JPS6250662A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、生体物質′の微量を検出測定するために適用
される酵素免疫測定法（エンザイムノアツセイ）に関す
るものである。

〔発明の背景〕

生体物質の微量を検出測定するために用いられる免疫学
的手法の一つとしてラジオイムノアッセイのように取扱
上の注意を要する放射性同位元素を使用する方式でなく
、酵素を抗原抗体反応複合物の標識として用いるように
した酵素免疫測定法が近時注目され、研究開発が盛んに
なっている。

この酵素免疫測定法は、例えばＣ１１ｎｉｃａｌＣｈｅ
ｎｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ　２２４８１２４３−１２５５（
１９７６）に示されるような種々の方法があるが、一般
的には、反応室であるセルの内壁面又はセル内に填加さ
れたビーズの表面に抗原あるいは抗１体を固定した状態
で、抗原あるいは抗体に標識として酵素を給金したコン
シュケートと抗原抗体反応により複合物を生成させ更に
、この酵素の活性作用を受けて、光学的に検知可能な変
化（螢光強度、吸光度、発光強度等の変化）を生ずる基
質を、前記セル内に填加し、この基質の変化を螢光測定
器、吸光光度計等の光学手段で測定し、この測定結果に
基づいて酵素を含む補金物の量ひいては抗原又は抗体の
量を定量するようにしたことを内容とする。

ところで、一般にｘｏ１３以下というような微量な生体
物質の定量を目的とする酵素免疫測定法にあっては、測
定誤差の影響度合が大きく、しだがって測定機器の高性
能化と共に、誤差の発生要因の除去が強く求められると
いってよい。

かかる観点から本発明者は従来一般の酵素免疫測定の手
法を種々検討したところ次の問題点が明らかとなった。

すなわち、一般にこの種の測定は、セル（反応室）を提
供するカップ等の内壁面、カップに填加されたビーズ、
あるいはその他の不溶性担体に固定した状態で抗原−抗
体−酵素の複合物を生成させ、これに基質溶液を接触さ
せて基質に対する酵素反応を開始させ、次いで一定時間
後に停止液を用いて酵素反応を停止させ、その時の基質
螢光強度を測定するか、あるいは停止液を用いずに一定
時間後の基質螢光強度を測定するか、して酵素免疫測定
が行なわれているが、かかる方法では、酵素反応開始か
ら測定時点までの時間の厳密管理が要求されること、酵
素反応開始時点での基質の螢光強度は必ずしも零でなく
ある程度のバラツキをもった値を示すため、所謂零点補
正が必要になること、また基質に現われる螢光強度の増
大変化を示す特性線は、酵素反応の開始後増加率が漸次
低下する曲線を示し、しかも酵素の量によって相違する
二以上の特性曲線の相互はＩＪ　ニヤな相関関係になく
、シたがって測定時間のバラツキで現われる誤差の程度
も、各特性曲線毎に夫々異ること等々の問題点が指摘さ
れるのである。

〔発明の目的〕

本発明は以上のような種々の点に鑑みてなされたもので
あシ、その目的は酵素免疫測定における測定精度の向上
を図るところにある。

また本発明の別の目的は、高精度な測定を、測定操作上
の時間管理等の負担を大きくすることなく実現するとこ
ろにある。

また本発明の更に別の目的は、測定操作を迅速かつ能率
よく行なうことを可能とし、多数の試料の測定処理効率
を向上させることを目的とする。

〔発明の概要〕

、　而して以上の目的を実現するためになされた本発明
よりなる免疫測定法の特徴は、酵素を標識した抗原抗体
反応複合物の該酵素の活性ｐｉ範囲と、基質の螢光測定
時のｐＨ範囲とが重複する組合せ複合物および基質を用
い、前記重複ｐＨ範囲に調整された溶液中で不均一に存
在する前記複合物に基質を接触させながら、酵素反応に
より現われる基質螢光強度の経時的変化を測定し、測定
された螢光強度変化特性線の実質的な直線部分の少なく
とも２点間の傾きから、抗原又は抗体の濃度を検出する
ようＫしたところである。

