WO1995006872A1 - Instrument de mesure optique et procede correspondant - Google Patents

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WO1995006872A1
WO1995006872A1 PCT/JP1994/001431 JP9401431W WO9506872A1 WO 1995006872 A1 WO1995006872 A1 WO 1995006872A1 JP 9401431 W JP9401431 W JP 9401431W WO 9506872 A1 WO9506872 A1 WO 9506872A1
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WO
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optical waveguide
optical
light
fluorescent substance
excitation
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Application number
PCT/JP1994/001431
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English (en)
French (fr)
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Masanori Hasegawa
Tomoaki Ueda
Kazuhisa Shigemori
Kenji Masuda
Masakazu Yoshida
Tomomi Sakamoto
Original Assignee
Daikin Industries, Ltd.
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Publication date
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Priority to AT94925028T priority patent/ATE194711T1/de
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures

Definitions

  • the present invention relates to an optical measuring device and a method therefor, and more particularly, to a specific reaction II, in which a reagent containing a fluorescent substance and a solution to be measured are accommodated to perform a predetermined reaction.
  • a part of the casing that constitutes the reaction vessel to be formed is composed of an optical waveguide, and the optical waveguide is irradiated with excitation light at a predetermined relative angle to emit light from the fluorescent material.
  • the present invention also relates to an optical measuring device iii for receiving a component emitted at a predetermined relative angle with respect to the optical waveguide and measuring optical characteristics near the surface of the optical waveguide in the reaction tank, and a method therefor.
  • the fluorescent material confined near the surface of the optical waveguide is excited by an evanescent wave component generated by introducing the excitation light so as to be seeded while being totally reflected in the optical waveguide, and the fluorescent material is
  • the present invention is applied to an optical measuring device and method for measuring optical characteristics near the surface of an optical waveguide based on a component of the emitted fluorescence which propagates while being totally reflected in the optical waveguide.
  • an evanescent wave component generated by introducing an excitation light so as to be seeded while being totally reflected in an optical waveguide excites a fluorescent substance that has been removed near the surface of the optical waveguide, thereby producing a fluorescent substance.
  • Optical measurement that measures the optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on the component of the fluorescent light emitted while propagating while totally reflecting inside the optical waveguide. I have.
  • a reaction tank with one surface of the slab-type optical waveguide as one section screen is provided, and antibodies (or antigens) are fixed on the surface in advance, and the measurement target is placed inside this reaction tank.
  • a solution or an antibody labeled with a fluorescent dye hereafter, labeled “drug” may be injected into this column, and the amount of the labeled antibody corresponding to the antigen concentration in the solution to be measured is equal to the amount of the antigen-antigen. Restrained by the body reaction in the vicinity of the ⁇ plane.
  • 3 ⁇ 4 It is possible to excite the photo-dye, and 3 ⁇ 4 it is possible to detect the concentration of the cross-section of the solution substratum to be measured based on the intensity of the fluorescence emitted from the photo-dye, slab-type optical waveguide and emitted. it can.
  • a reaction vessel is formed on the side of the optical waveguide, and the ligand (1 igand) immobilized on the surface of the optical waveguide, the solution to be measured injected into the reaction vessel, and the reaction vessel are injected into the reaction vessel.
  • an immunoreaction is carried out with a ligand labeled with a fluorescent dye, and a plane wave is introduced into the reaction tank through an optical waveguide to excite the optical substance.
  • a fluorescent immunoassay apparatus has been proposed which measures the degree of the above-mentioned immune reaction based on a component that propagates while totally reflecting inside the inside (see Patent Application Publication No. 61-502418).
  • ligand refers to an antigen, an antibody, a hapten, a hormone, or an organic substance capable of causing a specific binding reaction.
  • the fluorescent dye of the labeled antibody in the reaction rod can be excited by the excitation light, and of the fluorescence emitted from the fluorescent dye, the intensity of the light emitted by seeding the optical waveguide by evanescent wave coupling The degree of immune response based on the
  • the fluorescence emitted from the fluorescent dye collected near the surface of the optical waveguide is optically separated from the fluorescent light (hereinafter referred to as stray light) emitted from the fluorescent dye of the unreacted labeled antibody.
  • stray light is susceptible to fluctuations due to external factors such as temperature. Therefore, it is not possible to increase the sensitivity of the photoimmunoassay too much.
  • the operation is extremely complicated, and the data processing fill at the time of measurement becomes complicated.
  • stray light can be reduced by lowering the excitation light intensity, but at the same time, the actual i-number becomes smaller, so that the SZN ratio cannot be improved.
  • the fluorescence immunoassay as a result of the immune reaction, not only the photopigment confined near the surface of the optical waveguide, but also the unreacted fluorescent elements not participating in the immune reaction are excited by the excitation light. . Also, the fluorescence emitted by the unreacted fluorescent dye is emitted through the transparent wall of the reaction tank, and is detected by the photodetector together with the signal light that is seeded while being totally reflected by the optical waveguide.
  • the fluorescence caused by the unreacted fluorescent dye is extremely difficult to separate from the fluorescence caused by the fluorescent dye contributing to the immune reaction, and the fluorescence caused by the unreacted fluorescent dye depends on temperature, etc. Since it fluctuates easily under the influence of external factors, measurement sensitivity is greatly impaired.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and has an optical measurement device capable of improving the measurement sensitivity by reducing the amount of fluorescence emitted by unreacted fluorescent substance as a whole.
  • the present invention provides an optical measurement apparatus and method capable of significantly reducing stray light and increasing the SZN ratio of optical measurement without substantially affecting actual signals. It is intended to be.
  • the optical measuring device is characterized in that an evanescent wave component generated by introducing excitation light so as to propagate while totally reflecting inside the optical waveguide causes the optical measurement device to be in the vicinity of the surface of the optical waveguide.
  • the fluorescent material An optical measurement device that measures optical characteristics near the surface of an optical waveguide based on a component of the emitted light that propagates while being reflected in the optical waveguide. Fine particles that absorb light of at least one of the excitation wavelength of the fluorescent substance and the wavelength of the intrinsic light are added to the reaction tank to be defined.
  • the 'It optical substance trapped in the vicinity of the surface of the optical waveguide by an evanescent wave component generated by introducing the excitation light so as to propagate while being totally reflected in the optical waveguide.
  • the surface of the waveguide is designated as 1 and a reaction vessel is added, which absorbs light of at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance.
  • the optical measuring device excites a fluorescent substance confined near the surface of the optical waveguide by an evanescent wave component generated by introducing the exciting light so as to propagate while being totally reflected in the optical waveguide.
  • a water-soluble colorant that absorbs light of at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance is contained in the reaction tank having the above-mentioned one as the division screen.
  • the evanescent wave component generated by introducing the excitation light so that it propagates while totally reflecting inside the optical waveguide is trapped near the surface of the optical waveguide.
  • Unbound fluorescent material is excited near the surface of the waveguide, and "or is excited by excitation light scattered on the surface of the optical waveguide: 3 ⁇ 4 '
  • the fluorescent light emitted by the optical material is applied to the optical waveguide. It can be prevented from being introduced, and the SZN ratio of the optical measurement can be increased.
  • the optical measurement device wherein a part of a casing constituting a reaction tank for containing a reagent containing a fluorescent substance and a solution to be measured and performing a predetermined reaction is constituted by an optical waveguide,
  • the optical waveguide is irradiated with excitation light at a predetermined relative angle, and of the fluorescent light originating from the fluorescent substance, a component emitted at a predetermined relative angle with respect to the optical waveguide is received and the optical waveguide in the reaction tank is formed.
  • a part of a casing constituting a reaction tank for containing a reagent containing a fluorescent substance and a solution to be measured and performing a predetermined reaction is formed of an optical waveguide.
  • the optical waveguide is irradiated with excitation light at a predetermined relative angle, and of the ⁇ light caused by the fluorescent substance, the component emitted at a relative angle of ⁇ with respect to the optical waveguide is received and the reaction tank is received.
  • a substance having a property of absorbing at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance is added to the reaction tank.
  • the optical material is not constrained near the surface of the optical waveguide. 3 ⁇ 4
  • the optical material is excited by the excitation light, and ⁇ or the unconstrained fluorescent material emits near the surface of the optical waveguide: light is emitted.
  • Rukoto can, as possible out to enhance the optical measurement sensitivity (S Z N ratio) thus.
  • the optical measuring device is, as the optical measuring device, excited by irradiating excitation light so as to be introduced into a reaction vessel through an optical waveguide to excite a fluorescent substance, and of the fluorescent light emitted by the fluorescent substance, An optical waveguide that measures the optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on the component that propagates while reflecting in the waveguide is adopted.
  • the fluorescent substance is excited by irradiating the excitation light with the excitation light so as to be introduced into the reaction tank through the optical waveguide, and the fluorescence emitted from the fluorescent substance is reflected in the optical waveguide.
  • Properties near the surface of the optical waveguide based on the component propagating while moving
  • the reaction vessel is restricted near the surface of the optical waveguide. That no fluorescent material is excited by the excitation light introduced through the optical waveguide, and / or that no fluorescent material is constrained near the surface of the optical waveguide.
  • the optical measurement sensitivity S / N ratio
  • the configuration of the optical system can be simplified.
  • optical measuring device wherein the optical measuring device is confined in the vicinity of the front surface Si of the optical waveguide by an evanescent wave component generated by introducing the excitation light so as to propagate while totally reflecting inside the optical waveguide. It excites the emitted fluorescent material and measures the optical properties near the surface of the optical waveguide based on the component of the fluorescent light emitted from the fluorescent material that is emitted to the outside through the optical waveguide. I have.
  • the fluorescent material confined in the vicinity of the surface of the optical waveguide by the evanescent wave component generated by introducing the excitation light so as to propagate while being totally reflected in the optical waveguide.
  • the fluorescent substance is added to the reaction tank. Since a substance that absorbs at least one of the excitation wavelength and emission wavelength of the light is added, the excitation light is scattered on the surface of the optical waveguide and is not constrained near the surface of the optical waveguide.
  • the optical measurement sensitivity SZN ratio
  • the configuration of the optical system can be simplified.
  • the optical measuring device wherein, as the optical measuring device, the fluorescent material is excited by irradiating excitation light so that the fluorescent material is introduced into the reaction vessel through the optical waveguide at a predetermined angle.
  • the fluorescent material is excited by irradiating excitation light so that the fluorescent material is introduced into the reaction vessel through the optical waveguide at a predetermined angle.
  • the one that measures the optical characteristics near the ⁇ surface of the optical waveguide based on the component emitted outside through the optical waveguide at a predetermined angle that is the excitation light is adopted.
  • the fluorescent substance is excited by irradiating with excitation light so that the fluorescent substance is guided into the reaction vessel through a predetermined angle through the optical waveguide.
  • the fluorescent substance is excited in the reaction tank.
  • Excitation light guided by an unbound fluorescent substance through the optical waveguide near the surface of the optical waveguide because a substance that absorbs light of at least one of the wavelengths and emission waves: ⁇ is added.
  • the fluorescence emitted by an unconstrained fluorescent substance in the Z or near the surface of the optical waveguide is prevented from exiting through the optical waveguide, and thus the optical measurement sensitivity (SZN ratio) ) Can be increased.
  • SZN ratio optical measurement sensitivity
  • the optical measuring device is characterized in that, as the substance absorbing at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance, the excitation wave of the fluorescent substance and at least one of the emission wavelengths are used. Adopts abduction to absorb light of wavelength.
  • a part of a casing constituting a reaction tank for containing a drug containing a light substance and a solution to be measured and performing a predetermined reaction is constituted by an optical waveguide. And irradiates the optical waveguide with excitation light at a predetermined relative angle, and receives a component of the fluorescent light emitted from the fluorescent substance that is emitted at a predetermined relative angle with respect to the optical waveguide and receives the component in the reaction tank.
  • the reaction vessel contains fine particles that absorb light of at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance.
  • An unbound fluorescent substance near the surface is excited by the excitation light introduced through the optical waveguide, and the fluorescent light emitted by the unbound fluorescent substance near the surface of the optical waveguide is emitted from the optical waveguide. It can be prevented from being introduced into, and thus can increase the optical measurement sensitivity (S Z N ratio).
  • the optical measurement device wherein the material that absorbs at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance is at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance.
  • Water-soluble dye that absorbs light is at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance.
  • the reagent containing the fluorescent substance and the solution to be measured A part of a casing constituting a reaction vessel for containing and performing a predetermined reaction is formed of an optical waveguide, and is irradiated with excitation light at a predetermined relative angle with respect to the optical waveguide. Of the fluorescent light that is emitted, a component emitted at a predetermined angle relative to the optical waveguide is received, and the optical characteristics near the surface of the optical waveguide in the reaction chamber are measured.
