛刺激实验、皮肤刺激实验等，前述实验不仅需支出大量费用进行动物实验，同时也要牺牲许多动物的宝贵生命。
再者，欧盟已从2009年3月起禁止利用动物进行化妆品的测试，并且欧盟化妆品销售的法规从2013年起更规定禁止贩卖以利用动物作为毒性安全实验的化妆品，因此各大化妆品公司及学术单位都积极地投入非动物型妆品毒性的安全检测方法，而目前已发展的方法，主要是以细胞毒性检测作为化妆品安全的指标。
前述以细胞毒性作为化妆品检验指标，虽已避免以动物做为化妆品毒性安全实验目标的缺失，然而培养细胞仍需使用大量的血清，同时也要消耗大量时间观察毒性测试结果。对一般厂商而言，仍有研发成本高，制造成本大幅提升的劣势。
据此，如何发展出一套简易快速的毒性测试方法，以减少动物及细胞毒性试验，解决现有技术的缺失，实为相关技术领域者目前所迫切需要解决的问题。
发明内容
一般而言，凝胶化(gelation)是指大分子链的支链透过逐渐增大的支链形成非液态胶状物，其过程取决于起始材料的结构和构象。而这样的聚合物材料因具多分枝水溶性支链所以被称为“溶胶(sol)”。凝胶化的链接过程中会伴随着分支聚合物的尺寸逐渐增加与溶解度下降，这样的“无限的聚合”的结构被称为“胶(gel)”或“网络(network)”。而从有限的支链聚合物转化为无限的聚合结构的转变被称为“溶胶-凝胶(sol-gel)转变”(或“凝胶化”)。不同类型的凝胶化机制的发生可通过物理链接(物理胶凝)或通过化学连接(化学凝胶化)产生。其中物理性水胶形成是藉由分子间的静电力(离子性作用)、氢键及疏水性相互作用产生，具有像变化(可逆性)的特性。
有鉴于此，本发明提供一种应用植物胶固化而快速简便检测毒性物质的方法，是一种通过测定胶体凝固时间长短以测定样品是否影响化学键结的方法，进一步得知样品是否具有生物毒性。藉此，可避免动物或细胞实验的使用量，不仅达到保护动物的目的，亦可降低药物、食品或化妆品于毒性测试的成本
因此，本发明一种应用植物胶固化而快速简便检测毒性物质的方法，其包括步骤一(S101)：准备植物凝胶材料及待检测样品，其中植物凝胶浓度可例如为1％～6％；步骤二(S102)：混合植物凝胶材料以及样品，以形成混合物；以及步骤三(S103)：测定混合物的凝固时间，以测定样品所引起的生物毒性及刺激性，进而导致生物体组织结构伤害。
所述「刺激性」的定义为造成细胞膜、细胞质、细胞器产生剧烈变化而导致细胞崩解、坏死，这种崩解坏死通常又以外来物质而造成的整体细胞结构的破坏有关，例如与组成细胞化学成分的结构破坏有关。
于本发明实施例中，植物凝胶材料是选自琼脂(agar)。
较佳地，于本发明之一的实施例中，样品可例如为药物、食品或化妆品。
换句话说，因生命的基本单位是细胞，而细胞中含有种种生命分子系经各种化学键结组成，故藉由观察化学键结破坏程度来取代观察生命分子瓦解受伤的程度亦可当作一种毒性判断的指标
藉此，本发明的方法可快速检测样品是否为影响细胞或生物体的毒性物质，即使是不易穿过细胞膜的毒性物质或需长期观察才可以侦测到的细胞毒性，皆能在极短时间内观察出来。再者，本发明的方法不需使用细胞或动物实验，故可大幅降低毒性测试的成本。
附图说明
图1为本发明较佳实施例的步骤流程图；
图2为本发明的不同浓度p-甲氨基苯酚硫酸盐(p-Methylaminophenol Sulfate)与凝固时间的分析图；p-Methylaminophenol Sulfate浓度增加进而影响琼脂凝胶凝固时间。0是控制组(Control)为未添加p-Methylaminophenol Sulfate。
图3为本发明的不同浓度对苯二胺(p-Phenylenediamine，PPD)与凝固时间的分析图；PPD浓度增加进而影响琼脂凝胶凝固时间。0是控制组(Control)为未添加p-Phenylenediamine。
图4为本发明的不同浓度2-氨基苯酚(2-Aminophenol)与凝固时间的分析图；2-Aminophenol浓度增加进而影响琼脂凝固时间。0为控制组(Control)为未添加2-Aminophenol。
