WO1994029340A1

WO1994029340A1 - Facteur d'inhibition de la proliferation de cellules tumorales d'origine humaine

Info

Publication number: WO1994029340A1
Application number: PCT/JP1994/000895
Authority: WO
Inventors: Toshi Komurasaki; Kiyoshi Nakazawa; Hitoshi Toyoda; Masayoshi Takahashi; Daisuke Uchida; Kazunori Hanada; Shigezo Udaka
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1993-06-04
Filing date: 1994-06-02
Publication date: 1994-12-22
Also published as: AU6856294A; EP0703242A1; KR100313736B1; CA2164295A1; AU685124B2; KR960702849A; US5783417A

Description

明細書ヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子技術分野

本発明は、新規なヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子、それをコードする D N A断片、その D N A断片を含むヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の発現ブラスミド、その発現プラスミドで形質転換されたバチルス · ブレビス菌、並びにそのバチルス · ブレビス菌を利用したヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の遺伝子工学的製造法に関する。背景技術

従来、抗腫瘍剤として化学療法剤、免疫療法剤などの合成医薬品が広く用いられているが、一般に特異性が低く副作用が強いなどの問題がある。これに対して、組織培養細胞から多くの腫瘍細胞増殖阻害因子が見出されておりこれらの因子は特異性が高く、副作用が低い抗腫瘍剤になり得ると考えられている。このような物質としては、例えばインターフェロン、リンフォトキシン、ガン壊死因子（ T N F ) などが広く知られている。

最近では、ヒト由来の線維芽細胞から得られる腫瘍細胞障害因子（特開平 1 — 1 4 8 1 9 7号公報）、ヒト由来肺癌細胞から得られる腫瘍細胞増殖抑制因子（特開平 1 一 1 8 7 0 9 4 号公報）などが報告されている。一方、 S w i s s マウス胎児から得た細胞から樹立された線維芽細胞様細胞株 3 T 3細胞からいくつかの細胞増殖阻害因子が単離されている。即ち、例えば、

N a t r a j らは静止期の 3 T 3細胞細胞表層から増殖阻害因子が得られることを報告しており〔 P r o c . N a t l . A c a d . S c に U S A, 7 5 , 6 1 1 5 — 6 1 1 9 ( 1 9 7 8 ) 〕、 H a r e l らは、 3 T 3細胞の培養上清から分子量 4 0 k D aの増殖阻害因子が得られることを報告している〔 J . C e l 1 .

P h y s i o l . , 1 1 9， 1 0 1 - 1 0 6 ( 1 9 8

4 ) ； i b i d . , 1 2 3 , 1 3 9 - 1 4 3 ( 1 9 8

5 ) 。しかしながらこれらの増殖阻害因子はいずれも腫瘍細胞に対しては有意な阻害活性を示さないことが知られている。

腫瘍細胞に対して有意な阻害活性を有するマウス由来腫瘍細胞増殖阻害因子として、 S w i s s マウス胎児から樹立された線維芽細胞様細胞株 3 T 3細胞の 1 種である N I H 3 T 3細胞〔 J . V i r o l . ， ±, 5 4 9 ( 1 9 6 9 ) 〕からの継代培養により得られる株化細胞 N I H 3 T 3 — s f 細胞の培養上清から単離精製されたマウス由来腫瘍細胞増殖阻害因子が報告されている（特開平 4 - 2 1 1 6 9 8号公報及び E P 4 6 0 9 1 0 ) 。このマウス由来腫瘍細胞増殖阻害因子は、ヒト前骨髄性白血病細胞、ヒト子宮頸癌由来細胞などの腫瘍細胞に対して強力な増殖阻害活性を有しており新たな腫瘍治療剤として期待されるものである。しかしながらこの阻害因子はマウス由来であるためヒトへ適用した場合の抗原性などの問題が懸念される。発明の開示

本発明者らは、上記した N I H 3 T 3 — s f 細胞の培養上清から単離されたマウス由来腫瘍細胞増殖阻害因子をコードする c D N Aのクローニングに成功しその塩基配列について既に特許出願している（ P C T/ J P 9 2 / 0 1 5 8 0 )

そこで、本発明者らは新たにヒト由来の腫瘍細胞増殖阻害因子を得ることを目的として、上記のマウス由来腫瘍紬胞増殖阻害因子をコードする D N A断片をプローブとして用いてヒト胎盤染色体 D NA由来の D NAライブラリー及びヒト結腸癌細胞由来 c D N Aライブラリーよりヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子と考えられる因子をコードする c D N Aのクローニングを行い、新たなヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子及びそれをコードする D N A断片を見出した。

更に本発明者らは、このヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子をコードする D N A断片を用いて組換え D N A法により該阻害因子を工業的に有利に製造する方法について研究を行い、バチルス · ブレビス菌由来のプロモーター及びシグナルべプチドをコ一ドする D N A断片を調節遺伝子として用い、バチルス · ブレビス菌を宿主として用いて該阻害因子を発現させることにより、菌体外に大量に該阻害因子を分泌することができ該阻害因子の量産化が可能であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の目的は、式（ 1 に示すアミノ酸配列を有するヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子を提供するとにめる

V a l— S e r— I 1 e T h r— L y s— -C y s— S e r— S c r— A β — M e t— A s n— G 1 y— T y r— C y s— L e u— H i s— G 1 y— G 1 n— C y s— I i e— T y r~L e u— V e I— A s p— M e t— S e r— G l n— A s n— T y r— Cy s—A r ^— C y s—

G a' V a 1— G 1 y— T y r— T r— G 1 y— V a 1—A

C y s—G 1 u— H 1 s— P h P h e— L •(1) 本発明の他の目的は、式（ 1 ) に示すアミノ酸配列を有するヒト由来腫瘍細胞阻害因子をコードする D N A断片を提供することにある。

更に、本発明の他の目的は、バチルス ' ブレビス菌由来のプロモーター、バチルス · ブレビス菌由来のシグナルペプチドをコードする D N A断片、及び式（1) に示すアミノ酸配列を有するヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子をコ一ドする D N A断片を含有する D N A配列を提供する

^ とにめる。

更に、本発明の他の目的は、上記の D N A配列を含有するヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の発現プラスミドを提供することにある。

更に本発明の他の目的は、上記の発現プラスミドで形質転換されたバチルス · ブレビス菌を提供することにある。

更に、本発明の他の目的は、上記のバチルス ' ブレビス菌を培養してヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子を発現させて菌体外に分泌させ、次いでその培養液からヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子を回収するヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の製造法である。図面の簡単な説明

第 1 図は、マウス由来腫瘍钿胞増殖阻害因子をコードする D N A断片の塩基配列及びァミノ酸配列を示す。

第 2図は、サザンハイブリダィゼーシヨンによるヒト胎盤染色体 D N A断片の解析図、すなわちオートラジオグラフィーである。

第 3図は、ヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の一部をコ — ドする染色体 D N A断片の概略図（a) 、ヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の一部とマウス由来腫瘍細胞増殖阻害因子の前駆体の c D N A断片の一部との塩基配列の比較 (b) 、マウス由来腫瘍細胞増殖阻害因子の前駆体の一部とのアミノ酸配列の比較（C) を示す。

第 4 図は、ヒト結腸癌細胞である H C T— 1 5細胞から得られた c D N A断片の塩基配列と予想されるァミノ酸配列を示す。 '

第 5 図は、ヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子とマウス由来腫瘍細胞増殖阻害因子のァミノ酸配列の比較を示す。

第 6図は、ヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子をコードする c D N A断片の塩基配列と予想されるァミノ酸配列を示す。

第 7図は、 P C R法による D N A断片の増幅のためにプライマ一として用いたオリゴヌクレオチドを示す。

第 8図は、 N c 0 I 部位およびバチルス · ブレビス菌 4 7の主要菌体外蛋白質の 1 つである MW Pのシグナルぺプチドの C末端領域の一部をコ一ドする D N A配列を含有するプラスミド p B R— A Nの構成を示す。

第 9図は、ヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の遺伝子のクロ一ニングベクターとして用いたプラスミド p K N l 2 0 の構築を示す。

第 1 0図は、プラスミド p K N l 2 0 の開裂及びヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の遺伝子を示す。

