JPH09511576A

JPH09511576A - 毒性を測定する方法及び装置並びにその用途

Info

Publication number: JPH09511576A
Application number: JP7524271A
Authority: JP
Inventors: ポルトマン・ルドルフ; ロイマン・マチアス; トムメン・シュテファン
Original assignee: EIDGENOESS MUNITIONSFAB THUN
Current assignee: EIDGENOESS MUNITIONSFAB THUN
Priority date: 1994-03-19
Filing date: 1995-03-13
Publication date: 1997-11-18
Also published as: WO1995025955A1; EP0752101B1; ATE173541T1; US5789242A; CA2186001A1; FI963701A0; CN1148890A; NZ281565A; AU702860B2; FI963701A; NO963925D0; AU1752995A; BR9507108A; NO963925L; DE59504271D1; EP0752101A1; CZ275796A3

Abstract

(57)【要約】水溶性または水に混合可能な物質の毒性を測定するための方法は、物質の毒性作用に関する定量的な情報を得ることを目的とする。この方法は従来必要であった哺乳動物による実験の数を低減するために寄与する。この方法に従って、少なくとも２回の測定によって、水を含む媒体内での試験生物の少なくとも２個の個体の運動性およびまたは大きさの変化が、少なくとも一つの有毒物質の影響を受けながら測定される。方法を実施するための装置は像検出ユニットを備え、この像検出ユニットが対象の認識と、少なくとも一つの平面内での対象の逐次的な記録を、予め定めた時間インターバルで行い、像検出ユニットの後に、コンピュータとディスプレイ装置を備えた評価装置が接続配置され、この評価装置が生物の運動性およびまたは大きさを、既存の毒性と相対的に統計的に評価する。方法は特に、エコロジー、とりわけ水性動物相に対する毒の影響を測定するため、並びに製薬や食品の副作用や禁忌を確かめるために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】毒性を測定する方法及び装置並びにその用途本発明は水溶性または水に混合可能な物質の毒性を測定するための方法に関する。本発明は更に、この方法を実施するために適した装置と、方法の用途に関する。生き物は有毒物質の影響を受けてその活動性が損なわれることがよく知られている。これはこのような物質の存在を証明するのに充分であるがしかし、毒性の程度およびまたは物質を逆推論することはできない。そこで、本発明の課題は、物質の毒性に関する定量的な情報を与えることができ、必要な安全性検査の枠内での哺乳動物によって長時間かかる今日一般的な実験を減らすために寄与する方法を提供することである。更に、この方法の自動化を可能にし、その評価を合理化し、確実に実証することができる装置を提供すべきである。この課題は本発明に従い、水を含む媒体内での一種の試験生物の少なくとも２個の個体の運動性およびまたは大きさの変化が、少なくとも一つの有毒物質の影響を受けながら、少なくとも２つの時間インターバルで測定され、有毒物質を添加した後、少なくとも１回の基準測定と少なくとも１回の他の測定が行われることによって解決される。請求の範囲で使用される“運動性”の概念は、固体の状態の物理学から用いられ、試験生物の“運動活性”および特に“可動性”を表す。この試験生物は最も簡単な場合、水を含む媒体内で、単位時間あたりのその“場所の移動”として観察される。しかし、この運動性は試験生物の個々の器官の機能を観察することによって知ることもできる。個々の器官の運動性の高められた周波数から、特有の毒を推論することができる。この場合、生物の“場所の移動”は必ずしも影響を受けない。細胞の成長を妨げる物質の場合には、試験生物の観察または大きさの測定は、時間の関数として、特有の毒性の程度を表す。このような毒性の測定は運動性と平行に、しかも運動性から切り離して、同じ装置手段によって行うことができる。