JPH0225749A - 螢光免疫測定における反応開始時点検出方法およびその装置 - Google Patents
螢光免疫測定における反応開始時点検出方法およびその装置Info
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Classifications
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
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- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
この発明は螢光測定における測定開始時点検出方法およ
びその装置に関し、さらに詳細にいえば、光導波路に励
起光を導入することにより、抗原抗体反応の結果光導波
路の表面近傍に存在する螢光色素を励起し、螢光色素か
ら放射される螢光に基いて抗原または抗体の有無を測定
する免疫測定において、抗原抗体反応の開始時点を検出
するための方法および装置に関する。
びその装置に関し、さらに詳細にいえば、光導波路に励
起光を導入することにより、抗原抗体反応の結果光導波
路の表面近傍に存在する螢光色素を励起し、螢光色素か
ら放射される螢光に基いて抗原または抗体の有無を測定
する免疫測定において、抗原抗体反応の開始時点を検出
するための方法および装置に関する。
〈従来の技術、および発明が解決しようとする課題〉
従来から抗原または抗体の有無を測定するために、放射
免疫測定方法および螢光免疫測定方法が提供されている
が、標識抗体の標識が容易であること、および励起光の
導入が容易であることに着目して、光導波路の表面に予
め抗体を固定しておき、上記光導波路に励起光を導入す
るとともに、免疫測定対象溶液および螢光色素で標識さ
れた標識抗体をこの順に光導波路の表面に注入する光導
波型螢光免疫ΔＩＩ定方決方法供されている。
免疫測定方法および螢光免疫測定方法が提供されている
が、標識抗体の標識が容易であること、および励起光の
導入が容易であることに着目して、光導波路の表面に予
め抗体を固定しておき、上記光導波路に励起光を導入す
るとともに、免疫測定対象溶液および螢光色素で標識さ
れた標識抗体をこの順に光導波路の表面に注入する光導
波型螢光免疫ΔＩＩ定方決方法供されている。
上記先導波型螢光免疫測定方法においては、免疫測定対
象溶液を注入することにより、光導波路の表面に予め固
定された抗体のうち、免疫測定対象溶液中に存在する抗
原の量に対応する抗体のみが抗原抗体反応を行なう。次
いで標識抗体を注入すれば、抗原抗体反応を行なった抗
原との間で抗原抗体反応を行なうので、抗原の量に対応
する標識抗体のみが上記予め固定されている抗体と間接
的に結合される。
象溶液を注入することにより、光導波路の表面に予め固
定された抗体のうち、免疫測定対象溶液中に存在する抗
原の量に対応する抗体のみが抗原抗体反応を行なう。次
いで標識抗体を注入すれば、抗原抗体反応を行なった抗
原との間で抗原抗体反応を行なうので、抗原の量に対応
する標識抗体のみが上記予め固定されている抗体と間接
的に結合される。
したがって、光導波路に導入される励起光が光導波路の
表面からしみ出ることに起因して、上記間接的に結合さ
れた標識抗体の螢光色素が励起され、螢光を発すること
になる。そして、残余の標識抗体の螢光色素は励起され
ないのであるから、上記螢光の強度を測定することによ
り免疫の程度を検出することができる。
表面からしみ出ることに起因して、上記間接的に結合さ
れた標識抗体の螢光色素が励起され、螢光を発すること
になる。そして、残余の標識抗体の螢光色素は励起され
ないのであるから、上記螢光の強度を測定することによ
り免疫の程度を検出することができる。
また、螢光免疫測定方法は、抗原抗体反応が進行して平
衡がとれた状態における螢光強度に基く免疫測定方法（
以下、ＥＮＤ ＰＯＩＮＴ法と略称する）および平衡
がとれるまでの間における螢光強度の変化率に基く免疫
測定方法（以下、ＲＡＴＥ ＡＳＳＡＹ法と略称する
）に区分されている。
衡がとれた状態における螢光強度に基く免疫測定方法（
以下、ＥＮＤ ＰＯＩＮＴ法と略称する）および平衡
がとれるまでの間における螢光強度の変化率に基く免疫
測定方法（以下、ＲＡＴＥ ＡＳＳＡＹ法と略称する
）に区分されている。
上記ＥＮＤ ＰＯＩＮＴ法においては、抗原抗体反応
開始後数１０分が経過して完全平衡状態になった時点に
おける螢光強度に基いて免疫測定を行なうのであるから
、測定時間の誤差は余り問題にならず、かなり高精度の
免疫測定を行なうことができる。
開始後数１０分が経過して完全平衡状態になった時点に
おける螢光強度に基いて免疫測定を行なうのであるから
、測定時間の誤差は余り問題にならず、かなり高精度の
免疫測定を行なうことができる。
逆に、ＲＡＴＥ ＡＳＳＡＹ法が適用されるレーザネ
フエロメトリ（Ｌａｓｅｒ ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ
） 、ＦＰＩＡｌ、光導波路を用いた螢光測定等におい
ては、抗原抗体反応を開始した後、所定時間（例えば３
０秒、１分等適宜時間）が経過した時点における螢光強
度に基いて免疫測定を行なうのであるから、抗原抗体反
応開始時点を正確に判別する必要がある。そして、この
ような必要性を満足させるために、自動送液機構を具備
させることが考えられるが、自動送液機構は著しく大型
であるとともに高価であるから、螢光免疫測定装置を小
形化し、かつローコスト化することができないという問
題がある。特に、励起光を光導波路に導入するようにし
た螢光免疫測定装置においては、光学系を含む全体構成
を小形化できるにも拘らず自動送液機構が大型であるか
ら全体として大型化してしまうのである。
フエロメトリ（Ｌａｓｅｒ ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ
） 、ＦＰＩＡｌ、光導波路を用いた螢光測定等におい
ては、抗原抗体反応を開始した後、所定時間（例えば３
０秒、１分等適宜時間）が経過した時点における螢光強
度に基いて免疫測定を行なうのであるから、抗原抗体反
応開始時点を正確に判別する必要がある。そして、この
ような必要性を満足させるために、自動送液機構を具備