第 1 1 図は、ヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の発現プラスミド p B B 2 3 0 の構築を示す。

第 1 2図は、本発明で対象とするヒト由来腫瘍紬胞増殖阻害因子の C 1 8逆相 H P L Cの溶出プロファイルを示すグラフである。第 1 3 図は、ヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子のヒト癌細胞に対する増殖阻害活性を示すグラフである。

第 1 4 図は、ヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子のウェスタンプロッティングを示す写真である _c 発明を実施するため最良の形態

本発明のヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子（以下 h T G 一 7 0 0 又はヒト T G — 7 0 0 という）は、それをコ一ドする D N A断片をクロ一ニングし、その D N A断片を含む発現べクタ一を構築して、宿主細胞に導入し発現させることによって得ることができる。また、 h T G — 7

0 0 をコードする D N A断片からそのァミノ酸配列を明らかにして、そのアミノ酸配列に基づいて化学合成することによって得ることができる。

h T G — 7 0 0 をコードする D N A断片は、そのアミソ酸配列が既に知られているマウス由来腫瘍細胞増殖阻害因子（以下 m T G — 7 0 0 又はマウス T G — 7 0 0 という）をコードする D N A断片をプローブとして用いてヒト細胞由来 c D N Aライブラリーよりクローニングすることにより得ることができる。

m T G _ 7 0 0 は、 3 T 3 細胞由来株化細胞である N

1 H 3 T 3 - s f 細胞の培養上清から単離される物質でありそのアミノ酸配列も特開平 4 一 2 1 1 6 9 8 号公報及び E P 4 6 0 9 1 0 に報告されている。 m T G — 7 0 0 のアミノ酸配列は第 1 図に示した通りであり、この了ミノ酸配列をコードする c D N Aのクローニングは通常の方法により行うことができる。

即ち、先ず N I H 3 T 3 — s ί細胞から m R N Aを単離精製し、これに対応する c D N Aを H製しラムダファージ g t 1 0 に結合し、 i n v i t r oノッケ一ジング法 CH o h n e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A. ， _7_4_， 3 2 5 9 ( 1 9 7 7 ) 〕によりファージ粒子を形成させて c D N Aライブラリーを得る。次いで、 111丁 0— 7 0 0 のァミノ酸配列から推測される複数種類のオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、これをプライマーとして用い、上記の c D N Aライブラリーを铸型として P C R法〔 S a i k i e t a l . S c i e n c e , 2_3 0 , 1 3 5 0 , ( 1 9 8 5 ) 〕により、 m T G— 7 0 0 をコードする各種の D N A断片を増幅させ、これらの塩基配列をジデォキシ · チェイン · 夕一ミネ一夕一法 [ S a n g e r , F e t a に , P r o c . N a t l . A c a d . S c i U S A. , 7 4 , 5 4 6 3 , 1 9 7 7〕により決定し、これらの情報と m T G— 7 0 0 のアミノ酸配列から、 m T G— 7 0 0 をコードする D N Aの塩基配列を決定することができる。このようにして決定される m T G— 7 0 0をコードする D N A断片の塩基配列は第 1 図に示した通りである。

m T G - 7 0 0 をコードする D N A断片をプローブとして用いて、ヒト由来の c D N Aライブラリ一、例えばヒト胎盤染色体 D N Aのライブラリー、ヒト結腸癌細胞由来 c D N Aライブラリーより h T G — 7 0 0 をコードする c D N Aのクローニングを行うことができる。

具体的には、例えば以後に記載する実施例に示した方法を採用することできる。

即ち、先ず第 1 図に示した塩基配列を有する m T G — 7 0 0 をコードする D N A断片を例えば〔 α — ³² P〕 d C T Pでマルチプライム D N A標識システム（アマシャ厶社製）により標識して D N Aプローブを調製する。次いで、このプローブを用いて、ヒト胎盤染色体 D N A (クローンテック社製）を適当な制限酵素、例えば H a e I I I で消化して得られる D N A断片のサザンハイブリダゼーションを行う。このサザンノヽイブリダゼーショ、ノによって、プローブとノヽイブリダィズし、 m T G — 7 0 0 をコードする D N A断片と相同性の高い遺伝子を含有すると考えられる D N A断片を検出しその分子量を推定できる。次いで推定された分子量付近の D N A断片を例えばァガロースゲルから抽出する。

この D N A断片を、例えば市販品のラムダファージ g t l O — E c o R I アームと混合して T 4 D N A リガ一ゼにより両者を結合させてベクタ一を構築する。次いで i n v i t r oパッケージング法によりファージ粒子を形成させてヒト胎盤染色体 D N A断片ライブラリーを調製する。

このライブラリ一について、上記したと同様の D N A プローブ、即ち〔ひ一 ³² P〕 d C T Pで標識した m T G - 7 0 0 をコードする D N A断片を用いてハイブリゼ一ションを行ってスクリ一ニングし、 m T G— 7 0 0 をコ一ドする D N A断片と相同性の高い遺伝子を含むと考えられるクローンを得る。このクローンから D N Aを抽出し、ジデォキシ ' チェイン ' ターミネータ一法によって抽出された D N Aの塩基配列の解析を行う。この解析結果については第 3図に示されている。第 3図から判るように、制限酵素 H a e I I I で消化して得られるヒト胎盤染色体 D N A断片のうち、第 5 5 2番目から第 6 7 5 番目までの塩基配列中に m T G— 7 0 0 と相同性の高いアミノ酸配列を有し h T G— 7 0 0 と予想される蛋白質をコードする D N A断片が含まれていると考えられる。

次いで、 h T G— 7 0 0 をコードする D N A断片を含むと考えられる、ヒト胎盤染色体 D N A断片中の

P s t I 断片（第 3図における第 5 2 0番目から第 6 7 4番目までの塩基配列部分）を〔 α— ³² P〕 d C T Pで標識して D N Aプローブを調製する。この D NAプロ一ブを用いて、ヒト結腸癌細胞である H C T— 1 5細胞 (大日本製薬社製） [Cancer Research. Vol.39, p.1020(1 979) ] の m R N Aから c D N Aを合成しラムダファージ g t 1 0 — E c o R I アームと混合し次いで i n

V i t r oパ一ケージング法によって調製した c D N A ライブラリーのスクリーニングを行う。

かくして D N Aプローブとハイブリダィズするクローンを得、このクローンから D N Aを抽出してジデォキシ ' チェイン · ターミネータ一法によって D N Aの塩基配列を決定し、 m T G - 7 0 0 をコードする D N A断片の塩基配列と対比させて、目的とする h T G— 7 0 0 をコ一ドする D N A断片の塩基配列を決定することができるこのようにして決定される h T G— 7 0 0 をコードする D N A断片の塩基配列は式（ 2 ) で示される。

27 54

GTG TCA ATA ACA AAG TGT AGC TCT GAC ATG AAT GGC TAT TGT TTG CAT GGA CAG

81 108

TCC ATC TAT CTG GTG GAC ATC ACT CAA AAC TAC TGC AGG TCT GAA GTG GGT TAT

135

ACT GGT GTC CGA TGT GAA CAC πε ΤΓΓ ΠΑ

このようにして決定された式（ 2 ) の塩基配列を有する h T G— 7 0 0 をコードする D NA断片は、例えばリン酸トリエステル法〔 L e t s i n g e r e t a 1 . , J . Am. C h e m. S o c . , 9 1 , 3 3 5 0 ( 1 9 6 9 ) 〕などの公知の方法により化学的に合成することもできる。

あるいは、前記した H C T— 1 5細胞の m R N Aから調製される c D NAライブラリ一を铸型にして、 h T G - 7 0 0 をコードする D N A断片の 5 ' 末端部分及び 3 ' 末端部分に相当するオリゴヌクレオチドを合成してプライマーとして用いて P C R法〔 S a i k i e t a に， S c i e n c e , 2 3 0 , 1 3 5 0 ( 1 9 8 5 ) 〕を利用して、 h T G— 7 0 0 をコードする D N A 断片を大量に得ることもできる。 _f

力、くしてクローニングされた h T G— 7 0 0 をコードする D N A断片の塩基配列から、 h T G— 7 0 0 のアミノ酸配列は式（ 1 ) で示されるアミノ酸配列であることが決定される。

V a 1一 S e r— I 1 c— T h r— L y s— C y 8— S e r— S e r―

A s 一 A 5 n一 G 1 y— T y r一 C y s— L e u— H s一

G I y— G 1 n— C y s— I 1 T y r一 L e u— V a Ά 5 '

M e t一 S e G 1 n— A s n— T y r— C y s— A r g— y s—

G I u— "V a 1— G 1 y— T y r— T h r— G l — V a 1—A r g—

C y s— G 1 u— H I s— P h e— P h e— L e u •(1) 式（ 1 ) のアミノ酸配列を有する h T G— 7 0 0 は、例えば固相法〔M e r r i i i e l d， J . Am.