  • the excitation light is scattered in the table ifii of the optical waveguide and is constrained in the vicinity of the surface of the optical waveguide.
  • the fluorescent material that is not constrained in the vicinity of the surface of the optical waveguide or the Z is prevented from exiting through the optical waveguide. Can ⁇ Meru the measurement sensitivity (SZN ratio).
  • the reaction in the inside of the reaction tank having the surface of the optical waveguide as one of the two surfaces, the reaction is carried out with the ligand immobilized in the above ifif of the optical waveguide and the reaction.
  • a predetermined reaction is performed between the solution to be measured and a reagent containing a ligand, which is labeled with a fluorescent substance and injected into the reaction tank, and excitation light is introduced so as to propagate while totally reflecting inside the optical waveguide.
  • An optical measurement method for determining the optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on a component of the fluorescence emitted by the fluorescent substance that propagates while reflecting within the optical waveguide In the reaction vessel, a fine particle having a property of absorbing at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance is contained, and the component propagating while reflecting the optical waveguide ⁇ is received. Above in the reaction tank This is a method for measuring the optical characteristics of the optical waveguide near the above surface.
  • the ligand immobilized on the surface of the optical waveguide and the ligand are introduced into the reaction tank.
  • a predetermined reaction is performed between the solution to be measured and a reagent containing a ligand which is labeled with a fluorescent substance and injected into the reaction vessel, and excitation light is transmitted so as to propagate while being totally reflected in the optical waveguide.
  • An optical measurement method for measuring optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on a component that propagates while reflecting the optical waveguide ⁇ out of the fluorescence emitted by the fluorescent substance, while guiding the light.
  • reaction vessel ⁇ contains fine particles having a property of absorbing light of at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance
  • a component propagating while reflecting in the optical waveguide is received.
  • Reaction tank Since the optical properties of the optical waveguide in the vicinity of the 3 ⁇ 4 plane in the optical waveguide are measured, the excitation light is scattered on the surface of the optical waveguide and is not constrained in the vicinity of the surface of the optical waveguide: Excitation and / or the fluorescence emitted by the fluorescent substance excited by the excitation light scattered in the optical waveguide ⁇ can be prevented from being introduced into the optical waveguide, and thus the optical measurement Sensitivity (SZN ratio) can be increased.
  • SZN ratio optical measurement Sensitivity
  • the optical measurement method wherein the ligand immobilized on the surface of the optical waveguide and the ligand immobilized on the surface of the optical waveguide are injected into the inside of the reaction chamber having the surface of the optical waveguide as one section screen.
  • a predetermined reaction is performed between the solution to be measured and a reagent containing a ligand, which is labeled with an optical substance and injected into the reaction vessel, and the excitation light is transmitted so as to propagate while totally reflecting the optical waveguide ⁇ ⁇ .
  • the reaction ffi contains a water-soluble dye having a property of absorbing at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the light-emitting substance, and propagates while reflecting within the optical waveguide.
  • the ligand immobilized on the surface of the optical waveguide and the reaction tank are provided inside a reaction tank in which one surface of the optical waveguide is defined as one section screen.
  • a predetermined reaction is performed between the solution to be measured injected into the optical waveguide and the reagent containing the ligand, which is labeled with a light substance and injected into the reaction tank, so that the light propagates while being totally reflected in the optical waveguide.
  • the inside of the optical waveguide is reflected in a state where a water-soluble pigment having a property of absorbing at least one of the wavelength of the excitation light of the fluorescent substance and the wavelength of the emission light is contained in the reaction tank.
  • the excitation light is scattered on the 3 ⁇ 4 face of the optical waveguide, and the fluorescent material that is not filtered is excited near iili of the optical waveguide. And / or is excited by the scattered excitation light in the optical waveguide iiifii. It can be prevented from being introduced into the wave path, and the S ratio of the optical measurement can be increased.
  • the optical measurement method wherein the ligand immobilized on the surface of the optical waveguide and the ligand are injected into the reaction vessel 5 inside the reaction vessel having the surface of the optical waveguide as one of the two surfaces.
  • An optical element that receives a component emitted from the fluorescent substance at a predetermined relative ft to the optical waveguide and measures optical characteristics near the surface of the optical waveguide in the reaction MS.
  • a measurement method wherein a substance having a property of absorbing at least one of an excitation wavelength and an emission wavelength of a light-emitting substance is contained in the reaction tank, and the reaction is carried out with respect to the optical waveguide.
  • the component emitted at a given relative angle A law for measuring optical properties of the surface vicinity of the optical waveguide in the optical to the reaction.
  • the ligand in-phase with the surface of the optical waveguide and the reaction tank are used inside the reaction tank in which the angle of the optical waveguide is 1 and the inside of the reaction tank.
  • a predetermined reaction is performed between the solution to be measured injected into the reaction vessel and the reagent containing the ligand, which is labeled with the fluorescent substance and injected into the reaction tank, and is excited at a predetermined relative degree to the optical waveguide. Irradiates light and receives a component emitted at a predetermined relative angle with respect to the optical waveguide, out of the fluorescence caused by the light substance, and receives the optical characteristics in the vicinity of the -ifii of the optical waveguide in the reaction tank.
  • a substance having a property of absorbing at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength ⁇ of light is contained in the reaction vessel. Receives and emits the component emitted at a predetermined relative ft Since the optical characteristics near the surface of the optical waveguide in the optical waveguide are measured, the optical material is not constrained near the surface of the optical waveguide. It is also possible to prevent the emission of light which is not constrained in the vicinity of the surface of the light emitted from the light-emitting substance, and thus to enhance the optical measurement sensitivity (S / N ratio).
  • the optical measurement method according to claim 12 is characterized in that the optical measurement method includes irradiating excitation light so as to be introduced into a reaction vessel through an optical waveguide, and irradiating the fluorescent substance with a fluorescent substance.
  • the method of measuring the optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on the component of the light that propagates while reflecting in the optical waveguide is adopted.
  • the optical measurement method includes irradiating the excitation light so as to be introduced into the reaction tank through the optical waveguide, and selecting the optical waveguide of the fluorescent light emitted from the fluorescent substance. Since a method of measuring the optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on the component propagating while reflecting inside the optical waveguide is adopted, a fluorescent substance not bound to the surface of the optical waveguide is guided through the optical waveguide. Excited by human excitation light and / or not bound near the surface of the optical waveguide; emits non-fluorescent material: ⁇ ⁇ ⁇ prevents light from being introduced into the optical waveguide; In this case, the optical measurement sensitivity (S / N ratio) can be increased.
  • the optical measurement method described in claim 13 is based on the optical measurement method described above, in which the excitation light is introduced so that the light propagates while being totally reflected in the optical waveguide.
  • the method employs a method of measuring the optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on the component radiated to the outside through the optical waveguide.
  • excitation light is introduced so as to propagate while being totally reflected in the optical waveguide. Since the method of measuring the optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on the component radiated to the outside through the waveguide is adopted, the excitation light is scattered at the surface of the optical waveguide ffij and the surface of the optical waveguide is scattered. Excitation of fluorescent material that is not shaded in the vicinity of ⁇ ⁇ , and prevention of fluorescence emitted by unconstrained fluorescent material near Z or near the surface of the optical waveguide is emitted through the optical waveguide. As a result, the optical measurement sensitivity (SZN ratio) can be increased.
  • the optical measurement method according to claim 14 is characterized in that, as the optical measurement method, the excitation light is irradiated so as to be introduced into the reaction vessel through the optical waveguide at a predetermined angle, and of the fluorescence emitted by the fluorescent substance,
  • the method employs a method of measuring the optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on the component radiated outside through the optical waveguide at a predetermined angle different from the excitation light.
  • the optical waveguide is irradiated with excitation light so as to be guided to the reaction vessel by performing iffi at a predetermined angle, and further comprises: A method is used to determine the optical characteristics near the surface of the optical waveguide based on the component of the 'fluorescence emitted by the substance, which is emitted to the outside through the optical waveguide at a predetermined angle different from the excitation light.
  • the optical material is excited by the excitation light introduced through the optical waveguide, and / or not confined near the surface of the optical waveguide: 3 ⁇ 4Optical material It can prevent the light emitted by the laser beam from being emitted through the optical waveguide and increase the optical measurement sensitivity (S / N ratio).
  • an optical measurement method wherein the substance having a property of absorbing at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the fluorescent substance is at least one of the excitation wavelength and the emission wavelength of the optical substance. This is a method of collecting flirts that absorb light of a wavelength.
  • the excitation wavelength of the fluorescent substance and the emission wavelength of the fluorescent substance are substances that absorb at least one of the excitation wavelength and the light wavelength of the fluorescent substance.
  • Ffl which absorbs light of at least one of the wavelengths described above, so that an unbound fluorescent substance is excited near the surface of the optical waveguide by the excitation light introduced through the optical waveguide; And / or prevent fluorescence emitted by an unconstrained fluorescent substance near the surface of the optical waveguide from being introduced into the optical waveguide, thereby improving the optical measurement sensitivity (SZN ratio).
  • SZN ratio optical measurement sensitivity
  • FIG. 1 is a schematic longitudinal sectional view showing an embodiment of the optical measuring device of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in the end point signal and the offset signal with respect to the concentration of the dispersion of carbon black slightly abducted.
  • FIG. 3 is a diagram showing a change over time of a fluorescence immunoassay signal.
  • FIG. 4 is a diagram showing the wavelength dependence of the absorbance of cyan 1 P and B 1 ue 50 p.
  • FIG. 5 is a diagram showing the time-dependent change of the term “photoimmunoassay”.
  • FIG. 6 is a longitudinal sectional view schematically showing another embodiment of the optical measuring device of the present invention.
  • FIG. 7 is a longitudinal sectional view schematically showing still another embodiment of the optical measuring device of the present invention.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view schematically showing still another embodiment of the optical measuring device of the present invention.
  • FIG. 9 is a flowchart illustrating one embodiment of the optical measuring method of the present invention.
  • No. 101 0 is a block diagram showing a schematic configuration of an optical measuring device to which the flowchart of FIG. 9 is applied.
  • FIG. 1 is a schematic longitudinal sectional view showing one embodiment of the optical measuring device of the present invention, in which one side of a slab type optical waveguide 1 on which a prism 1 a of excitation light introduction ffl is formed at one end.
  • a reaction tank 2 is formed once, and a large number of antibodies 3 are fixed to the one side of the slab type optical waveguide 1.
  • a dichroic mirror 4, an excitation light source 5, and a photomultiplier which separate the optical path of the excitation light introduced through the prism 1a of the excitation light introducing section from the optical path of the fluorescence emitted through the prism 1a.
  • Light receiving element consisting of a tube
  • the child 6 and the like are arranged at predetermined relative positions with respect to the slab type optical waveguide 1.
  • the solution to be measured is first collected in the reaction 2 while the excitation light source 5 is operated, and the antigen 7 in the solution to be measured is The solution to be measured was discharged from the reaction tank 2 and labeled with the fluorescent dye 8a.
  • a reagent solution containing 9 nm (0.04% (w / v)) of dispersion of carbon black fine particles of 0 nm is added to the reaction tfi2 to allow the reaction with the antigen 7 that has undergone the antigen-antibody reaction.
  • FIG. 1 shows the change in end point No. 3 and offset signal with respect to the concentration of the carbon black fine particle dispersion, where a shows the endpoint signal and b shows the offset signal. I have. However, the concentration of carbon black is indicated by a dilution factor with respect to a light absorbing agent containing 3] .5% (wZv) of carbon black.
  • the decrease in the endpoint signal is remarkably gradual, while the decrease in the offset signal is remarkably steep. That is, the SZN ratio of the fluorescence immunoassay can be significantly improved by a simple treatment simply by adding a dispersion of carbon black fine particles.
  • the dilution ratio of light absorber comprising a force one Bonbura' click microparticles 1 0 4 ⁇ 1 0 — If this is converted into the concentration of carbon black fine particles, it will be approximately 0.004 to 0.3%.
  • Fig. 3 shows the changes in fluorescence immunoassays ⁇ with and without the addition of the carbon black fine particle dispersion.
  • a indicates the former field er
  • b indicates the latter ⁇ ⁇ .
  • FIG. 3 when carbon black fine particles were not added, not only the signal " ⁇ " increased but also the reagent stray light increased as shown in b.
  • the signal is slightly reduced as shown in a, but the stray light of the reagent is significantly reduced, so that the S / N ratio can be significantly increased.
  • carbon black fine particles fine particles of metals such as platinum and gold, and fine particles of polystyrene can also be employed, and the same effect can be achieved.