させることが考えられるが、自動送液機構は著しく大型
であるとともに高価であるから、螢光免疫測定装置を小
形化し、かつローコスト化することができないという問
題がある。特に、励起光を光導波路に導入するようにし
た螢光免疫測定装置においては、光学系を含む全体構成
を小形化できるにも拘らず自動送液機構が大型であるか
ら全体として大型化してしまうのである。
また、本件発明者は、光導波路に導入された励起光によ
り励起される螢光色素から放射される螢光が測定対象溶
液の注入時点、即ち、反応開始時点において不連続に変
化することを見出し、螢光の不連続点を検出することを
考えたが、螢光のレベルと比較して励起光のレベルが著
しく高いこと、励起光をカットするための光学フィルタ
の特性が不十分であること、光導波路の側面が十分には
平坦化されていないことおよび不連続な部分における信
号差が比較的小さく、ノイズ成分による影響を受けやす
いこと等の原因で不連続点を正確に特定することが困難
であるという問題を冑していることが分った。
り励起される螢光色素から放射される螢光が測定対象溶
液の注入時点、即ち、反応開始時点において不連続に変
化することを見出し、螢光の不連続点を検出することを
考えたが、螢光のレベルと比較して励起光のレベルが著
しく高いこと、励起光をカットするための光学フィルタ
の特性が不十分であること、光導波路の側面が十分には
平坦化されていないことおよび不連続な部分における信
号差が比較的小さく、ノイズ成分による影響を受けやす
いこと等の原因で不連続点を正確に特定することが困難
であるという問題を冑していることが分った。
〈発明の目的〉
この発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、
光導波路に励起光を導入することにより抗原抗体反応の
量に対応する螢光を励起させ、励起された螢光に基いて
抗原または抗体の有無の測定を行なう場合において、螢
光免疫測定装置全体として大型化することなく反応開始
時点を正確に検出するための方法およびその装置を提供
することを目的としている。
光導波路に励起光を導入することにより抗原抗体反応の
量に対応する螢光を励起させ、励起された螢光に基いて
抗原または抗体の有無の測定を行なう場合において、螢
光免疫測定装置全体として大型化することなく反応開始
時点を正確に検出するための方法およびその装置を提供
することを目的としている。
く課題を解決するための手段〉
上記の目的を達成するための、この発明の反応開始時点
検出方法は、光導波路に励起光を導入することにより、
抗原抗体反応の結果光導波路の表面近傍に存在させられ
る螢光色素を励起し、螢光色素から放射される螢光に基
いて抗原または抗体の有無を測定する場合において、螢
光標識抗体に加えて螢光色素が単独に添加された測定試
薬を注入することにより抗原抗体反応を行なわせ、放射
される螢光の強度に対応する検出信号の不連続点を検出
することにより螢光免疫測定のための反応開始時点を検
出する方法である。
検出方法は、光導波路に励起光を導入することにより、
抗原抗体反応の結果光導波路の表面近傍に存在させられ
る螢光色素を励起し、螢光色素から放射される螢光に基
いて抗原または抗体の有無を測定する場合において、螢
光標識抗体に加えて螢光色素が単独に添加された測定試
薬を注入することにより抗原抗体反応を行なわせ、放射
される螢光の強度に対応する検出信号の不連続点を検出
することにより螢光免疫測定のための反応開始時点を検
出する方法である。
但し、等方的に放射される螢光の強度に対応する検出信
号としては、螢光強度検出信号に基く時間微分信号であ
ることが好ましい。
号としては、螢光強度検出信号に基く時間微分信号であ
ることが好ましい。
上記の目的を達成するための、この発明の反応開始時点
検出装置は、螢光標識抗体に加えて螢光色素が単独で添
加された測定対象溶液と、光導波路に導入された励起光
により励起され、かつ、放射される螢光の強度に対応す
る電気信号に基いて時間微分信号を生成する微分手段と
、微分手段から出力される時間微分信号を入力として不
連続点を検出する不連続点検出手段とを有している。
検出装置は、螢光標識抗体に加えて螢光色素が単独で添
加された測定対象溶液と、光導波路に導入された励起光
により励起され、かつ、放射される螢光の強度に対応す
る電気信号に基いて時間微分信号を生成する微分手段と
、微分手段から出力される時間微分信号を入力として不
連続点を検出する不連続点検出手段とを有している。
上記の目的を達成するための他の発明の反応開始時点検
出方法は、光導波路に励起光を導入することにより、抗
原抗体反応の結果光導波路の表面近傍に存在させられる
螢光色素を励起し、螢光色素から放射される螢光に基い
て抗原または抗体の有無を測定する場合において、測定
対象溶液非注入状態における光導波路側面を高散乱状態
にしておき、測定試薬注入に伴なう散乱励起光量の急激
な減少点を検出することにより螢光免疫７Ｎ！［定のた
めの反応開始時点を検出する方法である。
出方法は、光導波路に励起光を導入することにより、抗
原抗体反応の結果光導波路の表面近傍に存在させられる
螢光色素を励起し、螢光色素から放射される螢光に基い
て抗原または抗体の有無を測定する場合において、測定
対象溶液非注入状態における光導波路側面を高散乱状態
にしておき、測定試薬注入に伴なう散乱励起光量の急激
な減少点を検出することにより螢光免疫７Ｎ！［定のた
めの反応開始時点を検出する方法である。
上記の目的を達成するための他の発明の反応開始時点検
出装置は、測定対象溶液が注入されるべき光導波路表面
に抗原抗体反応を行なうための基質を含む乾燥層が形成
されている。上記基質としては種々のものが使用可能で
あるが、例えば、固定化抗体等の蛋白、抗原抗体反応を
良好に遂行させるための緩衝液等を乾燥させたものであ
ることが好ましく、特にこれらを凍結乾燥させたもので
あることが一層好ましい。
出装置は、測定対象溶液が注入されるべき光導波路表面
に抗原抗体反応を行なうための基質を含む乾燥層が形成
されている。上記基質としては種々のものが使用可能で
あるが、例えば、固定化抗体等の蛋白、抗原抗体反応を
良好に遂行させるための緩衝液等を乾燥させたものであ
ることが好ましく、特にこれらを凍結乾燥させたもので
あることが一層好ましい。
上記の目的を達成するためのさらに他の発明の反応開始