C h e m . S o c . ， V o l 8 5 , p . 2 1 8 5 ( 1 9 6 3 ) ) によって化学合成することができる。固相法による化学合成は、通常ペプチド自動合成機を用いて標準的運用プログラムに従って行うことができる。本発明の h T G— 7 0 0 は、 h T G— 7 0 0をコードする D N A断片を用いて組換え D N A法により製造するこもできる。即ち、バチルス ' ブレビス菌由来のプロモ — 夕及びシグナルべプチドをコ一ドする D N A断片を調節遺伝子として用い、バチルス · ブレビス菌を宿主として用いて h T G— 7 0 0 を発現させることにより、菌体外に大量に h T G— 7 0 0 を分泌することができ h T G 一 7 0 0 の量産化が可能である。

バチルス . ブレビス菌は、菌体外プロテア一ゼをほとんど生産しない菌であり組換え D N A技術に用いる宿主として近年注目されているものである〔鵜高、日本農芸化学会誌， V o l . 6 1 , N o . 6 , p p . 6 6 9 - 6 7 6 ( 1 9 8 7 ) 〕。バチルス ' ブレビス菌由来のプロモーターとしては、例えばバチルス · ブレビス菌 4 7 ( F E R M P— 7 2 2 4 ) あるいはバチルス ' ブレビス菌 H 1 0 2 ( F E R M B P— 1 0 8 7 ) の主要菌体外蛋白質（m a j o r c e l l w a l l

p r ο t e i n ： M W P ) の遺伝子のプロ乇一ターが挙げられる。ノくチルス · ブレビス菌由来のシグナルぺプチドをコ一ドする D N A断片としては、同様にバチルス · ブレビス菌 4 7 あるいはバチルス · ブレビス菌 H 1 0 2 の主要菌体外蛋白質の遺伝子のシグナルペプチドをコードする D N A断片が挙げられる。このようなシグナルべプチドをコ一ドする D N A断片を用いることによって h T G— 7 0 0 を菌体外に分泌させることができる。 h T G - 7 0 0 を発現させるためには、上記プロモータの 3 ' 末端側にバチルス · ブレビス菌由来の S D配列、その 3 ' 末端側に翻訳開始コドン、上記シグナルべプチドをコードする D N A断片、次いで h T G— 7 0 0 をコードする D N A断片を連結する。

これらプロモーター、 S D配列の D N A断片、シグナルペプチドの D N A断片は公知であり〔 S . U d a k a e t a 1 . , B i o t e c h n o l o g y a n d G e n e t i c E n g i n e e r i n g

R e v i e w s , V o l . 7 , p p . 1 1 3 - 1 4 6

( 1 9 8 9 ) 〕、従って上記したリン酸トリエステル法などによって化学的に合成することも可能であり、また例えばバチルス · ブレビス菌 4 7などからクローニングすることもできる。これらの D N A断片は適当な制限酵素部位を利用することにより、あるいは適当なリンカ一を介して連結することができる。あるいは、公知のべク夕一、例えば p N U 2 0 0 はバチルス · ブレビス菌 4 7 の主要菌体外蛋白質遺伝子のプロモーター、 S D配列およびシグナルべプチドをコ一ドする D N A断片を有するベクターとして知られており〔鵜高、日本農芸化学会誌 V o l . 6 1 , N o . 6 , p p . 6 6 9 - 6 7 6 , ( 1 9 8 7 ) ； U d a k a e t a l . ，

P r o c . a t l . A c a d . S c i . U S A, V o l . 8 6 , p p . 3 5 8 9 - 3 5 9 3 , ( 1 9 8 9 ) 〕、従ってこれらベクターをそのまま利用することもできる。

より具体的には、例えば後述する実施例に示すような方法によって発現ベクターを構築することができる。

即ち、最初に、 h T G— 7 0 0 をコドするクローン化された c D N Aを含む c D N Aライブラリーを铸型にして P C R法により、 h T G— 7 0 0 をコ一ドする D N A断片、その 5 ' 末端側にシグナルペプチドをコードする D N A配列の一部、およびその 3 ' 末端側に終止コドンが連結した D N A断片である MWP— h T G— 7 0 0 (第 1 0 図参照）を作製する。

他方、シグナルペプチドの 1 部の D N A配列を有し且つ h T G— 7 0 0 をコードする遺伝子と連結するのに利用し得る制限酵素部位 N c o I を有するプラスミド p K Ν 1 2 0 を構築する（第 9図参照）。

次いで MW P — h T G— 7 0 0 と p K N l 2 0 とを制限酵素部位 N c o I を利用して連結して、プラスミド 4 6 h T G— R Fを構築する（第 1 1 図参照）。このブラスミドは、シグナルペプチドをコードする D N A配列の一部及びそれに続く h T G— 7 0 0 をコ一ドする D N A 断片と終止コドンを含有している。

次いで、 4 6 h T G— R Fから、 MW P— h T G— 7 0 0 を含む A p a L I - H i n d lll D N A断片を切り出す（第 1 1 図参照）。

他方、プラスミド p N U 2 0 0 を制限酵素処理して、バチルス . ブレビス菌由来のプロモーター、 S D配列及びシグナルぺプチドの N末端領域の一部のァミノ酸配列をコードする D NA配列を含有する D N A断片を得る。この D N A断片と上記した MW P— h T G— 7 0 0 を含有する D N A断片とを連結することによって、目的とする発現プラスミド p B B 2 3 0 を構築することができる

(第 1 1 図参照）。

上記した方法以外にも、例えば公知のプラスミド P H Y 5 0 0 を用いて同様にして発現プラスミドを構築することもできる。 p H Y 5 0 0 はバチルス ' ブレビス菌 4 7の主要菌体外蛋白質遺伝子のプロモーター、 S D配列及びシグナルべプチドをコ一ドする D N A断片を含有するベクターとして知られたものである

C H . Y a m a g a t a e t a 1 . , P r o c . N a t 1 . A c a d . S c i . U S A, V o l . 8 6 , p p . 3 5 8 9 - 3 5 9 3 ( 1 9 8 9 ) 〕。

h T G— 7 0 0 の発現に用いる宿主としては、例えばバチルス · ブレビス菌 4 7、バチルス · ブレビス菌 4 7 - 5 ( F E R M B P— 1 6 6 4 ) 、これらの変異株などが挙げられる。

発現プラスミドをこれらのバチルス · ブレビス菌に導入して形質転換体を得る方法としては、公知の方法

CT a k a h a s h i e t a 1 . , J .

