JP2016513237A - 細胞老化を評価するための方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、経時的に生物集団の移動度の変化を決定するための方法であって、a)第1の時点(T1)で集団の第1の画像(I1)を得るステップ、b)第2の時点(T2)で集団の第2の画像(I2)を得るステップ、c)I1とI2の間の絶対差(ΔD1)を計算するステップ、d)第3の時点(T3)で集団の第3の画像(I3)を得るステップ、e)第4の時点(T4)で集団の第4の画像(I4)を得るステップ、f)I3とI4の間の絶対差(ΔD2)を計算するステップ、及びg)ΔD1とΔD2の間の変化を計算し、全体として集団の移動度の変化を計算するステップを含む方法に関する。【選択図】図４

Description

本発明は、モデル生物、例えばカエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)(C.エレガンス)などの経時寿命(chronological lifespan: CLS)を評価するためのハイスループット法に関する。
C.エレガンスは、老化に使用される、十分に研究されているモデルであり、老化に寄与する基本的なプロセスの分析だけでなく、老化に関連した疾患の分析においても利用されている。寿命評価の従来の技術は、C.エレガンスの同期した老化集団の手作業の調査と、個々の物理的刺激によってなおも生き続けている集団の割合の評価を伴う。このようにして蓄積されたデータを経時的にプロットし、経時寿命(CLS)プロファイルを作製することができる。この方法には、時間がかかり、主観的であり、人的エラーを受けやすいという欠点がある。
米国特許出願公開第2008/0304732号に記載されているものなどの細胞の動きを特徴付けるための自動化方法が開発されている。しかしながら、これらの方法は、複雑な画像デコンボリューションとデータ分析を実施するために、かなりのコンピュータ処理能力と時間を必要とする。
英国特許出願公開第2479628号は、生物学的対象物の動きを追跡するための方法を開示している。この方法は、経時的に単一の生物学的対象物の動きを追跡することを可能にする、基準画像からのいくつかの画像の逐次減算を含む。
米国特許第5,789,242号は、経時的に集団内の個々の生物の移動度の変化を測定することによって、水溶性物質の毒性を決定するための方法を記載している。
国際公開第2007/042044号は、体外受精用に胚を選択する方法として、経時的に細胞集団の変化を決定するための方法を記載している。
米国特許出願公開第2008/0304732号 英国特許出願公開第2479628号 米国特許第5,789,242号 国際公開第2007/042044号
生物集団の移動度を決定するためのハイスループット自動化法の開発は、老化実験において非常に有利となる。本発明者らは、所定の集団の移動度を調べることによって、モデル生物の経時寿命を評価するために使用することができるこのような方法を開発した。次に、移動度を定量し、群内の生物数の割合として表して、移動度係数(MoCo)を得ることができる。
本発明の第1の態様において、経時的に生物集団の移動度の変化を決定するための方法であって、
a)第1の時点(T1)で集団の第1の画像(I1)を得るステップ、
b)第2の時点(T2)で集団の第2の画像(I2)を得るステップ、
c)I1とI2と間の絶対差(ΔD1)を計算するステップ、
d)第3の時点(T3)で集団の第3の画像(I3)を得るステップ、
e)第4の時点(T4)で集団の第4の画像(I4)を得るステップ、
f)I3とI4の間の絶対差(ΔD2)を計算するステップ、及び
g)ΔD1とΔD2の間の変化を計算し、全体として集団の移動度の変化を計算するステップ
を含む方法が提供される。
当業者には、本方法のステップd)〜g)が、経時的に集団の移動度の変化を計算するために、更なる時点で繰り返すことができることは明らかである。
本明細書で使用するとき、移動度という用語は、生物集団のメンバーの運動を指す。
移動度という用語は、本明細書で使用されるとき、集団内の生物の運動の速さ(velocity)又は速度(rate)の測定を必要としないことが理解される。経時的な、集団を形成する生物の速さの相対的変化の測定は、特許請求の範囲に記載された方法には必要とされない。さらに、移動度という用語は、集団内の個々の生物の移動度を指すものではなく、全体としての集団の移動度を指す。
一実施形態において、移動度は、二次元における、好ましくは固体培地上での、生物集団の運動を同定することを指す。本発明の好ましい実施形態において、生物は、培地中で固定されていないが、自由に移動することができることは理解される。
当業者は、生物集団の移動度が、集団の生存率と同等であり得ることを理解する。当業者は、生物の老化として、一般的に、生物は、移動性が低くなり、死に際して完全に運動を停止することを理解する。集団レベルで行われる場合、経時的な全移動度の変化は、集団の生存率と同等であり得る。
ΔD1が、第1の時点(例えば、0日目)での集団の移動度であることは明らかである。さらに、ΔD2が、第2の時点での集団の移動度であることは明らかである。当業者は、ΔD1とΔD2の間の移動度の変化が、その期間にわたる集団の生存率の変化と同等であることを理解する。
ΔDのサイズは、画像化された全集団の移動度に比例するものであり、適切な画像対、例えば、第1の画像(l1)と第2の画像(l2)を比較し、それらに由来したマトリックス(すなわち、画素強度の表に変換された画像)間の差を、その全体としての集団に対して計算することによって計算されることが理解される。2つのマトリックス間の差からの絶対値(すなわち、負の値が正の値に変換される)が合計される。この値を平均信号入力(画像I1とI2の強度の平均合計)で除し、それぞれのプレートにおける蠕虫の数のいずれかの変動を考慮する。この値は、本明細書において、移動度係数(MoCo)として定義され、移動性である画像化された集団の比率（proportion）の尺度である。集団を形成する生物の位置は、場合により、マトリックスを比較することによって間接的に比較されてもよい。該方法は、それぞれ個々の生物の位置又はそれぞれの生物が移動した場所の計算に依存せず、あるいは個々の生物が移動した距離の測定に依存しないことが理解される。該方法は、第1の画像と第2の画像の間の絶対差を計算すること、すなわち、どれだけ多くの生物がそれらの開始位置から移動したかを計算することを含む。これは、経時的に全集団の相対的移動度を計算するための方法を可能にし、ハイスループットスクリーニング法の開発を可能にする。さらに、この方法を用いて、定量的な移動度データは、画像の比較から得られることが理解される。