  • Example 2 Using an optical measuring device having the configuration shown in FIG. 1, a He—Ne laser having an excitation wavelength of 6> 33 n ⁇ as the excitation light source 5 was used, and a labeled antibody and cyan IP (( ⁇ ) were used. A reagent solution containing the following was added: 3 ⁇ 4 Photoimmunoassay was performed. '] ⁇ Photoimmunoassay was performed using a reagent solution containing only the labeled antibody and a reagent solution containing B1ue50p (manufactured by Nippon Kayaku Co., Ltd.) instead of 1P cyanide. Was.
  • the stray light of the reagent when the reagent solution containing only the labeled antibody was ffl was 61.1, whereas the stray light of the reagent was 36.0 when 1P of cyanide was added.
  • a remarkable reagent stray light reduction effect could be achieved.
  • the reagent stray light was 497. It is considered that the reagent stray light increased significantly because B 1 ue 5 ⁇ ⁇ promoted the scattering of the excitation light.
  • a in FIG. 4 indicates the light absorption characteristics of cyan 1P, and it can be seen that the film has a fairly high absorbance with respect to light having a wavelength of 633 nm.
  • FIG. 5 shows the time-dependent changes of the fluorescence immunoassay signals corresponding to the case where only the labeled antibody was added and the case where cyanide 1 P was also added.
  • FIG. 6 is a vertical section ⁇ ⁇ schematically showing another example of the optical measuring device of the present invention:
  • the reaction hSl 2 is integrally formed on one side of the slab-type optical waveguide 11 formed once, and a large number of antibodies 13 are identified on the one side of the slab-type optical waveguide 11.
  • the signal light that can be led out through the prism 11a of the signal deriving ffl is guided to a light receiving element 16 composed of a photomultiplier tube via a not-shown sharp filter or the like.
  • the light emitted from the excitation light source 15 composed of a laser light source or the like is passed through a collimating lens 14a, a neutral density filter (hereinafter abbreviated as an ND filter) 14b, etc., and the slab type optical waveguide 11 is used.
  • a collimating lens 14a a neutral density filter (hereinafter abbreviated as an ND filter) 14b, etc.
  • the slab type optical waveguide 11 is used.
  • the other side opposite to the one side is irradiated as a carrier wave, and introduced into the reaction tank 12 through the slab type optical waveguide 1 in the thickness direction.
  • the temperature of the excitation light source 15 is controlled by a temperature control unit (not shown), and the fluctuation of the intensity of the emitted light is prevented.
  • the slab-type optical waveguide 1 ⁇ and the reaction tank 12 do not cross the excitation light light (or parallel to this optical axis), and furthermore, the signal light light (or parallel to this light).
  • Black paint etc. is applied to the surface that does not intersect with the vertical axis (the surface in the direction perpendicular to the paper surface in FIG. 6, hereinafter simply referred to as the side surface). Therefore, if the light is prevented from being emitted from the above-described side surface, and the light is assumed to have been emitted, the emitted light may be received by the light receiving element 16 via various paths. Therefore, such light is prevented from entering the light receiving element 16 beforehand. Of course, it is also possible to prevent light from entering from outside through the above side.
  • the solution to be measured is first stored in the reaction tank ⁇ 2 with the excitation light source ⁇ 5 operating, and the width of the solution to be measured is reduced.
  • An antigen-antibody reaction was performed between the antigen 17 and the antibody 13 immobilized on the slab-type optical waveguide 11, and then the solution to be measured was discharged from the reaction tank 12, and the solution was labeled with photodye 18 a.
  • An antigen-antibody reaction was performed by containing a reagent solution containing labeled antibody 18 and having carbon black fine particles 19 (desired concentration) of a desired diameter added thereto in reaction tank 12.
  • An antigen-antibody reaction is carried out between the labeled antibody 17 and the labeled antibody 18 in an amount corresponding to the concentration of the antigen 17 in the solution to be measured.
  • the plane wave trapped by the exciting light is introduced into the reaction tank 12 through the slab-type optical waveguide 1 mm in the thickness direction.
  • the carbon black fine particles 19 are added to the reagent solution, the above-mentioned plane wave is effectively and early absorbed inside the reaction vessel 2 at a position away from the surface of the slab-type optical waveguide 11. In this case, the inconvenience of exciting the fluorescent dye 18a of the labeled antibody 18 can be significantly reduced.
  • the fluorescent dye 18a of the labeled antibody 18 emits fluorescence at a position away from the surface of the slab-type optical waveguide 11, this fluorescence is effectively absorbed, and the slab-type optical waveguide It is possible to significantly reduce the nj ability mixed in with the signal light propagating in 11. Therefore, the sensitivity of the optical immunoassay (SZN ratio) can be significantly increased.
  • milk protein stock solution and sodium azide (Na) were used as blocking agents. N3; ⁇ . 02%) was coated, and Ripponbon black fine particles 19 (diluted with a diluent and set to 1% by weight) were added.
  • CM 1 CC arbox ym ethylindocyanine Ig G (Irn munog 1 obu 1 in-G, 4 ⁇ g / m 1 ⁇ , reagent without added carbon black fine particles 19 (CM I-1 g G, 4 // g / m 1) was injected at 400 / z 1 to measure the output light intensity before and after the injection. Carbon black fine particles coated with black paint etc. to stray light shielding
  • reagent diluted with diluent and set to
  • reagent CM I — Ig G, 4 ⁇ g / m ⁇ , Inject 4 ⁇ m ⁇ ⁇ of reagent (CM I-IgG, 4 g / m 1) to which carbon black fine particles 19 are not added, and output before and after injection
  • the light intensity was measured.
  • a laser light source was used as the excitation light source 15, the output was set to 3 mW, the ND filter cut 10%, and a 3xl0 mm plane wave was used as a slab type. Irradiation was performed from the lower part of the optical waveguide 11.
  • the signal before and after the injection of the reagent was obtained.
  • the values are 0.239 7 kiloulseersecond (hereinafter abbreviated as kpps) and 14 ⁇ 20 16 kpps.
  • the signal liS before and after the injection of the reagent was: ⁇ .
  • the results were 2 234 kpps and 42.4 969 kpps.
  • the output light intensity before and after the injection of the reagent was measured. Is 0.27 17 kpps and ⁇ .
  • a slab-type optical waveguide 11 is coated with a ⁇ -color paint or the like for blocking stray light.
  • the signal before and after reagent injection is ⁇ . 2048 kpps, ⁇ . 2 ⁇ 76 k ⁇
  • the slab-type optical waveguide 1 1 was used because milk protein (a mixture of sodium azide and 0.2%) was coated on the surface of the slab-type optical waveguide 1] as a blocking agent. No reagent is present near the surface of the sample.
  • the output light before the injection of the reagent is an offset value due to the fluorescence of the slab type optical waveguide 110, and almost the same signal value is obtained in any case. 5
  • the largest signal value was obtained when neither the carbon black fine particles 19 nor the application of the color paint etc. of the stray light shielding ffl was applied, and the stray light shielding ffl ⁇
  • the next largest signal value is obtained when only the application of color paint etc.
  • a slab-type optical waveguide of the same configuration as above (without coating with black paint for blocking stray light) is used except that the milk protein coating (sodium azide 0.02% mixture) is omitted. Then, 200/1 of a coloring reagent ink having a concentration of 96 by weight was injected into the reaction tank 12 and the signal ⁇ before and after the injection was measured to be 0.080 kpps, 1.60 kpps. Met. In this case, since milk protein (a mixture of sodium azide 0.02%) is not coated on the surface of the slab type optical waveguide 11 1, the vicinity of the surface of the slab type optical waveguide 1] is not used.
  • the surface of the slab-type optical waveguide 11 was coated with milk protein (mixed with 0.02% sodium azide) as a blocking agent.
  • milk protein mixtureed with 0.02% sodium azide
  • the signal values before the reagent injection of the above-mentioned four persons who performed the measurement in the state where the slab-type optical waveguide 11 was used were as follows. Milk protein (sodium azide 0, 029 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ) as the blocking agent This is probably because the surface is coated.
  • the excitation light is introduced into the reaction tank 2 from the lower surface of the slab type optical waveguide ⁇ 1, the inside of the slab type optical waveguide 11 is seeded, and the signal light is emitted through the prism 11a.
  • the excitation light is introduced into the slab-type optical waveguide 11 through the prism 11a and propagated therethrough, and the slab-type optical waveguide 1 is passed through the slab-type optical waveguide 11 as shown in FIG.
  • the light emitted from the lower surface of the slab 1 is received by the light receiving element 16.
  • the lower surface of the slab-type optical waveguide 11 is irradiated with excitation light at a certain angle to the reaction tank 12.
  • the pump light is introduced into ⁇ , and the signal light emitted from the lower surface of the slab type optical waveguide 11 to the lower surface of the slab type optical waveguide 1 1 is received by the light receiving element 16 at an angle different from the angle formed by the excitation light. It is possible to do.
  • FIG. 9 is a flowchart illustrating an optical measurement method according to an embodiment of the present invention. In the case where an optical measurement is performed using the optical measurement device described in any of the above-described embodiments. Is shown. Therefore, for example, antibodies 3 and 13 are immobilized in advance on the surfaces of the slab-type optical waveguides 1 and 11 constituting one section of the reaction vessels 2 and 12.
  • step SP1 the target solution is injected into the reaction vessels 2 and 12 using the dispensing nozzle 32a (see FIG. 10).
  • antibody 3 that has been previously immobilized, 13 and measurement pairs gd solution ⁇ anti 1 ⁇ 2I7, at! 1 ⁇ 4 and 17 to perform the antigen-antibody reaction.
  • step S S2 the measurement solution is removed from the reaction tanks 2 and 12 using the dispensing nozzle 32a, and in step SP3, the desired solution is removed.
  • a reagent containing a light-absorbing substance at a concentration (a substance having a property of absorbing light of at least one of the excitation wavelength of the fluorescent dye and the emission wavelength) is supplied to the reaction tank 2 using the dispensing nozzle 32a.
  • step SP4 the fluorescent light emitted from the fluorescent dyes 8a and 18a of the labeled antibodies 8 and 18 confined in the vicinity of the surfaces of the slab optical waveguides 1 and 11 due to the antigen-antibody reaction is applied.
  • the optical measurement device (1) The light component is received by the light receiving elements (6) and (16) to obtain a symbol corresponding to the concentration of the antigen (7, 17) in the solution to be measured.
  • the concentrations of antigens 7 and 17 in the solution to be measured are obtained based on the obtained signal and the obtained calibration curve, and the series of processing is terminated as it is.
  • step S ⁇ 3 and the processing in step S ⁇ 4 are performed in step S; it is preferable that the processing in step SP4 be started before the processing in step SP3. Offset noise caused by the wave paths 1 and 1 can be obtained by data processing not shown.
  • step SP 4 4 The signal received may be changed until the signal value that changes due to the progress of the antigen-antibody reaction is almost saturated, and the ⁇ value at the time when the signal value is almost saturated may be used. It may be possible to continue calculating the time differential value of ffl and take the maximum value of the time differential value ffl.
  • FIG. 1A is a block diagram showing a schematic configuration of an optical measurement apparatus to which the flow chart of FIG. 9 is applied, and a reagent storage tank (not shown), a target solution storage tank (not shown), and a diluent storage tank (not shown). And a reaction cell 12 for performing an anti-antibody reaction, and a measurement cell 31 in which a slab type optical waveguide 11 on which an antibody 13 is fixed is formed on a predetermined surface of the reaction tank 12.
  • Dispensing device with dispensing nozzle 32 a for injecting solution into the tank or for aspirating and removing the solution from any case ⁇ 32 and measuring ffl cell 31 The degree of the immune reaction is determined by irradiating the slab-type optical waveguide 11 with excitation light at a predetermined angle at a predetermined position and detecting light emitted from the slab-type optical waveguide ⁇ 1 at a predetermined angle.
  • Optical measuring unit 33 that detects the Based on the information in the indicator section 34, the data section that holds the prescribed data corresponding to the conditions such as the inspection target, measurement items, and the constants: 5, and the information in the indicator section 34 and the data section 35.
  • Dispensing controller part 36 that controls the suction, discharge and suction amount of the dispensing nozzle 32a, and the main controller part that sends commands to the optical measurement part 3 and the dispensing controller part 36 3 7
  • the main controller 37 reads out the corresponding data from the data receiver 35 in correspondence with each step of the flowchart of FIG. 9, and reads out the read data and usage.
  • the operator controls the dispensing nozzle 32 a by operating the dispensing controller unit 36 based on the instruction of the person ffl. That is, the solution to be measured is sucked from the solution storage tank to be measured by the dispensing nozzle 32a, the dispensing nozzle 32a is moved to the reaction tank 12, and the sucked solution to be measured is transferred to the reaction tank 12 To perform the first antigen-antibody reaction.