B a c t e r i o 1 . , 1 5 6 , 1 1 3 0 ( 1 9 8

3 ) 〕などを用いることができる。

形質転換体を適当な培地、例えば T ₃ 改変培地〔 H Y a m a g a t a e t a l . , P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A , V o l . 8 6 , p p . 3 5 8 9 - 3 5 9 3 ( 1 9 8 9 ) 〕中で、培養温度は 1 5 °C 〜 4 2 て、より好ましくは 2 4 〜 3 7 °Cで、培養時間は 1 6 〜 1 6 6 時間、より好ましくは 2 4 〜 1 2 0 時間振盪培養を継続することにより h T G — 7 0 0 が活性型の立体構造を保持した形で培地中に分泌される。

培地中に分泌された h T G - 7 0 0 を公知の方法、例えば塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換ク口マトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を組み合わせることにより精製することができ、かくして目的とする h T G — 7 0 0 を得ることができる。

本発明の h T G — 7 0 0 は、薬理学的に許容される塩の形態にあってもよく、かかる塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩クェン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、シユウ酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などの酸付加塩、あるいはカリゥム塩、ナトリム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、アンモニゥム塩などの塩基付加塩などが挙げられる。

本発明の h T G — 7 0 0 は、白血病ゃ腎癌、子宮頸癌などの治療剤として有用である。これらの治療に用いる場合の h T G — 7 0 0 の投与量は、症状によって異なるが、通常成人に対する 1 日の投与量は静脈内投与の場合 0 . 0 0 1 〜 1 0 m g /ヒトが通常で、 1 日 1 回あるいは 1 日 2 〜 4 回に分割して投与することが出来る。 h T G - 7 0 0 は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形製剤、あるいは注射剤、液剤、乳剤、座剤などの製剤に調製して投与される。これら各製剤を調製するためには、慣用的な製剤技術に従って製造されるが、必要に応じて助剤、安定剤、乳化剤、希釈剤などの通常使用される添加剤を使用することが出来る。

以下に本発明を実施例及び試験例により更に詳細に説明する。

実施例 1

h T G - 7 0 0 をコードする D N A断片の単離及びその塩基配列の決定

1. h T G - 7 0 0 の一部をコードするヒト染色体 D N A断片の単離及び塩基配列の決定

1) サザンハイブリダィゼーシヨンによるヒト染色体 D N A断片の解析

第 1 図に示した塩基配列を有する m T G— 7 0 0 をコードする c D N A断片をプローブとしてヒト染色体 D N A断片のサザンハイプリダイゼーションを行った。

すなわち、ヒト胎盤染色体 D N A ( クローンテック社製） 1 0 〃 gを H a e lli ( l O O U n i t s ) で 3 7 て、 1 5時間消化し、 0. 8 %ァガロースゲルにて電気泳動を行い、 S o u t h e r n らの方法

( S o u t h e r n , E . M. , J . M o 1 . B i o l 9 8， 5 0 3 , 1 9 7 5 ) に従い、ナイロンメンブラン

(ハイボンド— N ：アマシャム社製）に転写し、 8 0 °C 2時間熱処理して D N A断片を固定した。得られた D N A断片が固定されたフィルターはハイプリダイゼ一ション溶液（ 6 X S S C , 5 Xデンハルト溶液、 0. 5 % S D S、 3 0 %ホルムアミド、 1 0 0 〃 g Zmlサケ精子 D N A断片）に浸し、 3 7 °Cで 2時間熱処理した。図 1 に示した塩基配列を有する m T G— 7 0 0 をコードする c D N A断片をマルチプライム D N A標識システム（アマシャム社製）を用いて〔ひ — ³² P〕 d C T Pで標識したものをプローブとして用い、このプローブを上記のハイブリダィゼーシヨン溶液に添加し、 3 7 °Cで 1 6時間反応を行った。反応後、フィルタ一は室温で 0. 1 % S D Sを含む 1 X S S C緩衝溶液で洗浄し、さらに 3 7でで 3 0分間、 0. 1 % S D Sを含む 0. 1 X S S C緩衝溶液で洗浄した後、風乾した。このフィルターを X線フィル厶、 X— O MA R T A R (コダック社製）に密着させ、一 8 0 °Cで 1 6時間露光した。その結果、 1 2 0 0 塩基対付近にバンドが認められ、ヒト染色体 D N A上に m T G— 7 0 0 c D N A断片と相同性の高い、ヒト由来の腫瘍細胞増殖阻害因子をコードすると考えられるヒト型遺伝子が存在することが示唆された（第 2図参照）。 2) ヒト染色体 D N A断片のライブラリ一の作製

(1) ヒト染色体 D N A断片の抽出

1)で示した方法により、ヒト胎盤染色体 D N A (クローンテック社製） 1 0 / gを H a e lll

( 1 0 0 U n i t s ) で消化し、 0. 8 %ァガロースゲルにて電気泳動を行い、以下のようにして 1 2 0 0塩基対付近の D N A断片を抽出した。

a. D E 8 1 ペーパー（Wh a t m a n社製）を用いて 1 2 0 0塩基対付近の D N A断片を着させた

( D r e t z e n G . e t . a l . , A n a l

Β i ο c h e m， 1 1 2 , 2 9 5 , 1 9 8 1 ) ；

b. 3 0 0 1 溶出液（ 1 . 5 M N a C l ， 1 mM E D T A， 1 0 mM T r i s - H C 1 ( H 8. 0 ) を添加した；

c. 3 0 0 〃 1 フエノーノレ：クロ口ホルム（ 1 : 1 ) を添加した；

d. 攪拌後、遠心（ 1 0 0 0 0 X g 1 0分）した； e. 上清をとり、 7 5 0 1 のエタノールを添加した；

f. 一 7 0 °Cで 1 時間放置した；

g. 遠心（ 1 0 0 0 0 X g 1 0分）した；

h. 1 0 / l の T E緩衝液（ I mM E D TA、 1 0 mM T r i s — H C 1 ( pH 8. 0 ) ) に溶解し、 1 2 0 0 塩基対付近の D N A断片を含む溶液を得た。

(2) ヒト染色体 D N A断片とベクターの結合

(1) で得られた D N A断片をラムダファージ g t 1 0 — E c o R l アーム（ストラテジーン社製）と混合し. T 4 D N A リガーゼを用いて両者を結合した。

(3) I n V i t r 0パッケージング

(2) に示した方法でベクターと結合した該 D N A断片を、 i n v i t r oノ、。ッケ一ジングキット（アマシャ厶社製）を用いてファージ粒子を形成させ、ヒト染色体 D N A断片ライブラリーを作製した。

3) ヒト染色体 D N A断片ライブラリーのスクリーニン 2L

上記 2)の（3) で得られた約 6 X 1 0 ⁵ 個の組換えファージを、あらかじめ L B培地（トリプトン： 1 0 g、酵母エキス： 5 g、塩化ナトリウム： 1 O g Z L ) で 3 7 °C、一昼夜培養した 4 mlの大腸菌 NM 5 1 4 に感染させた後、 1 . 5 %の寒天を含む L B培地プレート（ 9 X 1 4 cm) 2 0枚に播種し、 4 5てに保温した 0. 7 5 %ァガロースを含む L B培地 3 mlを上記 L B培地ブレート上に重層した。 3 7 °Cで 1 2時間培養後、プラークの生じたプレート上にナイロンメンブラン（ハイボンド一 N ：アマシャム社製）に 1 分間密着させた。このフィルターをアルカリ溶液（ 1 . 5 M N a C 1 , 0. 5 N

N a O H) に 2分間浸し、次に中性溶液〔（ 3. 0 N a C 1 , 0. 5 N T r i s — H C 1 ( pH 7. 0 ) 〕に 5分間浸し、さらに 2 x S S Cで洗浄し、風乾した。得られたフィルタ一は上記した 1 一 1 )で示した方法で D N A断片を固定し、〔《 — ³²P〕 d C T Pで標識した m T G— 7 0 0 をコードする D N A断片をプローブとして用いてハイプリダイゼーションを行ない、フィルムに露光した。フイルム上に感光したシグナルに相当するプレートの位置を採取し、 TM緩衝液〔 1 0 mM T r i s - H C 1 ( pH 8 . 0 ) ， 1 0 mM M g S O ₄ 〕に浸して組換えファージを抽出した。

かくして得られた組換えファージについて、再度上記したと全く同様の方法によってスクリニングを繰り返し、ヒト由来の腫瘍細胞増殖阻害因子をコードすると考えられる D N A断片を含有すると予想される 9 個の単一なプラーク（陽性クローン）を得た。

4) 塩基配列の解析

上記の 3)で調製したプラークから常法に従って D N A を抽出し、ジデォキシ ' チェイン ' ターミネータ一法 ( S a n g e r , F . e t a 1 . ， P r o c . a t に A c a d . S c i . U . S . A . ， 7 4 , 5 4 6 3 1 9 7 7 ) により、 7 — D e a z a —