本方法は、全体としての集団の位置の絶対的変化の測定に関し、集団内の1つ以上の個々の生物の別々の分析に関するものではないことが理解される。
一実施形態において、I1とI2(及びいずれかの続く画像対、例えば、I3とI4)の間の時間は、好ましくは、約100ミリ秒〜約5分、約140ミリ秒〜約3分、約200ミリ秒〜約90秒、約300ミリ秒〜約1分、約400ミリ秒〜約45秒、約500ミリ秒〜約30秒、約600ミリ秒〜約15秒、約700ミリ秒〜約10秒、約750ミリ秒〜約5秒、約800ミリ秒〜約3秒、約850ミリ秒〜約2秒、約900ミリ秒〜約1秒又は約1秒〜約2秒である。
第2の実施形態において、I1とI2(及びいずれかの続く画像対、例えば、I3とI4)の間の時間は、好ましくは、約500ミリ秒、約800ミリ秒、約1秒、約2秒、約3秒、約4秒、約5秒、約6秒、約7秒、約8秒、約9秒又は約10秒である。最も好ましくは、約1秒である。
当業者には、2つの画像間で経過し得る時間量は、生物集団のメンバーがその合間にどのくらい遠くに移動するのかを決定付けることは明らかである。
I1とI2(及びいずれかの続く画像対、例えば、I3とI4)の間の時間は、本方法において使用される生物に依存して変化してもよいことは当業者に理解される。時間は、開始位置からの生物の運動を可能にするのに十分でなければならないが、集団における別の生物の開始位置に生物が移動し得るには十分に長くないことが理解される。
当業者には、I1とI2の間の時間及びI3とI4の間及びいずれかの続く画像対の時間は同じでなければならないことは容易に明らかである
当業者には、I2とI3の間の時間はいずれかの適切な時間であり得ることは明らかである。
時間は、試験対象の生物の寿命に応じて、いずれかの適した期間であり得ることは理解される。
一実施形態において、I2とI3の間の時間は、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約1日間、少なくとも約2日間、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間又は少なくとも約12日間である。好ましくは、少なくとも約1日間、より好ましくは少なくとも約2日間及び最も好ましくは少なくとも約4日間である。
1つの好ましい実施形態において、ΔD1は、0日目に得られた画像から計算され、ΔD2は、4日目に得られた画像から計算される。l1とl2の間及びl3とl4の間の時間は、好ましくは1秒である。
さらに好ましい実施形態において、ΔD1は、0日目に得られた画像から計算され、ΔD2は、6日目に得られた画像から計算される。l1とl2の間及びl3とl4の間の時間は、好ましくは10秒である。
さらに好ましい実施形態において、ΔD1は、0日目に得られた画像から計算され、ΔD2は、6日目に得られた画像から計算される。l1とl2の間及びl3とl4の間の時間は、好ましくは1分である。
更なる実施形態において、経時的に移動度の変化を測定する場合、経時寿命プロファイルが計算され得る。当業者には、経時的な生物の移動度の増加は、生物の経時寿命の増加と等しいことは容易に明らかである。
当業者には、画像を適切な時間間隔で得て、生存率の減少の代わりとして、経時的に集団の運動の変化を同定及び測定することができることは明らかである。
当業者には、好ましい実施形態において、画像セット(I1とI2、I3とI4)間の時間は、それぞれの時点のセットについて同じでなければならないことは容易に明らかである。
本明細書で使用するとき、集団という用語は、一実施形態において、同一の群又は種に属する複数の生物を指す。生物が、運動できる任意の適切な生物(例えば、動物、微生物又は単細胞生命体)であり得ることは、当業者に理解される。1つの好ましい実施形態において、運動という用語は、移動を指し、例えば、心筋細胞などの細胞の収縮、又は、例えば、胚若しくは他の分裂細胞塊において生じるような細胞分裂によって引き起こされる細胞若しくは複数の細胞の運動を意味しないことは理解される。
一実施形態において、集団は、少なくとも約2、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約100、少なくとも約110、少なくとも約120、少なくとも約150、少なくとも約175、少なくとも約200、少なくとも約250、少なくとも約300、少なくとも約350、少なくとも約400、少なくとも約450、少なくとも約500、少なくとも約550、少なくとも約600、少なくとも約650、少なくとも約700、少なくとも約750、少なくとも約800、少なくとも約850、少なくとも約900、少なくとも約950又は少なくとも約1000の生物を含む。
更なる実施形態において、集団は、約5〜約1000、約10〜約750、約20〜約500、約50〜約300、約50〜約200、約75〜約200、約80〜約150、約90〜約125又は約95〜約100の生物を含む。
さらに好ましい実施形態において、集団は、50、75、80、90、100、110、125、150、175又は200の生物を含む。
本明細書で使用するとき、画像という用語は、生物集団の視覚的表現を指す。画像は、任意の適切な手段によって、例えば、検出器又は電磁ビームを用いて走査することによって得ることができることは理解される。一実施形態において、ワイドスクリーン顕微鏡が使用される。更なる実施形態において、蛍光プレートリーダーが使用される。
一実施形態において、生物を標識することができる。
好ましい実施形態において、生物集団は、任意の適切な手段によって蛍光標識される。さらに好ましい実施形態において、生物の集団は、緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識される。
本発明者らは、標識が生体内の1つの特定の領域に局在化した生物を用いることによって、移動度の変化を決定するために作り出されたデータがより正確であることを発見した。当業者は、これにより、高密度集団を使用し、サンプリング誤差を低減させ得ることを理解する。
一実施形態において、生物は、C.エレガンスである。好ましくは、GFPを発現するC.エレガンスである。より好ましくは、体壁筋においてGFPを発現するC.エレガンスである。