图5为本发明的不同浓度月桂基硫酸铵(Ammonium Lauryl Sulfate，ALS)与凝固时间之分析图；ALS浓度增加进而影响琼脂凝固时间。0是控制组(Control)为未添加ALS。
图6为本发明的不同浓度3-氨基苯酚(3-Aminophenol)与凝固时间的分析图。3-Aminophenol浓度增加进而影响琼脂凝固时间。0为控制组(Control)为未添加3-Aminophenol。
附图标记说明
S101、步骤一；S102、步骤二；S103、步骤三。
具体实施方式
本发明是藉由不同浓度或不同含量的化妆品原料(样品)进行测试。其中化妆品原料(样品)选自月桂基硫酸铵(Ammonium Lauryl Sulfate)、丁酯(Butyl Paraben)、月桂酰两性基二乙酸二钠(Disodium Lauroamphodiacetate)、乙醇胺(Monoethanolamine)、甘油(Glycerin)、过氧化氢(Hydrogen Peroxide)、羟乙基纤维素(Hydroxy Ethyl Cellulose)、盐酸赖氨酸(Lysine hydrochloride)、对烃基苯甲酸甲酯(methylp-hydroxybenzate)、甲基氯异塞唑晽酮(Methylchloroisothiazolinone)、丁二醇(Butylene Glycol)、p-甲氨基苯酚硫酸盐(p-Methylaminophenol Sulfate)、聚乙二醇(Polyethylene Glycol)、聚季铵盐-7(Polyquaternium-7)、对苯二胺(p-Phenylenediamine)、间苯二酚(Resorcinol)、水杨酸(Salicylic Acid)、2-氨基苯酚(2-Aminophenol)、3-氨基苯酚(3-Aminophenol)、硫化钠(sodium Sulfide-9-Hydrate)、角鲨烷(Squalane)、维生素E醋酸酯(TocopherolAcetate)、柠檬酸三钠二水合物(Trisodium Citrate Dihydrate)、肉豆蔻酸异丙脂(Isopropyl Myristate)及乳酸(lactic acid)。
于其中一实施例中，植物凝胶材料选自琼脂(agar)。
于本发明再一实施例中，样品例如，但不限于药物、食品或化妆品。
本发明所述的琼脂(agar)浓度1-6％，例如，但不限于1％、2％、3％、4％、5％、6％。
本发明所述的琼脂(agar)体积系为1毫升(mL)至250毫升(mL)，例如，但不限于1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升、7毫升、8毫升、9毫升、10毫升、50毫升、100毫升、150毫升、200毫升、250毫升。
本发明所述的植物凝胶凝固时间，特别是指琼脂凝胶凝固时间，是以琼脂凝胶溶液加热溶解为澄清溶液，于室温中降至25℃，并以琼脂凝胶所承载的载具，例如瓶、或试管，以相对地面的垂直面约30°～60°而操作，例如45°而操作，当操作者观察前述琼脂凝胶溶液不流动时，即为凝固时间。
如图1所示，本发明一种应用植物胶固化而快速简便检测毒性物质的方法，于较佳实施例特别是指一种应用琼脂胶固化而快速简便检测毒性物质的方法，包括下述步骤。
步骤一(S101)：准备植物凝胶材料及待检测样品。
步骤二(S102)：混合植物凝胶材料以及待监测样品，以形成混合物。
步骤三(S103)：测定混合物的凝固时间。本发明是以前述凝固时间而定义测定样品因凝胶键结间的变化而等同于样品所导致生物体组织或/及细胞结构的伤害，进而引起的生物毒性及刺激性。「刺激性」的定义为造成细胞膜、细胞质、细胞器产生剧烈变化而崩解、坏死，这种崩解坏死通常又以外来物质而造成的整体细胞结构的破坏有关，例如与组成细胞化学成分的键结破坏有关。换句话说，本发明所述「刺激性」是可藉细胞存活率与细胞毒性试验而得者。
此外，藉由下述具体实施例，可进一步证明本发明可实际应用的范围，但不意欲以任何形式限制本发明的范围。
实施例一：细胞存活率分析