本発明では、物質の毒性を測定するために微生物を使用することができる。この場合、この微生物の変化時の個々の物質およびまたはその組み合わせの影響が測定される。このような測定により、病気の実験動物の必要な実験の数が大幅に減少する。測定の情報の信頼性を高めるために、同じような試験生物の、互いに分離した多数のグループを観察し、グループ毎に一緒に評価すると有利である。方法の他の利点は簡単であること、迅速に操作可能であること、および低コストであることである。しかし、毒性の概念は普通の意味の毒物作用に限定されない。生きている生物に対する認識可能なあらゆる作用（反応）に及ぶことができる。方法を実施するための装置は、像検出ユニットが設けられ、この像検出ユニットが対象の認識と、少なくとも一つの平面内での対象の位置の逐次的な記録を、予め定めることができる時間インターバルで行い、像検出ユニットの後に、コンピュータとディスプレイ装置を備えた評価装置が接続配置され、この評価装置が生物の運動性およびまたは大きさを、既存の毒性と相対的に統計的に評価することを特徴とする。簡単な場合には、像検出ユニットは機械的に摺動可能に形成され、検査すべき試料の上方へ案内される。運動性の変化として、請求項２に示すように、時間インターバルあたりに試験生物が進む距離が評価される。運動性の重要な値は、請求項３に記載した、速度値から算出される加速度によって得ることができる。本発明に従って検出される毒性は、請求項４に示すように、標準毒性に対する相対的な毒性である。運動速度の測定と加速度値の算出およびまたは生物の大きさの変化の測定は、装置コストに応じて、一平面内でも三次元的にも行うことができる。その結果として、簡単な方法で、高等生物でも物質の作用を示す測定曲線を記入することができる。本発明では好ましくは、試験生物として下等動物が使用される。そのために特に、水生の生物が特に適している。なぜなら、その運動性を簡単に観察することができるからである。アルテミアサリナノープリウス(Artemia salina Nauplia) を用いた試験の実施は、四季によっても影響を受けないし、餌の供給や飼育にも影響されない。周囲温度と時間のファクターによってのみ影響を受けるので、プロフェッショナルな試験手段として自動化された方法進行だけが適している。標準温度に対して周囲温度が上昇することにより、試験生物の運動性の増大が経験により確認された。再現性のある結果を得るために、２２℃±１℃で測定を行い、標準化することが推奨される。この値は装置手段によって比較的に容易に一定に保たれ、更に長時間の観察時の多量の蒸発または水蒸気発生を防止する。アルテミアサリナは困難な製造条件で嚢子（前の嚢胚状態で留まる卵）を形成し、多数年にわたって保存される。これに応じて、請求項５に記載したように、特に（約0.9〜1.15ｍｍの大きさの胚の段階３，４の）アルテミアサリナノープリウスのような真葉足類(Euphyll opoda)を使用して、海水中で試験を行うと、非常に合目的である。同様に、請求項６記載の自由に浮遊する輪虫類（プロイマ ploima）を使用することができる。例えば発癌性の物質を検査する場合の特別な試験のためには、請求項７記載の水ノミ（技角類 Cladocera）が適している。なぜなら、二世代にわたって簡単に観察することができるからである。アルテミアサリナが海水動物であるので、請求項８による人工的な海水は測定のための適切な環境である。毒性の物質と海水およびまたは水道の水との制御できない反応を防ぐために、ナトリウム重炭酸塩を有する蒸留された水からなる人工の淡水中の鰓脚類のエビを使用すると有利である。同様に、人工的に作られた海水の使用が推奨される。タードボーレ(tadpole)等のような他の生物も本発明に従って使用可能である。試験生物の運動性の測定は請求項９に従って、顕微鏡を用いて純光学的に行うことができる。この場合、毒性物質の影響を受けた状態で、試験生物の運動性の遅延およびまたは不活性を観察することができる。勿論、顕微鏡によるこの測定は少数の試料の場合でも可能であるが、安全性や標準化の理由から、自動化された試験手段を使用することが推奨される。方法の好ましい実施形では、請求項１０に記載したように、例えば（今まで公開されていない）スイス国特許出願第０３１４１／９３−６号明細書に記載されているようなマイクロ滴定トレーを使用して測定が行われる。