別の実施形態において、生物は、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)である。好ましくは、GFPを発現するゼブラフィッシュである。より好ましくは、体壁筋においてGFPを発現するゼブラフィッシュである。
1つの好ましい実施形態において、GFPの発現は、標識された生物内のある特定の領域に局在化される。
より好ましい実施形態において、生物は、C.エレガンスMYO2bus-5(咽頭においてGFPを発現する薬物感受性蠕虫)である。
さらに、本発明者らは、単一の生体内での2つの標識された遺伝子座の使用により、特定の頭部及び/又は尾部の運動を同定することができることを発見した。これにより、生存率を計算する場合に、行動及び麻痺の副作用が考慮され得る。
当業者は、共通の一般的知識の一部である蛍光標識された生物を作製するための方法を認識する。
アルゴリズムを用いて、画像対間での入力信号の位置の変化を分析する。アルゴリズムは、画像をグレースケールに変換し、それらに閾値を設定し、2つの画像間の絶対差を計算することによって数学的に画像を比較する。次に、この値は、集団サイズの割合（fraction）として集団の移動度を表すために、平均入力信号で除される。この値は、移動度係数(MoCo)と呼ばれる。
また、本発明者らは、第1と第2の時点又はその後の時点の間の期間中に、ある比率の生物が自由になり得る（escape）という驚くべき発見をした。したがって、平均入力信号による除算は、生物数のこの減少を考慮する。移動度係数(MoCo)は、初期数と比較して、存在する生物の総数に比例することが理解される。
当業者には、本発明が、集団サイズの変化、すなわち、絶対数の増減の測定に関するものではないが、集団の移動度の変化、したがって集団の生存率を同定することに関するものであることは明らかになる。したがって、集団サイズの維持、又は集団サイズの変化を考慮することが望まれる。
画像間で同じ時間間隔を有するいくつかの画像を、上記のように評価することができ、平均及び誤差の統計値の作成を可能にすることは理解される。
一実施形態において、アルゴリズムを用いて、集団の移動度の変化を計算する。
更なる実施形態において、ビニングを用いて、本方法の感度を変更することができる。当業者は、ビニングが、対を形成した画像間の差を計算する前に、画像マトリックスにおいて細胞の集計を伴うことを認識する。Binサイズの増加は、アッセイの感度を人為的に低減することは明らかである。本発明者らは、これにより、より年をとった、より移動度が少ない集団の移動度の変化を検出することができることを発見した。
一実施形態において、1〜100、2〜75、3〜50、4〜25又は5〜10のBin値をアルゴリズムにおいて使用する。好ましい実施形態において、1、5、10、50又は100のBin値をアルゴリズムにおいて使用する。より好ましい実施形態において、1のBin値を使用する。
一実施形態において、本方法は、集団の生存率/CLSに対する、少なくとも1つの試験化合物又は少なくとも1つの環境因子の効果を評価するために使用することができる。少なくとも1つの試験化合物が、任意の適切な化合物、例えば、1つ以上の小分子又は生物学的組成物であってもよいことは容易に明らかである。さらに、試験化合物が、任意の適切な手段によって生物に適用され得て、例えば、試験化合物が局所的に適用されてもよく、又は生物が維持される培地内に設置されてもよいことは容易に明らかである。
さらに、少なくとも1つの環境因子が、関心のある任意の環境因子であってもよく、例えば、温度、光又は大気因子、1つ以上の栄養状態、例えば、栄養補給又は栄養不足が挙げられることは明らかである。また、大気因子が、関心のある任意の因子であってもよく、例えば、汚染レベル、大気組成、水分レベルなどが挙げられ得ることは容易に明らかである。
当業者には、任意の適した試験化合物、例えば、コンビナトリアルライブラリーに含まれる化合物を、本発明の方法において使用することができることは明らかである。さらに、例えば、試験生物の移動度を介して測定される該生物のCLSを延長する任意の化合物が、例えば、老化の作用に対抗し、又は加齢関連障害の治療に有用であり得る候補化合物であることは明らかである。さらに、試験生物のCLSを減少させる任意の化合物が毒性作用を有する可能性があることは明らかである。
本発明の第2の態様において、創薬及び/又は毒物学に関する第1の態様による方法の使用が提供される。
本発明の第3の態様において、第1の態様の方法に生物集団を供することを含む、該生物集団の生存率の変化を評価するための方法が提供される。
本発明の第4の態様によれば、第1の態様の方法に生物集団を供することを含む、該生物集団の老化を評価するための方法が提供される。
これは、対照集団と比較して、経時的に生物集団の全体で観察される移動度係数の全体的な変化を計算することによって達成される。好ましい実施形態において、生物はC.エレガンスである。
当業者には、生物が、任意の適切な装置において、例えば、ペトリ皿/単一ウェルプレート又はマルチウェルプレートにおいて維持され得ることは明らかである。一実施形態において、集団は、単一ウェルプレートに維持される。別の実施形態において、集団は、マルチウェルプレートのウェルに維持され、それぞれのウェルは別々の集団を含む。更なる実施形態において、本方法は、6ウェル、12ウェル、24又は96ウェルプレートを用いて行われる。好ましい実施形態において、本方法は、12ウェルプレートを用いて行われる。
当業者は、FUDRが、そうでなければ老化実験を複雑にする、第二世代の子孫の形成を妨げ、齢が同期した集団を生成するために、C.エレガンス研究に使用される化学療法薬であることを認識する。FUDRはDNA合成を妨げ、したがって、卵が孵化せず、若い蠕虫が発育しない。従来のアッセイにおいて、FUDRによる処理は、薬物の非存在下で、例えば、NGM寒天プレートなどの培地上で成長させた成虫を、FUDR溶液で浸漬されたプレートに転移することによって行われる(転移法)。
本発明者らは、FUDRを局所的に添加することよって齢を同期させたC.エレガンス集団の作製が可能であり、転移法より好ましいことを発見した。これは、該方法が、蠕虫の転移を必要とせず、最低限の維持で単一プレート又はウェルで行うことができるためである。
単一ウェル又はマルチウェルプレートのいずれかにおける集団の同期後、該集団は、FUDRで局所的に処理され、該集団が新たなプレート及びウェルに移されないことは理解される。
