CZ275796A3 - Method of determining toxicity, apparatus for carrying out the method and the use of such apparatus - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu stanovení toxicity látek rozpustných ve vodě nebo mísitelných s vodou.

Vynález se rovněž týká vhodného zařízení k provádění tohoto způsobu, stejně jako jeho použití.

Dosavadní stav techniky

Je dobře známo, že se účinkem toxických látek poškozuje vitalita organismů. I když to podává dostatečný důkaz o přítomnosti takových látek, nedovoluje to, aby byly získány závěry týkající se stupně toxicity a/nebo koncentrace látky.

Podstata vynálezu

Předmět tohoto vynálezu poskytuje způsob, který ulehčuje kvantitativní stanovení toxicity látek a přinejmenším přispívá ke sníženi stále obecně časově náročných experimentů, které používají savce v rámci testů pro stanovení základní bezpečnosti.

Další předmět se týká zařízení, které umožňuje, aby provádění způsobu bylo automatizované, přičemž vyhodnocení tohoto způsobu má být racionalizováno a autenticky dokumentováno.

% ΐ

Podle tohoto vynálezu se dosahuje stanoveni změny . nobility a/nebo velikosti alespoň dvou jedinců jediného typu testovaného organismu ve vodném prostředí při účinku přinejmenším jedné toxické látky během alespoň dvou časových fc

Ϊ intervalů, s alespoň jedním referenčním měřením a alespoň jedním dalším měřením prováděným po podání toxických látek.

..................... ..........»............................. ......... ........... .....................I-- ......

Pojem mobilita' je převzat z fyziky tuhého stavu a popisuje pohybovou aktivitu a zejména mobilitu testovaných organismů, která se ve vodném prostředí jednoduše pozoruje jako posun umístění.testovaných organismů za časovou jednotku.

Tato mobilita může být však také vnímána pozorováním funkce specifických orgánů testovaného organismu.

Zvýšená frekvence mobilityjednotlivých organismů dovoluje vyvodit závěry týkající se specifické toxicity bez výsledného posunu umístění organismu, který je nutně postižen.

S látkami inhibujícími růst buněk, pozorování nebo měření velikosti testovaných organismů jako funkce času vytváří měřítko tohoto specifického typu toxicity.

* Stanovení toxicity tohoto druhu se může provádět paralelně se stanovením mobility, ale také odděleně od tohoto stanovení, se stejnými přístrojovými prostředky.

Podle tohoto vynálezu je možné používat mikroorganismy pro stanovení toxicity látek, měřením účinku jediné látky nebo kombinace látek na změny těchto organismů. Takové měření dovoluje, aby se výrazně snížilo nezbytné množství experimen-3 tů na laboratorních zvířatech citlivých k bolesti.

Ke zvýšení významu měření je. výhodné provádět pozorování na větších skupinách jednotlivých testovaných organismů oddělených od jiných skupin a všeobecně ohodnotit každou skupinu.

Další výhoda způsobu spočívá ve své jednoduchosti . a snadné aplikovatelnosti, stejně jako v nízkých nákladech.

Pojem toxicita vsak není omezen na účinek jedu v běžném významu, a může být rozšířen na aplikaci libovolného patrného účinku (reakce.) na žijící organismus.

Zařízeni k provádění způsobu je charakterizováno tím, že je vybaveno jednotkou pro'získání obrazu, která v předem stanovených' časových intervalech provádí zjišťování předmětu a následný záznam polohy předmětu v alespoň.jedné ploše, přičemž jednotka pro získání obrazu je spojena s vyhodnocovacím systémem, který zahrnuje počítač a zobrazovací zařízení, které ve vztahu k přítomné toxicitě.provádějí'statistické vyhodnocení mobility organismů.

V nejjednodušším případě jednotka pro získání obrazu je navržena tak, že je mechanicky přemístitelná a je vedena nad vzorky určenými ke zkoušení.

Jak je popsáno v nároku 2, změna mobility se vyjadřuje vzdáleností, kterou překoná za časovou jednotku testovaný organismus.

Signifikantní hodnoty mobility mohou být odvozeny od zrychlení specifikovaného v patentovém nároku 3, které se vypočítá z hodnot rychlosti.

Toxicita vypočítaná podle tohoto vynálezu, uvedená v patentovém nároku 4, je relativní toxicitou, vzhledem k normalizované toxicitě.

Stanovení pohybové rychlosti, stejné jako výpočet, výsledných hodnot zrychlení a/nebo změn velikosti organismů se může provádět v rovině, stejně jako trojrozměrně, v závislosti na zdokonalení použitého zařízení. Z těchto výsledků je možné nejjednoduším .způsobem vynést charakteristické křivky, jejichž interpretací se může dojít ke stanoveni účinku látek také na vyšší organismy.

Vynález je výhodně aplikovatelný za použití nižších organismů jako organismů testovacích. Obzvláště vhodné k tomuto účelu jsou organismy žijící ve vodě, protože jejiph mobilita je snáze pozorovatelná.

. · γ*

Provádění testu za použití Artemia šalina nauplia není postiženo ani závislostí na ročním období, ani podáváním potravy a rozmnožováním, ale je ovlivněno teplotou okolí a časovým faktorem, takže jako profesionální prostředky pro vyšetření jsou vhodné pouze automatizované procesy.