本発明において前記した構成が採用された理由は次のこ
とによる。

酵素反応によって基質に現われる螢光強度の程度は、溶
液中の基質濃度および酵素の！（すなわち抗原−抗体−
酵素の複合物の量）によって異り、前者の基質濃度を一
定とすれば、螢光強度は酵素の量に依存する。そして前
記ビーズ等の不溶性担体表面に固定した状態で抗原−抗
体−酵素の複合物を生成させ、この複合物に基質を接触
させる不均一系溶液において、酵素反応の現われ方を螢
光強度の変化として詳しく観察すると、酵素反応の開始
初期には螢光強度が実質上直線的に増大する領域のある
ことが認められた。この領域は変化特性線の２点間の傾
きを測定上有意な値（誤差が十分小さい値）として検出
するに十分であり、また前記２点間の傾き（増大率）は
、一定濃度の基質を用いれ、ば溶液中の酵素の量にリニ
ヤに依存すると言って差支えないから、かかる点を測定
する本発明方法が有効なものとして採用されるのである
。

本発明方法において対象となるのは、抗原−抗体一酵素
複合物が不溶性担体表面に固定されて溶液中で不均一に
存在する系のものでちり、不溶性担体としては、セルを
提供する容器の内壁、セルに添加されるビーズ等、ある
いは織布、不織布等が例示される。

また前記した螢光強度の増大が、初期の直線的領域から
漸次増大率の低下する領域に移行するのは、溶液中で不
均一に存在する複合物の酵素反応が、経時的に溶液中で
の基質の拡散に律速されるためと解される。したがって
、前記傾きを検出するための測定２点間の間隔を拡げて
、一層の精度向上を図るには、不溶性相・体を溶液中で
低周波振動させて、反応が拡散により律速されるのが望
ましい場合が多く、例えばセル内に填加した磁性ビーズ
を振動磁界により撮動させることがよい。振動の程度は
、通常１０〜１８０回／―、好ましくは７０〜１２０回
／−がよく、ビーズの振動の場合、ビーズが直線往復動
又は円運動をセル内の全域に渡るようＫすることが好ま
しい。このようなビーズ振動のための装置としては、透
磁性カップ、例えばフェライト等磁性粉（好ましくは常
磁体粉）をボリスチレ／、ＥＶＡ等の樹脂バインダーで
結着した磁性ビーズ、および例えば永久磁石を往復動さ
せるようにして設けられた振動磁界を及ぼす磁石装置等
から構成されたものを挙げることができる。ビーズ表面
への抗原又は抗体の固定は既知の方法によればよい。

本発明における酵素免疫測定法で対象とされる抗原、抗
体は特に限定されるものではない。

また標識される酵素および基質は、酵素の活性ｐＨ範囲
と、基質螢光測定のためのｐ）ｌ範囲とが重複する組合
せのものであればよく、他は格別限定されるものではな
い。

螢光測定は適宜の光学装置を使用して行ない測定結果か
ら検出した螢光強度変化特性線の実質的直線部分の傾き
を予め求められている検量線と対比することで、酵素の
量ひいては抗原量又は抗体量を得ることができる。

〔発明の実施例〕

以下本発明の実施態様を図面に基づいて説明する。

第１図は本発明方法を適用する装置−例の一部構成概要
を示したものでｓ、ｂ、ｉはテストカップ、２はテスト
カップ１内に填加されたビーズ（ビーズの大きさは限定
されないが測定セルの口径の１／２以下程度以下が好ま
しい。）であり、このビーズ表面に固定した状態で抗原
−抗体−酵素の複合体が常法により生成される。

３は基質溶液であり、その螢光測定のだめのｐＨは、前
記酵素の活性ｐＨと一致したものが選択される。

テストカップは、ビーズ２および基質溶液３を図示の如
く双方の填加した状態とされた直後から螢光検出装置に
よる螢光測定が開始される。

本例の螢光検出装置は、光源４、励起側フィルタ５、グ
イクロイックミラー６、集光レンズ７、受光側フィルタ
８、受光センサ９とからなり、受光センサ９で検出され
た信号は適宜増幅器等を介した後マイクロコンピュータ
等の演算回路（図示せず）に入力され、螢光強度変化特
性線を経時的に算出する。第２図のａ、ｂ、ｃはこのよ
うにして算出された螢光強度変化特性線の例を示したも
のであり、測定される各試料中の抗原（又は抗体）の量
は、螢光強度の大きい順にａ　）　ｂ　）　ｃである。

そして、これら各特性線ａ、ｂ、ｃの酵素反応開始の初
期には、第２図中ｔ１〜ｔ２で示した領域で拡散に殆ん
ど影響されない実質的な直線部分が現われる。したがっ
てこの領域内での２点間より、各試料についての螢光強
度増大率（傾き）を検出し、これを検量線と比較するこ
とで高精度な抗原量又は抗体量の測定が実現される。