有利な電子光学式機器分析のために、請求項１１では、上記の容器内で、検出すべき水溶性物質が水または人工の海水に溶かされ、試験生物が添加され、その反応が電子的に評価される。その際、試験生物の運動性の変化は容器毎に平均値を求め、以前に既に検出した値と比較される。適当な相関性は請求項１２に従って、既存の毒性についての量的な情報を与える。上記の試験は、請求項１３に記載したように、常に同じ条件で行うと合目的である。なぜなら、結果が温度によって左右されないからである。方法の進行は請求項１４に記載した体系的なピボット供給によって最適化される。それによって、潜在的なエラー源が充分に除去可能である。方法を実施するための装置は、普通のＥＤＶ手段によって、観察された像の簡単な評価を可能にする。請求項１６に記載した、時間インターバル当たりおよび像毎の進んだすべての距離の商を求めることにより、試験成分の相対的な平均速度が算出可能であるかあるいは第２の推論によってその加速度が算出可能である。動く対象と動かない対象の間の違いは特に重要である。なぜなら、多数の試験生物が観察時間の間脱皮し、この剥がれた皮がエラーを検出することになるからである。他方では、請求項１７に従って、既に死んだ動物を確認し、計算から除去しなければならない。方法を実施すために特に、請求項１８記載のいわゆるＣＣＤ−シャッタ−カメラが適している。なぜなら、目下、このようなカメラだけが充分にシャープで評価可能な像を提供することができるからである。請求項１９で提案された２台のカメラの構造により、試験生物の動きを三次元的に観察および測定することができる。充分に大きな装置コストの場合、すなわち適切なカメラの使用時および充分に大きな像データメモリおよび迅速なコンピュータの場合、基本的には、試験装置内にあるすべて試験生物を同時に撮影し、個々に評価することができる（請求項２０参照）。試験生物の合理的な自動観察および評価は、請求項２１または２２の記載によって実現可能である。この場合、使用される搬送機構が振動を生じないで作動することが前提である。請求項２３〜２５に記載した用途は、環境保護または食料品技術および製薬産業の実際の要求に関する。勿論、生物学の他の分野に関する他の用途も考えられる。アルテミアサイナノープリウスによって詳細に説明したような毒性検出は、水を含む媒体内の物質、すなわち水溶性物質や例えばアセトンのような溶解の媒介物によって水に溶ける物質から、毒を浄化することを可能にする。しかも、請求項２３〜２５に記載したように、水生動物相に対する物質の有毒作用、特に殺虫剤や農薬の有毒作用を逆推論することを可能にする。更に、同じ時間インターバルでの周期的な測定によっておよび毒物量の濃度を高めることにより、致死量曲線を記録することができる。この致死量曲線は有害物質の種類に関する逆推論を可能にし、有害物質または有害物質の組み合わせの作用メカニズムを究明するために役立つ。次に、図に基づいて本発明の実施の形態を詳しく説明する。図１は、試験生物の運動性を測定するための、特徴的な試験生物を有する電子光学式像検出ユニットの概略図、図２は像検出ユニットと評価装置を備えた機器の全体図、図３は、正面の板に対して垂直方向に見た、図２の機器キャビネットの部分断面図、図４は、正面の板に対して平行に見た、図２の機器の部分断面図、図５は６個の試料トレーを収容するための滴定トレー装置を示す図、図６は試験生物の運動性を自動的に測定するためのプログラム進行を示すフローチャート、図７は１０時間にわたって観察された、三つの有毒溶液内での生きている試験生物の平均速度の時間的な低下を示す図、図８はパラオキソン(Paraoxon)溶液内のアルテミアサリナによる毒性テストを示すグラフであり、横座標には濃度が、縦座標には死んだ生物の割合が記入してある。