Zvýšení teploty okolí vzhledem k normální teplotě má podle zkušenosti za výsledek zvýšení mobility testovaných organismů.

Za účelem dosažení reprodukovatelných výsledků se doporučuje provádéť a normalizovat testy při teplotě 22 .± 1 °C. Za použití obvyklých přístrojů se tato hodnota udržuje konstantní relativně snadno a kromě toho zabraňuje nadměrnému odpařování a tvorbě vodní páry při prodloužených pozorováních.

Za nepříznivých životních podmínek Artemia· šalina vytváří cysty (vajíčka, která jsou uzavřena v časném stádiu gastruly) a tak mohou být chráněna během mnoha let..

Jak je uvedeno..v .patentovém nároku .5, testy. se. něj výhodně ji provádějí v mořské vodě za použití Euphyllopoda,. jako jedinců Artemia šalina nauplia (v embryonálních stavech 3 a 4, s velikostí přibližně od 0,9 až do 1,15 mm).

Použitelné jsou také'volně plující rotatorie. (Ploina), jak je uvedeno v patentovém nároku 6.

Pro zvláštní vyšetření, to znamená pokud se testují karcinogenní látky , jsou -výhodnými: druhy, perloočky.. (Cladocera.) ( viz patentový nárok: 7 ) , protože.· je možné/jednoduchým .způsobem provádět pozorování na dvou generacích. .

I když Artemia -sa-lina je organismus žijící v-mořské vodě, umělá mořské voda je rovnocenným prostředím pro toto měření (viz nárok 8). .

Za účelem vyloučení možnosti neřízených reakcí mezi toxickou látkou a mořskou vodu a/nebo vodovodní vodou, může být výhodné použít sladkovodní typy Euphyllopoda v umělé sladké vodě, která sestává z destilované vody a hydrogenuhličitanu sodného. Rovněž se doporučuje používat uměle připravené mořské vody.

Podle tohoto vynálezu se mohou také používat jiné organismy, například pulci a podobní živočichové.

Podle nároku 9 se stanoveni mobility testovaných organismů může dosahovat čisté optickým způsobem.za pomocí mikroskopu, přičemž zpomalení mobility a/nebo inaktivace testovaného organismu je pozorovatelná při účinku toxické látky. ~~~ ...............

I když v případě malého počtu vzorků jsou samozřejmě možná měření s mikroskopem, z důvodu spolehlivosti a normalizace se má usilovat o to, aby již v tomto okamžiku bylo doporučeno.použít automatizovaného testovacího vybavení.

Při výhodném provedení způsobu se provádí měření jako je popsáno v patentovém nároku 10, za použití mikrotitrační misky, například jako je podrobně popsáno v (dosud nepublikované) švédské patentové přihlášce č. 03 141/93-6.

Pro výhodnou elektrooptickou přístrojovou analýzu, jak uvedena v patentovém nároku 11, se látky rozpustné ve vodě, které jsou určeny pro vyšetření, rozpustí ve vodě nebo v umělé mořské vodě a zavedou do výše popsaných schránek (jamek), přidají se testované organismy a reakce těchto organismů se ohodnotí elektronicky.

V průběhu analýzy se změna mobility testovaného organismu na schránku průměruje a srovnává v dříve zaznamenanými hodnotami. Příslušné korelace poskytují kvantitativní údaje . týkající se přítomné toxicity, viz patentový nárok 12.

Výše uvedená vyšetření se mají vždy provádět za identických podmínek, jak se uvádí v patentovém nároku 13, protože na výsledek působí teplota.

Průběh způsobu se může významně optimalizovat systematickým mícháním podporovaným pipetou, jak je popsáno v patentovém nároku 14, čímž se značně eliminují potenciální zdroje chyb.

Zařízení umožňující provádění-způsobu usnadňuje jednoduché ohodnocení pozorovaného obrazu obvyklým EDV prostředkem. Sestavením.kvocientů, zmíněných v.patentovém nároku 16, u všech vzdáleností pokrytých-za časový.interval a na obraz, se může stanovit relativní střední rychlost a pomocí druhé derivace také její hodnota zrychlení.

Obzvláště důležité je stanovit.odlišnost, mezi . pohybujícími se a nepohybujícími se.předměty, ježto na jedné

JÍ straně řada testovaných organismů svléká svoji pokožku během období pozorování a odložená pokožka je odpovědná za nesprávné záznamy. Z druhé, strany se musí zjistit již uhynulé organismy a vyloučit.je z výpočtu,.viz nárok 17.

Pro provedení způsobu je obzvláště výhodná tak zvaná CCD clonová kamera, jaká je nárokována v patentovém nároku 18, a v současné době jsou pouze kamery tohoto typu schopny vyjádřit tvar a vysvětlitelné zobrazení.

Pomocí uspořádání zahrnujícího dvě kamery, jak je navrženo v patentovém nároku 19, je možné pozorovat a měřit pohyby testovaného organismu také trojrozměrně.