時点検出装置は、測定対象溶液が注入されるべき光導波
路表面に、光散乱性を有するとともに、可溶性を有する
固体層が形成されている。
時点検出装置は、測定対象溶液が注入されるべき光導波
路表面に、光散乱性を有するとともに、可溶性を有する
固体層が形成されている。
上記可溶性を有する固体層としては種々のものが使用可
能であるが、例えば、可溶性の粉体、顆粒、粒体等から
なる光散乱性の固体であることが好ましい。
能であるが、例えば、可溶性の粉体、顆粒、粒体等から
なる光散乱性の固体であることが好ましい。
く作用〉
以上の反応開始時点検出方法であれば、光導波路に励起
光を導入することにより、抗原抗体反応の結果光導波路
の表面近傍に存在させられる螢光色素を励起し、螢光色
素から放射される螢光に基いて抗原または抗体の有無を
測定する場合において、螢光標識抗体に加えて螢光色素
が単独に添加された測定対象溶液を注入することにより
抗原抗体反応を行なわせ、螢光色素から放射される螢光
の強度に対応する検出信号が抗原抗体反応を開始した時
点において不連続に、かつ急激に変化するのであるから
、不連続点を正確に検出することができ、この不連続点
に基いて螢光免疫ｎノ定のための反応開始時点を検出す
ることができる。
光を導入することにより、抗原抗体反応の結果光導波路
の表面近傍に存在させられる螢光色素を励起し、螢光色
素から放射される螢光に基いて抗原または抗体の有無を
測定する場合において、螢光標識抗体に加えて螢光色素
が単独に添加された測定対象溶液を注入することにより
抗原抗体反応を行なわせ、螢光色素から放射される螢光
の強度に対応する検出信号が抗原抗体反応を開始した時
点において不連続に、かつ急激に変化するのであるから
、不連続点を正確に検出することができ、この不連続点
に基いて螢光免疫ｎノ定のための反応開始時点を検出す
ることができる。
したがって、上記のようにして正確に検出された反応開
始時点を基準として高精度に免疫測定を行なうことがで
きる。
始時点を基準として高精度に免疫測定を行なうことがで
きる。
さらに詳細に説明すると、光導波路の表面に予め抗体を
固定し、好ましくは抗原抗体反応を良好に遂行させるた
めの緩衝液で満たされた光導波路に励起光を導入してい
る。ここで、この励起光による散乱光の強度に対応する
信号がオフセット信号として検出される。そして、この
状態において免疫測定を行なうべき対象溶液に予め螢光
標識抗体に加えて螢光色素を単独で添加した状態で注入
すれば、抗原または抗体の量に対応する量の抗原抗体反
応が行なわれ、光導波路の表面近傍に存在する螢光色素
の量が急激に増加するとともに、単独で添加された螢光
色素の存在によっても光導波路の表面近傍に存在する螢
光色素の量が一層急激に増加するので、上記オフセット
信号を基準として不連続に、かつ急激に変化する信号が
得られる。
固定し、好ましくは抗原抗体反応を良好に遂行させるた
めの緩衝液で満たされた光導波路に励起光を導入してい
る。ここで、この励起光による散乱光の強度に対応する
信号がオフセット信号として検出される。そして、この
状態において免疫測定を行なうべき対象溶液に予め螢光
標識抗体に加えて螢光色素を単独で添加した状態で注入
すれば、抗原または抗体の量に対応する量の抗原抗体反
応が行なわれ、光導波路の表面近傍に存在する螢光色素
の量が急激に増加するとともに、単独で添加された螢光
色素の存在によっても光導波路の表面近傍に存在する螢
光色素の量が一層急激に増加するので、上記オフセット
信号を基準として不連続に、かつ急激に変化する信号が
得られる。
したがって、この不連続点を反応開始時点として検出す
れば、反応開始時点の検出精度が向上することに伴なっ
て免疫測定精度を向上させることができる。
れば、反応開始時点の検出精度が向上することに伴なっ
て免疫測定精度を向上させることができる。
そして、放射される螢光の強度に対応する検出信号が、
螢光強度検出信号に基く時間微分信号である場合には、
螢光強度検出信号の不連続点に対応して顕著に変化する
時間微分信号が得られるので、反応開始時点の検出を高
精度化することができる。
螢光強度検出信号に基く時間微分信号である場合には、
螢光強度検出信号の不連続点に対応して顕著に変化する
時間微分信号が得られるので、反応開始時点の検出を高
精度化することができる。
上記の構成の反応開始時点検出装置であれば、光導波路
に励起光を導入することにより、抗原抗体反応の結果光
導波路の表面近傍に存在させられる螢光色素を励起し、
螢光色素から放射される螢光に基いて抗原または抗体の
有無を測定する場合において、予め螢光標識抗体に加え
て螢光色素が単独で添加された測定対象溶液を光導波路
の表面に注入すれば、単独で添加された螢光色素および
抗原抗体反応に起因して放射される螢光強度が不連続に
、かつ急激に変化する。そして、上記螢光強度に対応す
る電気信号を微分手段に供給することにより、不連続部
分に対応して顕著に変化する時間微分信号を得ることが
できるので、不連続点検出手段により反応開始時点とし
ての不連続点を検出することができる。
に励起光を導入することにより、抗原抗体反応の結果光
導波路の表面近傍に存在させられる螢光色素を励起し、
螢光色素から放射される螢光に基いて抗原または抗体の
有無を測定する場合において、予め螢光標識抗体に加え
て螢光色素が単独で添加された測定対象溶液を光導波路
の表面に注入すれば、単独で添加された螢光色素および
抗原抗体反応に起因して放射される螢光強度が不連続に
、かつ急激に変化する。そして、上記螢光強度に対応す
る電気信号を微分手段に供給することにより、不連続部
分に対応して顕著に変化する時間微分信号を得ることが
できるので、不連続点検出手段により反応開始時点とし
ての不連続点を検出することができる。
第４の反応開始時点検出方法であれば、測定対象溶液非
注入状態における光導波路表面が高散乱状態に保持され
ているのであるから、励起光のがなりの割合いが光導波
路の表面において散乱させられ、測定対象溶液を注入す
ることにより高散乱状態が解消させられることにより励
起光に基く散乱光が著しく減少する。したがって、螢光
と比較して著しく強度が高い散乱励起光強度の大幅な減
少に基いて簡単に反応開始時点を検出することができる
。
注入状態における光導波路表面が高散乱状態に保持され
ているのであるから、励起光のがなりの割合いが光導波