図９はパラオキシン濃度の関数としての試験生物の速度が、重ね合わされた致死量曲線と共に示してある、他の毒性検査を示す図、図１０は観察の開始時の水を含む媒体内で生きている試験生物のグループのビデオ撮影を示す図、図１１は媒体の一部が蒸発している、２４時間後の図１０のまだ生きている試験生物のグループの他のビデオ撮影を示す図、図１２は試験生物の測定の準備、実施および評価を示す活動／時間グラフ、図１３は図１２のグラフによる６個までの滴定トレーの測定を示す図、図１４は各々のトレーのために１０分までの時間が許容される、１０個までのトレーの測定を示す図、図１５はトレーの測定の時間インターバルで示した、逐次的に進行する個々の測定を示す図、図１６は個々の測定の間の時間がカメラの搬送機構によって決まる、個々の容器の測定のためのインターバルを示す図、そして図１７は滴定トレー内の個々の容器を評価可能に記録するために必要なすべての進行の逐次評価を示す図である。図１において、ビデオカメラ（ＣＣＤシャッタカメラ；ソニー社、ＸＣ−７７ＲＲ−ＣＥ型）が１で示してある。電子式カメラ１に装着した光学系２は拡大レンズ（ソニーのＣＭ５０型）である。ビデオカメラ１はＣ−アーム４ａ〜４ｃに取付けられた２個の支持体３，３′上にそれ自体公知のごとく配置されている。Ｃ−アームは市販の位置決めユニット５に載っており、この位置決めユニットは例えば、ステッピングモータを有する２個の送りユニットを備えたＸＹテーブル (ISEL Automation 社 D-6419 Eiterfeld)である。このステッピングモータはＸ方向に４００ｍｍまたはＹ方向に３００ｍｍの変位を生じる。光学系２と光分配器６と間には、アルテミアサリナ(Artemia salina)１００で示した試料Ｐがあり、この試料は光透過法で観察される。カメラ１の光学系２の垂直方向上方において光分配器６がＣ−アームに設けられている。この光分配器には光導体７を経て図示していない光源から光が供給される。ビデオ信号ＶＳは信号導体９を経て上方へ案内される（図３，４参照）。試験生物を観察および評価するための装置全体は、図２において１０で示した像検出ユニットおよび評価ユニット１０，１０′内にまとめられている。機器キャビネット１１内の試料室には２個のドア１２ａ，１２ｂから標本を供給可能である。機器キャビネット１１上には、普通のモニター１４を備えたパーソナルコンピュータ（ＰＣ）の市販の中央ユニット１５が設けられている。ＰＣの隣りには、回転可能なスタンド上に他のモニター１３が設けられている。この他のモニター１３は機器キャビネット１１内にあるビデオカメラによって撮影された像を表示する。機器キャビネット１１上には、機器を操作するために必要な図示していない操作機器および入力機器（キーボード、マウス等）のための載せ面１６が設けられている。図３の断面図は機器キャビネットの内部を示している。この場合、ドア１２ａ，１２ｂ（図２参照）の位置で切断されている。ここでは、図１に示すＣ−アーム４ａ，４ｂ，４ｃとその構成部品および位置決めユニット５および光導体７が再び示してある。この光導体は普通の光源８に接続されている。ドア１２ａ，１２ｂからアクセス可能な試料室２０内には、試験生物を有する試料を収容する滴定トレー装置２１が設けられている。装置全体に市販の遮断されない給電装置２２から電流が供給される（図３，４参照）。位置決めユニット５の制御のために必要なすべての信号は制御装置２３内で発生する。ビデオ信号ＶＳは制御コンピュータ１５内の普通のカメラ制御装置に導かれる。プリンタ、プロッタのような、ＰＣに接続可能な周知の周辺機器は図示していない。図５には試料室２０内に設けた滴定トレー装置２１がその主要な構成部品と共に示してある。滴定トレー装置２１は機器キャビネット１１にねじで固定された、開口２４を有するフレームからなっている。この開口には、各々９６個の容器を有する６個のマイクロ滴定トレー２４．１〜２４．６を挿入可能であり、この容器はそれぞれ試験生物（約１２個のアルテミアサリナを有する試料を一つずつ含んでいる。図示していない保護カバーが塵埃の作用およびまたは熱放射による試料干渉を防止している。更に、蒸発作用を低減するために、個々の滴定トレーは透明な合成樹脂によって被覆されている。上記の装置によって、試験生物の運動性を測定することができる。これは試験溶液内での生物の前進速度を測定することによって簡単に行われる。この場合、相対速度は（有毒物質を含まない）制御溶液に関連づけられる。使用者は一連の試験を進める際に好ましくはＰＣプログラムによって指導される。このＰＣプログラムは濃度（モルまたはパーセント）と平行測定、無負荷値、制御装置およびその配置と、多容器装置のそれぞれの容器内の試験片の配置について質問する。