Pokud je vložena dostatečně velká investice do zařízení, to znamená, pokud je.umožněno použít příslušných kamer a dostatečně veliké paměti pro zobrazované hodnoty, stejně jako dostatečně rychlého počítače, v zásadě je možné současně zaznamenávat a odděleně vyhodnocovat všechny testované organismy z testovaného uspořádání', srovnej patentový nárok 20.

Racionální automatizované pozorování a hodnocení testovaných organismů se může provádět podle informací poskytnutých v patentových nárocích 21 nebo 22, za předpo-_~ kladu, že použitý transportní mechanismus pracuje hladce.

Použiti zmíněná v patentových nárocích 23 až 25 se týkají aktuální potřeby ochrany životního prostředí, technologie potravin a farmaceutického^průmyslu. Je zřejmé, že se může uvažovat s dalšími aplikacemi, které jsou také z příbuzných nebo jiných oblastí biologie.

Stanovení toxicity, jak se důkladně zkouší na jedincích Ařtemia šalina nauplia, usnadňuje objasnění

Λ relativní toxicity látek ve vodném prostředí, to znamená látek rozpustných ve vodě, ale také látek, u kterých se může dosáhnout rozpustnosti ve vodě pomocí meziproduktů usnadňujících rozpouštění, jako například pomocí acetonu. Jak. je vysvětleno v patentových nárocích 23 až 25, současně se také získává informace o toxických účincích látek, obzvláště insekticidů a pesticidů, na vodní faunu.

Pomocí periodických měření během stejných časových intervalů a při zvyšujících se koncentracích toxických dávek je možné připravit charakteristické křivky letální dávky, které dovolují učinit konečný úsudek týkající se typu toxické látky a které přispívají ke zkoumání účinného mechanismu látky nebo kombinace látek.

Přehled obrázků na výkresech

Dále se podrobněji vysvětlují ztělesněni tohoto vynálezu pomocí obrázků, kde obr. 1 je schematické znázornění elektrooptické jednotky·pro získání obrazů s charakteristickým testovacím organismem, ke stanovení jeho mobility, . . . .obr,. . 2 představuje, celkový.pohled na zařízení včetně jednotky pro získání obrazu a vyhodnocovacího systému,obr. 3 je částečný, příčný řez skřínkou zařízení z obr. 2, ve směru kolmém k přední, desce., obr. 4 představuje částečný příčný řez.skříňkou zařízení z obr. 2, ve směru rovnoběžném k přední desce, obr. 5 znázorňuje systém titračních misek, pro umístění šesti misek vzorků, 'obr. 6 je postupový diagram ukazující průběh programu pro automatické stanovení -mobility testovaných organismů, obr. 7 představuje charakteristický střední pokles rychlosti, jako funkci času, u žijících organismů ve třech zvolených toxických roztocích, který se pozoruje během časového období 10 hodin, obr. 8 ilustruje test toxicity prováděný s Artemia šalina v roztoku paraoxonu, s první souřadnicí, kde jsou uvedeny koncentrace, a s druhou souřadnicí, uvádějící podíl uhynulých organismů, obr. 9 znázorňuje další test toxicity s rychlostí testovaného organismu, která je představována jako funkce koncentrace paraoxonu, společně s proloženou křivkou letální dávky, obr.. 10 představuje video zobrazení skupiny žijících testovaných organismů ve vodném prostředí na,začátku pozorování, obr. 11 je dalším video zobrazením skupiny stále žijících testovaných organismů z obr. 10 po 24 hodinách, s částí odpařeného prostředí, ^: obr. 12 je diagram účinku na čase, ukazující přípravu, provedení a vyhodnocení měření nobility testovaných organismů, obr. 13 ukazuje měření až 6 titračních misek podle diagramu z obr. 12, obr. 14 představuje měření až 10 misek' s časovou periodou až 10 minut, která se ponechává pro každou misku, obr. 15 znázorňuje sekvenční průběh jednotlivých měření representovaných v časovém intervalu měřeni misky, i < .+ obr. .16 znázorňuje intervaly poskytované pro měřeni jednotlivé schránky, přičemž časové intervaly mezi jednotlivými měřeními jsou určeny transportním mechanismem kamery a obr. 17 představuje sekvenční hodnocení všech průběhů způsobu, které jsou vyžadovány pro ohodnotitelnou registraci jediné schránky v titrační misce.

- 11 Na obr. 1 je vztahovou značkou 1 označena video kamera (CCD Shutter Camera, Sony, typ XC-77 RR-CEO). Optika 2 namontovaná na elektronickou video ' kameru 1 je tvořena makroobjektivem (Sony, typ CM 50), Video kamera 1 je uspořádána vertikálně osobě známým'způsobem na dvou nosičích ¹ . které jsou připojeny'k C-ramenu 4a až 4c. Opery C-rámene na komerčně dostupné .jednotce 5. pro nastavení polohy,-na- XY-stolu se. dvěma posuvnými jednotkami (_ISEL. Automation D-64.19, Eiterfeld), obsahující vhodné krokové motory, dovolují přemístění ve směru osy X o 400 mm a ve směru osy. Y o 300 mm.

Mezi optikou 2a světelným difuzorem 6 jsou umístěny, vzorky P, pro které jsou charakteristické Artemia šalina 100, pozorované ve snímaném světle.