当業者には、FUDRと同じ機能を果たす他の薬物が、転移法と局所法の両方に等しく使用され得ることは明らかである。
好ましい方法において、マルチウェルプレートにおいて集団を同期した後、該集団は、少なくともO.5μg/ml培地、少なくとも1.0μg/ml、少なくとも1.5μg/ml、少なくとも1.7μg/ml、少なくとも2.0μg/ml、少なくとも2.5μg/ml、又は少なくとも3μg/mlのレベルでFUDRを用いて局所的に処理される。
第1の好ましい実施形態において、12ウェルプレートにおいて集団を同期した後、該集団は、1.7μgのFUDR/ml培地を用いて局所的に処理される。
第2の好ましい実施形態において、6ウェルプレートにおいて集団を同期した後、該集団は、2μgのFUDR/ml培地を用いて局所的に処理される。
第3の好ましい実施形態において、24ウェルプレートにおいて集団を同期した後、該集団は、2μg超のFUDR/ml培地を用いて局所的に処理される。
当業者には、集団の同期は、第1の画像(l1)を得る前に行われるべきであることは明らかである。
本発明の第5の態様において、先の態様のいずれかによる方法を実施するために、データ処理装置を構成するように操作可能な命令を含むコンピュータプログラムが提供される。
さらに、本発明は、以下の図面を参照しながら実施例において説明される。
6ウェルプレートにおける転移及び局所適用技術によるAM134bus-5変異体C.エレガンスのFUDR処理の比較を示す図である。画像は、FUDRなし又は成長1日後(13-09)にFUDR添加を伴う6ウェルプレートにおける様々な時点での同期した蠕虫集団を示す。 12ウェルプレートにおける転移及び局所適用技術によるAM134bus-5変異体C.エレガンスのFUDR処理の比較を示す図である。画像は、成長1日後(13-09)にFUDR添加を伴う12ウェルプレートにおける様々な時点での同期した蠕虫集団を示す。 24ウェルプレートにおける転移及び局所適用技術によるAM134bus-5変異体C.エレガンスのFUDR処理の比較を示す図である。画像は、成長1日後(13-09)にFUDR添加を伴う24ウェルプレートにおける様々な時点での同期した蠕虫集団を示す。 MatLabアルゴリズム並びにC.エレガンスの低速度撮影GFP画像の処理及び分析を概要する図である。 AM134bus-5から計算されたMoCoに対する様々な画像分離時間の効果を示す図である。 AM134bus-5から計算されたMoCoに対する様々なbinサイズの効果を示す図である。 C.エレガンスの異なるGFP局在化系統を示す図である。 MYO2bus-5 C.エレガンスから計算されたMoCoに対する様々な画像分離時間の効果を示す図である。 MYO2bus-5 C.エレガンスから計算されたMoCoに対する様々なbinサイズの効果を示す図である。 AM134bus-5及びMYO2bus-5 C.エレガンスを用いた実験からのMoCoマトリックスを示す図である。 MYO2bus-5蠕虫、並びに140ミリ秒、800ミリ秒及び1秒の10枚の連続画像のそれぞれの間の時間間隔及び1のBIN値に関する結果の概要を示す図である。 4℃にて1時間の低温ショック(低移動度)後の蠕虫の同集団と比較した、室温(高移動度)でのMYO2bus-5 C.エレガンス集団において計算されたMoCoに対する、画像獲得中のGFP低速度撮影画像間の時間間隔の変化と、MatLab分析中のBIN値の両方の効果を示す図である。 0日目のFUDR処理後にFK506又はDMSOで処理されたウェルを含む12ウェルプレートにおける蠕虫集団の相対的MoCoを示す図である。 MoCoに対するFK506の相対的効果に対する、測定日と蠕虫密度の効果を示す図である。 MoCoに対するFK506の相対的効果に対する、測定日と蠕虫密度の効果を示す図である。 画像間の1秒の時間間隔を用いた、10μlのDMSOにより擬似処理された42匹のMYO2bus-5蠕虫とFK506により処理された51匹のMYO2bus-5蠕虫におけるMoCoの比較を示す図である。 画像間の10秒の時間間隔を用いた、10μlのDMSOにより擬似処理された42匹のMYO2bus-5蠕虫とFK506により処理された51匹のMYO2bus-5蠕虫におけるMoCoの比較を示す図である。
[実施例]
[実施例1]
FUDR濃度の最適化及び単一プレートの寿命アッセイのための適用のメカニズム
2'-デオキシ-5-フルロウリジン(flurouridine)(FUDR)は、そうでなければ老化実験を複雑にする第二世代の子孫の形成を妨げるC.エレガンス研究に使用される化学療法薬である。FUDRはDNA合成を妨げ、したがって、卵が孵化せず、若い蠕虫は発育しない。従来的には、処理は、薬物の非存在下で、M9緩衝液を用いたNGM寒天プレート上で成長させた成虫を、FUDR溶液で浸漬されたプレートに転移することによって行われる(転移法)。このようにして蠕虫を転移することは、時間がかかり、したがって高価なプロセスである。また、プラスチック器具への生きた蠕虫の接着に起因して、老化集団あたりの蠕虫の数に変動をもたらす誤差を起こし易い。
実験は、従来の転移法と、FUDRが老化集団に局所的に添加される新規の時間節約及び誤差低減アプローチ(局所法)を比較するために行われた。
局所法により、老化実験は、最低限の維持で単一プレート上で行うことができる。マルチウェルディッシュにおける様々なサイズのウェルの使用は、ハイスループットアッセイにおける使用に最も適したプレートを最適化するために、老化アッセイを実施するためのそれらの適合性を決定するために比較された。
FUDR適用の局所法及び転移法を比較し、24ウェル、12ウェル及び6ウェルプレート上のFUDRの最適濃度を評価した。
AM134bus-5及びbus-8の薬物感受性蠕虫は、漂白によって同期され、次に、マルチウェルプレートにプレーティングされ、成体期にまで発育させた。ウェル半分の成体は、M9緩衝液を用いて、様々な量のFUDR溶液で浸漬された別々のウェルに転移された。残りのウェルは、FUDRを用いて局所的に処理された。
次に、培養物を定期的に明視野顕微鏡で画像化し、必要に応じてOP50を与えた。
図1は、6ウェルプレート上での転移及び局所適用技術による、AM134bus-5変異体C.エレガンスのFUDR処理の比較を示す。画像は、1日後(13-09)のFUDR添加を伴う6ウェルプレート上での同期された蠕虫集団を示す。結果は、処理の4日後(17-09)、6日後(19-09)及び11日後(24-09)を示す。