更に、プログラムは試験物質の名前、その分子量、試験可能な最高濃度および線形または対数の一連の希釈の選択に関するデータを要求する。試験のための全体容積、試験生物（例えばアルテミアサリナ）または試験物質を加える容積を入力した後で、プログラムは試験のために必要な試験物質の量を計算する。計量された量を検出した後で、プログラムを進めて、必要な希釈を直接行うことができる。モニタースクリーンの光学的な補助によって、ピペット供給が容易になる。有利な海水溶液は１００ｍｌの蒸留水に、２８００ｍｇのＮａＣｌと、３４２ｍｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏと、２３４ｍｇのＭｇＣｌ₂／６Ｈ₂Ｏ、１２２ｍｇのＣａＣｌ₂／２Ｈ₂Ｏと、２０ｍｇのＮａＨＣＯ₃と７４ｍｇのＫＣｌを含んでいる。最初のステップで、電子光学的な測定によって、試験生物の数が測定される。この試験生物は検査すべき物質を混合した人工的な海水溶液内にある。生物に対する物質の影響の観察は、予め定めた時点で、図示した像分析装置を介して行われる。この観察は次の判断基準を検出することができる。 − 生物の数、 − そのうちどれ位がもはや活動的ではないかの測定、 − 平均速度または相対移動速度の検出、 − 生物の平均的な大きさ（相対的な面積）、生物の個別的な、位置に依存する表面積の図心。電子光学的な測定は基本的には次のように行われる。試料が上記の自動分析装置内の、試験物質を含むマイクロ滴定トレー内に置かれる。予め定めた測定時間で電子カメラがマイクロ滴定トレーの個々の測定場所の下方を移動し、１２〜３６枚の像を撮影する。同時に、それぞれの試料が上側から光を照射される。この像がシャープになるようにするためには、シャッタースピード制御装置を備えたカメラで取らなければならない。このカメラのレンズは、一方ではフレーム全体で像を撮影し、他方では液体の深さ（約１ｃｍ）全体にわたって像がシャープになるように設計されている。照明は光分配器を介して行われる。この光分配器はＣ−アームに固定され、カメラと共に平行に移動する。解像度は、最少の画素で全部の分析を行うことができるように最適化される。これは、像分析のための計算時間をできるだけ遅くすることを可能にする。２５６×２５６の画素の解像度が選択される。この解像度は、生物の輪郭をはっきりと識別することを可能にする。その際、（９６個の容器を備えた）マイクロ滴定トレーあたり約３分、すなわち測定場所あたり約２秒の測定および評価時間が達成される。データは測定終了後フロッピィディスクに記憶され、ＰＣプログラムで直接評価可能である。その際、データは更にグラフで示され、特有の毒性値が直接検出される。このデータは、いつでも比較のために供されるようにデータバンクに記憶される。液体試料の上記の機器分析を行うために、透明な材料からなるマイクロ滴定トレーが使用される。異なる物理特性を有する二つの材料からなる多容器構造体によって、液体の表面の表面張力を調節すことができるので、この液体表面は少なくともほぼ平らである。その際、多容器構造体の底は透明な材料（スイス国特許出願第０３１４１／９３−６号）、例えばポリスチロールまたはポリスチロールの共重合体で作られ、壁はメニスカスを形成しないかあるいは蛋白質を吸収しない透光性材料、例えばポリオレフィンまたはポリテトラフルオルエチレンで作られる。図１〜５の示した装置で実施された上記のプログラム進行は、図６から推察することができる。この場合、スタートはＳｔで、プログラム終了はＲＥＳ＝結果で示してある。スタート後、一定の時間インターバルΔｔで一連の像が撮影され、しかもオンラインで撮影が行われる。この場合、値は公知のごとく２値化され、バッファメモリに記憶される。これはＢ−Ｓで示してある。続いて、液体レベルに依存して測定窓半径が決定される。これはＲｏで示してある。次のステップでは、対象が表示され、測定窓内のすべての像の対象パラメータが決定される。すなわち、各々の容器の対象の図心座標、相対的な面積、外周および視覚的に（電子的に）確認可能な穴の数が、識別のために測定される。Ｏ− Ｐ１。その後、すべての像において許容されない対象が除去される。この場合、面積と外周の許容される絶対値によって判定基準がプログラミングされる。ＯＥ−１。そのとき、すべての結果像データについて一連の像あたりの試験生物の数が検出される。