Vertikálně nad optikou 2. je umístěn, na C-^rameni světelný di.fuzor;.6, který je napájen z nezná zorněného . zdr.oje světelným vedením ]_. Signálním kabelem 9 se video signály VS' vedou směrem nahoru (srovnej obr. 3 a obr.- 4).' Celé zařízení pro pozorování a hodnoceni testovaných organismů sestává z jednotky pró získání obrazu a z vyhodnocovací jednotky ,10, 10¹ . která je na obr. 2 označena vztahovou značkou 10. Dvoje dveře 12a. 12b do skříňky 11 zařízení dovolují., aby se do vzorkovacího prostoru dodal preparát. Na- horní části skříňky 11 je umístěna komerční centrální procesorová jednotka 15 osobního počítače (PC), včetně rovněž.obchodně dostupného monitoru 14. V sousedství osobního počítače je uložen na otáčivé podložce další monitor 13. který zobrazuje obraz snímaný, video kamerou umístěnou ve skříňce ll. Skříňka 11 je opatřena odkládacím povrchem 16. pro ovládání zařízení a pro neznázorněné vstupní zařízení (klávesnice, myš), ktěré však je vyžadováno k ovládání zařízení.

Příčný řez z obr. 3 znázorňuje vnitřek přístrojové skříňky, přičemž orientace řezu je dána polohou dveří 12a.12b. Znovu je vidět C-rameno 4a, 4b, 4c se svými komponentami , viz obr. 1, stejně jako jednotka 5 pro nastavení polohy_ a světelné vedeni 7, které je připojeno k běžnému zdroji 8 světla.

V prostoru 20 pro vzorek, přístupném dveřmi 12a. 12b, je umístěn systém 21 titračních misek, pro přijímání vzorků, s testovanými organismy. Energie pro celé zařízení je dodávána komerčně dostupným, nerozbitným zdrojem 22 energie, obr. 3 a obr. 4. Všechny signály vyžadované k řízení jednotky 5 pro nastavení polohy se vytvářejí v kontrolní jednotce 23. Video signály VS se' vedou do obvyklé jednotky řídicí' kameru v centrální procesorové jednotce 15 (v-řídicím počítači).

i··*

Neznázorněno je o sobě známé periferní příslušenství, jako jsou tiskárny, plotry a podobně, které se dají připojit k osobnímu počítači.

Obr. 5 představuje systém 21 titračních misek, který je umístěn v prostoru 20 pro vzorek a zahrnuje v podstatě své ňéjzákladnější složky.

Systém 21 titračních misek sestává z rámu pevně připojeného ke skříňce 11, který má otvory 24, do kterých se dá zavést šest mikrotitračních misek 24.1 až 24.6, z nichž každá má 96 schránek, přičemž každá schránka obsahuje jeden vzorek testovaného mikroorganismu (přibližně 12 jedinců .. Artemía šalina). Chrániči kryt (není znázorněn) zabraňuje narušení vzorků účinkem prachu a/nebo tepelným zářením a podobně. Kromě toho oddělené titrační. misky jsou pokryty transparentním plastickým materiálem, ke snížení účinku odpařování.

Za použití výše popsaného zařízení se může měřit mobilita testovaných organismů. Při nejjednodušším způsobů se .toho .může., dosáhnout. určením..rychlosti. přemístění , organismů .... v testovaném roztoku., přičemž, tato. relativní rychlost se vztahuje ke kontrolnímu roztoku (bez toxické látky).

Při plánování.řad.testů se/uživátel.nej lépe. řídí programem pro osobní počítač. Tento program.zkoumá například počet koncentraci (v. mol nebo v procentech.) a paralelních_: stanovení, slepé hodnoty, kontrolní stanovení a '.jejich uspořádání, stejnějako umístění preparátu do příslušných schránek .v systému s větším počtem schránek. Kromě toho program vyžaduje údaje týkající se názvu testované látky, její molekulové hmotnosti, nejvyšší koncentrace určené k testování a volby lineární nebo logaritmické řady ředění.

• Poté co -osobní počítač má informace^; týkající· se celkového objemu pro test, rozsahu, ve kterém se přidávají testované organismy (například Artemia šalina), stejně jako testované látky, program vypočítá objem testované látky, která je vyžadována pro test. Po odváženi množství se požadované ředění může provádět pod vedením programu. Míchání, kterému sě pomáhá pipetou, je usnadněno pomocí optického prostředku na stínítku monitoru.

Výhodný roztok mořské vody sestává z 2800 mg chloridu sodného, 342 mg heptahydrátu síranu hořečnatého, 234 mg ' hexahydrátu chloridu horečnatého, 122 mg dihydrátu chloridu vápenatého, 20 mg hydrogenuhličitanu sodného a 74 mg chloridu i

draselného, na 100 mg destilované vody.

V prvním stupni se elektroopticky stanoví počet testovaných organismů, které jsou přítomny v roztoku umělé mořské vody, ke kterému se přidala látka, jež je určena k testování.