路の表面において散乱させられ、測定対象溶液を注入す
ることにより高散乱状態が解消させられることにより励
起光に基く散乱光が著しく減少する。したがって、螢光
と比較して著しく強度が高い散乱励起光強度の大幅な減
少に基いて簡単に反応開始時点を検出することができる
。
但し、この方法においては、散乱励起光強度の大幅な減
少が理想状態と比較してがなりなまってしまう可能性が
あるので、時間微分信号を得ることが好ましく、反応開
始時点の検出精度を向上させることができる。
少が理想状態と比較してがなりなまってしまう可能性が
あるので、時間微分信号を得ることが好ましく、反応開
始時点の検出精度を向上させることができる。
第５の反応開始時点検出装置であれば、測定試薬が注入
されるべき光導波路表面に抗原抗体反応を行なうための
物質を含む乾燥層が形成されているので、測定対象溶液
が注入されるまでは散乱励起光強度が著しく太きく、ｎ
＋定対象溶液が注入されれば、散乱励起光強度が著しく
小さくなるので、散乱励起光強度の著しい減少点を検出
することにより反応開始時点を正確に検出することがで
きる。
されるべき光導波路表面に抗原抗体反応を行なうための
物質を含む乾燥層が形成されているので、測定対象溶液
が注入されるまでは散乱励起光強度が著しく太きく、ｎ
＋定対象溶液が注入されれば、散乱励起光強度が著しく
小さくなるので、散乱励起光強度の著しい減少点を検出
することにより反応開始時点を正確に検出することがで
きる。
第６の反応開始時点検出装置であれば、測定試薬が注入
されるべき光導波路表面に、光散乱性をＨするとともに
、可溶性を有する固体層が形成されているので、測定対
象溶液が注入されるまでは散乱励起光強度が著しく大き
く、ｎ１定対象溶液が注入されれば、散乱励起光強度が
著しく小さくなるので、散乱励起光強度の著しい減少点
を検出することにより反応開始時点を正確に検出するこ
とができる。
されるべき光導波路表面に、光散乱性をＨするとともに
、可溶性を有する固体層が形成されているので、測定対
象溶液が注入されるまでは散乱励起光強度が著しく大き
く、ｎ１定対象溶液が注入されれば、散乱励起光強度が
著しく小さくなるので、散乱励起光強度の著しい減少点
を検出することにより反応開始時点を正確に検出するこ
とができる。
〈実施例〉
以下、実施例を示す添付図面によって詳細に説明する。
第３図はこの発明の螢光測定装置の一実施例を示す概略
図であり、励起光光源（１）から出、射される励起光を
コリメータレンズ（２）および光学フィルタ（３）を通
して光導波路（４）に導入している。そして、光導波路
（４）の表面には測定対象溶液等が注入されるキュベツ
ト（５）が形成されており、キュベツト（５）の底面に
は多数の抗体（６）が固定化されている。さらに、光導
波路（４）のキュベツト（５）と反対側表面に近接させ
て光検出器（７）が配置されているとともに、光導波路
（４）と光検出器（７）との間に励起光成分をカットす
る光学フィルタ（８）が配置されている。また、上記光
検出器（７）から出力される電気信号を入力とする微分
回路（９）と、微分信号の急峻なピークに対応するタイ
ミング信号を生成するピークタイミング生成回路（１０
）と、光検出器（７）から出力される電気信号を入力と
し、タイミング信号を反応開始時点指示信号として所定
の演算を施すことにより免疫ｌＪｊ定信号を生成する演
算回路（１１）とが接続され−いる。
図であり、励起光光源（１）から出、射される励起光を
コリメータレンズ（２）および光学フィルタ（３）を通
して光導波路（４）に導入している。そして、光導波路
（４）の表面には測定対象溶液等が注入されるキュベツ
ト（５）が形成されており、キュベツト（５）の底面に
は多数の抗体（６）が固定化されている。さらに、光導
波路（４）のキュベツト（５）と反対側表面に近接させ
て光検出器（７）が配置されているとともに、光導波路
（４）と光検出器（７）との間に励起光成分をカットす
る光学フィルタ（８）が配置されている。また、上記光
検出器（７）から出力される電気信号を入力とする微分
回路（９）と、微分信号の急峻なピークに対応するタイ
ミング信号を生成するピークタイミング生成回路（１０
）と、光検出器（７）から出力される電気信号を入力と
し、タイミング信号を反応開始時点指示信号として所定
の演算を施すことにより免疫ｌＪｊ定信号を生成する演
算回路（１１）とが接続され−いる。
第１図は免疫／ＩＪＩ定動作を説明する概略図であり、
当初は第１図Ａに示すようにキュベツト（５）の底面に
抗体（６）が固定されただけの光導波路（４）に励起光
を導入している。そして、上記キュベツト（５）に抗原
（１８）のみを含む７７ｇ１定対象溶液を注入する。そ
の後、キュベツト（５）の内容物は、上記測定対象溶液
をそのままにしておくか、好ましくは抗原抗体反応を良
好に遂行させるための緩衝液で満たされた光導波路（４
）に励起光を導入する。
当初は第１図Ａに示すようにキュベツト（５）の底面に
抗体（６）が固定されただけの光導波路（４）に励起光
を導入している。そして、上記キュベツト（５）に抗原
（１８）のみを含む７７ｇ１定対象溶液を注入する。そ
の後、キュベツト（５）の内容物は、上記測定対象溶液
をそのままにしておくか、好ましくは抗原抗体反応を良
好に遂行させるための緩衝液で満たされた光導波路（４
）に励起光を導入する。
ここで、この励起光による散乱光の強度に対応する電気
信号（第２図中頭域Ｒ１参照）が光検出器（７）から出
力される。
信号（第２図中頭域Ｒ１参照）が光検出器（７）から出
力される。
その後、第１図Ｂに示すように、上記キュベツト（５）
に、螢光標識抗体（以下、単に標識抗体と略称する）
（１２）に加えて螢光色素（１５）が単独で添加された
測定対象溶液（１７）を注入すれば、単独で添加された
螢光色素（１５）の一部が光導波路（４）の界面近傍に
位置するとともに、測定対象溶液（１７）に含まれてい
る抗原（１６）と、上記固定化された抗体（６）および
標識抗体（１２）との間で抗原抗体反応を行なわれる結
果、標識抗体（１２）を標識している螢光色素（■３）
が光導波路（４）の界面近傍に位置することになる。そ
して、これら光導波路（４）の界面近傍に位置する螢光
色素（１５）が励起光のエバネッセント波成分により励
起されるので、先ず単独で添加された螢光色素（１５）