藉由皮肤B16-F10细胞(购自食品工业发展研究所生资中心/台湾省卫生研究院细胞库，ATCC number:CRL-6475)与皮肤3T3细胞(购自食品工业发展研究所生资中心/台湾省卫生研究院细胞库，ATCC number:CCL-92)以测试各样品的毒性(IC50:μg/ml)。
再者，利用存活细胞的粒线体酵素可将MTT试剂还原成紫色结晶formazan，再用DMSO(Dimethyl Sulfoxide)将结晶溶解，以OD 570nm的吸光值来测量，形成的颜色深浅与存活的细胞数目成正比。皮肤B16-F10细胞与皮肤3T3细胞以8x103/well种于96孔盘中，3-5小时后待细胞贴于96孔盘，加入含有待侧样品(每孔100μl)。培养24小时后，加入MTT试剂(MTT 5mg/ml溶于PBS中)反应1～2小时待结晶形成，将96孔盘中的培养液与MTT试剂吸干，加入100μl的DMSO溶解结晶，以570nm的波长在酵素免疫分析仪(ELISA reader)下读取吸光值
所述半抑制浓度IC50是指某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶、细胞受体或是微生物)的半量，这里的反应可以是酶催化反应、或抗原抗体反应等。在细胞毒性测试方面，是以一特定浓度的某种药物造成细胞死亡50％，该浓度称为50％抑制浓度，即死亡细胞与全部细胞数之比等于50％时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导死亡的能力，亦即前述药物诱导死亡的能力越强，该数值越低。
因此，本发明先藉由细胞存活率分析而获得各种化妆品原料细胞毒性IC50等相关数据，进而可与后述不同实施例中，各种化妆品原料对于凝胶凝固时间进行验证比较。
实施例二：评估各种化妆品原料对琼脂凝固时间的影响
琼脂是系由海藻中提取的多醣体，其降温凝固的过程中与氢键的形成有密切的关系，本发明利用载具例如试管中所添加的化妆品原料对琼脂凝固而造成影响，并进而评估化妆品原料的毒性。于此实施例中，本发明亦进一步评估化妆品原料对琼脂凝固时间与细胞毒性IC50的相关性。
准备以琼脂(agar)作为本发明植物凝胶材料的主要应用材料，并准备不同样品，藉以分别测试如前述25种样品的凝固时间。
配置浓度为1-6％的琼脂溶液，例如，但不限于浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％的琼脂溶液，特别是浓度3％的琼脂溶液加热至100℃使其溶解，取100毫升(mL)、或200毫升(mL)琼脂溶液加入已放置各种样品(100毫升、或200毫升)的瓶、或试管中均匀混合后计时，每隔30秒倾斜前述瓶、或试管以相对地面的垂直面约45°观察是否有凝固，并记录自100℃经室温冷却至凝固的时间。
所述正确性Equivalence定义为＝Number of Compounds CorrectlyIdentified/Total Number of Compounds Tested(正确样本数量/全体样本数量)。
所述敏感性Sensitivity定义为＝Number of Irritants CorrectlyIdentified/Total Number of Irritants(被测出有刺激性的样本数量/全部有刺激性的样本数量)。
所述特异性Specificity定义为＝Number of Non-Irritants CorrectlyIdentified/Total Number of Non-Irritants(被测出无刺激性的样本数量/全部无刺激性的样本数量)。
所述伪阳性False positive Rate定义为＝Number of Non-IrritantsClassified as Irritants/Total Number of Compounds Tested(没有刺激性的样本被测出当作有刺激性样本的数量/全部样本数量)。
所述伪阴性False Negative Rate定义为＝Number of Irritants Classifiedas Non-Irritants/Total Number of Compounds Tested(有刺激性的样本被测出当作无刺激性样本的数量/全部样本数量)。