Pozorování účinku látky na organismy se provádí v předem stanovených časových okamžicích pomocí přítomného systému analýzy obrazu a dovoluje stanovit tyto skutečnosti:

jaký je počet organismů, ,._it rt.

jak mnoho organismů neprojevuje delší dobu aktivitu., jaká je průměrná mobilita nebo relativní rychlost pohybu, jaká je průměrná velikost (relativní plocha povrchu) organismů a jaké je jejich individuální těžiště, závislé na poloze plochy povrchu.

Elektrooptické stanovení se v podstatě provádí takto:

^_ '“V mikrotitrační misce obsahující testovanou látku se umístí vzorky do popsaného automatického analyzátoru. V předem stanovených okamžicích měření se elektronická kamera pohybuje pod oddělenými měřicími místy titrační misky a snímá 12 až 36 obrázků. Ve stejné době se příslušné vzorky osvětlují svrchu. Aby tyto obrazy byly ostré, musí se pracovat s kamerou s kontrolou expozice, objektiv této kamery je navržen tak, aby jednak obraz vyplňoval rám a jednak obraz byl ostrý v celé hloubce kapaliny (přibližně 1 cm), osvětlo- 15 vání se provádí světelným vedením, které připojeno k C-rameni, pracuje dohromady s kamerou. Rozlišení se optimalizuje tak, že celková analýza se může provádět s minimem zobrazovacích bodu' (pixelů). To dovoluje udržovat vypočtený čas pro zobrazovací analýzu na co nejnižší úrovni. Vybrané rozlišení odpovídá 256 x 256 zobrazovacím bodům. , S tímto rozlišením se obrysy organismů se mohou stále jasně rozeznat. V důsledku. toho_se dosahuje měření .a doby. ohodnocení. . .. ., ......

přibližně 3 minuty.na titrační misku (s 96 schránkami), to znamená přibližně 2 sekundy na měřicí místo, k C-rameni, pracuje dohromady ε kamerou. Rozlišení se optimalizuje tak, že celková analýza se může provádět .s. minimem. pixelů. To dovoluje udržovat vypočtený čas pro zobrazovací analýzu na co. nejnižší úrovni. Vybrané rozlišení odpovídá 256 x 256 zobrazovacím bodům. S tímto rozlišením se obrysy organismů mohou stále jasně rozeznat. V důsledku toho se dosahuje měření a doby ohodnocení přibližně 3 minuty na titrační misku (s 96 schránkami), to znamená .přibližně 2 sekundy ňa měřicí místo.- ....

Při ukončení měření -se -hodno-ty-ukládagU-na-d-išk-é-t-y a mohou nyní být přímo vyhodnoceny pomocí-programu pro osobní, počítač. Kromě toho se údaje předvádějí graficky a přímo se zjištují charakteristické hodnoty toxicity. Tyto údaje se potom ukládají do databanky tak, že jsou vždy dostupné pro srovnávací účely.

Při provádění výše popsané automatizované analýzy kapalných vzorků' se používané mikrotitrační misky mohou zhotovit z transparentního materiálu. Pomocí systému s větším počtem schránek, sestávajícího ze dvou materiálů, které mají odlišné fyzikální vlastnosti, je možné upravit povrchové napětí na povrchu kapaliny tak, že způsobí, že povrch je přibližně rovinný i Toho se dosahuje výhodně zhotovením dna systému s větším počtem schránek z transparentního materiálu (švýcarská patentová přihláška č. 03 141/93-6), například z polystyrenu nebo z kopolymerů polystyrenu, a stěn z méně transparentního materiálu, například z polyolefinů nebo z polytetrafluorethvlenu, které_nejsou^příčinou povrchového zakřivení nebo adsorpce proteinu.

Částečný průběh programu testování, jak je schematicky uveden výše, v září zení podle obr. Taž 5, se může znázornit na obr. 6, kde začátek je označen St (start) a konec programu jako RES (resultát).

Po zahájení se sled obrazů snímá· v přímém zapojení v konstantních časových intervalech /\ t. Snímané hodnoty jsou binarizovány o sobě známým způsobem a jsou uloženy v operativní paměti, která je označena jako B-S,.

Potom se stanoví poloměr měřicího okna, který je závislý na hladině kapaliny, a je označen jako Ro.

V dalším stupni se charakterizují předměty a parametry předmětů pro všechny obrazy se stanoví v rozměrech okna, to znamená, že k identifikaci se změří souřadnice těžiště, TeiaUivňí^pTočha povrchu, obvod a počet vizuálně^-(^lěktronič^ ky) identifikovatelných otvorů u předmětu v každé schránce, a označí se O-Pl.

Potom se vyloučí nepřípustné předměty ve všech . obrazech za použití měřítka, které je naprogramováno na přijatelnou velikost plochy povrchu a obvodu. K označení se použije 0-E1.

-17 Nyní se stanoví počet testovaných organismů na sekvenci pro všechny zobrazené hodnoty a označí se jako O-CL (spočítané předměty). To koresponduje s celkovým počtem žijících organismů na obraz.

Střední hodnota se prčí měřením rychlosti organismů zevšech dříve stanovených zobrazených hodnot. Ňa obr. 6 je tato hodnota označena. .j.ako.„0.-v ..(střední .rychlost organismu),.......

s.okamžitou souřadnicí těžiště plochy povrchu v obrysu organismu, co slouží jako- srovnávací měření.