の影響により放射される螢光の強度が不連続に、かつ大
巾に増加し、次いで抗原抗体反応の進展に伴なって放射
される螢光の強度が連続的に増加する。したがって、光
検出器（７）からは、上記螢光の強度に対応する電気信
号（第２図中頭域Ｒ２参照）を出力する。
に、螢光標識抗体（以下、単に標識抗体と略称する）
（１２）に加えて螢光色素（１５）が単独で添加された
測定対象溶液（１７）を注入すれば、単独で添加された
螢光色素（１５）の一部が光導波路（４）の界面近傍に
位置するとともに、測定対象溶液（１７）に含まれてい
る抗原（１６）と、上記固定化された抗体（６）および
標識抗体（１２）との間で抗原抗体反応を行なわれる結
果、標識抗体（１２）を標識している螢光色素（■３）
が光導波路（４）の界面近傍に位置することになる。そ
して、これら光導波路（４）の界面近傍に位置する螢光
色素（１５）が励起光のエバネッセント波成分により励
起されるので、先ず単独で添加された螢光色素（１５）
の影響により放射される螢光の強度が不連続に、かつ大
巾に増加し、次いで抗原抗体反応の進展に伴なって放射
される螢光の強度が連続的に増加する。したがって、光
検出器（７）からは、上記螢光の強度に対応する電気信
号（第２図中頭域Ｒ２参照）を出力する。
上記電気信号は、微分回路（９）に供給されることによ
り時間微分信号が得られるとともに、そのまま演算回路
（１１）に供給される。そして、上記時間微分信号に基
いてピークタイミング生成回路（１０）において微分信
号の急峻なピークに対応するタイミング信号が生成され
、反応開始時点指示信号として演算回路（１１）に供給
される。したがって、例えば反応開始時点指示信号が供
給された後、予め設定されている所定時間が経過した時
点における螢光強度に対応する電気信号に基いて演算回
路（１１）により免疫１１ＰＩ定信号を生成することが
できる。
り時間微分信号が得られるとともに、そのまま演算回路
（１１）に供給される。そして、上記時間微分信号に基
いてピークタイミング生成回路（１０）において微分信
号の急峻なピークに対応するタイミング信号が生成され
、反応開始時点指示信号として演算回路（１１）に供給
される。したがって、例えば反応開始時点指示信号が供
給された後、予め設定されている所定時間が経過した時
点における螢光強度に対応する電気信号に基いて演算回
路（１１）により免疫１１ＰＩ定信号を生成することが
できる。
上記の説明から明らかなように、この実施例においては
、光検出器（７）から出力される電気信号に基いて反応
開始時点を検出することができるので、螢光免疫測定装
置全体として小形化することができるとともに、ローコ
スト化することができる。
、光検出器（７）から出力される電気信号に基いて反応
開始時点を検出することができるので、螢光免疫測定装
置全体として小形化することができるとともに、ローコ
スト化することができる。
また、螢光色素（１３）で標識された標識抗体（１２）
は抗原抗体反応を最適に行なえる濃度で使用され、この
点においてもローコスト化を達成することができるとと
もに、高精度の免疫測定を行なうことができる。
は抗原抗体反応を最適に行なえる濃度で使用され、この
点においてもローコスト化を達成することができるとと
もに、高精度の免疫測定を行なうことができる。
尚、上記実施例においては、光検出器（力から出力され
る電気信号を時間微分してから反応開始時点指示信号を
得るようにしているが、単独で添加する螢光色素の量を
増加させれば、上記電気信号自体に十分な量の不連続が
生じるので、電気信号に基いて直接反応開始時点指示信
号を得ることが可能である。
る電気信号を時間微分してから反応開始時点指示信号を
得るようにしているが、単独で添加する螢光色素の量を
増加させれば、上記電気信号自体に十分な量の不連続が
生じるので、電気信号に基いて直接反応開始時点指示信
号を得ることが可能である。
〈実施例２〉
第４図は螢光免疫測定装置の他の実施例を示す概略図で
あり、上記実施例と異なる点は、キュベツト（５）の底
面に固定化抗体（Ｉ９）が凍結乾燥されている点および
測定対象溶液（１７）に代えて螢光色素（１５）が単独
で添加されていないＩＴＩＩ定対象溶液（１８）を使用
する点のみであり、他の部分の構成は同一である。
あり、上記実施例と異なる点は、キュベツト（５）の底
面に固定化抗体（Ｉ９）が凍結乾燥されている点および
測定対象溶液（１７）に代えて螢光色素（１５）が単独
で添加されていないＩＴＩＩ定対象溶液（１８）を使用
する点のみであり、他の部分の構成は同一である。
したがって、この実施例の場合には、測定対象溶液（１
８）および測定用試薬（１４）の何れも注入されていな
い状態において、励起光のかなりの量が固定化抗体（１
９）により散乱させられる結果、光検出器のから高レベ
ルの電気信号（第５図中領域Ｒ１参照）が出力される。
８）および測定用試薬（１４）の何れも注入されていな
い状態において、励起光のかなりの量が固定化抗体（１
９）により散乱させられる結果、光検出器のから高レベ
ルの電気信号（第５図中領域Ｒ１参照）が出力される。
そして、抗原抗体反応を行なわせるべく測定用試薬（１
４）および測定対象溶液（１８）をキュベツト（５）に
注入すれば、固定化抗体（１９）の乾燥状態が解消させ
られるので、散乱励起光が急激に減少し、その後は抗原
抗体反応の進展に伴なって放射される螢光強度が連続的
に増加する。この結果、光検出器（７）から−旦急激に
レベルが低下した後、連続的に増加化する電気信号（第
５図中領域Ｒ２参照）が出力される。
４）および測定対象溶液（１８）をキュベツト（５）に
注入すれば、固定化抗体（１９）の乾燥状態が解消させ
られるので、散乱励起光が急激に減少し、その後は抗原
抗体反応の進展に伴なって放射される螢光強度が連続的
に増加する。この結果、光検出器（７）から−旦急激に
レベルが低下した後、連続的に増加化する電気信号（第
５図中領域Ｒ２参照）が出力される。
以上のようにして得られた電気信号は上記実施例と同様
に、微分回路（９）に供給されることにより時間微分信
号が得られるとともに、そのまま演算回路（１１）に供
給される。そして、上記時間微分信号に基いてピークタ
イミング生成回路（１０）において微分信号の急峻なピ
ークに対応するタイミング信号が生成され、反応開始時
点指示信号として演算回路（１１）に供給される。した
がって、例えば反応開始時点指示信号が供給された後、