列1と2は、FUDRが添加されていないウェルを示す。これらのウェルには、様々な異なる齢の多数の蠕虫が存在し、寿命評価を不可能にしている。
列3と4は、FUDR濃度が2μg/ml(5mlのNGMに対して25μlの10mg/ml FUDR)であるウェルを示す。これらの条件下では11日後でさえ、子孫を観察することができない。1μl、5μl、10μl、25μl及び50μlのFUDR体積は、このようにして試験され、25μlは、子孫の発生阻止に最低有効用量として同定された。列3と4から見ることができるように、局所法と転移法の両方は、第二世代の子孫の発生阻止に成功を収めた。
図2は、12ウェルプレート上の転移及び局所適用技術による、AM134bus-5変異体C.エレガンスのFUDR処理の比較を示す。画像は、1日後(13-09)のFUDR添加を伴う12ウェルプレート上での同期させた蠕虫集団を示す。結果は、処理の4日後(17-09)、6日後(19/09)及び11日後(24/09)を示す。
列1と2は、FUDRが添加されていないウェルを示す。これらのウェルにおいて、様々な異なる齢の多数の蠕虫が、特に11日目(24-9)に存在し、寿命評価を不可能にしている。
列3と4は、FUDR濃度が1.7μg/ml(2.5mlのNGMに対して15μlの10mg/ml FUDR)であるウェルを示す。局所適用のためのこれらの条件下では11日後でさえ、子孫を観察することができない(列4の最下段を参照されたい)。1μl、5μl、10μl、15μl及び20μlのFUDR体積は、このようにして試験され、15μlは、子孫の発生阻止に最低有効用量として同定された。局所適用は、これらの条件下での転移法よりも、子孫の阻止により効果的であるようである(列3と4における最下段の画像を比較されたい)。
図3は、24ウェルプレートにおける転移及び局所適用技術によるAM134bus-5変異体C.エレガンスのFUDR処理の比較を示す。画像は、1日後(13-09)のFUDR添加を伴う24ウェルプレート上での同期させた蠕虫集団を示す。結果は、処理の4日後(17-09)、6日後(19/09)及び11日後(24/09)を示す。
列1と2は、FUDRが添加されていないウェルを示す。これらのウェルには、様々な異なる齢の多数の蠕虫が存在し、寿命評価を不可能にしている。
列3と4は、FUDR濃度が2μg/ml(1mlのNGMに対して5μlの10mg/ml FUDR)であるウェルを示す。局所法及び転移法のためのこれらの条件下で11日後、子孫を観察することができる(列3と4の最下段)。1μl、2μl、3μl、4μl及び5μlのFUDR体積は、このようにして試験された。これらの実験から、測定を妨げる第二世代の子孫を阻止するために、より多くのFUDRがこのプレート上のウェルに添加される必要があることは明らかである。しかしながら、完全に乾燥し、ひびが入り、側面から離れるこれらの小さなウェルの傾向は、それらが、目的に適していないと考えられることを意味する。
結論
これらの実験は、局所的なFUDR添加によって、齢が同期したC.エレガンス集団の生成が可能であり、標準的なM9緩衝液の転移法に好適であることを示す。データは、このアッセイにおいて、子孫蠕虫を発生から阻止するための最適な実験パラメータが、12ウェルプレートにおけるウェルあたり15μlの10mg/ml FUDR(2.5ml NGM中の1.7μg/ml)の添加であることを示す。
[実施例2]
コンピュータ分析パラメータの最適化と系統タイプ
本発明の新規なアッセイは、集団の生存率の代わりとして、蠕虫集団の相対的な移動度を使用する。経時的に生存率の変化を測定する場合、経時寿命プロファイルを計算することができる。
この目的のため、MatLabアルゴリズム(図4参照)は、広視野画像(すなわち、多数の蠕虫を包含する画像-5〜500枚)対の間のGFP信号の位置変化を分析するために書かれている。コード(付属書類1に示される)は、画像をグレースケールに変換し、それらに閾値を設定し、2つの画像間の絶対差を計算することによって数学的に画像を比較する。次に、この値は、集団サイズの割合として、集団の移動度を表すために平均入力信号で除される。この値は、移動係数(MoCo)と呼ばれる。それらの間で同じ時間間隔を有するいくつかの画像を評価し、平均及び誤差統計を作成することができる。
ビニングは、分析の感度を変更するために使用することができる。ビニングは、画像対間の差を計算する前に、画像マトリックス(例えば、1×1ビニングなし - 2×2ビニング群 4細胞同時)において細胞を集計することを伴う。理論的に、binサイズの増加は、アッセイの感度を人為的に低減させ、より高齢の移動性が小さい集団における移動度の変化を検出することができる。
実験は、移動度の変化の検出におけるアルゴリズムの使用を確認し、このタイプの分析のために画像とビニングサイズの間で経過させ得る時間を最適化するために行われた。
図4は、MatLabアルゴリズムと、C.エレガンスを表す低速度撮影（time lapse）GFP画像の処理及び分析を概要する。
ステップ1 画像を獲得する-2つの画像間を経過し得る時間量は、暫定時間において蠕虫がどれだけ移動したかを決定する。
ステップ2 閾値を定義する-グレースケールへの画像の変換とバックグラウンド除去は、ノイズを低減させ、後の分析を簡素化する。
ステップ3 ビニング-残りの信号は、特定数のピクセルを組み合わせるためにビニングされる(A×Aビニング)。
ステップ4-連続した画像を重ね合わせ、該画像間の絶対差を計算する。これは、移動度の定量的な推定値を与える。
図4の左側パネルは、高移動度の蠕虫が、画像処理をした場合、信号が高いMoCoの生成と重複しないように、相対的に遠くに移動することを示す。
反対に、移動度のない蠕虫(右側パネル)は絶対的に重複し、したがって、画像間で絶対差がなく、その結果、MoCoが0である(NaN-右側列)。
低/中間移動度の蠕虫からの信号(中央パネル)は部分的に重複し、中間MoCo値をもたらす。
プロセスは、多数の画像について繰り返され、それらを連続的に分析することによって、平均値と誤差の測定を計算する。
[実施例3]
低温ショックによって固定された蠕虫における画像対とbinサイズの時間的分離の最適化