これＯ−ＣＬ＝対象計数と呼ばれる。これは像あたりの生きている生物の全部の数に一致する。前に検出されたすべての像データから生物の速度を測定することにより、平均値が求められる。この値は図６においてＯ−ｖ＝生物の平均速度で示してある。この場合、生物のシルエット内の面の図心のそのときの座標が測定基準として役立つ。続いて、画素をベースとした像がその座標ｘｉ，ｙｉで生じ、数１が動かない死んだ対象を意味するよう正規化される。その際、残りのすべての画素ｘｉ，ｙｉは零（＝０）にセットされる。この方法ステップはＲ（ｘｉ，ｙｉ）で表される。更に、ＯＰ−２の下で、対象の表示と、測定窓内のすべての像の対象パラメータの測定が行われる。すなわち図心座標、相対的な面積、容器内の対象の数と外周が行われる。その後、すべての像において許容されない対象が除去される。この場合、面積と外周の許容される絶対値によって判定基準がプログラミングされる。ＯＥ−１。その後、結果像内の死んだ対象が数えられる。Ｏ−ＣＤ。ＲＥＳの下で、結果の評価が統計的方法で公知のごとく行われる（プロビット法等）。図７に示すように、選択された三つの公知の有毒溶液に含まれるフェノバルビタールをＰｈで、アンフェタミンスルファートをＡｍで、そしてＤ−プロポキシフェンをＰｒで示した。アルテミアサリナの単位時間あたりの位置の移動は平均速度ｖで検出され、記録された。制御溶液、すなわち次に説明する人工の海水からなる溶液内で、アルテミアサリナの５・１０^-3〜６・１０^-3ｍ／ｓの代表的な平均速度が確認された。図７から判るように、Ｄ−プロポキシフェンの場合、１０時間にわたる相対的な線形の速度低下は元の速度の約８４％である。アンフェタミンスルファートの場合には、元の速度の約６５％に速度が低下し、フェノバルビタールの場合には約８０％に低下した。これから、毒性等価ファクター（有毒物質の種類または群またはクラス）に応じて特有の速度低下が認められることが判った。これは、個々の物質や組み合わせ物質の認識に役立つ重要な作用として用いることができる。生物に対する物質の作用に応じて、像の適切な評価と測定方法の適合によって測定の有意性を最適化することができる。例えば前進運動速度の観察の代わりに、生物の個々の器官の特有の運動性を観察することができる。更に、周期的な運動は速度測定からの最初の推論によって強調または簡単に検出および分析することができる。パラオキソンの毒性を測定するための実際の例図８において、死んだ生物の割合Ｚは測定の開始時の１００％から計算してある。パラオキソンの濃度Ｃが増大すると、Ｚが上昇する。この種の評価は有毒物質のＬＣ₅₀値の周知の測定を可能にする。死んだアルテミアサリナの数は試験生物の速度の測定に基づいて上記の方法で計算される。この場合、速度零が死んだ生き物を意味する。図８に示したカーブは、絶対値の三つのオーダーの、人工海水中のパラオキソンの濃度範囲に対する、独立した４回の試験の平均値である。温度が２２℃のときの測定されたＬＣ₅₀値の平均値は、３３％の最大のばらつきで５．９・１０^-5 モル／ｌであった。図９は、濃度を増大させてパラオキソン溶液を添加した後３０分で測定した、複数の試験のアルテミアサリナ試験生物の速度ｖを示している。ここでは、速度の２か所の大幅が低下が図示してある。約１・１０^-4モル／ｌのときの第２の低下は、ＬＣ₅₀値に一致する。このＬＣ₅₀値は重ね合わせた致死量カーブから推察可能である。第１の大幅な速度低下はパラオキソンの約１・１０^-6モル／ｌのときであり、 “有効濃度”ＥＣ₅₀に相当する。これは有毒物質の機能の表示として役立つ。特有のビデオ撮影は図１０（試験の開始時）と図１１（２４時間後の試験の終わり）から明らかである。第２の撮影時に、死んだ生き物、すなわち動かない生き物はそれ自体公知のごとく、電子的に隠蔽され、従って図２のモニターでは見えない。図１１には更に、半径Ｒｘが二点鎖線で記入してある。この半径は測定窓半径を縮小する液体の蒸発を意味する。技術的な方法の進行のその他の詳細は図１２〜１７から推察することができる。この場合、図１２の活動／時間グラフは方法の全体の進行を示している。このグラフは個々の段階においてＩ〜Ｖで示してある。この場合、方法のステップは横座標のその時間のオーダーから読み取ることができる。