S e q u e n i n g K i t (東洋紡社製）を使用して塩基配列を決定した。該塩基配列と m T G — 7 0 0 c D N A断片との相同性を調べた結果を第 3 図に示した。第 3 図から判るように該塩基配列の 5 5 0 番目から 6 7 5 番目に m T G — 7 0 0 前駆体の c D N A断片の一部と類似な部分が認められた〔第 3 図の（b) 参照：下線部分は成熟型 m T G— 7 0 0 c D N A断片の一部を示す〕。この部分をアミノ酸に翻訳したところ、 m T G — 7 0 ひ前駆体の一部と類似していた〔第 3 図の（c) 参照〕。また C e c h ( C e c h , T . D . , C e 1 1 , 3 4 , 7 1 3 , 1 9 8 3 ) の法則によりこの部分（ 5 5 2番目から 6 7 5 番目）が蛋白質への翻訳部分（ェキソン）であると推定された〔第 3 図の（a) 参照〕。

以上のこのことから、上記の 3)で調製したプラークから得られた染色体 D N A断片には h T G— 7 0 0 をコードする D N A断片の一部が含まれていものと思われた 2. h T G - 7 0 0 の全領域をコードする c D N A断片の単離及び塩基配列の決定

1) H C T— 1 5 細胞のライブラリ一の作製

(1) H C T— 1 5 細胞から m R N Aの抽出

ヒト結腸癌細胞である H C T— 1 5 細胞（大日本製薬社製） C Cancer Research, Vol. 3 9 ， p. 1 0 2 0 ( 1 9 7 9 ) 〕を 1 0 %牛胎児血清含有 D F培養液で 3 7 °C 5 % C 02 の条件で培養し、細胞が.コンフルエンスに達した時点で、培養液を除去し、 P B S (—）で 1 回洗浄した後、 P B S (—）を添加してセルスクレイバーで細胞をかきとり、コニカルチューブに集めた。遠心（ 1 5 0 0 x g、 5 分、室温）後、 P B S (—）を添加して細胞を懸濁し、再度遠心して沈澱を得た。この沈澱から m R N A抽出キット（フアルマシア社製）を用いて m R N Aを抽出した。この方法を用い、 2 X 1 0 ⁸ 個の細胞から 5 8 . 3 〃 gの m R N Aを精製することができた。

(2) c D N Aの合成

(1) に示した方法で調製した m R N Aを铸型とし、 c D N A合成キット（フアルマシア社製）を用い、オリゴ d Tをプライマーとして c D N Aを合成した。この方法を用いて 1 . 9 〃 gの m R N Aから 1 . 0 〃のじ 0 N Aを合成することができた。

(3) c D N Aとベクターの結合、及び I n

V i t r 0ノ、。ッケ一ジング

(2) に示した方法で合成した該 c P N A断片を前記した 1 一 2)—（2) の方法で E c o R I アダプタ一と結合させ、前記した 1 - 2)— (3) の方法で i n v i t r o パッケージングを行い、 c D N Aライブラリーを作製した。

2) H C T - 1 5細胞の c D N Aライブラリーのスクリ一二ング

前記した 1 — 3)で得られた h T G— 7 0 0 の一部をコ — ドすると考えられる D NA断片の P s t I 断片（第 5 2 0塩基対から第 6 7 4塩基対：第 3図参照）を、マルチプライム D N A標識システム（アマシャム社製）を用いて〔ひ一 ³² P〕 d C T Pで標識することにより D N A プローブを作製した。

この D N Aプローブを用いて、上記 1 )の（3) で得られた H C T— 1 5細胞の c D NAライブラリーのスクリーニングを行った。スクリーニングは前記した 1 一 3)で示した方法により行った。約 6 x 1 0 ⁵ 個の組換えファージより、 h T G— 7 0 0 をコードする D N A断片を含むと考えられる 1 個の陽性クローンを得た。

3) 塩基配列の解析

上記の 2)で得られたクローンから該 D NA断片を抽出し、前記した 1 — 4)で示した方法で塩基配列を決定した第 4 図に塩基配列の一部と翻訳したァミノ酸配列を示した。該 D N A断片より予想される h T G — 7 0 0 のアミノ酸配列と m T G — 7 0 0 のアミノ酸配列を比較した (第 5 図参照）。第 5 図から判るよう _tに h T G — 7 0 0 のアミノ酸配列は m T G — 7 0 0 と高い相同性を示した < m T G — 7 0 0 の N末端及び C末端の構造から h T G — 7 0 0 は N末端が V a 】で C末端が L e u であると予想され（第 4 図下線部分）、第 6 図に示すアミノ酸配列を有すると考えられた。また h T G — 7 0 0 をコードする D N A断片は第 6 図に示す塩基配列を有すると考えられた。実施例 2

h T G — 7 0 0 の化学合成

第 6 図に示した塩基配列でコードされるアミノ酸配列に起因するぺプチドを 9 一フルォレニルメトキシカルボニル（ F m o c ) 型固相法で合成した。

F m o c型固相合成法（E. At her ton, J. Logan, and R. C. Sheppard, J. Chem. Soc.. Perkin Trans.1.1981.538- 546)は、目的とするペプチドのカルボキシル末端より a 一アミノ保護基である F m o c 基の第 2級アミンによる選択的除去、側鎖官能基保護アミノ酸の縮合という一連の操作を繰り返すことで側鎖保護べプチド鎖が作られ、ついで固相樹脂からの切り出し、側鎖保護基の除去を経て直鎮ペプチドを得ることができる非常に簡便なぺプチド合成法である。

実際の合成は、ペプチド自動合成機（ P e p s y n 9 0 5 0 ペプチドシンセサイザ一：ミリポア社）を用い、 0 . l m m o l スケールで合成を行った。合成終了後の樹脂の半量で固相樹脂からの切り出し、側鎖保護基の除去を行い、直鎖ペプチドを得た。但し h T G - 7 0 0 はその分子内に 3 組の S — S結合を有すると考えられたのでシスティンの側鎖だけは通常の側鎖除去操作で脱離しない保護基を選択した。得られた直鎖ペプチドを化学選択的一段階精製法（ S. Funakoshi, H. Fukuda, and N. Fuji i, Proc. Natl. Acad. USA.1991, 88, 6981 -6985. ) を用いて精製した後、システィン側鎖保護基の除去を行い引き続いて空気酸化によって分子内で S - S結合を形成させ、最終的に高速液体クロマトグラフィーにて単一標品にまで精製した。この精製標品をプロテインシークェンサー 4 7 3 A (アプライドバイオシステムズ社）で解折し、第 6 図に示すアミノ酸配列を有していることを確認した。また、得られた h T G— 7 0 0 は、第 6 番目と第 1 9 番目のシスティン残基、第 1 4 番目と第 3 0 番目のシスティン残基、及び第 3 2番目と第 4 1 番目のシスティン残基のあいだに S — S結合を形成していた。試験例 1

h T G - 7 0 0 の主要細胞増殖阻害活性

実施例 2 で化学合成された h T G — 7 0 0 について以下の評価系を用いて活性を検討した。

(1) ヒト子宮癌細胞 H e L a に対する増殖阻害活性

4 8 穴プレート（スミロン）に H e L a細胞を 2 x 1 0 / 2 5 0 / 1 / 1 0 % F B S + D F /w e 1 】で幡種し 2 4 時間培養した。培養液を除き h T G — 7 0 0 を含む 0 . 0 1 % B S A + D F培地 2 5 0 p. 1 を加え 6 日間培養した。培養後、 0 . 2 5 % トリプシン / ^/ 0 . 0 0 2 % E D T Aにより細胞を剝離しコ一ルターカウンタ一（コールター社）により細胞数を計測した。 H e L a 細胞に対する増殖阻害活性は無処理群を 1 0 0 % とした時の％で示した。

結果は、表 1 に示す。表 1 ：ヒト子宮癌細胞 H e L a に対する増殖阻害活性細胞数 (%)of Control コン卜 π ル 2 . 6 1 X 1 0 ⁵ 1 0 0 処理群 0 . 4 7 X 1 0 ⁵ 1 8