  • the solution to be measured in the reaction tank 12 is sucked by the dispensing nozzle 32a and discharged to a waste liquid tank (not shown).
  • the reagent containing labeled antibody 18 and carbon black fine particles 19 is aspirated from the drug storage tank by the dispensing nozzle 32a, and the dispensing nozzle is dispensed.
  • the second antigen-antibody reaction is carried out by moving 32 a to reaction tank No. 2 and discharging the sucked reagent to reaction tank 12.
  • the liquid suction amount is adjusted by, for example, setting the number of pulses per unit time to be given to a pulse monitor (not shown) for controlling the suction amount and the discharge amount of the dispensing nozzle 32a. This is achieved by setting the optimum value corresponding to the suction amount by the dispensing controller section '36.
  • the solution to be measured was injected into the reaction vessels 2 and 12 to perform the first antigen-antibody reaction of B, and then the reagent was injected after removing the solution to be measured.
  • the so-called two-step method is used to perform the second antigen-antibody reaction, but the antigen-antibody reaction is performed by mixing the solution to be measured and the above reagents in advance, and this mixed solution is reacted.
  • the so-called one-step method is adopted, in which an anti-antibody reaction is performed between the antibodies 3 and 13 immobilized on the surface of the slab-type optical waveguides 1 and 11 by injecting them into the tanks 2 and 12. ffl is possible.
  • reaction tank is formed integrally with a slab-type optical waveguide, a solution to be measured and a reagent are injected into the reaction tank, and excitation light is introduced into the slab-type optical waveguide.
  • the present invention can be suitably applied to a measuring device for measuring optical characteristics near the metaphysical surface of the slab-type optical waveguide, and the S / N ratio of the optical measurement can be increased.

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Description

鴨 I香 光学的測定装置およびその方法 技術分野 この発明は光学的測定装置およびその方法に関し、 さらに詳 IIにいえば、 蛍光 物質を含む試薬と測定対象溶液とを収容して所定の反応を行なわせる反応槽を構 成するケ一シングの一部が光導波路で構成されているとともに、 光導波路に女' iし て所定の相対角度で励起光を照射し、 蛍光物質に起因する蛍光のうち、 光導波路 に対して所定の相対角度で出射される成分を受光して反応槽内における光導波路 の表面近傍の光学的特性を測定する光学的測定装 iiiおよびその方法に関する。 特 に好ましくは、 光導波路内を全反射しながら 播するように励起光を導入するこ とにより生じるエバネッセント波成分によつて光導波路の表面近傍に拘束された 蛍光物質を励起し、 蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光導波路内を全反射しなが ら伝播する成分に基づいて光導波路 表面近傍の光学的特性を測定する光学的測 装置およびその方法に閔する。 背景技術 従来から、 光導波路内を全反射しながら 播するように励起光を導入すること により生じるエバネッセント波成分によつて光導波路の表面近傍に佝朿された蛍 光物質を励起し、 蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光導波路内を全反射しながら 伝播する成分に基づいて光導波路の表面近傍の光学的特性を測定する光学的測定 装匿を fflいた蛍光免疫測^装置が提案されている。
^休的には、 例えば、 スラブ型光導波路の一表面を 1の区画面とする反応槽を 設け、 上記表面に予め抗体 （または抗原） を固定しておき、 この反応槽の内部に 測定対象溶液、 蛍光色素で標識された抗体 （以ド、 標識 ½休と称する） をこの顺 に注入すればよく、 则定対象溶液中の抗原濃度に対応する量の標識抗体が抗原抗 体反応により上記^面の近傍に拘束される。
したがって、 励起光のエバネッセント波成分により上記 ½朿された標識抗体の
¾光色素を励起することができ、 ¾光色素から放射され、 スラブ型光導波路を^ 播して出射される蛍光の強度に Sづいて測定対象溶液屮の ίΛ股の濃度を検出する ことができる。
また、 従来から、 光導波路の 側に反応槽を形成し、 光導波路の表面に固相化 されたリガンド （ 1 i g a n d ) と、 反応槽に注入された測定対象溶液と、 反応 槽に注入され、 かつ蛍光色素で標識されたリガンドとの間で免疫反応を行なわせ、 しかも、 平面波を光導波路を通して反応槽に導入することにより ^光物質を励起 し、 蛍光色素が放射する蛍光のうち、 光導波路内を全反射しながら伝播する成分 に基づいて上記免疫反応の程度を測^する蛍光免疫測定装置が提案されている (特許出願公表昭 6 1 - 5 0 2 4 1 8号公報参照） 。 尚、 この明細害において、 「リガンド」 は、 抗原、 抗体、 ハプテン、 ホルモンの他、 特異的な結合反応を起 こせる有機物質を称する。
したがって、 励起光により反応棹内の標識抗体の蛍光色素を励起することがで き、 蛍光色素から放射される蛍光のうち、 エバネッセント波結合により光導波路 を 播して出射される' ¾光の強度に基づいて免疫反応の程度を換出することがで さる
上記前者の蛍光免疫測定装置は、 光導波路の ^iffiが完全な平滑面であれば、 抗 原抗体反応によって表面近傍に ίίθ束されている蛍光色素のみが蛍光を発し、 未反 応の蜇光色素は蛍光を発しない。 しかし、 ^際には光導波路の ¾面を完全な平滑 面にすることは殆ど不可能であるから、 エバネッセント波成分だけでなく励起光 の散乱成分が蛍光色素を励起することになり、 未反応の蛍光色素も蜇光を発して しまうことになる。 そして、 光導波路の表面近傍に枸朿された蛍光色素から放射 される蛍光と未反応の標識抗体の蛍光色素から放射される ¾光 （以下、 迷光と称 する） とを光学的に分離することは殆ど不可能である。 また、 迷光は温度等の外 部要因による変動を受けやすい。 したがって、 ¾光免疫測^の感度を余り高める ことができない。
このような不都台を解^するために、 迷光に起因する信号と' 際の反応に起因 する^号 （以下、 実信号と称する） とを分離するための演算処理を行なうことが 考えられるが、 演算が著しく複雑であるとともに、 測定時のデータ処 fillが複雑に なるという不都合があり、 しかも十分な測定粞度を達成できる保証がないという 不都^がある。
また、 励起光強度を低下させれば迷光を低減することができるが、 同時に実 i 号も小さくなるので、 S Z N比を改善することはできない。
上記後者の蛍光免疫測定装置は、 免疫反応の結果、 光導波路の表面近傍に拘束 された ¾光色素のみならず、 免疫反応に寄 していない未反応の蛍光 素が励起 光により励起されてしまう。 また、 未反応の蛍光色素が放射する蛍光は、 反応槽 の透明な区幽壁を通して放射され、 光導波路を全反射しながら 播する信号光と 共に光検出器により検出される。 未反応の蛍光色素に起 する上記蛍光は、 免疫 反応に寄 した蜇光色素に起因する蛍光との分離が著しく困難であり、 また、 未 反応の蛍光色素に起闪する上記蛍光は温度等の外部要闪の影響を受けて変動し易 いので、 測定感度を大きく阻害してしまう。
また、 上記未反応の蛍光色素に起闪する蛍光が光検出器により検出されてしま うことを防止するために、 反応槽の光検出 ¾側に、 反応槽の側壁から出射し、 か つ木来の免疫反応に寄与していない光を光検出器に対して遮蔽する扳等を設ける ことが考えられるが、 光学系の構成が後雑になってしまう。 発明の開示
この発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、 未反応の ¾光物質が放 射する蛍光の量を全休として <¾減し、 測定感度を向上させることができる光学的 測定装置およびその方法を提供することを目的とし、 特に、 実信号に殆ど影響を 及ぼすことなく、 迷光を大幅に低減して光学的測定の S Z N比を高めることがで きる光学的測定装置およびその方法を提供することを目的としている。
上記の目的を達成するための、 請求項 1の光学的測定装置は、 光導波路内を全 反射しながら伝播するように励起光を導入することにより生じるエバネッセン卜 波成分によって光導波路の表面近傍に拘束された蛍光物質を励起し、 蛍光物質が 放射する^光のうち、 光導波路内を反射しながら伝播する成分に基づいて光導波 路の表面近傍の光学的特性を则定する光学的測定装置であって、 光導波路の表而 を 1の区 ιϋώとする反応槽に、 'ϋί光物質の励起波長、 允光波長の少なくとも一方 の波長の光を吸収する微粒子を添加してある。
請求项 1の光学的測定装置であれば、 光導波路内を全反射しながら伝播するよ うに励起光を導入することにより生じるエバネッセント波成分によって光導波路 の表面近傍に拘朿された 'It光物質を励起し、 '蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光 導波路内を全反射しながら伝播する成分に Sづいて光導波路の表面近 !¾'の光学的 特性を測定するに当って、 光導波路の表 を 1の区幽 i とする反応槽に、 蛍光物 質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する微拉子を添加し てあるので、 光導波路の表 ώにおいて励起光が散乱されることにより光導波路の 表面近傍には拘束されていない蛍光物質が励起されること、 および または光導 波路の表面において散乱された励起光により励起される： ¾'光物質が放射する蛍光 が光導波路に導入されることを防止することができ、 ひいては光学的測定の S / Ν比を高めることができる。
請求項 2の光学的測定装置は、 光導波路内を全反射しながら伝播するように励 起光を導入することにより生じるエバネッセント波成分によつて光導波路の表面 近傍に拘束された蛍光物質を励起し、 蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光導波路 内を全反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路の表面近傍の光学的特性を 測定する光学的測定装置であって、 光導波路の表而を 1の区画面とする反応槽に、 '蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する水溶性色 素を含有させてある。
詰求项 2の光学的測定装置であれば、 光導波路内を全反射しながら伝播するよ うに励起光を導入することにより生じるエバネッセン ト波成分によつて光導波路 の表面近傍に拘朿された: ¾光物質を励起し、 光物質が放射する ¾光のうち、 光 導波路内を全反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路の表面近傍の光学的 特性を測定するに当って、 光導波路の表 ώを 1の区幽 ώとする反応槽に、 光物 質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する水溶性色素を含 有させてあるので、 光導波路の表 ώにおいて励起光が散乱されることにより光導 波路の表面近傍には拘束されていない蛍光物質が励起されること、 および "また は光導波路の表面において散乱された励起光により励起される： ¾ '光物質が放射す る蛍光が光導波路に導入されることを防止することができ、 ひいては光学的測定 の S Z N比を高めることができる。