その際、Ｉは滴定トレーに試料を供給するためのＰＣの“セットアップ補助”によって行われる一連の測定の準備を意味し、ＩＩは監視プログラムのスタート値の較正を意味し、ＩＩＩは有毒物質の供給を意味し、ＩＶは監視プログラムによる一連の測定の撮影を意味し、Ｖは統計的な分析方法と従来の測定との対比を行う一連の測定の評価を意味する。次の図１３〜１７はすべて、方法ステップＩＶに関する。これは見やすくするためにそれぞれ活動／時間グラフで記入してある。図１３は６個までの滴定トレーの一連の方法の撮影時の代表的な進行を示している。この場合、２４時間の間、“時間毎”に測定される。この一連の測定は図１２において位置ＩＶに相当する。図１４は位置ＩＶ（一連の測定の撮影）を詳細に示している。個々の滴定トレーはここではＰ１０１〜Ｐ１０６で示してある。最長測定時間は実際には１０分に制限されている。図１５から、測定の間の個々の方法ステップを推察することができる。その際、ａ１は像を処理するための２値化しきい値のセットを意味し、ａ２は像の処理によるカメラの焦点合わせまたは焦点検査を意味し、ａ３は（試料の低下する濃度の固定および考慮のために）滴定トレーの方向の検査を意味し、ａ４は第１の容器の測定を意味し、ａ５〜ａ７は任意のまたはｎ番目の容器の測定を意味する。図１６は容器あたりの逐次的な像撮影を示している。そのために実際には、最大２０ミリ秒の時間が設けられる。図１７は逐次的な評価を示し、容器の評価可能な半径はＳ１で示され、すべての試験生物（像１）の図心座標と像ｎのすべての生物の図心座標はＳ２で示されている。この座標は像処理によって決まる。Ｓ４で示した次のステップでは、生物の数と平均速度はすべての像データから計算によって求められる。次のステップＳ５ではすべての像が組み合わせられて一つの合成像が作られる。この合成像は死んだ生物だけを含む。次のステップＳ６では像処理によって死んだ生物を数える。有毒物質に基づいて実施された試験は、一般的に、しきい値、刺激域、しきい線量および濃度の測定に及んでいる。微生物の使用は更に、試験動物のかなりの節約を可能にする。なぜなら、試験動物の数が試験すべき濃度を予め測定することによって制限可能であるからである。本発明の対象物は、今まで試験されなかった線虫（糸状虫）のような他の生物や、マイクロ分野の他の生物に適用することができる。同様に、方法は慣用の分析方法と組み合わせることができる。従って、測定時間が短縮され、コストのかかる実験を必要とせずに、測定の有効性が一層強化される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロイマン・マチアススイス国、ツェーハー−8484 ヴァイスリンゲン、ライジビュエル、54 (72)発明者トムメン・シュテファンスイス国、ツェーハー−8302 クローテン、ディートリッカーストラーセ、44

Claims

【特許請求の範囲】１．水溶性または水と混合可能な物質の毒性を測定するための方法において、水を含む媒体内での一種の試験生物の少なくとも２個の個体の運動性およびまたは大きさの変化が、少なくとも一つの有毒物質の影響を受けながら、少なくとも２つの時間インターバルで測定され、有毒物質を添加した後、少なくとも１回の基準測定と少なくとも１回の他の測定が行われることを特徴とする方法。２．時間インターバルあたりに試験生物が進む距離が運動性の変化として評価されることを特徴とする請求項１記載の方法。３．時間インターバルあたりに測定される、試験生物の速度の変化が、運動性の変化として評価されることを特徴とする請求項１記載の方法。４．検出された毒性が相対的な毒性として評価されることを特徴とする請求項１記載の方法。５．アルテミアサリナ、連鎖セファラスプロボスシデウス(Streptocephalus)のような真葉脚類(Euphillipoda)が試験生物として使用されることを特徴とする請求項１，２記載の方法。６．ツボワムシカリシフロラス(Brachionus calyciflorus))またはツボワムシプリカチリス(Brachionus plicatilis)のような自由に浮遊する輪虫類(Rotatoria) が試験生物として使用されることを特徴とする請求項１，２記載の方法。７．ミジンコマグナ(Daphnia magna)またはミジンコプレックス(Daphnia Pulex) のような水ノミが試験生物として使用されることを特徴とする請求項１，２記載の方法。