Následně se vytváří obraz z výsledku, založeného.na. pixelech se souřadnicemi xi, yi a normalizuje se takovým způsobem, že číslo 1 bude představovat nepohybující se uhynulý předmět. Zbytek pixel xi, yi je množina s hodnotou *

nula (= 0). Tento krok způsobu je označen jako R(xi, yi).

Pod O-P2 se předměty znovu charakterizují a parametry předmětů u všech obrazů se stanoví v měřítku okna, to znamená, že se ve schránce změří souřadnice těžiště, . relativní - plocha -povrchu, obvod- -a počet předmětů. Potom_: se· · znovu vyloučí nepřijatelné předměty ve všech obrazech za použití měřítka, které je naprogramováno na přijatelnou velikost plochy povrchu a obvodu. K označeni se použije 0-E2.

Nakonec se spočítají výsledné mrtvé předměty v konečném obrazu a označí se jako O-CD.

Pod RES se provádí vyhodnocení výsledků, za použití statistických metod o sobě známým způsobem (Probit, a podobně).

Na obr. 7 jsou znázorněny tři známé, vybrané roztoky, které obsahují £enobarbital, označen jako Ph, sulfát amfetaminu, označen jako Am, a D-propoxyfen, označen jako Pr. stanovuje se posun umístěni Artemia šalina na jednotku času a označuje se jako střední rychlost v.

V kontrolním roztoku, to znamená v roztoku umělé mořské vody blíže popsaném dále, jsou stanoveny střední rychlosti Artemia šalina od 5.10^-3.do 6.10^-3 m/s.

Jak vyplývá z representačních údajů znázorněných na obr., 7, v případě D-propoxyfenu nastává během časového období 10 hodin relativní lineární pokles rychlosti na přibližně 65 % počáteční rychlosti a v případě fenobarbitalu ' •!ť ¹ na přibližně 80 %.

» *

Ukazuje se, že v závislosti na faktoru ekvivalence toxicity (typu, skupině nebo třídě toxické látky) by bylo vhodné povšimnout si charakteristických poklesů rychlosti. To se může zobecnit, aby se také postihly významné účinky a tak účinky napomáhající detekci oddělených látek a kombinací takových látek.

V závislosti na povaze účinku látky na organismus se múze optimalizovat významnost měření pomocí vhodného ohodno-cení*obra-zu a 'úpravou^-m'ěřicí^- meťodyv Například^-ria^— místo pozorování rychlosti přemístění je možné pozorovat specifickou mobilitu separovaných orgánů z organismu. Vedle toho vypočtením první derivace naměřené rychlosti se může položit důraz na cyklické pohyby a ty se mohou snáze zaznamenat a analýzovat.

Příklad provedeni vynálezu

-19 Praktický příklad týkající se stanovení toxicity paraoxonu

Na obr. 8 je podíl Z uhynulých organismů vztažen ke 100 % organismů, které byly na začátku měření. Při vzrůstající koncentraci paraoxonu stojí za povšimnutí vzrůst Z. Tento typ hodnocení dovoluje stanovit dobře známou hodnotu LC_5Q toxické-látky.

Výpočet počtu uhynulých Artemia šalina je.založen na měření rychlosti testovaných organismů podle výše popsané metody, s tím, že pozorovaná rychlost odpovídající nule ukazuje na .uhynulý'organismus... .

Křivka znázorněná na obr. 8 je střední hodnotou odvozenou ze čtyř nezávislých sérií testování, které pokrývají koncentrační rozmezí paraoxonu v umělé mořské vodě nad velikost tři řádů. Střední hodnota takto stanovených hodnot LC₅q za teploty 22 °C je 5,9.10~⁵, při maximálním . rozptylu 33 %.

Obr. 9 -ukazuje -rychlost-^:v-testovaných- organismů Artemia šalina v sériích testů,-jak se změří 30 minut po smíchání roztoků paraoxonu se zvyšujícími se koncentracemi. Může se pozorovat dvojí výrazné snížení rychlosti. Druhý pokles, při obsahu přibližně 1.10”⁴ mol/1 paraoxonu, je v souladu s hodnotou LC₅₀, jak se může usuzovat z překrývající křivky, která znázorňuje letální dávku.

Významný první pokles rychlosti nastává přibližně při obsahu 1.10 mol/1 paraoxonu a.odpovídá účinné koncentraci EC₅₀. Tato účinná koncentrace, slouží jako indikace funkce toxické látky.

Charakteristické video obrazy mohou být zřejmé na obr. 10 (na začátku experimentu) a na obr. 11 (na závér experimentu, po 24 hodinách). Na druhém obraze se uhynuli, to znamená nepohybující se živočichové elektronicky potlačují o sobě známým způsobem a jsou proto neviditelní na monitoru 13., obr. 2.

Obr. 11 znázorňuje dodatečný poloměr Rx, který ukazuje., na možné odpaření kapaliny a výsledné snížení měřicího poloměru okna, co je znázorněno několikrát přerušenou plnou čárou.