実験は、低温ショックによって固定された蠕虫における画像対とbinサイズの時間的分離を最適化するために行われた。AM134bus-5(体壁筋におけるGFP発現)変異体C.エレガンスの集団を漂白によって同期した。孵化した蠕虫を成体に成熟させ、低速度撮影のGFP画像を蛍光顕微鏡で得た。1秒毎に10秒間、10秒毎に1分間、及び1分毎に5分間撮像した。有効性を確認し、記載されたアルゴリズムを最適化するため、集団における蠕虫の移動度を減少するために、蠕虫を低温ショックによって固定した。これを達成するために、プレートを4℃で1時間置き、次に、上記のように画像化を繰り返した。
図5は、AM134bus-5から計算されたMoCoに対する画像分離時間を変化させる効果を示す。図5は、通常の移動度(室温)と低移動度(低温ショック)の蠕虫のMoCo計算値に対する、連続した画像間の異なる時間間隔の効果を示す。AM134bus-5蠕虫集団は、1秒毎に10秒間(全10画像)、10秒毎に1分間(全6画像)、次に1分毎に5分間(全5画像)を画像化された。画像を分析し、BIN値は1であった。誤差バーは、平均の標準誤差に対応し、n=画像数-1である。1秒の時間間隔は、2つの条件間の最大差を与える。これらの画像からのデータは、binサイズを最適化するために使用された。
1秒は、低温誘導MoCo減少における変化を検出するために、最適な画像分離として予め同定された。図6は、1秒の分離画像について、通常の移動度(室温)及び低移動度(低温ショック)のAM134bus-5蠕虫のMoCo値に対するMatLab分析中の様々なBINサイズの効果を示す。各条件についての分析は、1秒の時間間隔で撮像された同じ10枚の連続画像についてであり、MoCoは、画像間で測定された平均移動度係数を表す。誤差バーは、標準偏差値を生じさせたMatLabを用いて計算された平均の標準誤差を表し、この場合、n-1=9である。図6から見ることができるように、1のBin値(すなわち、ビニングなし)は、2つの条件間の最大の相対差を与える。
[実施例4]
異なるGFP発現局在化を有する系統の影響
異なるGFP発現局在化を有する系統の影響を比較するために(すなわち、GFPを蠕虫の異なる部分において見出すことができる)、繰り返し実験がMYO2bus-5(より局所化された咽頭領域におけるGFP発現)C.エレガンスを用いて行われた。GFP発現のより小さな領域を有する蠕虫を使用することによって、作成されたデータは、より正確であり、より密度の高い蠕虫集団を成長させることができる。
図7は、C.エレガンスの異なるGFP局在化系統を示す。明視野画像は、全蠕虫のプロファイルを示す。中央の画像は、AM134のものであり、この系統における発現領域(体壁筋)を示す。右側の画像は、MYO2系統のものであり、咽頭においてより局在化されたGFP発現を示す。
図8は、MYO2bus-5蠕虫の集団について上述したように、通常の移動度(室温)及び低い移動度(低温ショック)を用いて、蠕虫のMoCo計算値に対する連続した画像間の異なる時間間隔の効果を示す。1秒毎に10秒(全10画像)、10秒毎に1分間(全6画像)、次に、1分毎に5分間(全5画像)撮像した。画像を分析し、BIN値は1であり、誤差バーは、平均の標準誤差に対応し、n=画像数-1である。1秒の時間間隔は、2つの条件間の最大の差異を与える。これらの画像からのデータは、binサイズを最適化するために使用された(図9参照)。
先の実験は、低温誘導されたMoCo変化を検出するための最適な画像分離として、1秒を同定した。図9は、1秒の分離画像についての通常の移動度(室温)と低い移動度(低温ショック)のMYO2bus-5蠕虫のMoCo値に対する、MatLab分析の様々なBINサイズの効果を示す。各条件についての分析は、1秒の時間間隔で撮像された同じ10枚の連続画像についてであり、MoCoは、画像間で測定された平均移動度係数を表す。誤差バーは、標準偏差値を生じさせたMatLabを用いて計算された平均の標準誤差を表し、この場合、n-1=9である。以下の頁にある図から見ることができるように、1のBin値(すなわち、ビニングなし)は、2つの条件間の最大の相対差を与える。
図10は、AM134bus-5及びMYO2bus-5 C.エレガンス変異体のMoCoマトリックスの比較を示す。MatLab分析中に、画像対は、閾値が設定され、画像間の絶対差を計算することによって数学的に比較された。これらの移動度係数マトリックスは、移動性蠕虫がプレートのどの部分にあるのかの視覚的アカウント、並びに誘導されたMoCo値のサイズ及び起源の視覚的アカウントを与える。1秒の画像分離とビニングなしはこのデータについて使用された。マトリックスは、MYO2bus-5蠕虫が、より正確なGFP標識に起因してAM134bus-5蠕虫と比較して画像化された場合の画像間にGFP信号変化のより多くの局在化された差があり、両系統が低温ショック後の移動度において劇的な減少を示すことを表す。
Figure 2016513237
表1は、全信号の百分率として標準偏差を概要する。上記の実施例において、2つの系統、すなわち体壁筋で発現するAM134bus-5及びより局在化されたMYO2bus-5(GFPを発現する咽頭)は、アッセイを最適化するために使用される。これらの系統のうちいずれがハイスループットスクリーニングにおける使用に最も効果的であるのかを決定するために、平均の比率として生じた誤差の比較が、それぞれについて、最適な設定(BIN値が1であり、画像は1秒の間隔である)を用いて計算された。上記表1に示されるデータは、MYO2bus-5系統が、特に蠕虫がより高い移動度のものである場合、画像解析中にAM134bus-5系統よりも小さい相対誤差を生じることを示唆する。したがって、この系統を更なる研究に使用した。
[実施例5]
MYO2bus-5 C.エレガンスについて最適な時間的分離の確認
上記のプロトコールは、MYO2bus-5蠕虫を用いて繰り返され、10枚の連続画像間の時間間隔は、140ミリ秒、800ミリ秒及び1秒であった。この実験は、最適な画像分離パラメータを確認するために行われた。これらの全ての実験からのデータは、このパラメータの最適値の決定を可能にするために、様々なbin設定を用いて分析された。
図11は、140ミリ秒、800ミリ秒及び1秒の10枚の連続画像のそれぞれの間の時間間隔であり、BIN値が1であるMYO2bus-5蠕虫に関する結果の概要を示す。室温下で、4℃にて1時間置いた直後の成虫の同じ集団の平均移動度係数(MoCo)が、1のBIN値を用いて計算された。誤差バーは、n-1=9である場合に、平均の標準誤差を表す。これらの結果は、1秒の時間間隔が最適な画像分離であり、すなわち、異なる運動性の蠕虫の集団間でのMoCoの最大差を与えることを確認する。