８．人工の海水または淡水が水を含む媒体として使用されることを特徴とする請求項５記載の方法。９．試験生物の運動性およびまたは大きさの変化が顕微鏡によって観察されることを特徴とする請求項１〜８に記載の方法。 10．試験生物の運動性およびまたは大きさの変化がマイクロ滴定トレー内で観察されることを特徴とする請求項１〜９に記載の方法。 11．試験生物の運動性およびまたは大きさの変化が電子光学的な方法で観察および評価されることを特徴とする請求項１〜１０に記載の方法。 12．試験生物の相対運動性およびまたは大きさを示す度合いとして、同じ時間インターバル内でかつ同じ条件で観察されたすべての生物の平均値が計算されることを特徴とする請求項１１記載の方法。 13．水を含む媒体内での測定が、温度を所定の一定値に調節した後で行われることを特徴とする請求項１〜１２に記載の方法。 14．有毒物質の添加が、ディスプレイスクリーンを介して制御されるピポット供給によって行われることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。 15．請求項１〜１３の方法を実施するための装置において、像検出ユニット（１０）が設けられ、この像検出ユニットが対象の認識と、少なくとも一つの平面内での対象（１００）の位置の逐次的な記録を、予め定めることができる時間インターバルで行い、像検出ユニット（１０）の後に、コンピュータとディスプレイ装置を備えた評価装置（１０′）が接続配置され、この評価装置が生物の運動性およびまたは大きさを、既存の毒性と相対的に統計的に評価することを特徴とする装置。 16．像検出ユニット（１０）が同じ条件下にある試験生物（１００）の少なくとも一つのグループのグレースケール像を撮影し、後続配置された評価装置（１０ ′）がこのグレースケール像から２値の黒／白値を算出し、かつ試験生物のそのときどきの座標位置を表示することによって逐次的な個々の像の評価を行い、この座標位置から、コンピュータがその前に撮影した像と比較することによっておよび所定の時間インターバルで両像の間の少なくとも一つの商を求めることによって、生物の運動性およびまたは大きさの相対的な程度を計算することを特徴とする請求項１５記載の装置。 17．評価装置（１０′）が像において相対運動が零である検出された対象に印しをつけ、この対象をコンピュータ内で除去することを特徴とする請求項１５記載の装置。 18．像検出ユニットが１個のＣＣＤ−シャッタ−カメラを備え、このカメラが同じ条件下で試験対象（１００）のその都度のグループの上方にタクト的に案内されることを特徴とする請求項１５記載の装置。 19．像検出ユニット（１０）が２個のＣＣＤ−シャッタ−カメラを備え、このカメラの光軸が互いに少なくとも鋭角をなし、カメラが試験生物の運動およびまたは大きさを三次元で検出することを特徴とする請求項１５記載の装置。 20．像検出ユニット（１０）が定置され、この像検出ユニットが異なる条件下にある複数のグループの試験生物（１００）を同時に検出し、評価部に供給することを特徴とする請求項１５記載の装置。 21．像検出ユニット（１０）が定置され、異なる条件下にある複数のグループの試験生物（１００）がこの像検出ユニットのそばを連続的な速度で通過し、像検出ユニット（１０）がこのグループを逐次検出し、評価部に供給することを特徴とする請求項１５記載の装置。 22．異なる条件下にある試験生物（１００）のグループが、像検出ユニットの下方で円状に案内されることを特徴とする請求項２０記載の装置。 23．方法が水性動物相に対する毒性作用を測定するために使用されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一つにつ記載の方法の用途。 24．方法が、エコロジーに対する、殺虫剤や農薬のような有毒物質の影響を測定するために使用されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一つにつ記載の方法の用途。 25．方法が製薬と食品の副作用および禁忌を測定するために使用されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一つにつ記載の方法の用途。