このような方法によれば、前記特性線の零点補正は不要
であり、しかも増大率（傾き）を算出するための２点間
の時間間隔を正確に管−理すれば、反応開始（例えばテ
ストカップへの基質溶液の注入）の操作の時間管理は特
に要求されることもなく、測定操作処理上の容易化、簡
易化が大幅に実現される利点がある。特に多数の試料の
測定を連続的に行なうような装置の構成にあたっては、
テストカップへの基質溶液注入の時点を厳しく制約され
ないことは装置設計上の自由度を拡大し、その実際上の
利益は極めて大きいものとなる。

第３図は前記例のものにおいてビーズ２′を磁性体とし
、テストカップ１の下方近傍において往復動する棒体１
０上に適宜の間で永久磁石片１１゜１１を固着した形式
のものを示している。

このような例によれば、テストカップ１内のビーズは、
往復動する永久磁石片１１．１１によって該テストカッ
プ１円を往復振動し、この結果得られる螢光強度変化特
性線は、第４図ａ１゜ｂ′、Ｃ′のように、実質的な直
線部分が経時的に長く現われるものとなる。したがって
検出される増大率（傾き）の精度は第１図の例に比べて
一層良好となシ、微量生体物質の定量測定においての効
果は極めて犬となる。

実施例１ 第１図に示した装置を用い、酵素としてアルカリ７オス
フアターゼを標識した複合体を５燗のビーズ１個の表面
に生成した後、４−メチルウンベリフェロンを基質とし
て含む基質溶液（濃度１ｍ　Ｏｔ／Ｌ　ＰＨ８，５）　
ｔｆス）　カッ７’　１内に注入することで、螢光の測
定を行なった。

得られた螢光強度変化特性線は、基質溶液の注入直後か
ら６０秒までの間で実質的な直線部分が現われ、この領
域内の任意の２点間の傾きは、同一試料を対象とした複
数回の試験において誤差０．１　％以下のものであった
。

実施例２ 第３図の例に従い、１．４　ｍのビーズ１０個を９０回
／−ｉ＝の周波数で振動させながら実施例１と同様の試
験を行なった。

この場合螢光強度変化特性線の実質的直線部分は、基質
溶液注入後から６０秒までの間で現われ、この領域内の
任意の２点間の傾きは、同一試料を対象とした複数回の
試験において誤差０．１チ以下のものであった。

〔発明の効果〕

以上述べたようＫ、本発明方法によれば、微量生体物質
の定量を高精度に行なうことができ、しかも誤差の要因
である零点のオフセット、測定処理のための時間管理の
厳密さの要求が軽減ないし無関係となり、その効果は極
めて大なるものである。また更Ｋ、多数の試料を連続的
に処理するための装置を構成する場合に、本発明・方法
によれば装置設計の自由度が大きく得られこの点の効果
も極めて大なるものである。

【図面の簡単な説明】

図面第１図は本発明方法を適用する装置の構成−例を示
す概要図、第２図は同装置によって得られる螢光強度変
化特性線の状態を説明する図、第３図は他の例の装置を
説明する図、第４図は同第３図の装置によって得られる
螢光強度変化特性線の状態を示す図である。 １・・・テストカップ　　２・・・ビーズ３・・・基質
溶液　　　　１１・・・磁石片。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　酵素を標識した抗原抗体反応複合物の該酵素の活性
   ｐＨ範囲と、基質の螢光測定時のｐＨ範囲とが重複する
   組合せを用い、前記重複ｐＨ範囲に調整された溶液中で
   不均一に存在する前記複合物に基質を接触させながら、
   酵素反応により現われる基質螢光強度の経時的変化を測
   定し、端定された螢光強度変化特性線の実質的な直線部
   分の少なくとも２点間の傾きから、抗原又は抗体の濃度
   を検出することを特徴とする酵素免疫測定法。 ２　溶液中の複合物を、不溶性担体表面に固定して存在
   させることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載し
   た酵素免疫測定法。 ３　不溶性担体が、セル内に填加されたビーズであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載した酵素免
   疫測定法。 ４　ビースを、セル内で低周波振動させながら基質螢光
   強度の経時的変化を測定することを特徴とする特許請求
   の範囲第３項に記載した酵素免疫測定法。