予め設定されている所定時間が経過した時点における螢
光強度に対応する電気信号に基いて演算回路（１１）に
より免疫測定信号を生成することができる。
に、微分回路（９）に供給されることにより時間微分信
号が得られるとともに、そのまま演算回路（１１）に供
給される。そして、上記時間微分信号に基いてピークタ
イミング生成回路（１０）において微分信号の急峻なピ
ークに対応するタイミング信号が生成され、反応開始時
点指示信号として演算回路（１１）に供給される。した
がって、例えば反応開始時点指示信号が供給された後、
予め設定されている所定時間が経過した時点における螢
光強度に対応する電気信号に基いて演算回路（１１）に
より免疫測定信号を生成することができる。
上記の説明から明らかなように、この実施例においても
、光検出器（７）から出力される電気信号に基いて反応
開始時点を検出することができるので、螢光免疫測定装
置全体として小形化することができるとともに、ローコ
スト化することができる。
、光検出器（７）から出力される電気信号に基いて反応
開始時点を検出することができるので、螢光免疫測定装
置全体として小形化することができるとともに、ローコ
スト化することができる。
また、測定対象溶液（１８）に螢光色素を単独で添加し
ないので、−層のローコスト化を達成することができる
とともに、高精度の免疫測定を行なうことができる。
ないので、−層のローコスト化を達成することができる
とともに、高精度の免疫測定を行なうことができる。
〈実施例３〉
第６図は螢光免疫測定装置のさらに他の実施例を示す概
略図であり、第４図の実施例と異なる点は、光検出器（
７）のほかに光学フィルタを介在させることなく放射さ
れる光を受光する光検出器（２０）を設けた点および光
検出器（７）から出力される電気信号に代えて光検出器
（２０）から出力される電気信号を微分回路（１０）に
供給している点のみであり、他の部分の構成は同一であ
る。
略図であり、第４図の実施例と異なる点は、光検出器（
７）のほかに光学フィルタを介在させることなく放射さ
れる光を受光する光検出器（２０）を設けた点および光
検出器（７）から出力される電気信号に代えて光検出器
（２０）から出力される電気信号を微分回路（１０）に
供給している点のみであり、他の部分の構成は同一であ
る。
したがって、この実施例の場合には、測定用試薬（１４
）および測定対象溶液（１８）を注入する前後において
第７図に示すように階段状に変化する電気信号が光検出
器（２０）から出力されるので、微分回路（１０）にお
いて反応開始時点指示信号を得ることができる。そして
、反応開始時点指示信号が正確に得られることにより、
演算回路（１１）において正確な免疫測定信号を生成す
ることかできる。
）および測定対象溶液（１８）を注入する前後において
第７図に示すように階段状に変化する電気信号が光検出
器（２０）から出力されるので、微分回路（１０）にお
いて反応開始時点指示信号を得ることができる。そして
、反応開始時点指示信号が正確に得られることにより、
演算回路（１１）において正確な免疫測定信号を生成す
ることかできる。
そして、光検出器（２ｏ）としては、光電子増倍管を用
いる必要がないので、光検出器の数が増加してもコスト
アップを大巾に抑制することができる。
いる必要がないので、光検出器の数が増加してもコスト
アップを大巾に抑制することができる。
尚、この実施例の場合には、光検出器（２ｏ）からの出
力信号に基いて光検出器（７）からの出力信号を補正す
ることもでき、この場合には、光学フィルタ（８）によ
り励起光が完全にカットされなくても、励起光の影響を
完全に排除して正確な免疫測定信号を生成することがで
きる。
力信号に基いて光検出器（７）からの出力信号を補正す
ることもでき、この場合には、光学フィルタ（８）によ
り励起光が完全にカットされなくても、励起光の影響を
完全に排除して正確な免疫測定信号を生成することがで
きる。
また、上記実施例においても、光検出器（２ｏ）から出
力される電気信号を時間微分してから反応開始時点指示
信号を得るようにしているが、信号変化量が十分に大き
いのであるから微分回路（１０）を省略して、直接反応
開始時点指示信号を得ることが可能である。
力される電気信号を時間微分してから反応開始時点指示
信号を得るようにしているが、信号変化量が十分に大き
いのであるから微分回路（１０）を省略して、直接反応
開始時点指示信号を得ることが可能である。
〈実施例４〉
第８図は螢光免疫測定装置のさらに他の実施例を示す概
略図であり、第６図の実施例と異なる点は、光学フィル
タ（３）と光導波路（４）との間にハーフミラ−（２１
）を設け、光導波路（４）から出射されハーフミラ−（
２１）により反射された光を光学フィルタ（８）を通し
て光検出器（７）に導くようにした点のみであり、他の
部分の構成は同一である。
略図であり、第６図の実施例と異なる点は、光学フィル
タ（３）と光導波路（４）との間にハーフミラ−（２１
）を設け、光導波路（４）から出射されハーフミラ−（
２１）により反射された光を光学フィルタ（８）を通し
て光検出器（７）に導くようにした点のみであり、他の
部分の構成は同一である。
したがって、この実施例の場合には、第６図の実施例と
同様に光検出器（２０）から出力される電気信号の不連
続点に基いて反応開始時点指示信号を生成することがで
き、光導波路（４）から出射され、ハーフミラ−（２１
）により反射された後、光学フィルタ（８）を通して光
検出器（７）に導かれる螢光の強度および反応開始時点
指示信号に基いて演算回路（１１）により免疫測定信号
を生成することができる。
同様に光検出器（２０）から出力される電気信号の不連
続点に基いて反応開始時点指示信号を生成することがで
き、光導波路（４）から出射され、ハーフミラ−（２１
）により反射された後、光学フィルタ（８）を通して光
検出器（７）に導かれる螢光の強度および反応開始時点
指示信号に基いて演算回路（１１）により免疫測定信号
を生成することができる。
尚、この実施例の場合にも、光検出器（２ｏ）からの出
力信号に基いて光検出器（７）からの出力信号を補正す
ることができ、この場合には、光学フィルタ（８）によ
り励起光が完全にカットされなくても、励起光の影響を
完全に排除して正確な免疫測定信号を生成することがで
きる。また、上記ハーフミラ−（２１）に代えてダイク