請求項 3の光学的则定装置は、 蛍光物質を含む試薬と測定対象溶液とを収容し て所定の反応を行なわせる反応槽を構成するケーシングの一部が光導波路で構成 されているとともに、 光導波路に対して所定の相対角度で励起光を照射し、 蛍光 物質に起因する蛍光のうち、 光導波路に対して所定の相対角度で出射される成分 を受光して反応槽内における光導波路の ¾面近傍の光学的特性を測^する光学的 測定装^であって、 上記反応槽に、 蛍光物質の励起波 、 発光波^の少なくとも 一方の波長の光を吸収する性質を有する物質を添加してある。
詰求¾ 3の光学的測定装置であれば、 蛍光物質を含む試薬と測定対象溶液とを 収容して所定の反応を行なわせる反応槽を構成するケーシングの一部が光導波路 で構成されているとともに、 光導波路に対して所定の相対角度で励起光を照射し、 蛍光物質に起因する泶光のうち、 光導波路に対して所; ΐの相対角度で出射される 成分を受光して反応槽內における光導波路の表面近傍の光学的特性を測定するに 当って、 上記反応槽に、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長 の光を吸収する性質を有する物質を添加してあるので、 光導波路の表面近傍には 拘束されていない ¾光物質が励起光により励起されること、 および Ζまたは光導 波路の表面近傍には拘束されていない蛍光物質が放射する： 光が出射されること を防止することができ、 ひいては光学的測定感度 （S Z N比） を高めることがで きる。
請求項 4の光学的測定装置は、 上記光学的測定装置として、 光導波路を通して 反応槽に導入されるように励起光を照射して蛍光物質を励起し、 蛍光物質が放射 する蛍光のうち、 光導波路内を反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路の 表面近傍の光学的特性を測定するものを採用している。
請求項 4の光学的測定装置であれば、 光導波路を通して反応槽に導入されるよ うに励起光を照射して蛍光物質を励起し、 蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光導 波路内を反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路の表面近傍の光学的特性 を測定するに ¾つて、 上記反応槽に、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくと も一方の波長の光を吸収する物質を添加してあるので、 光導波路の表面近傍には 拘束されていない蛍光物質が光導波路を通して導入される励起光により励起され ること、 および/または光導波路の表 ώί近傍には拘束されていない ¾光物質が放 射する蛍光が光導波路に導入されることを防 iL.することができ、 ひいては光学的 測定感度 （S / N比） を高めることができる。 また、 励起光と ¾光とを分離する ための光学素子を用いる必要がないので、 光学系の構成を簡単化できる。
請求項 5の光学的測定装置は、 上記光学的測定装置として、 光導波路内を全反 射しながら伝播するように励起光を導入することにより生じるエバネッセント波 成分によって光導波路の表 Si近傍に拘束された ¾光物質を励起し、 ¾光物質が放 射する蛍光のうち、 光導波路を通して外部に放射される成分に Sづいて光導波路 の表面近傍の光学的特性を測定するものを採用している。
請求項 5の光学的測定装置であれば、 光導波路内を全反射しながら伝播するよ うに励起光を導入することにより生じるエバネッセント波成分によつて光導波路 の表面近傍に拘束された蛍光物質を励起し、 蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光 導波路を通して外部に放射される成分に基づいて光導波路の表 Bd近傍の光学的特 性を測定するに当って、 上記反応槽に、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なく とも一方の波長の光を吸収する物質を添加してあるので、 光導波路の表面におい て励起光が散乱されることにより光導波路の表面近傍には拘束されていない蛍光 物質が励起されること、 および または光導波路の ¾ώ近傍には拘束されていな い蛍光物質が放射する蛍光が光導波路を通して出射されることを防 ιΙ·.することが でき、 ひいては光学的測定感度 （S Z N比） を卨めることができる。 また、 励起 光と蛍光とを分離するための光学素子を fflいる必要がないので、 光学系の構成を 簡単化できる。
請求項 6の光学的測定装置は、 上記光学的測定装置として、 光導波路を所定角 度で通して反応槽に導入されるように励起光を照射して蛍光物質を励起し、 ¾光 物質が放射する蛍光のうち、 励起光と^なる所定角度で光導波路を通して外部に 放射される成分に基づいて光導波路の ¾面近傍の光学的特性を測定するものを採 用している。 詰求项 6の光学的測定装置であれば、 光導波路を所定角度で通して反応槽に導 入されるように励起光を照射して蛍光物質を励起し、 蛍光物質が放射する蛍光の うち、 励起光と異なる所定角度で光導波路を ilfiして外部に放射される成分に基づ いて光導波路の表面近傍の光学的特性を则 'す に当って、 上記反応槽に、 蛍光 物質の励起波長、 発光波：^の少なくとも一方の波 の光を吸収する物質を添加し てあるので、 光導波路の表面近傍には拘束されていない蛍光物質が光導波路を通 して導人される励起光により励起されること、 および Zまたは光導波路の表面近 傍には拘束されていない蛍光物質が放射する蛍光が光導波路を通して出射される ことを防止することができ、 ひいては光学的測定感度 （S Z N比） を高めること ができる。 また、 励起光と蛍光とを分離するための光学桌子を用いる必要がない ので、 光学系の構成を簡 ί|ί化できる。
請求項 7の光学的则定装置は、 上記蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくと も一方の波長の光を吸収する物質として、 蛍光物質の励起波^、 発光波長の少な くとも一方の波長の光を吸収する微拉了を採用している。
詰求项 7の光学的測定装置であれば、 光物質を含む ¾薬と測定対象溶液とを 収容して所定の反応を行なわせる反応槽を構成するケーシングの一部が光導波路 で構成されているとともに、 光導波路に対して所定の相対角度で励起光を照射し、 蛍光物質に起因する蛍光のうち、 光導波路に対して所定の相対角度で出射される 成分を受光して反応槽内における光導波路の表面近傍の光学的特性を測定するに 当って、 上記反応槽に、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長 の光を吸収する微粒子を含有させてあるので、 光導波路の表面近傍には拘束され ていない蛍光物質が光導波路を通して導入される励起光により励起されること、 およびノまたは光導波路の表面近傍には拘朿されていない蛍光物質が放射する蛍 光が光導波路に導入されることを防止することができ、 ひいては光学的測定感度 ( S Z N比） を高めることができる。
請求項 8の光学的则定装置は、 上記蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくと も一方の波長の光を吸収する物質として、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少な くとも一方の波長の光を吸収する水溶性色素を採用している。
詰求¾ 8の光学的測定装置であれば、 蛍光物質を含む試薬と測定対象溶液とを 収容して所定の反応を行なわせる反応槽を構成するケーシングの一部が光導波路 で構成されているとともに、 光導波路に対して所定の相対角度で励^光を照射し- 蛍光物質に起闪する蛍光のうち、 光導波路に対して所定の相対角度で出射される 成分を受光して反応枘内における光導波路の表面近傍の光学的特性を測定するに ^つて、 上記反応槽に、 蛍光物質の励起波長、 発光波 の少なくとも一方の波長 の光を吸収する水溶性色素を含有させてあるので、 光導波路の表 ifiiにおいて励起 光が散乱されることにより光導波路の表面近傍には拘束されていない蛍光物質が 励起されること、 および Zまたは光導波路の表面近傍には拘束されていない 光 物質が放射する蛍光が光導波路を通して出射されることを防止.することができ、 ひいては光学的測定感度 （S Z N比） を卨めることができる。
請求項 9の光学的測定方法は、 光導波路の表面を 1の区兩面とする反応槽の内 部において、 上記光導波路の上記表 ifiiに固相化されたリガンドと上記反応 に注 人された測定対象溶液と、 蛍光物質で標識され、 かつ上記反応槽に注入されたリ ガンドを含む試薬とで所定の反応を行なわせ、 上記光導波路内を全反射しながら 伝播するように励起光を導入するとともに、 蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光 導波路内を反射しながら伝揺する成分に基づいて光導波路の表 ili近傍の光学的特 性を则定する光学的測定方法であって、 上記反応槽内に、 蛍光物質の励起波良、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する性質を有する微粒了'を含有させ た状態で、 上記光導波路內を反射しながら伝播する成分を受光して反応槽内にお ける上記光導波路の上記表 ώ近傍の光学的特性を測定する方法である。
請求項 9の光学的測定装置であれば、 光導波路の表面を 1の区両面とする反応 枘の内部において、 上記光導波路の上記 ¾ίώに固 ¾化されたリガンドと上記反応 槽に泮入された測定対象溶液と、 蛍光物質で標識され、 かつ上記反応槽に注入さ れたリガンドを含む試薬とで所定の反応を行なわせ、 上記光導波路内を全反射し ながら伝播するように励起光を導人するとともに、 蛍光物質が放射する蛍光のう ち、 光導波路內を反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路の表面近傍の光 学的特性を測定する光学的測定方法であって、 上記反応槽內に、 蛍光物質の励起 波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する性質を有する微粒了を含 させた状態で、 上記光導波路内を反射しながら伝播する成分を受光して反応槽 内における上記光導波路の上記 ¾面近傍の光学的特性を測定するのであるから、 光導波路の表面において励起光が散乱されることにより光導波路の表面近傍には 拘束されていない: ¾光物質が励起されること、 および/"または光導波路の ϋϊΠίに おいて散乱された励起光により励起される蛍光物質が放射する蛍光が光導波路に 導入されることを防止することができ、 ひいては光学的測定感度 （S Z N比） を 高めることができる。
請求項 1 0の光学的測定方法は、 光導波路の ¾面を 1の区画面とする反応槽の 内部において、 上記光導波路の上記表面に固相化されたリガンドと上記反応槽に 注入された測定対象溶液と、 ¾光物質で標識され、 かつ上記反応槽に注入された リガンドを含む試薬とで所定の反応を行なわせ、 上記光導波路內を全反射しなが ら伝播するように励起光を導入するとともに、 蛍光物質が放射する ¾光のうち、 光導波路內を反射しながら伝播する成分に Sづいて光導波路の表面近傍の光学的 特性を则^する光学的測定方法であって、 上記反応 ffi内に、 ¾光物質の励起波長、 発光波 ¾の少なくとも一方の波 の光を吸収する性質を 'する水溶性色素を含有 させた状態で、 上記光導波路内を反射しながら伝播する成分を受光して反応槽内 における上記光導波路の上記表面近傍の光学的特性を測定する方法である。
請求項 1 0の光学的測定方法であれば、 光導波路の ¾面を 1の区画面とする反 応槽の内部において、 上記光導波路の上記表面に固相化されたリガンドと上記反 応槽に注入された測^対象溶液と、 光物質で標識され、 かつ上記反応槽に注入 されたリガンドを含む試薬とで所定の反応を行なわせ、 上記光導波路内を全反射 しながら伝播するように励起光を導入するとともに、 蜇光物質が放射する ¾光の うち、 光導波路内を反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路の表面近傍の 光学的特性を測^する光学的则 方法であって、 上記反応槽内に、 蛍光物質の励 起波畏、 発光波 ¾の少なくとも一方の波長の光を吸収する性質を有する水溶性色 素を含有させた状態で、 上記光導波路内を反射しながら伝播する成分を受光して 反応槽內における上記光導波路の上記表面近傍の光学的特性を測定するのである から、 光導波路の 5¾面において励起光が散乱されることにより光導波路の iili近 傍には ^朿されていない蛍光物質が励起されること、 および または光導波路の iiifiiにおいて散乱された励起光により励起される ¾光物質が放射する ¾光が光導 波路に導入されることを防 I卜.することができ、 ひいては光学的測定の S 比を 卨めることができる。