表一、琼脂凝固与细胞毒性的关联性
Figure GDA0001480021740000111
前述表一中的参数一是指以5％(w/w)浓度样品、化妆品原料于3％琼脂时，凝固时间大于15分钟以上作为毒性(细胞毒性IC50小于250μg/ml)分类的截止时间。
表二、化妆品原料对琼脂凝固时间影响及细胞毒性(一)
Figure GDA0001480021740000121
Figure GDA0001480021740000131
Figure GDA0001480021740000141
前述表二中的名称一是指浓度(w/w)为5％时琼脂凝固时间大于15分钟的样品、化妆品原料。
表三、化妆品原料对琼脂凝固时间影响及细胞毒性(二)
Figure GDA0001480021740000151
Figure GDA0001480021740000161
Figure GDA0001480021740000171
Figure GDA0001480021740000181
前述表三中的名称二是指浓度(w/w)为5％时琼脂凝固时间小于15分钟的样品。
另外，本发明亦藉不同浓度的各种化妆品原料对琼脂凝固时间是否存在浓度依赖性的关系。若以不同种类的化妆品来测定琼脂凝固而言，如图2，随着p-甲氨基苯酚硫酸盐(p-Methylaminophenol Sulfate)浓度的上升，琼脂的凝固时间具显著的延长而且有统计上的意义(「*」代表相较于控制组p<0.05；「**」代表相较于控制组p<0.01)(图2中，数据是以mean±S.E.M表示，其中进行了三重复测试。
图3，随着对苯二胺(p-Phenylenediamine)浓度的上升，琼脂的凝固时间具显著的延长而且有统计上的意义(图3中，数据是以mean±S.E.M表示，其中进行了三重复测试。图4，随着2-氨基苯酚(2-Aminophenol)浓度的上升，琼脂的凝固时间具显著的延长而且有统计上的意义(图4中，数据是以mean±S.E.M表示，其中进行了三重复测试。图5，随着月桂基硫酸铵(Ammonium Lauryl Sulfate)浓度的上升，琼脂的凝固时间具显著的延长而且有统计上的意义(图5中，数据是以mean±S.E.M表示，其中进行了三重复测试。图6，随着3-氨基苯酚(3-Aminophenol)浓度的上升，琼脂的凝固时间显著的延长而且有统计上的意义(图6中，数据是以mean±S.E.M表示，其中进行了三重复测试。换句话说，由表二、表三、图2至图6的结果显示，测试的化妆品原料的琼脂凝固时间与毒性具有浓度依赖性的现象。
综上，利用样品测定琼脂凝固时间并以B16-F10细胞及3T3细胞毒性进行比对的数据，如前述表二～表三所示，当分别加入不同含量的样品时，随着样品中的毒性物质含量越高，其琼脂凝固的时间相较于未加入样品的控制组则愈长。举例而言，具毒性物质的样品与本发明琼脂混合后，琼脂凝固的时间超过15分钟。
换言之，本发明藉琼脂的凝固时间测试，并与细胞存活率分析实验进行比较，进而验证化妆品原料中如「丁酯(Butyl Paraben)、甘油(Glycerin)、羟乙基纤维素(HydroxyEthyl Cellulose)、盐酸赖氨酸(Lysine hydrochloride)、聚乙二醇(PolyethyleneGlycol)、聚季铵盐-7(Polyquaternium-7)、柠檬酸三钠二水合物(Trisodium CitrateDihydrate)」等属「对皮肤不具伤害性」的化妆品原料、样品。
另外，本发明藉琼脂之凝固时间测试，并与细胞存活率分析实验进行比较，进而验证化妆品原料中如「月桂基硫酸铵(Ammonium Lauryl Sulfate)、月桂酰两性基二乙酸二钠(Disodium Lauroamphodiacetat)e、Hydrogen Peroxide、Methylchloroisothiazolinone、p-甲氨基苯酚硫酸盐(p-Methylaminophenol Sulfate)、对苯二胺(p-Phenylenediamine)、Resorcinol、2-氨基苯酚(2-Aminophenol)、3-氨基苯酚(3-Aminophenol)、sodiumSulfide-9-Hydrate、Lactic acid」等属「对皮肤具伤害性」的化妆品原料、样品。