ロイックミラーを用いることが好ましい。
力信号に基いて光検出器（７）からの出力信号を補正す
ることができ、この場合には、光学フィルタ（８）によ
り励起光が完全にカットされなくても、励起光の影響を
完全に排除して正確な免疫測定信号を生成することがで
きる。また、上記ハーフミラ−（２１）に代えてダイク
ロイックミラーを用いることが好ましい。
〈発明の効果〉
以上のように第１の発明は、螢光標識抗体に加えて螢光
色素が単独に添加された測定対象溶液を注入し、抗原抗
体反応を行なわせることにより、螢光色素から放射され
る螢光の強度に対応する検出信号を抗原抗体反応を開始
した時点において不連続に、かつ急激に変化させること
ができ、自動送液機構等を必要とすることなく簡単な構
成で、この不連続点に基いて螢光免疫測定のための反応
開始時点を正確に検出することができ、しかも全体とし
て小形化することができるという特有の効果を奏する。
色素が単独に添加された測定対象溶液を注入し、抗原抗
体反応を行なわせることにより、螢光色素から放射され
る螢光の強度に対応する検出信号を抗原抗体反応を開始
した時点において不連続に、かつ急激に変化させること
ができ、自動送液機構等を必要とすることなく簡単な構
成で、この不連続点に基いて螢光免疫測定のための反応
開始時点を正確に検出することができ、しかも全体とし
て小形化することができるという特有の効果を奏する。
第２の発明は、螢光強度検出信号の不連続点に対応して
顕著に変化する時間微分信号が得られるので、反応開始
時点の検出を高精度化することができるという特有の効
果を奏する。
顕著に変化する時間微分信号が得られるので、反応開始
時点の検出を高精度化することができるという特有の効
果を奏する。
第３の発明は、螢光標識抗体に加えて螢光色素が単独に
添加された測定対象溶液を注入し、抗原抗体反応を行な
わせることにより、螢光色素から放射される螢光の強度
に対応する検出信号を抗原抗体反応を開始した時点にお
いて不連続に、かつ急激に変化させることができるので
、上記検出信号のみに基いて不連続点を検出し、この不
連続点に基いて螢光免疫測定のための反応開始時点を正
確に検出することができ、しかも全体として構成を簡素
化することができるとともに、小形化することができる
という特有の効果を奏する。
添加された測定対象溶液を注入し、抗原抗体反応を行な
わせることにより、螢光色素から放射される螢光の強度
に対応する検出信号を抗原抗体反応を開始した時点にお
いて不連続に、かつ急激に変化させることができるので
、上記検出信号のみに基いて不連続点を検出し、この不
連続点に基いて螢光免疫測定のための反応開始時点を正
確に検出することができ、しかも全体として構成を簡素
化することができるとともに、小形化することができる
という特有の効果を奏する。
第４の発明は、螢光と比較して著しく強度が高い散乱励
起光強度の大幅な減少に基いて簡単に反応開始時点を検
出することができるという特ｑの効果を奏する。
起光強度の大幅な減少に基いて簡単に反応開始時点を検
出することができるという特ｑの効果を奏する。
第５の発明は、散乱励起光強度の著しい減少点を検出す
ることにより反応開始時点を正確に検出することができ
、しかも構成の簡素化および小形化を達成することがで
きるという特有の効果を奏する。
ることにより反応開始時点を正確に検出することができ
、しかも構成の簡素化および小形化を達成することがで
きるという特有の効果を奏する。
第６の発明は、散乱励起光強度の著しい減少点を検出す
ることにより反応開始時点を正確に検出することができ
、しかも構成の簡素化および小形化を達成することがで
きるという特ａの効果を奏する。
ることにより反応開始時点を正確に検出することができ
、しかも構成の簡素化および小形化を達成することがで
きるという特ａの効果を奏する。
第１図はこの発明の螢光免疫ｉｆＪ定手順を説明する図
、 第２図は螢光免疫１１′ｌｌｊ定により得られる信号波
形を示す図、 第３図はこの発明の螢光免疫測定装置の一実施例を示す
概略図、 第４図は螢光免疫測定装置の他の実施例を示す概略図、 第５図は第４図の実施例により得られる信号波形を示す
図、 第６図および第８図は、それぞれ螢光免疫測定装置のさ
らに他の実施例を示す概略図、第７図は第６図の実施例
により得られる信号波形を示す図。
、 第２図は螢光免疫１１′ｌｌｊ定により得られる信号波
形を示す図、 第３図はこの発明の螢光免疫測定装置の一実施例を示す
概略図、 第４図は螢光免疫測定装置の他の実施例を示す概略図、 第５図は第４図の実施例により得られる信号波形を示す
図、 第６図および第８図は、それぞれ螢光免疫測定装置のさ
らに他の実施例を示す概略図、第７図は第６図の実施例
により得られる信号波形を示す図。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、光導波路（４）に励起光を導入することにより、抗
原抗体反応の結果光導波路（４）の表面近傍に存在させ
られる螢光色素（１３）を励起し、螢光色素（１３）か
ら放射される螢光に基いて免疫を測定する螢光免疫測定
方法において、 螢光標識抗体に加えて螢光色素（１５）が単独に添加さ
れた測定対象溶液（１７）を注入することにより抗原抗
体反応を行なわせ、螢光の強度に対応する検出信号の不
連続点を検出することにより螢光免疫測定のための反応
開始時点を検出することを特徴とする螢光免疫測定方法
における反応開始時点検出方法。 ２、螢光の強度に対応する検出信号が、螢光強度検出信
号に基く時間微分信号である上記特許請求の範囲第１項
記載の螢光免疫測定方法における反応開始時点検出方法
。 ３、光導波路（４）に励起光を導入することにより、抗
原抗体反応の結果光導波路（４）の表面近傍に存在させ
られる螢光色素（１３）を励起し、螢光色素（１３）か
ら放射される螢光に基いて免疫を測定する螢光免疫測定
装置において、 螢光標識抗体に加えて螢光色素（１５）が単独に添加さ
れた測定対象溶液（１７）と、螢光の強度に対応する電
気信号に基いて時間微分信号を生成する微分手段（９）
と、微分手段（９）から出力される時間微分信号を入力
として不連続点を検出する不連続点検出手段（１０）を
有していることを特徴とする螢光免疫測定装置における
反応開始時点検出装置。 ４、光導波路（４）に励起光を導入することにより、抗