Další podrobnosti týkající se průběhu technického provedení způsobu se mohou vyvodit z obr. 12 až'17, kde diagram účinek/doba ukazuje celý průběh metody.. Ve svých jednotlivých stupních je tento diagram označen symboly i až V, aby se uvedla velikost doby trvání jednotlivých stupňů metody, která je označena na první souřadnici.

Číselné hodnoty představují:

I Příprava měřicí série pomocí nastavení pomoci na osobním počítači pro naplnění titračních misek.

II Kalibrace počátečních hodnot sledovacího programu.

III Přimíchání toxické látky.

IV Natáčení (přijímání) změřených řad údajů pomocí sledovacího programu.

V vyhodnocení změřených řad za použití statistických metod z analýzy a koreiací s předchozími měřeními '

-------(databanka). — ~

- 21 Sekvence z obr. 13 až 17 se vždy vztahují ke stupni IV způsobu, jako k příznačnému stupni pro objasnění všech těchto diagramů účinek/doba.

Obr. 13 představuje, typický průběh natáčení změřených řad z až šesti titračních misek, kde měření jsou prováděna v.hodinových intervalech._Tyto řady odpovídají poloze IV na obr. 12.

Na obr. 14 je poloha ’IV'(natáčení změřených řad) rozlišena, v podrobnostech:. Oddělené titrační misky jsou označeny jako Pl 01 až Pl 06i Přitom měření je vé skutečnosti omezeno na maximální dobu trvání 10 minut.

Oddělené stupně způsobu během období měření se mohou odvodit z obr. 15 a zde jsou označeny takto:

al založení binarizačního práhu pro zpracování zobrazení,

- a2 - nastavení a . přezkoušení .zaostřování ..kamery pomocí- -------zpracování obrazu, a3 přezkoušeni orientace titrační misky (pro nastavení, ponechání a snížení hodnot koncentrace vzorků), • 'js . a4 měření první schránky, a5 až a7 měření libovolného nebo n-té schránky.

Obr. 16 představuje postupné snímání snímků na schránku, pro které se při praktickém provedení dosahuje maximálního časového intervalu 20 ms.

Obr. 17 ilustruje sekvenční ohodnocení, s místem Sl pro ohodnotitelný poloměr schránky, S2 pro označení souřadnic těžiště na obraze 1 a S3 pro označení souřadnic těžiště organismů v obraze n, které se stanovují zpracováním obrazu.

V následujícím stupni, označeném jako Ξ4, se stanovuje počet organismů a jejich střední rychlost výpočtem, za použití všech zobrazených hodnot.

Další sekvence jsou S5, která kombinuje všechny obrazy za vzniku výsledného zobrazení, jež obsahuje pouze uhynulé organismy, a sekvence Ξ6, která počítá uhynulé organismy pomocí zpracování tohoto zobrazení.

Stanovení, provedené v širokém rozsahu s toxickými látkami, se může zobecnit tak, že zahrnuje také prahové hodnoty, stimulaci prahu, prahové dávky a koncentrace.

Vedle toho použití mikroorganismů umožňuje výraznou úsporu experimentálních zvířat, protože se jejich počet může omezit v důsledku předcházejícího stanovení koncentrací látek, které se mají testovat.

Dá se přědpókTádat, žepředmět tohoto vynálezu je možné aplikovat také na další dosud netestované organismy, jako jsou hlístce (Nematoda), stejně jako na jiné organismy mikroskopické velikosti. .

Tento způsob může být kombinován s obvyklými způsoby analýzy, které umožňují, aby se zkrátilo trvání měřeni a aby platnost naměřených hodnot byla ještě více autentická, bez potřeby nákladnýchřad experimentů. ~

JUDr. Petr;

Claims (24)

1. PATEN TO V É NÁROKY

   1. Způsob stanovení toxicity látek rozpustných ve vodě nebo mísitelných s vodou, vyznačující se tím, že se stanoví změna mobilitý a/nebo velikosti alespoň dvou jedinců- jediného typu testovaného organismu ve-vodném prostředí při účinku přinejmenším jedné toxické látky během alespoň dvou časových intervalů, s.alespoň, jedním referenčním měřením a alespoň jedním dalším měřením prováděným po podání toxické látky. ' »
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že vzdálenost překonaná testovaným organismem za časovou jednotku se stanoví jako změna mobility.
3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že změna rychlosti testovaného organismu, za časovou jednotku se stanoví jako změna mobility.
4. 4. Způsob podle nároku 1,vyznačujíc i se tím, že stanovená toxicita se stanoví jako toxicita relativní.
5. 5. Způsob podlé nároků la 2, vyznaču jí c i se t i m, že se jako testovaný organismus použije Euphillipoda, jako je Artemia šalina nebo Streptocephalus proboscideus.
6. 6. Způsob podle nároků 1 a 2, v y z na č u j i ci, se t i m, že se jako testovaný organismus použije volně plovoucí rótatorie, jako je Brachionus calyciflorus nebo

   Brachionus plicatilis.
7. 7. Způsob podle nároků la 2, vyznačuj íc í se t i in, že se jako testovaný organismus použije perloočka, jako je Daphnia magna nebo Daphia pulex.

   i .7»w»iH ni .jíi iii il^. — i»t j Hiiilfciu·—i«I? . anw ’ » lιΜ<- ΜΤ·'*»-ι.Τ.ίι· ,w .XfcTJt -i .
8. 8. Způsob podle, nároku 5,. v y z n a č, u j í. c í se tím, že se jako vodné prostředí použije umělá mořská voda nebo sladká voda.