図12は、4℃にて1時間の低温ショック後の蠕虫の同じ集団(低移動度)と比較して、室温(高移動度)でのMYO2bus-5 C.エレガンスの集団において計算されるMoCoに対する、画像獲得中のGFP低速度撮影画像間の様々な時間間隔と、MatLab分析中の様々なBIN値の両方の効果を示す。図は、画像が1秒の分離で記録され、1の最小化されたBIN値を用いて分析された場合に、相対的なMoCoにおいてピークを示し、これは、これらのパラメータが、移動度の変化の検出に最大の感度を与えることを示す。
結論
4℃にて1時間の低温ショックに蠕虫を供することにより、蠕虫の移動度が劇的に減少し、老化の効果を模倣する(すなわち、集団の移動度を低減する)ために使用された。画像取得の設定が最適化され、1秒の同定が最も効果的な画像分離間隔であった。画像解析中、ビニングは、異なる移動度の集団を区別するための最適な選択肢であるようではなかった。最後に、MYO2bus-5蠕虫は、この系統から生じたデータが、より局在化されたGFP標識に起因して、AM134bus-5系統よりも、信号の百分率として非常に小さい誤差を生じさせたため、アッセイにおいて使用されるべき系統として選択された。
[実施例6]
プレートタイプ及び密度の最適化
ハイスループット技術の目的は、同時に実施することができる実験数を最大限にすることである。これは、マルチウェルプレートの使用を介して達成してもよい。先の実験は、12ウェルプレートが、方法に適用可能である最小のプレートフォーマットであることを示した。更なる実験は、蠕虫集団の密度と、データが収集されるべき老化プロセス全体での時間点を最適化するために行われた。FK506は、C.エレガンスの経時寿命を延ばすことで知られている化合物であって、アッセイを最適化するために対照として使用された。12ウェルプレートをFK506又はDMSO対照で浸漬し、漂白によって同期化させたMYO2bus-5 C.エレガンスをそれぞれのウェルに添加した。12ウェルプレートについて、ウェルあたり10、50、100及び200個の卵を添加した。蠕虫が成体期に達したとき、それらは、FUDRを用いて局所的に処理され、GFPフィルターを用いて蛍光顕微鏡により画像化された。画像は、それぞれのウェルについて、1秒の間隔で10秒間(全10画像)、再度、10秒の間隔で1分間(全6画像)の低速度撮影によって得られた。MatLab分析を行い、1のBIN値を用いた。
図13は、0日目にFUDR処理後、FK506又はDMSOで処理されたウェルを含む12ウェルプレートにおける蠕虫集団の相対的MoCoを示す。蠕虫を同期したとき、約100個の卵が存在した。全てのデータは、0日目のMoCo計算値に対する割合として表される。誤差バーは、平均の標準誤差を表し、1秒の低速度撮影画像についてはn-1=9であり、10秒の低速度撮影画像については5である。図13は、これらの条件下で、予想されるように、相対的MoCoは、蠕虫が加齢するのと経時的に低下し、不動になることを示す。予想されるように、FK506で処理された蠕虫は、経時寿命を延長し、したがって、より高いMoCoが長続きする。
プレートあたりの卵の最適数と蠕虫を画像化する最良の時間を決定するために、FK506処理に対する効果(相対的なFK506 MoCo/相対的な対照MoCo)が、老化の変化を検出するための最適な条件を同定するために、試験された期間(0、1、4、6、11日間)にわたって蠕虫密度の範囲についてプロットされる。1秒と10秒の画像分離もまた比較した。
図14は、MoCoに対するFK506の相対的効果に対する測定の日と蠕虫密度の効果を示す。FK506処理に対する効果(相対的FK506 MoCo/相対的対照MoCoとして表される)は、老化の変化を検出するための最適条件を同定するために、蠕虫密度(ウェルあたり20、50、100及び200個の卵)の範囲について及び試験された期間(0、1、4、6、8日間)にわたりプロットされる。ここに示されたデータは、ウェルあたり100個の卵を用いることが最適な蠕虫密度であり、1秒の画像分離を用いて0日目と4日目にアッセイすること、及び10秒の画像分離を用いて0日目と6日目にアッセイすることが、MoCoにおける加齢依存性変化の検出に最適であることを示唆する。
図15は、10μlのDMSOで擬似処理された42匹のMYO2bus-5蠕虫と、FK506で処理された51匹のMYO2bus-5蠕虫のMoCoの比較を示す。図15は、FUDR処理後、0日目で観察される初期MoCoと比較した2つの集団のMoCoを示し、画像は、1秒の時間間隔で10秒間(全10画像)で撮像され、1のBIN値をMatLab分析に用いた。誤差バーは信頼区間を表し、n-1=9及びp=0.01である。これらの結果は、FK506で処理されたC.エレガンス集団が、8日間にわたって加齢するとき、擬似処理された蠕虫よりも高い移動度を有することを示す。
図16は、10μlのDMSOで擬似処理された42匹のMYO2bus-5蠕虫と、FK506で処理された51匹のMYO2bus-5蠕虫のMoCoの比較を示す。図16は、FUDR処理後、0日目で観察される初期MoCoと比較した2つの集団のMoCoを示し、画像は、10秒の時間間隔で1分間(全6画像)で撮像され、1のBIN値をMatLab分析に用いた。誤差バーは信頼区間を表し、n-1=5及びp=0.01である。これらの結果は、FK506で処理されたC.エレガンス集団が、8日間にわたって加齢するとき、擬似処理された蠕虫よりも高い移動度を有することを示す。
結論
上述のデータは、12ウェルディッシュのウェルあたり100個の卵の蠕虫密度が、CLSの変化の検出に最適であることを示す。1秒の画像分離を用いて0日目と4日目にアッセイをすること、及び10秒の画像分離を用いて0日目と6日目にアッセイをすることが、CLSにおける変化の検出について読み取りを行うために最適な日である。
明細書で先に記載した全ての刊行物は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。本発明に記載された方法及び系の種々の修飾及び変種は、本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく、当業者に明らかになる。本発明を特定の好ましい実施形態と関連して記載したが、特許請求の範囲に記載したような本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。実際、生化学及びバイオテクノロジー又はこれに関連する分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の種々の修飾は、続く特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