請求項 1 1の光学的測定方法は、 光導波路の表面を 1の区両面とする反応槽の 内部において、 上記光導波路の上記表面に固相化されたリガンドと上記反応 «5に 注入された測定対象溶液と、 蛍光物質で標識され、 かつ上記反応槽に注入された リガンドをさむ試薬とで所定の反応を行なわせ、 上記光導波路に対して所定の相 対角度で励起光を照射し、 蛍光物質に起闪する蛍光のうち、 上記光導波路に対し て所定の相対 ft度で出射される成分を受光して反応 MS内における上記光導波路の 上記表面近傍の光学的特性を測定する光学的測定方法であって、 上記反応槽内に、 ¾光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する性質を有 する物質を含^させた状態で、 上記光導波路に対して所定の相対角度で出射され る成分を受光して反応 内における上記光導波路の上記表面近傍の光学的特性を 測定する 法である。
詰求项 1 1の光学的測定方法であれば、 光導波路の ¾ώを 1の区幽面とする反 応槽の内部において、 上記光導波路の上記表面に同相化されたリガンドと上記反 応槽に注入された測定対象溶液と、 ¾光物質で標識され、 かつ上記反応槽に注入 されたリガンドを含む試薬とで所定の反応を行なわせ、 上記光導波路に対して所 定の相対 度で励起光を照射し、 ¾光物質に起因する蛍光のうち、 上記光導波路 に対して所定の相対角度で出射される成分を受光して反応槽内における上記光導 波路の上記- ifii近傍の光学的特性を測定するに ¾つて、 上記反応槽内に、 ¾光物 質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波 βの光を吸収する性質を^する物 質を含有させた状態で、 上記光導波路に対して所定の相対 ft度で出射される成分 を受光して反応槽内における上記光導波路の上記表面近傍の光学的特性を測定す るのであるから、 光導波路の表面近傍には拘束されていない ¾光物質が励起光に より励起されること、 およびノまたは光導波路の表面近傍には拘束されていない ¾光物質が放射する蜇光が出射されることも防止することができ、 ひいては光学 的測定感度 （S / N比） を高めることができる。
請求项 1 2の光学的測定方法は、 上記光学的測定方法として、 光導波路を通し て反応槽に導入されるように励起光を照射するとともに、 蛍光物質が放射する蛍 光のうち、 光導波路内を反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路の表面近 傍の光学的特性を測定する方法を採 fflしている。
詰求 ¾ 1 2の光学的測定方法であれば、 上記光学的測定方法として、 光導波路 を通して反応槽に導入されるように励起光を照射するとともに、 蛍光物質が放射 する蛍光のうち、 光導波路内を反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路の 表面近傍の光学的特性を測定する方法を採用するのであるから、 光導波路の表面 近傍には拘朿されていない蛍光物質が光導波路を通して導人される励起光により 励起されること、 および/または光導波路の表面近傍には拘束されてい.ない蛍光 物質が放射する: ¾光が光導波路に導入されることを防止することができ、 ひいて は光学的则定感度 （S / N比） を高めることができる。
詰求项 1 3の光学的測定方法は、 上記光学的測定方法として、 光導波路内を全 反射しながら伝播するように励起光を導入するとともに、 蛍光物質が放射する蛍 光のうち、 光導波路を通して外部に放射される成分に基づいて光導波路の表面近 傍の光学的特性を測定する方法を採用している。
詰求¾ 1 3の光学的測定方法であれば、 上記光学的測定方法として、 光導波路 内を全反射しながら伝播するように励起光を導入するとともに、 蛍光物質が放射 する蛍光のうち、 光導波路を通して外部に放射される成分に基づいて光導波路の 表面近傍の光学的特性を測定する方法を採川するのであるから、 光導波路の表 ffij において励起光が散乱されることにより光導波路の表 ώ近傍には 朿されていな い蛍光物質が励起されること、 および Zまたは光導波路の表面近^には拘束され ていない蛍光物質が放射する蛍光が光導波路を通して出射されることを防止する ことができ、 ひいては光学的測定感度 （S Z N比） を高めることができる。
請求 ¾ 1 4の光学的測定方法は、 上記光学的測定方法として、 光導波路を所定 角度で通して反応槽に導入されるように励起光を照射するとともに、 蛍光物質が 放射する蛍光のうち、 励起光と異なる所定角度で光導波路を通して外部に放射さ れる成分に基づいて光導波路の表面近傍の光学的特性を測^する方法を採 fflして いる。
請求項 1 4の光学的则 方法であれば、 上記光学的则定方法として、 光導波路 を所定角度で iffiして反応槽に導人されるように励起光を照射するとともに、 '蛍光 物質が放射する'蛍光のうち、 励起光と異なる所定角度で光導波路を通して外部に 放射される成分に基づいて光導波路の表面近傍の光学的特性を则定する方法を採 wするのであるから、 光導波路の表 ta近傍には拘束されていない' 光物質が光導 波路を通して導入される励起光により励起されること、 および/または光導波路 の表 ώ近傍には拘朿されていない： ¾光物質が放射する ' '光が光導波路を jjfiして出 射されることを防止することができ、 ひいては光学的測定感度 （S / N比） を高 めることができる。
請求項 1 5の光学的则定方法は、 上記蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なく とも一方の波長の光を吸収する性質を有する物質として、 光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する微拉子を採 fflする方法である。 詰求项 1 5の光学的測定方法であれば、 上記蛍光物質の励起波長、 允光波長の 少なくとも一方の波長の光を吸収する性質を^する物質として、 蛍光物質の励起 波長、 ¾光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する微拉子を採 fflするのであ るから、 光導波路の表面近傍には拘束されていない蛍光物質が光導波路を通して 導入される励起光により励起されること、 および または光導波路の表 ϋ近傍に は拘束されていない蛍光物質が放射する蛍光が光導波路に導入されることを防止 することができ、 ひいては光学的測定感度 （S Z N比） を卨めることができる。 請求項〗 6の光学的測定方法は、 上記蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なく とも一方の波長の光を吸収する性踅を有する物質として、 ： 光物質の励起波^、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する水溶性色素を採 fflする方 であ る
請求項 1 6の光学的測定方法であれば、 上記蛍光物質の励起波長、 発光波長の 少なくとも一方の波長の光を吸収する性質を有する物質として、 蛍光物質の励起 波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する水溶性色素を採用するの であるから、 光導波路の表面において励起光が散乱されることにより光導波路の 表面近傍には拘束されていない蛍光物質が励起されること、 および/または光導 波路の表 ώ近傍には拘朿されていない蛍光物質が放射する蛍光が光導波路を通し て出射されることを防止することができ、 ひいては光学的測定感度 （S Z N比） を高めることができる。 図面の簡^な説明 第 1図はこの允明の光学的測定装置の一実施例を示す概略縱断面囟である。 笫 2図はカーボンブラック微拉了-の分散体の濃度に対するェンドボイント信号 およびオフセッ ト信号の変化を示す図である。
第 3図は蛍光免疫測定信号の経時変化を示す図である。
第 4図はシアン 1 Pと B 1 u e 5 0 pの吸光度の波長異存性を示す図である。 第 5図は觉光免疫測定 ί言号の経時変化を示す図である。
第 6図はこの允明の光学的測定装置の他の実施例を模式的に示す縱断面図であ る ο
第 7図はこの発明の光学的測定装置のさらに他の実施例を模式的に示す縱断面 図である。
第 8図はこの発明の光学的測定装置のさらに他の実施例を模式的に示す絨断面図 である。
第 9図はこの発明の光学的測定方法の一実施例を説明するフローチャー トであ る ο
第 1 0 1 ^は囟 9のフローチヤ一卜が適用される光学的測定装置の概略構成を示 すブロック図である。 発明を尖施するための最良の形態 以下、 実施例を示す添付図面によって詳細に説明する。
図 1はこの允明の光学的測定装置の一実施例を示す概略縱断面図であり、 一端 部に励起光導入 fflのプリズム 1 aがー体形成されたスラブ型光導波路 1の一側に 反応槽 2が一休形成されてあるとともに、 スラブ型光導波路 1の上記一側に多数 の抗体 3が固定されてある。 また、 励起光導入 Πのプリズム 1 aを通して導入さ れる励起光の光路と、 プリズム 1 aを通して出射される蛍光の光路とを分離する ダイクロイツクミラ一 4、 励起光光源 5、 および光電了增倍管 からなる受光素 子 6等がスラブ型光導波路 1に対して所定の相対位置に配置されている。
上記の構成の光学的測定装置を用いて蛍光免疫測定を行なう場 Aには、 励起光 光源 5を動作させた状態において先ず測定対象溶液を反応 2に収 して、 測定 対象溶液中の抗原 7との問で抗原抗休反応を行なわせ、 次いで、 反応槽 2から測 定対象溶液を排出して、 ¾光色素 8 aで標識された.擦識抗体 8を含み、 かつ粒径 約 2 0 0 n mのカーボンブラック微粒子の分散休 9 { 0 . 0 4 % ( w / v ) } を 添加してなる試薬溶液を反応 tfi 2に収容することにより、 抗原抗体反応を行なつ た抗原 7との間で抗原 ½休反応を行なわせ、 则定対象溶液中の抗原 7の濃度に対 応する量の標識抗体 8をスラプ型光導波路 1の一側近傍に拘束する。 この一連の 処琿を行なっている間、 励起光に起闪するエバネッセン ト波成分が生じているの みならず、 スラブ型光導波路 1の表面において励起光が散乱されている。 しかし、 試薬溶液にはカーボンブラック微粒子の分散休 9が添加されているのであるから、 励起光散乱成分、 スラブ型光導波路 1の表 ώ近傍に拘束されていない標識抗体 8 の蛍光色素 8 aが放射する蛍光 （以下、 試薬迷光と称する） が効果的に吸光され、 光学的免疫測定の S Z N比を著しく卨めることができる。 図 2はカーボンブラ ック微粒子の分散体の濃度に対するェン ドボイン ト ί3号およびオフセッ ト信号の 変化を示す図であり、 aがエンドポイント信号を、 bがオフセッ ト信号をそれぞ れ示している。 但し、 力一ボンブラックの濃度は、 3 ] . 5 % ( w Z v ) の力一 ボンブラック微拉了-を含む吸光剤に対する希釈倍率で ¾示してある。 図 2から明 らかなように、 エンドポイント信号の減少が著しくなだらかであるのに対して、 オフセッ ト信号の減少が著しく急峻であることが分る。 即ち、 カーボンブラック 微粒子の分散体を添加するだけの簡単な処理で、 蛍光免疫測定の S Z N比を著し く卨めることができる。 尚、 ェンドボイント信号の低下が 1 0 %以内であり、 し かもオフセッ ト信号が低下している範囲を 効範囲と定めれば、 力一ボンブラッ ク微粒子を含む吸光剤の希釈倍率は 1 0— 4〜 1 0 — になる。 これをカーボン ブラック微粒子の濃度に換算すると、 ほぼ 0 . 0 0 4〜 0 . 3 %になる。
また、 カーボンブラック微粒子の分散体を添加した場^、 添加しない場合のそ れぞれに対応する蛍光免疫測定^号の経 Π.Ϊ変化を図 3に示す。 尚、 図 3中 aが前 者の場 erを、 bが後者の埸 ^をそれぞれ示している。 図 3から明らかなように、 カーボンブラック微拉子を添加していない場合には、 bに示すように信 "^が大きくなるだけでなく、 試薬迷光も大きくなる。 これに対 'して、 カーボンブラック微粒子を添加した場合には、 aに示すように信号がやや 小さくなるが、 試薬迷光が著しく小さぐなるので、 Sノ N比を著しく高めること ができる。
尚、 カーボンブラック微粒子に代えて、 プラチナ、 金等の金属の微粒子、 ポリ スチレン微拉子等を採用することも可能であり、 同様の効果を達成することがで
3る 0 実施例 2 図 1の構成の光学的測定装置を用い、 励起光光源 5として励起波長が 6> 3 3 n πιの H e — N eレーザを用い、 標識抗体およびシアン I P ( Π本化薬株式会社製） を添加してなる試薬溶液を川いて: ¾光免疫測定を行なった。 また、 標識抗体のみ を添加した試薬溶液、 シアン 1 Pに代えて B 1 u e 5 0 p (日本化薬株式会社製） を添加してなる試薬溶液をそれぞれ用いて']^光免疫測定を行なった。
この結果、 標識抗体のみを添加した ¾薬溶液を fflいた場合における試薬迷光が 6 1 . 1であったのに対し、 シアン 1 Pを添加した場合には、 試薬迷光が 3 6 . 0になり、 著しい試薬迷光低減効果を達成することができた。 これに対して、 図 4 rl > bで示すように、 上記励起波長 6 3 3 n mの光を吸光しない B 1 u e 5 ϋ p を添加した場合には試薬迷光が 4 9 7であった。 試薬迷光が著しく大きくなつた のは、 B 1 u e 5 ϋ ρが励起光の散乱を助長したためであると思われる。 尚、 図 4中 aはシアン 1 Pの吸光特性を示しており、 波長 6 3 3 n mの光に対してかな り卨ぃ吸光度を有していることが分る。
また、 標識抗体のみを添加した場合、 シアン 1 Pをも添加した場合のそれぞれ に対応する蛍光免疫測定信^の経時変化を囟 5に示す。
図 5から明らかなように、 標識抗体のみを添加した場合には、 bに示すように 信"^が大きくなるだけでなく、 試薬迷光も大きくなる。 これに対して、 'ンアン 1 Pをも添加した場 Aには、 aに示すように β号がやや小さくなる力 <、 ¾薬迷光が 著しく小さくなるので、 S Z N比を著しく卨めることができる。