综上所述，本发明一种应用植物胶固化而快速简便检测毒性物质的方法，特别是一种应用琼脂胶固化而快速简便检测毒性物质的方法，不仅相较现有技术能于约15～60分钟较短时间检测如化妆品、食品、药品等样品，也能对前述样品中是否含有对生物体具伤害性的过量毒性物质，因而能对包括如化妆品等样品，判断是否含有具过量毒性物质。
虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。

Claims (7)

1.一种应用植物胶琼脂固化而快速简便检测毒性物质的方法，其特征是包括：
步骤一：准备琼脂(agar)及待检测样品，并将该琼脂经加热而至完全溶解以形成热琼脂溶胶溶液；
步骤二：混合所述热琼脂溶胶溶液及所述样品于一载具中，以形成混合物；以及
步骤三：测定所述混合物经室温而冷却至25℃的凝固时间，其中该凝固时间的截止时间(cut-off time)以15分钟为判断该样品是否为毒性物质；
其中所述热琼脂溶胶溶液的琼脂浓度为1-6％，其中所述热琼脂溶胶溶液的体积是为1毫升至250毫升；其中所述样品的凝固时间大于该截止时间者，则该样品被判断为属于毒性物质，其中所述样品的凝固时间小于该截止时间者，则该样品被判断为不属于毒性物质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述琼脂浓度为3％。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述载具是以相对地面的垂直面45°而操作。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是，所述混合物的体积为100毫升至200毫升。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述毒性物质定义为导致生物体细胞受到损伤。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述样品选自化妆品、食品、或药物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述样品选自月桂基硫酸铵(Ammonium LaurylSulfate)、丁酯(Butyl Paraben)、月桂酰两性基二乙酸二钠(DisodiumLauroamphodiacetate)、乙醇胺(Monoethanolamine)、甘油(Glycerin)、过氧化氢(Hydrogen Peroxide)、羟乙基纤维素(Hydroxy Ethyl Cellulos e)、盐酸赖氨酸(Lysinehydrochloride)、对烃基苯甲酸甲酯(methyl p-hydroxybenzate)、甲基氯异塞唑晽酮(Methylchloroisothiazolinone)、丁二醇(Butylene Glycol)、p-甲氨基苯酚硫酸盐(p-Methylaminophenol Sulfate)、聚乙二醇(Polyethylene Glycol)、聚季铵盐-7(Polyquaternium-7)、对苯二胺(p-Phenylenediamine)、间苯二酚(Resorcinol)、水杨酸(Salicylic Acid)、2-氨基苯酚(2-Aminophenol)、3-氨基苯酚(3-Aminophenol)、硫化钠(sodium Sulfide-9-Hydrate)、角鲨烷(Squalane)、维生素E醋酸酯(TocopherolAcetate)、柠檬酸三钠二水合物(Trisodium Citrate Dihydrate)、肉豆蔻酸异丙脂(IsopropylMyristate)和乳酸(lactic acid)中的一种或多种。
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