原抗体反応の結果光導波路（４）の表面近傍に存在させ
られる螢光色素（１３）を励起し、螢光色素（１３）か
ら励起される螢光に基いて免疫を測定する螢光免疫測定
方法において、 測定試薬非注入状態における光導波路表面を高散乱状態
にしておき、測定対象溶液注入に伴なう散乱励起光量の
急激な減少点を検出することにより螢光免疫測定のため
の反応開始時点を検出することを特徴とする螢光免疫測
定方法における反応開始時点検出方法。 ５、光導波路（４）に励起光を導入することにより、抗
原抗体反応の結果光導波路（４）の表面近傍に存在させ
られる螢光色素（１３）を励起し、螢光色素（１３）か
ら励起される螢光に基いて免疫を測定する螢光免疫測定
装置において、測定対象溶液（１７）（１８）が注入さ
れるべき光導波路表面に抗原抗体反応を行なうための物
質を含む乾燥層（１９）が形成されていることを特徴と
する螢光免疫測定装置における反応開始時点検出装置。 ６、光導波路（４）に励起光を導入することにより、抗
原抗体反応の結果光導波路（４）の表面近傍に存在させ
られる螢光色素（１３）を励起し、螢光色素（１３）か
ら励起される螢光に基いて免疫を測定する螢光免疫測定
装置において、測定対象溶液（１７）が注入されるべき
光導波路表面に、光散乱性を有するとともに、可溶性を
有する固体層が形成されていることを特徴とする螢光免
疫測定装置における反応開始時点検出装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63175779A JP2526998B2 (ja) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | 螢光免疫測定における反応開始時点検出方法およびその装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63175779A JP2526998B2 (ja) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | 螢光免疫測定における反応開始時点検出方法およびその装置 |
Publications (2)
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|---|---|
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| JP2526998B2 JP2526998B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=16002117
Family Applications (1)
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| JP63175779A Expired - Lifetime JP2526998B2 (ja) | 1988-07-14 | 1988-07-14 | 螢光免疫測定における反応開始時点検出方法およびその装置 |
Country Status (1)
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994008227A1 (en) * | 1992-10-07 | 1994-04-14 | Daikin Industries, Ltd. | Optically measuring device |
| WO1995006872A1 (fr) * | 1993-08-31 | 1995-03-09 | Daikin Industries, Ltd. | Instrument de mesure optique et procede correspondant |
| JP2003507736A (ja) * | 1999-08-20 | 2003-02-25 | スティフチュンク フュル ディアグノスティシュ フォルシュンク | エバネッセンス場法を用いて物質を測定する方法 |
| US7416173B2 (en) | 2004-05-24 | 2008-08-26 | Tokai Rubber Industries, Ltd. | Pneumatically switchable type fluid-filled engine mount |
| JP2012515897A (ja) * | 2009-01-20 | 2012-07-12 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ，インコーポレイティド | 楔状支持体を通した生体試料アレイの空間的に制御された照明 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS57156544A (en) * | 1976-06-02 | 1982-09-27 | Beckman Instruments Inc | Method of generating signal for introduction of chemical reaction components to chemical analyzer |
| JPS6180047A (ja) * | 1984-09-28 | 1986-04-23 | Shimadzu Corp | 免疫反応測定方法 |
-
1988
- 1988-07-14 JP JP63175779A patent/JP2526998B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
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| JP2012515897A (ja) * | 2009-01-20 | 2012-07-12 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ，インコーポレイティド | 楔状支持体を通した生体試料アレイの空間的に制御された照明 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2526998B2 (ja) | 1996-08-21 |
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