以上には、 励起光波長に対する吸光度が高い水溶性色素を添加した場合につい て説明したが、 ¾光色素が放射する ¾光の波長に対する吸光度が高い水溶性色素 を採 fflすることが可能であるほか、 励起光波 に対する吸光度および蛍光色素が 放射する ¾光の波長に対する吸光度が卨ぃ水溶性色素を採用することが W能であ り、 その他、 この発明の要旨を変 5!しない範囲内において種々の設 変 Sを施す ことが可能である。
¾施例 3 図 6はこの発 Iリ jの光学的測定装置の他の:^施例を模式的に示す縦断 ώ図であり、 —端部に^号光導出 fflのプリズム 1 1 aが一休形成されたスラブ型光導波路 1 1 の一側に反応 hS l 2が一体形成されてあるとともに、 スラブ型光導波路 1 1の上 記一側に多数の抗体 1 3が同定されてある。 また、 号光導出 fflのプリズム 1 1 aを通して導出きれる信号光を図示しないシャープ力ッ トフィルタ等を介して光 電子增倍管からなる受光素子 1 6に導いている。 さらに、 レーザ光源等からなる 励起光光源 1 5からの出射光をコリメ一夕レンズ 1 4 a、 ニュー トラルデンシテ ィフィルタ （以下、 N Dフィルタと略称する） 1 4 b等を通して上記スラブ型光 導波路 1 1の、 上記一側と対向する他側に甲 Ιΰί波として照射し、 スラブ型光導波 路〗 1を厚み方向に通して反応槽 1 2に導入している。 また、 上記励起光光源 1 5は、 図示しない温度制御部によってその温度が制御され、 ひいては出射光強度 の変動が防 lhされている。 さらに、 上記スラブ型光導波路 1 〗および反応槽 1 2 は、 励起光の光蚰 （またはこの光軸と平行な蚰） と交差せず、 しかも信号光の光 幸由 （またはこの光幸由と平行な軸） とも交差しない面 （図 6において紙面に垂直な 方向の面、 以下、 単に側面と称する） に黒色の塗料等が塗布されている。 したが つて、 上記側面から光が出射することを未然に防止-し、 仮に光が出射したと仮定 した埸合に、 出射した光が種々の経路を経て受光素子 1 6により受光される可能 性があるので、 このような光が受光素子 1 6に入射することを未然に防 il .する。 もちろん、 上記側 ϋを通して外部から光が入射することも防止できる。 上記の構成の光学的測定装置を川いて蛍光免疫測定を行なう場合には、 励起光 光源〗 5を動作させた状態において先ず測定対象溶液を反応槽〗 2に収容して、 測定対象溶液巾の抗原 17とスラブ型光導波路 1 1に固定されている抗体 13と の問で抗原抗体反応を行なわせ、 次いで、 反応槽 12から測定対象溶液を排出し て、 ^光色素 18 aで標識された標識抗体 18を含み、 かつ、 所望の. 径のカー ボンブラック微粒子 1 9 (所望の濃度） を添加してなる試薬溶液を反応槽 1 2に 収容することにより、 抗原抗体反応を行なつた抗原 17との間で抗原抗体反応を 行なわせ、 则定対象溶液中の抗原 1 7の濃度に対応する量の標識抗体 18をスラ ブ型光導波路 1 1の一側近傍に抅朿する。 この一連の処理を行なっている間、 励 起光に起囚する平面波はスラブ型光導波路 1 〗を厚み方向に通して反応槽 1 2内 に導入されている。 しかし、 試薬溶液にはカーボンブラック微粒子 19が添加さ れているのであるから、 上記平面波が反応槽] 2の内部において早期に効果的に 吸光され、 スラブ型光導波路 1 1の表面から離れた位置における標識抗体 18の 蛍光色素 1 8 aを励起するという不都合を大幅に低減することができる。 また、 仮に、 スラブ型光導波路 1 1の表 ώから離れた位置における標識抗体 18の' il光 色素 18 aが蛍光を放射しても、 この蛍光が効果的に吸光され、 スラブ型光導波 路 1 1内を伝播する信号光に混人される nj能性を大幅に低減することができる。 したがって、 光学的免疫測定感度 （SZN比） を著しく高めることができる。 上記の構成の光学的測定装笸において、 スラブ型光導波路 1 1の上^—側に多 数の抗体 1 3を固定する代わりに、 ブロッキング剤として、 ミルクプロテイン原 液とアジ化ナトリウム （N a N 3 ； ϋ. 02%) とを混合したものをコーティ ン グしてなるものを用い、 力一ボンブラック微粒子 1 9 (希釈液で希釈して 1重量 %に設定したもの） が添加された試薬 (CM 1 CC a r b o x ym e t h y l i n d o c y a n i n e) — I g G ( I rn m u n o g 1 o b u 1 i n - G , 4 μ g/m 1 } 、 カーボンブラック微粒子 19が添加されていない試薬 (CM I - 1 g G, 4 // g/m 1 ) を 400 /z 1注入して、 注入前後の出力光強度を则定した。 また、 上記の構成のスラブ型光導波路 1 1の信 光導出 ώに近接する ώに迷光遮 光のために、 黒色の塗料等を塗布してなるものを用い、 カーボンブラック微粒子
19 (希釈液で希釈して に設定したもの） が添加された試薬 （CM I — I g G, 4 μ g/m \ , カーボンブラック微粒子 1 9が添加されていない試薬 (CM I - I g G, 4 g/m 1 ) を 4 ϋ ϋ〃 〗注入して、 注入前後の出力光強 度を測定した。 尚、 この測定に当っては、 励起光光源 1 5としてレーザ光源を ffl い、 出力を 3 m Wに設定し、 N Dフィル夕により 1 0 %カッ トし、 3 x l 0 mm の平面波をスラブ型光導波路 1 1 の下部から照射した。
上記測定の結 、 カーボンブラック微粒子 1 9を添加していない試薬を用い、 スラブ型光導波路 1 1に迷光遮光のための ¾色の塗料等を塗布していない場合に は、 試薬注入前後の信号値 （光？ S子增倍管の出力パルス数であり、 出力光強度に 対応する） は、 0. 239 7 k i l o u l s e e r s e c o n d (以 0 ド、 k p p sと略称する） ， 14 ϋ. 20 1 6 k p p sであり、 力一ボンブラッ ク微拉子 1 9を添加していない試薬を用い、 スラブ型光導波路 1 1 に迷光遮光の ための黒色の塗料等を塗布した場合には、 試薬注入前後の信号 liSは、 ϋ. 2 2 3 4 k p p s , 4 2. 4 969 k p p sであった。 また、 カーボンブラック微拉子 1 9を添加した試薬を用い、 スラブ型光導波路 1 1に迷光遮光のための黒色の塗5 料等を塗布していない場合には、 試薬注入前後の出力光強度は、 0. 27 1 7 k p p s , ϋ. 2 563 k p p sであり、 カーボンブラック微 f立子 1 9を添加した 試薬を用い、 スラブ型光導波路 1 1に迷光遮光のための^色の塗料等を塗布した 場合には、 試薬注人前後の信^値は、 ϋ. 2048 k p p s , ϋ. 2 ϋ 7 6 k ρ
Ρ Sであった 0
0 これらの測定においては、 ブロッキング剤としてのミルクプロテイン （アジ化 ナトリウム 0, 0 2%混合） がスラブ型光導波路 1 】の表面にコ一ティ ングされ ている関係上、 スラブ型光導波路 1 1の表面近傍には試薬が存在していないこと になる。 また、 試薬注入前の出力光はスラブ型光導波路 1 1 0体の蛍光によるォ フセッ ト値であり、 何れの場合にもほぼ同様の信号値が得られている。 し力、し、 5 試薬注入後においては、 カーボンブラック微粒子 1 9、 迷光遮光 fflの^色塗料等 の塗布の何れも適用されていない場合に最も大きい信^値が得られ、 迷光遮光 ffl の^色塗料等の塗布のみが適 fflされた場合に次に大きい信号値が得られ、 カーボ ンブラック微粒子 1 9が適 fflされた場 ^に試薬注入前とほぼ等しい信 値が得ら れている。 この結果から明らかなように、 前 2¾の場合には試薬迷光がかなり^ 出されているのに対して、 後 2者の場合には試薬迷光を十分に低減できているこ とが分る。 尚、 試薬注入後の 号値が試薬注入前の 号値よりも僅かながら小さ くなつているのは、 試薬注入による屈折率の変化の影響である。
さらに、 ミルクプロテインのコーティ ング （アジ化ナトリウム 0 . 0 2 %混合） を省略した他は上記と同じ構成のスラブ型光導波路 （迷光遮光用の黒色塗料等の 塗布を行なっていないもの） を採用して、 反応槽 1 2に 1重量 96の濃度の着色試 薬インクを 2 0 0 / 1注入し、 注入前後の信号崆を測定したところ、 0 . 0 8 0 k p p s , 1 . 6 0 0 k p p sであった。 この場合には、 スラブ型光導波路 1 1 の ¾面にブロッキング剤としてのミルクプロテイン （アジ化ナトリウム 0 . 0 2 %混合） がコーティ ングされていない関係上、 スラブ型光導波路 1 ] の表面近傍 の励起領域に試薬が 在することとなるので、 ^際の免疫反応による信号成分は 十分に取り出せると推察できる。 また、 上記の则定における着色試薬イ ンク注人 前の信号眩よりも、 ミルクプロテイン （アジ化ナトリウム 0 . 0 2 %混合） をブ ロッキング剂としてスラブ型光導波路 1 1の表面にコーティ ングを施した状態で 測定を行なった前記 4者の試薬注入前の信号値が大きいのは、 ブロッキング剤と してのミルクプロテイン （アジ化ナトリウム 0 , 0 2 9ό¾Α) がスラブ型光導波 路 1 1の^面にコーティ ングされているためであると思われる。
尚、 この実施例においては、 スラブ型光導波路〗 1の下面から反応槽】 2内に 励起光を導入し、 スラブ型光導波路 1 1内を ミ播させ、 プリズム 1 1 aを通して 信号光を出射するようにしているが、 図 7に示すように、 プリズム 1 1 aを通し てスラブ型光導波路 1 1内に励起光を導入して伝播させ、 スラブ型光導波路 1 1 を通してスラブ型光導波路 1 1の下面から出射する 号光を受光素子 1 6により 受光させること、 図 8に示すように、 スラブ型光導波路 1 1の下面に対して所 の角度で励起光を照射して反応槽 1 2內に励起光を導入し、 スラブ型光導波路】 1の下面に対して、 励起光のなす角度と異なる角度でスラブ型光導波路 1 1の下 面から出射する信号光を受光素子 1 6により受光させることが可能である。
また、 図 6〜図 8の光学的測 装置において、 カーボンブラック微拉了に代え て、 プラチナ、 金等の金属の微粒子、 ポリスチレン微拉子等を採用することが可 能であり、 さらに、 カーボンブラック微粒了に代えて、 励起光波長に対する吸光 度が高い水溶性色尜、 泶光色素が放射する货光に Wする吸光度が高い水溶性色素. 上記両光に対する吸光度が高い水溶性色素を採 Wすることも可能で'ある。 実施例 4 図 9はこの発明の光学的測定方法の一実施例を説明するフローチャー トであり、 上記灾施例の何れかに記載された光学的測定装置を用いて光学的測定を行なう場 合を示している。 したがって、 反応槽 2, 12の一区画面を構成するスラブ型光 導波路 1, 11の表面に、 例えば抗体 3, 13が予め固定化されている。
免疫測定の開始が ½示された場合に、 ステップ S P 1において、 反応槽 2， 1 2内に、 分注ノズル 32 a (図 10参照） を用いて则^対象溶液を注入して、 上 記予め固定化されている抗体 3, 13と測定対 gd溶液屮の抗 ½ί7, 17との!1曰 4で 抗原抗体反応を行なわせる。 上記抗原抗体反応を所^時問行なわせた後、 ステツ プ S Ρ 2において、 分注ノズル 32 aを用いて反応槽 2, 12から測定対 ¾溶液 を除去し、 ステップ S P 3において、 所望の濃度の吸光性物質 （蛍光色素の励起 波^、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収する性質を有する物質） を含 有させてなる試薬を、 分注ノズル 32 aを用いて反応槽 2, 12に注入して、 既 に抗 亢休反応を行なってスラブ型光導波路 1, 11の表面近傍に拘束された抗 原 7, 17と試薬中の標識抗体 8, 18との IK]で抗原抗体反応を行なわせる。 ま た、 ステップ S P4において、 抗原抗体反応によりスラブ型光導波路 1, 11の 表面近傍に拘束された標識抗体 8, 18の蛍光色素 8 a, 18 aから放射される 蛍光のうち、 適用される光学的測定装置により定まる： ¾光成分を受光素子 6, 1 6により受光して则定対象溶液中の抗原 7, 17の濃度に対応すべき ίϊ号を得、 ステップ S Ρ 5において、 得られた信号と 'め得られている検量線とに基づいて 測定対象溶液中の抗原 7, 17の濃度を得、 そのまま一連の処理を終了する。
尚、 ステップ S Ρ 3の処理とステップ S Ρ 4の処理とは に行なわれるので ある力;'、 ステップ S P 4の処理をステップ S P 3の処理よりも先に開始すること が好ましく、 スラブ型光導波路 1, 1 1に起因するオフセッ トノイズを、 図示し ない後のデータ処理により ることができる。 また、 ステップ S P 4において ί られる信 ¾としては、 抗原抗体反応の進行により変化する信号値がほぼ飽和する まで待ち、 ほぼ飽和した時点における^号値を るようにしてもよいが、 抗原抗 体反応の進行により変化する信号の時間微分値を算出し続け、 時間微分値の最大 値を採 fflするようにしてもよい。