   ..
9. 9. Způsob podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že změna mobility a/nebo velikosti testovaného organismu se pozoruje pomocí mikroskopu. .
10. 10. Způsob podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že změna mobility a/nebo velikosti testovaného organismu se pozoruje na mikrotitrační misce.
11. 11. Způsob podle nároku 1 nebo 10,vyznačují c í se t í m, že změna mobility a/nebo velikosti testovaného organismu se pozoruje a hodnotí elektroopticky.
12. 12. Způsob podle nároku 11,vyznačuj ící se tím, že střední hodnota se vypočítá ze všech pozorovaných organismů během sťě'jněho~casovéhorozmezí aza stejných podmínek, jako míra změny mobility a/nebo velikosti testovaných organismů.
13. 13. Způsob podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že měření ve vodném prostředí se provádí poté co se teplota upraví na předem stanovenou konstantní hodnotu.

    - -25
14. 14. Způsob podle některého z nároků 1 až 13, v y značující se tím, že přimíchání toxických látek se provádí pipetováním, které se sleduje na stínítku obrazovky.
15. 15. Zařízení k provádění způsobu podle nároků 1 až

    13, v y z n a č u j i c í se tím, že sestává z jednotky (10) pro získání obrazu, která .v předem.stanovených.. časových intervalech, provádí zjišťování předmětu a následující zaznamenání polohy předmětu (100) v alespoň jedné rovině, přičemž jednotka (10) pro získání obrazu je spojena s vyhodnocovací jednotkou (10'), která sestává .z. počítače.. a zobrazovacího zařízení, které v závislosti na.přítomné toxicitě provádí statistické vyhodnocení, mobility,a/nebo velikosti organismů.
16. 16. Zařízení podle nároku 15, vyznačující se tím, že jednotka (10) pro. získání obrazu snímá;, obraz, v systému šedých odstínů, alespoň jedné skupiny testovaných' organismů (100). vyskytující se . za stejných podmínek a že - , _v. - _ připojená vyhodnocovací- jednotka- (10') -stanovuje·- binární černo bílé hodnoty z obrazu v systému šedých odstínů xa dovoluje sekvenční jednoobrazové ohodnocení s indikací okamžité polohy souřadnic testovaných organismů, z kterého počítač, porovnáním s dříve sejmutým obrazem a alespoň jednou formací kvocientu s časovým intervalem mezi dvěma obrazy, vypočítá relativní míru mobility a/nebo velikosti organismu.
17. 17. Zařízení podle nároku 15,vyznačuj ící se t i m, že na jedné straně vyhodnocovací jednotka (10’) označuje v obraze získané předměty, které mají relativní mobilitu odpovídající nule a na druhé straně je eliminuje v počítači.
18. 18. Zařízení podle nároku 15, vyznačuj ící. se t i m, že jednotka (10) pro získání obrazu je opatřena jedinou ČCD clonovou kamerou, která za identických podmínek je vedena stupeň po stupni nad příslušnou skupinou

    ........ . ,te s to váných „předmětů.. (100),. .......„..... _; .............., . . .......... /
19. 19. Zařízení podle nároku 15, vyznačuj ící setím, že jednotka (10) pro získání obrazu je opatřena dvěma CCD clonovými kamerami, umístěnými v příslušných _ optických osách, které tvoří s jednou jinou osou přinejmenším ostrý úhel a zjišťují pohýb a/nebo velikost testovaných organismů v.trojrozměrném uspořádání.

    1,·.
20. 20. Zařízeni podle nároku 15, vyznačující se t í m, že jednotka (10) pro získání obrazu je stacionární a že tato jednotka zjišťuje ve stejném čase několik skupin testovaných organismů (100), které se vyskytují za rozdílných podmínek, a pomáhá při jejich-vyhodnocení.
21. 21. Zařízení podle nároku 15, vyznačující se t í ni, že jednotka (10) pro získání obrazu je stacio- nární a několik skupin testovaných organismů, které se vyskytují za rozdílných podmínek, se vede přes jednotku (10) pro získání obrazu konstantní rychlostí a tak tato jednotka •(10) pro získání obrazu zjišťuje tyto skupiny postupně a pomáhá při jejich vyhodnocení.
22. 22. Zařízení podle nároku 20, vyznačující se t í ro, že skupiny testovaných organismů (100), které se vyskytují za rozdílných podmínek, se vedou pod jednotkou (10) pro získání obrazu v cirkulační sestavě.

    -27
23. 23. Použití způsobu podle některého z nároků 1 až 13, ke stanovení toxických účinků na vodní faunu.
24. 24. Použití způsobu podle některého.z nároků 1 až 13, ke stanovení účinků toxických látek, jako jsou insekticidy a pesticidy na ekologii.

    ..... __25.._ Použití způsobu podle některého z nároků 1·-až 13 y ke stanovení vedlejších účinků a kontraindikaee farmaceutických prostředků a potravin.