(2) 各種癌細胞に対する増殖阻害活性

4 8 穴プレート（スミロン）に H e L a ( ヒト子宮癌）、 H C T— 1 5 ( ヒト結腸癌）、 T一 1 3 ( ヒト腎癌）、 T一 2 8 ( ヒト腎癌）の各癌細胞を 5 x 1 0 ³ / 2 5 0 a 1 / 1 0 % F B S + D F Zwで幡種し培養した 2 4 時間後、培養液を除き h T G - 7 0 0 を含む 0 . 1 % B S A + D F培養液 2 0 0 1 を加え 6 日間培養した培養液を除き P B S (—）で洗浄後 0 . 2 5 % トリプシンで剝離し細胞数をコール夕一力ウン^ ー（コールター社）で計測した。増殖阻害活性は以下の式に示すようにしてもとめた。結果は表 2 に示す。 h T G - 7 0 0 処理群の細胞数

(%) of Control = ——； 1 0 0 無処理群の細胞数

表 2 ：各種癌細胞に対する増殖阻害活性 h T G — 7 0 0 { u g / m \ )

細胞名 1 0 2 0 ， 4 0 . 0 8

H e L a 1 2 4 7 6 4 9 6

H C T一 1 5 7 2 5 3 8 5 0

T一 1 3 2 8 1 9 5 6

T一 2 8 4 2 6 4 2 7 5

表 1 及び 2 の結果から明らかなように、本発明で提供される新規な h T G — 7 0 0 は腫瘍細胞増殖阻害活性を有しており、新たな腫瘍治療剤として十分に期待されるものである。実施例 3

組換え D N A技術による h T G— 0 0 の製造

1 . h T G— 0 0 をコードする D N.A断片のクロ一二ング

(1) h T G 0 0遺伝子を P C R法で増幅するためのオリゴヌクレオチドの合成

h T G— 7 0 0 の c D NAの塩基配列を基に、 5 ' 側プライマー、及び 3 ' 側プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドをそれぞれ作製した。

即ち、第 7図に示したように、 5 ' 側プライマ一として、 N c 0 I リンカ一、バチルス · ブレビス菌 4 7の主要菌体外蛋白質の 1 つである MWP (m a j o r c e l l w a l l p r o t e i n ノ伝子 CH. Y a m a g a t a e t a l . ， J .

B a c t e r i o 1 . 1 6 9 , 1 2 3 9 - 1 2 4 5 ( 1 9 8 7 ) 〕のシグナルペプチドの C末端コード領域の一部及び h T G— 7 0 0 の N末端側のアミノ酸をコードする領域を含む合成オリゴヌクレオチド（ B B— 1 5 ) を合成した。 3 ' 側のプライマ一として、 h T G— 7 0 0 の C末端側のアミノ酸をコードする領域、終止コドン及び H i n d II I リンカ一を含む D N A配列と相補的な塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチド（ B B— 2 2 ) を設計し合成した。これらのオリゴヌクレオチドは D N A合成機（A B I 社製モデル 3 8 0 B ) により合成し、 O P C カラム（ A B I 社製）で精製した。

(2) P C R法による h T G - 7 0 0 遺伝子の増幅と精製 H C T — 1 5 細胞の c D N Aをクローン化した実施例 1 の 2 の 1 )の（3) で得られた； I g t 1 0 イブラリ一

\ 0 u \

+ 5 8 fi 1 滅菌水

+ 9 5 °C 1 0 分

氷中で急冷

+ B B - 1 5 ( 1 0 0 p m 0 1 )

+ B B - 2 2 ( l O O p m o l )

+ I 0 u \ x l O 緩衝液

+ 1 6 1 1 . 2 5 m M d N T P

+滅菌水の添加（全量を 1 0 0 1 にする）

+ 1 1 T a q ポリメラーゼ

P C R法を用いた遺伝子増幅

9 4 °C ( 1 分） → 4 0 °C ( 2分） → 7 2 "C ( 3 分） ( 3 0 回繰り返し）

+ 1 0 〃 1 3 M酢酸ナトリウム（pH 6 0 ) , 2 5 0 1 エタノール

一 7 0 °C 1 時間

遠心（ 1 0 , 0 0 0 x g 2 0 分）

沈澱

+ 3 0 0 / 1 7 0 %エタノール

遠心（ 1 0， 0 0 0 x g 2 0 分）

沈澱遠心エバポレー夕一により沈澱を乾燥

2 0 1 T E溶液に溶解

+ 5 ^ 1 N c 0 I ( 1 2ユニット / 1 ) ， 4 1 x l O M緩衝液（ 1 0 0 mM _tT r i s — H C l ( pH 7. 5 ) , 1 0 0 mM Μ g C 1 ₂ ， 1 0 mM

D i t h i o t h r e i t o l , 5 0 0 mM

N a C 1 )

+ 1 1 1 滅菌水

3 7 °C 3時間

6 5 °C 1 0分熱失活

+ 5 1 H i n d lll ( 1 2ュニッド〃 1 ) ，

5 1 x l O K緩衝液（ 2 0 0 mM T r i s - H C 1 ( pH 8. 5 ) , 1 0 0 mM M g C 1 ₂ , 1 0 ra D i t h i o t h r e i t o l , 1 M

K C 1 )

3 7 °C 3時間

電気泳動 3 %ヌシーブ 3 ： 1 ァガロース（ F M C社製）

D E 8 1 ペーパー（Wh a t m a n社製）を用いて増幅した D N A断片を吸着

3 0 0 ^ 1 溶出液（ 1 . 5 M N a C 1 , 1 mM

E D T A , 1 0 mM T r i s 一 H C 1 ( pH

8. 0 ) )

3 0 0 1 フエノールクロ口ホルム（ 1 ： 1 ) 攪拌後、遠心（ 1 0， 0 0 0 X g 1 0分）上清をとり Ί 5 0 u 1 のエタノールを添加

- 7 0 °C 1 時間

遠心（ 1 0 ， 0 0 0 x g 1 0 分）

1 2 1 の T E緩衝液に溶解（ 1 mM ,E D T A , 1 0 mM T r i s - H C l ( pH 8 . 0 ) )

以上の操作により、 MW P — h T G — 7 0 0 D N A断片が得られる（第 1 0 図参照）

2. h T G - 7 0 0 遺伝子の発現べクタ一への組み込み (1) p B R - A Nの作製

N c 0 I リンカ一を有する MW P — h T G — 7 0 0 を導入するために用いるプラスミドであり後述する p K N 1 2 0 を構築するために、 N c 0 I 部位を有するプラスミド p B R — A Nを構築した。第 8 図に示したように p B R — A Nは、以下の 2 つの D N Aを連結し作製した。領域 A ： B B — 1 、 B B — 2 の 2本の合成オリゴヌクレォチドを合成し、 O P Cカラムで精製後、アニーリングした。

B B - 1 ； 5 ' - AGTGCACTCGCACTTACTGTTGCTCCCATGGCTT

TCGCTGCAG - 3 '

B B - 2 ； 5 ' - GATCCTGCAGCGAAAGCCATGGGAGCAACAGTAA

GTGCGAGTGCACT - 3 '

領域 Aには、第 8 図で示したように N c o I 部位及び

MW Pのシグナルペプチドをコードする 5 ' 末端部分を欠失した D N A配列が含まれる。

領域 B : 大腸菌プラスミド P B R 3 2 2 C S u t c l i f f e , J . G . ( 1 9 7 9 ) C o 1 d

S p r i n g H a r b o r S y m p o s i u m, 4 3 7 7 — 9 0 〕の B a m H I — N r u l 断片

(2) M 1 3 m p 1 8 R F D N Aの S m a I - H i n d 111 消化と脱燐酸

M l 3 m p 1 8 R F D N A (宝酒造社製） 2 〃 gを S m a I ( 2 4 1111 1 1 ) 及び^1 1 1 1 【【1

( 2 4 U n i t ) で各々 3 7 °Cで 3時間消化後、仔牛腸ホスファターゼ（宝酒造社製）により脱燐酸化し最終産物が 0. 1 g Z jw l となるように T E緩衝液に溶解し M l 3 m ρ 1 8 R Fの S m a I — H i n d 【II D N A断片を得た（第 9図）。

(3) クローニングべ _ク夕一 p K N 1 2 0 の作製

N c 0 I 部位および M W Pのシグナルべプチドの C末端領域の一部をコードする D N A配列（以下 N c o l - MWP領域と言う）を含有するプラスミド p B R— A N 1 0 〃 8を 1 0 0ユニットの H i n d lll 、および 1 0 0 ュニットの P V u 11により 3 7 °C 2時間消化した。この反応物を 3 % ヌシーブ 3 ： 1 ァガロースで電気泳動した後、 D E 8 1 ペーパーを用いて N c o l — MW P領域を含む H i n d lH — A p a L I 断片を分離精製し、最終的に 1 2 1 の T E緩衝液に溶解した。

該 D N A溶液 5 β 1 を上記（2) で調製した S m a I 一 H i n d lll D N A断片 2 z l と混合し T ₄ D NA リガーゼ（宝酒造社製）を用い連結し、反応液を大腸菌 J M 1 0 5 〔 C . Y a n i s c h — P e r r o n , J .