また、 図 1 ϋは図 9のフローチャー トが適用される光学的測定装置の概略構成 を示すブロック図であり、 図示しない試薬収容槽、 図示しない測定対象溶液収容 槽、 図示しない希釈液収容槽および抗^抗体反応を行なわせる反応槽 1 2を備え、 抗体 1 3が固定されたスラブ型光導波路 1 1が反応槽 1 2の所定面に形成されて いる測定 セル 3 1と、 何れかの槽に溶液を注入し、 または何れかの格から溶液. を吸引して除 ¾するための分注ノズル 3 2 aを備えた分注装 § 3 2と、 測定 fflセ ル 3 1に対して所定位置に配置され、 スラブ型光導波路 1 1に対して所定角度で 励起光を照射するとともに、 スラブ型光導波路〗 1から所定角度で出射される^ 号光を検出することにより免疫反応の程度を検出する光学的測定部 3 3と、 使 者からの指示が入力される指示部 3 4と、 検査対象、 则定項目、 则定数等の条件 に対応して所定のデータを保持するデータ部: 5と、 指示部 3 4およびデ一夕部 3 5の情報に Sづいて分注ノズル 3 2 aの吸引、 吐出および吸引量、 吐出量を制 御する分注コントロ一ラ部 3 6と、 光学的測定部 3および分注コントローラ部 3 6に指令を送るメインコントローラ部 3 7とを している。
この光学的測定装置においては、 図 9のフローチヤ一卜の各ステップに対応し てメインコントローラ部 3 7が対応するデ一夕をデ一夕部 3 5から読み出し、 読 み出されたデータおよび使 ffl者の指示に基づいて分注コントロ一ラ部 3 6を動作 させ、 分注ノズル 3 2 aを制御する。 即ち、 分注ノズル 3 2 aにより測定対象溶 液収容槽から測定対象溶液を吸引し、 分注ノズル 3 2 aを反応槽 1 2まで移動さ せて、 吸引した測定対象溶液を反応槽 1 2に吐出することにより第 1回目の抗原 抗体反応を行なわせる。 但し、 測定対象溶液を希釈する必要がある場合には、 測 定対象溶液を吸引する前、 または後に、 希釈液収容槽から希釈液を吸引する。 そ の後、 分注ノズル 3 2 aにより反応槽 1 2内の測定対象溶液を吸引して図示しな い廃液タンクに吐出する。 次いで、 分注ノズル 3 2 aにより ¾薬収容槽から標識 抗体 1 8およびカーボンブラックの微 ti子 1 9を含む試薬を吸引し、 分注ノズル 3 2 aを反応槽〗 2まで移動させて、 吸引した試薬を反応槽 1 2に吐出すること により第 2回目の抗原抗体反応を行なわせる。 尚、 これらの場合において液体吸 引量の調節は、 例えば、 分注ノズル 3 2 aの吸引量、 吐出量を制御するパルスモ 一夕 （図示せず） に与える単位時閭当りのパルス数を、 分注コン トローラ部' 3 6 により吸引量に対応する最適値に設定することにより達成される。 また、 試薬、 測定対象溶液をこの順に吸引し、 測定対象溶液、 f式薬の順に吐出させることも W 能であり、 この場合には、 試薬と測定対象溶液との問にエアギャップを形成する ことにより、 分注ノズル 3 2 a内における両液の混合を防止することができる。 したがって、 光学的免疫则定を行なう状態において、 反応槽 2 , 1 2内には必 ず光吸収性物質が含有されているのであるから、 上述の実施例からも明らかなよ うに、 試薬迷光を十分に低減して、 光学的免疫測定感度 （S Z N比） を著しく高 めることができる。
尚、 この実施例においては、 反応槽 2 , 1 2内に測定対象溶液を注入して第 1 回 Bの抗原抗体反応を行なわせ、 次いで、 測定対象溶液を除去した後に上記試薬 を注入して第 2回目の抗原抗体反応を行なわせる、 いわゆる 2ステップ法を採 ffl しているが、 予め測定対象溶液と上記試薬とを混合しておく ことにより抗原抗体 反応を行なわせ、 この混合溶液を反応槽 2 , 1 2に注入することにより、 スラブ 型光導波路 1 , 1 1の表 ώに固定化された抗体 3 , 1 3との間で抗) 抗体反応を 行なわせる、 いわゆる 1 ステツプ法を採 fflすることが可能である。
さらに、 以上の何れの実施例においても、 光吸収性物質が予め試薬に含有され ている場合について説明しているが、 試薬注入前、 または試薬注入後に光吸収性 物質を反応槽に注入することが "J能である。 産業上の利用可能性 スラブ型光導波路と一体に反応槽を形成し、 反応槽に測定対象溶液および試薬 を注入し、 かつスラブ型光導波路に励起光を導入してスラブ型光導波路の表而近 傍における光学的特性を計測する測定装置に好適に適†iすることができ、 光学的 測定の Sノ N比を βめることができる。

Claims

特許詰求の範囲
1. 光導波路 （1) 内を全反射しながら伝播するように励起光を導入するこ とにより生じるエバネッセン ト波成分によって光導波路 （1) の表而近傍に拘束 された: ¾ '光物質を励起し、 '光物質が放射する: ¾光のうち、 光導波路 （1) 内を 反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路 （〗） の表而近傍の光学的特性を 測定する光学的測定装證であって、 光導波路 （1) の表 ώを 1の区幽 ώとする反 応槽 （2) に、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸 収する微粒子 （9) (19) を添加してあることを特徴とする光学的測定装置。
2. 光導波路 （1) 内を全反射しながら伝播するように励起光を導入するこ とにより生じるエバネッセント波成分によって光導波路 （1) の表面近傍に拘朿 された蛍光物質を励起し、 蛍光物質が故射する蛍光のうち、 光導波路 （1 ) 内を 全反射しながら伝播する成分に基づいて光導波路 （1) の表 ώ近傍の光学的特性 を測定する光学的则定装置であって、 光導波路 （1) の表而を 1の区画面とする 反応槽 （2) に、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を 吸収する水溶性色素を含 させてあることを特徴とする光学的測定装置。
3. 光物質を含む試薬と測定対象溶液とを収容して所定の反応を行なわせ る反応槽 （2) (12) の一部が光導波路 （1) (1 1 ) で構成されているとと もに、 光導波路 （1) (11) に対して所定の相対 ft度で励起光を照射して: ¾光 物質を励起し、 蛍光物質に起因する蛍光のうち、 光導波路 （1) (1 1) に対し て所定の相対角度で出射される成分を受光して反応槽 （2) (12) 内における 光導波路 （1) (1 1) の表而近 の光学的特性を測定する光学的測定装置であ つて、 上記反応槽 （2) (12) に、 ¾光物質の励起波長、 発光波長の少なくと も一方の波長の光を吸収する性質を有する物質 （9) (1 ) を添加してあるこ とを特徴とする光学的測定装置。
4. 上記光学的測定装置は、 光導波路 （1 1 ) を通して反応槽 （12) に導 入されるように励起光を照射して蛍光物質を励起し、 蛍光物質が放射する '虽光の うち、 光導波路 （] 1) 内を反射しながら伝播する成分に Sづいて光導波路 （1 1 ) の表 ώ近傍の光学的特性を測定するものである請求项 3に記載の光学的測定 装篋。
5. 上記光学的測定装置は、 光導波路 （1 1) 内を全反射しながら伝播する ように励起光を導入することにより生じるエバネッセント波成分によつて光導波 路 （1 1) の表面近傍に拘束された蛍光物質を励起し、 蛍光物質が放射する蛍光 のうち、 光導波路 （11) を通して外部に放射される成分に基づいて光導波路
(1 1) の表面近傍の光学的特性を測定するものである請求項 3に記載の光学的 測定装置。
6. 上記光学的測定装置は、 光導波路 （1 〗） を所定角度で通して反応槽
(12) に導入されるように励起光を照射して' 光物質を励起し、 '盥光物質が放 射する蛍光のうち、 励起光と^なる所定角度で光導波路 （1 1) を通して外部に 放射される成分に基づいて光導波路 （11) の表 tii近傍の光学的特性を測定する ものである請求項 3に記載の光学的測定装置。
7. 上記' 光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収 する性質を する物質 （9) ( 9) は、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少な くとも一方の波長の光を吸収する微粒子である詰求项 3から詰求项 6の何れかに 記載の光学的測定装置。
8. 上記蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の光を吸収 する性質を 'する物質 （9) (1 9) は、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少な くとも一方の波長の光を吸収する水溶性色素である請求项 3から諳求项 6の何れ かに記載の光学的则定装置。
9. 光導波路 （1) の表 ώを 1の 幽 ώとする反応槽 C2) の内部において、 上記光導波路 （] ) の上記表面に固相化されたリガンド （3) と上記反応槽 （2) に注入された測定対象溶液と、 光物質 （8 a) で標識され、 かつ上記反応槽
(2) に注入されたリガンド （8) を含む試薬とで所定の反応を行なわせ、 上記 光導波路 (1) 内を全反射しながら伝播するように励起光を導人するとともに、 蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光導波路 （1 ) 内を反射しながら伝播する成分 に基づいて光導波路 (1) の表面近傍の光学的特性を測定する光学的測定方法で あって、 上記反応槽 （2) 内に、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なく とも一 方の波長の光を吸収する性質を有する微粒 f (9) を含有させた状態で、 上記光 導波路 （1) 内を反射しながら 播する成分を受光して反応槽 (2) 内における 上記光導波路 （1 ) の上記表面近傍の光学的特性を測定することを特徴とする光 学的測定方法。
1 0. 光導波路 （1 ) の表面を 1の区 面 する反応槽 （2) の内部におい て、 上記光導波路 （1) の上記 ¾面に固相化されたリガンド （3) と上記反応槽
(2) に注人された測定対 ¾溶液と、 蛍光物質 （8 a) で標識され、 かつ上記反 応槽 (2) に注入されたリガンド （8) を含む試薬とで所定の反応を行なわせ、 上記光導波路 （1 ) 内を全反射しながら伝播するように励起光を導入するととも に、 ¾光物質が放射する ¾光のうち、 光導波路 （1) 内を反射しながら 播する 成分に基づいて光導波路 （1 ) の表面近傍の光学的特性を測定する光学的測定方 法であって、 上記反応槽 （2) 内に、 ¾光物質の励起波長、 発光波長の少なくと も一方の波畏の光を吸収する性質を有する水溶性色素を含 させた状態で、 上記 光導波路 （1) 内を反射しながら^播する成分を受光して反応槽 (2) 内におけ る上記光導波路 （ 1) の上記表面近傍の光学的特性を測定することを特徴とする 光学的測定方法。
1 1. 光導波路 （1 ) (1 1) の表面を 1の区闹面とする反応槽 （2) (1 2) の内部において、 上記光導波路 （1) (1 1 ) の上記 ¾面に固相化されたリ ガンド （3) (13) と上記反応槽 （2) (12) に注入された測定対象溶液と、 蛍光物質 (8 a) (18 a) で標識され、 かつ上記反応槽 (2) (12) に注入 されたリガンド （8) (18) を含む試薬とで所定の反応を行なわせ、 上記光導 波路 （1) (1 1) に対して所定の相対角度で励起光を照射し、 蛍光物質に起因 する蛍光のうち、 上記光導波路 （1) (1 1) に対して所定の相対角度で出射さ れる成分を受光して反応槽 （2) (12) 内における上記光導波路 （1) (1 1) の上記表面近傍の光学的特性を測定する光学的測定方法であって、 上記反応槽 (2) (12) 内に、 蛍光物質の励起波長、 発光波長の少なくとも一方の波長の 光を吸収する性質を有する物質 （9) (1 9) を含 させた状態で、 上記光導波 路 （1) (1 1) に対して所定の相対角度で出射される成分を受光して反応槽
(2) (1 2) 内における上記光導波路 （1 ) ( 1 1 ) の上記表面近傍の光学的 特性を測定することを特徴とする光学的測^方法。
12. 上記光学的測 方法は、 光導波路 （1 1) を通して反応槽 （12) に 導人されるように励起光を照射するとともに、 蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光導波路 （1 1 ) 内を反射しながら 播する成分に基づいて光導波路 （1 1) の 表面近傍の光学的特性を測定する方法である詰求¾1 1に記載の光学的測定 法 c
13. 上記光学的測定方法は、 光導波路 （1 1) 内を仝反射しながら 播す るように励起光を導入するとともに、 蛍光物質が放射する蛍光のうち、 光導波路 (1 1) を通して外部に放射される成分に基づいて光導波路 (1 1) の表面近傍 の光学的特性を測定する方法である詰求項 1 1に記載の光学的測定方法。
14. 上記光学的測定方法は、 光導波路 （1 1) を所定角度で通して反応槽0 (12) に導入されるように励起光を照射するとともに、 蛍光物質が放射する蛍 光のうち、 励起光と異なる所定角度で光導波路 （1 1) を通して外部に放射され る成分に基づいて光導波路 （1 1 ) の表面近傍の光学的特性を測定する方法であ る請求項 1 1に記載の光学的測定方法。
1 5. 上記蛍光物質の励起波 β、 発光波 ½の少なくとも一方の波: βの光を吸 収する性質を有する物質 （19) は、 蜇光物質の励起波長、 発光波長の少なくと も一方の波 の光を吸収する微粒子 （19) である請求項 1 1から請求項 14の 何れかに記載の光学的^ ^方法。
16. 上記蛍光物質の励起波 ½、 発光波 の少なくとも一方の波長の光を吸 収する性質を有する物質 （19) は、 ¾光物質の励起波長、 発光波長の少なく と も一方の波 の光を吸収する水溶性色素である請求 ¾1 1から請求項 14の何れ かに記載の光学的測^方法。
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