Figure 2016513237
Figure 2016513237
Figure 2016513237

Claims (24)

  1. 経時的に生物集団の移動度の変化を決定するための方法であって、
    a)第1の時点(T1)で集団の第1の画像(I1)を得るステップ、
    b)第2の時点(T2)で集団の第2の画像(I2)を得るステップ、
    c)I1とI2の間の絶対差(ΔD1)を計算するステップ、
    d)第3の時点(T3)で集団の第3の画像(I3)を得るステップ、
    e)第4の時点(T4)で集団の第4の画像(I4)を得るステップ、
    f)I3とI4の間の絶対差(ΔD2)を計算するステップ、及び
    g)ΔD1とΔD2の間の変化を計算し、全体として集団の移動度の変化を計算するステップ
    を含む方法。
  2. I1とI2の間の時間が、約100ミリ秒〜約5分、約140ミリ秒〜約3分、約200ミリ秒〜約90秒、約300ミリ秒〜約1分、約400ミリ秒〜約45秒、約500ミリ秒〜約30秒、約600ミリ秒〜約15秒、約700ミリ秒〜約10秒、約750ミリ秒〜約5秒、約800ミリ秒〜約3秒、約850ミリ秒〜約2秒、約900ミリ秒〜約1秒又は約1秒〜約2秒である、請求項1に記載の方法。
  3. I2とI3の間の時間が、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約1日間、少なくとも約2日間、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間又は少なくとも約12日間である、請求項1又は2に記載の方法。
  4. I2とI3の間の時間が少なくとも約4日間である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  5. ΔD1が、0日目に得られた画像から計算される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
  6. ΔD2が、4日目に得られた画像から計算される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. I1とI2の間の時間が約1秒である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. ΔD2が、6日目に得られた画像から計算される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  9. I1とI2の間の時間が約10秒である、請求項8に記載の方法。
  10. 集団が、少なくとも約2、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約50、少なくとも約75、少なくとも約100、少なくとも約110、少なくとも約120、少なくとも約150、少なくとも約175、少なくとも約200、少なくとも約250、少なくとも約300、少なくとも約350、少なくとも約400、少なくとも約450、少なくとも約500、少なくとも約550、少なくとも約600、少なくとも約650、少なくとも約700、少なくとも約750、少なくとも約800、少なくとも約850、少なくとも約900、少なくとも約950又は少なくとも約1000の生物を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 生物が標識される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 生物が、緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識される、請求項11に記載の方法。
  13. 生物が、C.エレガンス(C. elegans)又はゼブラフィッシュ(Danio rerio)である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 標識が、生物内の1つの特定の領域に局在化される、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 生物が、C.エレガンスMYO2bus-5である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 集団が、単一ウェル又はマルチウェルプレートに維持される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
  17. プレートが、6ウェルプレート、12ウェルプレート、24ウェルプレート又は96ウェルプレートである、請求項16に記載の方法。
  18. 生物集団の移動度に対する、少なくとも1つの試験化合物又は少なくとも1つの環境因子の効果を評価するための、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 少なくとも1つの試験化合物が、小分子又は生物学的組成物を含む、請求項18に記載の方法。
  20. 少なくとも1つの環境因子が、大気因子、栄養補給若しくは栄養不足、光条件、及び/又は温度条件を含む群から選択される、請求項18に記載の方法。
  21. 請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法を行うことを含む、集団生存率の変化を評価するための方法。
  22. 請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法を行うことを含む、集団の老化を評価するための方法。
  23. 創薬及び/又は毒物学における請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法の使用。
  24. 請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法を実施するためのデータ処理装置を構成するように操作可能な命令を含むコンピュータプログラム。
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