V i e i r a a n d J . M e s s i n g ( 1 9 8 5 ) G e n e 3 3 1 0 3 — 1 1 9〕へカルシウム法〔 M e s s i n g , J . ( 1 9 8 3 ) M e t h o d s i n E n z y m o 1 o g y 1 0 1 2 0 — 7 8〕により導入し、 J M 1 0 5 を指示菌としてプラークを形成させた。該プラークを J M 1 0 5 に吸着させて培養し、菌体からアルカリ法！： B i r n b o i m H C

A N D D o 1 y J . , N u c l e i c A c i d s R e s 7 1 5 1 3 — 1 5 2 3 ( 1 9 2 9 ) 〕により R F— D N Aを調製し、 N c o I — MW P領域を含有する目的とする H i n d lll — A p a L I D N A断片をもつプラスミド p K N 1 2 0 を得た（第 9図参照）。 (4) p K N 1 2 への h T G - 7 0 0遺伝子のク D — 二ング

p K N 1 2 0、を N c o l — H i n d lll で消化した後、仔牛腸ホスファタ一ゼ（宝酒造社製）により脱燐酸化し、最終産物が 0. 1 g Z 1 となるように T E緩衝液に溶解した（第 1 0図参照）。該 D NA溶液 2 〃 1 を上記した 1 一（2) で増幅した h T G— 7 0 0遺伝子を含む MWP— h T G 7 0 0の D N A溶液 5 〃 1 と混合して T ₄ D N A リガーゼを用いて連結し、反応液を大腸菌 J M 1 0 5へカルシウム法により形質転換した。形質転換株からアル力リ法により R F D N Aを調製し、 h T G— 7 0 0遺伝子が MW Pのシグナルべプチドをコードする領域の下流に連結したブラスミド 4 6 h T G—

R Fを得た（第 1 1 図）。

(5) 発現プラスミド P B B 2 3 0 の構築

1) 1^ 11 2 0 0 ( 5 £ ) を八 ^ 1

( 5 0 u n i t s ) . H i n d III ( 5 0 u n i t s ) で各々 3 7 °C 3時間消化した後、仔牛腸ホスファターゼにより脱燐酸化し、ァガロースゲル電気泳動の後、 D E 8 1 ペーパーを用いて、 MW Pのプロモーター、 S D配列、シグナルペプチドをコードする D N A塩基配列の 5 ' 末端部分及びエリスロマイシン耐性遺伝子を含むベクタ一 D N Aを精製し、 3 0 1 の丁 £緩衝液に溶解した。

2) 次に、 4 6 h T G— R F ( 2 0 z g ) を制限酵素 A p a L I ( 2 0 0 u n i t s ) , H i n d III ( 2 0 0 υ n i t s ) で 3 7 °C 3時間消化し、ァガロースゲル電気泳動の後、 D E 8 1 ペーパーを用いて A p a L I 一 H i n d lll の D N A断片を分離精製した。このようにして 5 ' 末端部分を欠失した M W Pシグナルペプチドをコードする D N A配列の下流に h T G— 7 0 0遺伝子を連結した D N A断片が得られた（第 1 1 図参照）。該 D N A断片を、 1 2 1 の T E緩衝液に溶解した。

3) 上記 1)で調製した脱燐酸化ベクター 2 1 と上記 2)で調製した h T G— 7 0 0遺伝子を含む挿入 D N A断片 5 〃 1 を T ₄ D N A リガ一ゼを用いて連結した。これらの反応液を、高橋らの方法 CT a k a h a s h i e t a 1 J B a c t e r i o 1 1 5 6

1 1 3 0 - 1 1 3 4 ( 1 9 8 3 ) 〕によってバチルス ' ブレビス 4 7 — 5株！： H. Y a m a g a t a e t

a 1 . ， J . B a c t e r i o 1 . _¾ 1 6 9 , 1 2 3 9 — 1 2 4 5 ( 1 9 8 7 ) 〕の形質転換を行った。形質転換株力、らアルカリ法 C B i r n b o i m H . C . a n d D o 1 y J . , N u c l e i c A c i d s

R e s ]_ 1 5 1 3 — 1 5 2 3 ( 1 9 7 9 ) 〕によりプラスミド D N Aを調製し、 MW Pプロモーター、 S D配列、シグナルペプチドコード領域の下流に h T G— 7 0 0遺伝子が連結した目的とする h T G— 7 0 0発現プラスミドである p B B 2 3 0 を得た（第 1 1 図）。

3. バル . ビス菌による h T_G - _ _ 0 0 の生 _ 上記した 2 — (5) で作製した p B B 2 3 0 を保持するバチルス ' ブレビス菌（ p B B 2 3 0 / 4 7 — 5 ) を、適当な培地、例えばエリスロマイシン 1 0 〃 g / m 1を含んだ T ₃ 改変培地（ 5 mM M g C 1 2 ポリペプトン P 1 ( 日本製薬） 2 0 g、酵母エキス（日本製薬） 6. 5 g、グルコース 3 0 g、 0. 1 gゥラシルノリットル、 pH7. 0 に N a 0 Hで調製）で 3 0 °C、 3 日間振盪培養後、 1 リットル当り 2 0 gのグルコースを添加し、さらに 2 日間振盪培養した。

4. ノくチルス ' ブ-レビ菌により生産された h T G— 7 0 0 の生物活性の測定

生物活性を測定する目的で、培養上清を遠心分離し、 U L T R A F R E E C 3 H V S T R L ( ミリポア社製）を用いて濾過滅菌し、培養上清の h T G - 7 0 0 の生物活性をマウス B a 1 b 3 T 3細胞に対する増殖促進活性を指標に測定した。方法は、 9 w e 1 1 プレートにマウス線維芽細胞由来 · B a 1 b 3 T 3 を

1 w e 1 1 あたり l x l 0 ⁴ / 1 0 0 〃 1 ( 5 %牛血清入りダルベッコ改変イーグル培地）で播種し 3 7 °C 5 % C 02 条件下で 4 8 時間培養した。次に、培養液を 0 . 5 % 牛血清入りダルベッコ改変イーグル培地

( 0 . 5 % C S - D M E ) に交換し、さらに 2 4 時間培養した。ここで、 h T G— 7 0 0 の標品（ 0. l 〃 g Z ml〜 1 0 0 n g Zml) またはサンプルを含有する 0. 5 % C S — D M Eに培地交換し、 2 0時間 3 7 °Cで培養した。これに、 l w e l 1 あたり〔 ³H〕チミジン（アマシャム社製）を 0. 2 5 ;z C i 添加、 4 時間標識を行い ^ プレートシステム（アマシャム社製）を用いて

C ³H〕チミジンの取り込み活性を定量した。その結果培地 1 リットルあたりの h T G— 7 0 0 の生産量は約 4 mgであつた。

5. ノくチルス · ブレビス菌により生産された h T G— 7 0 0 の精製

(1) Qセファロース ' C ₄ 樹脂連結カラム

上記した 3で示した方法で培養した p B B 2 3 0 / 4 7 - 5 の培養上清 1 0 0 Lを国産 S型超遠心機（ 8， 0 0 0 rpm 、国産精ェ製）にて分離後、上清を収集しペリコンカセットシステム（限外濾過膜システム、 0 . 3 〃 m フイソレ夕、フジフィル夕一社製）を用いて濾過し、濾液に 1 M T r i s - H C 1 ( pH 7 . 5 ) を用いて pH 7 . 5 に調製し、予め 2 0 mM T r i s - H C 1 ( pH 7 . 5 ) 、 5 %ァセトニトリルで平衡化した Qセファロース ' C ₄ 連結カラムへ添加した。

カラム： Qセファロース F F (フアルマシア社製）

φ 1 6 cm X 1 0 cm

C 4 (ケムコ社製） ø 1 6 cmx 1 5 cm 流速： 4 O ml/ min

h T G - 7 0 0 は Qセファロースに非吸着で、 C ₄ 樹脂に吸着する。吸着後、 C ₄ カラムを 5 %ァセトニトリルで洗浄し、 5 0 %ァセトニトリル、 0 . 1 % T F A溶液 (流速： 4 0 ml/min ) で溶出した。

(2) S — セファロース

(1) で得られた活性画分を、エバポレー夕一にてァセトニトリルを除いた後、 1 1^酢酸緩衝液 }14 . 0 、酢酸ナトリウム一酢酸）を添加し、サンプルの pHを 4 に調整した。これを、 2 0 mM酢酸緩衝液（ pH 4 . 0 ) 、 5 % ァセトニトリルで平衡化させた S —セファロースカラムに吸着させ、溶離液 A、 Bで段階的に溶出を行った。カラム： S — セファロース F F ( フアルマシア社製） φ 1 0 cm X 1 0 cm

溶離液 A ： 2 0 mM酢酸緩衝液（ pH 4 . 0 ) 、 5 %ァセト二トリル + 0 . 0 5 M N a C 1 溶離液 B ： 2 0 mM酢酸緩衝液（pH4 . 0 ) 、 5 %ァセト二トリノレ + 0 . 5 M N a C 1

流速： 5 0 ml / mi n

(3) C H P L C

活性画分は、溶離液 Bにより溶出した画分より得られこれを C ₄ 逆相 H P L Cで精製した。

カラム： C ₄ 0 2. 2 2 5じ111カラム（ ¥ 7 (5 3 0：社製）

溶離液 A : 1 0 %ァセトニトリル、 0 1 ¾ T F A 溶離液 B ： 4 0 %ァセトニトリノレ、 0 1 % T F A 流速： 1 5 ml/ min

分画： 2 min

グラジェント： A→ B ( 1 5 0 min )

(4) C ₁₈H P L C

(3) の活性画分に 0. 1 % T F A溶液を等量加えた後 C ₁₈カラムにより分離精製を行った。

カフ厶：〃 B o n d s p h e e C i 8 ( ø 3 9 x 1 5 0 mm、 W a t e r s社製）

溶離液 A : 0. 1 % T F A

溶離液 B : 2 0 %ァセトニトリル 0. 1 % T F A 溶離液 C ： 4 0 %ァセトニトリル 0. 1 % T F A 流速： 8 ml / mi n

溶出条件： A→ B ( 5 min ) → B ( 5 min ) C ( 1 2 0 min )

その結果、単一ピークに活性が収束した（第 1 2図）試験例 2

(1) h T G - 7 0 0 の癌細胞増殖阻害活性

4 8 e 1 1 プレートに H e L a ( ヒト子宮癌）、 H C T— 1 5 ( ヒト結腸癌）、 T一 1 3 _¾ ( ヒト腎癌）、 T 一 2 8 ( ヒト腎癌）の各癌細胞を l w e l 1 当り、 5 x 1 0 ³ 2 5 0 u 1 · 1 0 %牛胎児血清 + D F培養液 (ダルベッコ改変 M E M : H a m F — 1 2 = 1 ： 1 ) 播種し培養した。 2 4 時間後、培養液を除き実施例 3 の 5 で得られた h T G — 7 0 0 を含む 0 . 1 % B S A + D F 培養液 2 0 0 1 を加え 6 日間培養した。培養液を除き P B S ( ― ) ( K C 1 ： 0 . 2 g . K H 2 P 0 4 ： 0 . 2 g、 N a C l : 8 g、 N a ₂ H P 0₄ ： 1 . 1 5 g リットル）で洗浄後 0 . 2 5 % トリプシンで剝離し細胞数をコ一ルターカウンター（コール夕一社製）で計測した。細胞増殖阻害活性は以下のようにしてもとめた h T G - 7 0 0 処理群の細胞数

% of control = X 1 0 0 無処理群の細胞数 h T G — 7 0 0 には第 1 3 図に示したように、いくつかのヒト癌細胞に対して増殖阻害活性が認められた。

(2) マウス T G — 7 0 0 抗体による h T G - 7 0 0 の検実施例 3 の 5 で得られた h T G — 7 0 0 について 2 0 % S D S — P A G E を行った後、ニトロセルロースフィルターに転写した。フィル夕一は、 2 % B S A (牛血清アルブミン）入り T B S溶液（ 1 5 0 mM N a C 1 、 2 0 mM T r i s - H C 1 ( pH 8 . 0 ) で室温 1 時間振盪後、 1 0 % H S (ゥマ血清）、 0 . 1 % B S A入り T B S溶液で 4 °C一夜静置しプロッキングを行った。一次抗体は抗マウス T G - 7 0 0 抗体、二次抗体はロバ抗ゥサギ I g G F ( a b ' ) 2 で順次反応をさせ、各操作の間の洗浄は、 2 % T w e e n 2 0 、 1 0 %ブロックエース（大日本製薬社製）の入った T B S溶液で行い、 E C L システム（アマシャム社製）を用いて検出した。マウス T G — 7 0 0 に対する抗体によりヒト型 T G — 7 0 0 を予想された分子量の位置に、検出することができた (第 1 4 図）。産業上の利用可能性

本発明により、新規な h T G — 7 0 0 が提供される。この h T G — 7 0 0 は白血病ゃ腎癌、子宮頸癌などの治療剤として期待されるものである。また、本発明により h T G — 7 0 0 をコードする D N A断片が提供され、この D N A断片を利用することによって h T G — 7 0 0 を組換え D N A技術により製造することが可能となる。本発明では、バチルス · ブレビス菌由来のプロモーターおよびシグナルべプチドをコ一ドする D N A断片を調節遺伝子として用いて h T G — 7 0 0 をバチルス · ブレビス菌において発現させ、菌体外に活性型の立体構造を保持した形で分泌させることができる。従って本発明は、新たな医薬品として期待される h T G — 7 .0 0 及びそのェ業的に有利な製造法を提供するものでありその意義は大きい。

Claims

請求の範囲

1 . 式（ 1 ) に示すアミノ酸配列を有するヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子。 _£

V a 1一 S e r一 I 1 c— T h r— L y s― C y »— S e r一 S e r一

A s p— M e t— A s n— G 1 7— y r— C y s— L e — H I s— G 1 y— G 1 n— C y s— I I c— T y r— L e u— V a I— A s p—

M e t一 S e r— G 1 n— A s n— y r— Cy s— A r g— C 7 s— G I u— V a 1— G 1 y— T y r— T h r— G l y— V a l一 A r g—

C y s— G H i s— P h e— P h e— L e u •(1)

2 . 請求の範囲第 1 項のヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子をコードする D N A断片。

3 . 式（ 2 ) に示す塩基配列を有する請求の範囲第 2項の D N A断片。 27 54

GTG TCA ATA ACA AAG TGT AGC TCT GAC ATG AAT CGC TAT TGT TTG CAT GGA CAG

81 108

TBC ATC TAT CTG GTG GAC ATG ACT t¾A MC TAC TGC AGG TGT GAA GTC GGT TAT

135

ACT GGT GTC CGA TGT GAA CAC TIT ΠΑ (2)

4 . バチルス ' ブレビス菌由来のプロモータ一、バチルス · ブレビス菌由来のシグナルぺプチドをコ一ドする D N A断片、及び請求の範囲第 2項または第 3 項の D N A断片を含有する D N A配列。

5 . 請求の範囲第 4 項の D N A配列を含むヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の発現プラスミド。

6 . 請求の範囲第 5 項の発現プラスミドで形質転換されたバチルス ■ ブレビス菌。

7 . 請求の範囲第 6項のバチルス ' ブレビス菌を培養してヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子を発現させて菌体外に分泌させ、次いでその培養液からヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子を回収するヒト由来腫瘍細胞増殖阻害因子の遺伝子工学的製造法。