WO1994027150A1 - Method for assaying more than one immunological ligand, and assay reagent and kit therefor - Google Patents

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WO1994027150A1 PCT/JP1994/000725 JP9400725W WO9427150A1 WO 1994027150 A1 WO1994027150 A1 WO 1994027150A1 JP 9400725 W JP9400725 W JP 9400725W WO 9427150 A1 WO9427150 A1 WO 9427150A1
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immunological
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solid phase
ligand
ligands
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PCT/JP1994/000725
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Yuichi Oku
Noriko Toyoda
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Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to an immunological component analysis method using an antigen-antibody reaction, and more particularly, to one or more types of antigens which can be used to analyze one or more types of antigens or one or more types of antibodies at a time in almost infinite combinations.
  • the present invention relates to a method for analyzing an antigen or one or more antibodies, an analytical reagent thereof, and a kit thereof.
  • immunological detection is a method used for quantifying and detecting minute amounts of biological components, and various methods have been developed. Among them, immunological detection methods that use non-radioactive substances such as fluorescent substances, luminescent substances, and enzymes as antibody labels require special facilities like radioactive substances used as labels. It is widely used in biological component analysis because it is easy to handle and can handle large quantities.
  • the dot blot method has been conventionally used as an immunological detection method for simultaneously detecting the presence or amount of one or more antibodies present in a sample
  • various kinds of antigens are spotted in advance on a membrane of a nitrocell ore, and there is a possibility that a plurality of antibodies to be detected on the nitrocellulose membrane are contained.
  • the presence or amount of the antibody was detected based on the reaction with the sample and the binding of the label-introduced substance to the antibody captured on the nitrocellulose membrane.
  • FIG. 1 shows another immunological detection method different from the dot blot method, which is generally referred to as a sandwich method which is a conventional immunological detection method using a labeled compound. It is a process diagram.
  • a conventional sandwich method using a labeled compound will be described below with reference to FIG. 1 is a solid phase composed of a water-insoluble carrier, 2 is an antibody bound to the solid phase, 3 is an antigen to be measured bound in response to the antibody, and 4 is a labeled labeled antibody.
  • the test sample is brought into contact with the antibody 2 bound to the solid phase 1, and the antigen 3 to be detected contained in the test sample is bound to the antibody 2 (FIG. 1 (a)). Washing is performed to remove unreacted contaminants contained in the reaction system (Fig. 1 (b)). Cleaned solid phase antibody-antigen complex The union is reacted with the labeled labeled antibody 4 to form a solid phase-antibody-antigen-labeled antibody complex (FIG. 1 (c)). Washing is performed to remove impurities such as unreacted labeled antibodies contained in the reaction system in the above step (FIG. 1 (d)). The purified solid phase-antibody-antigen-label antibody complex is determined by detecting its label (Fig. 1 (e)).
  • the labeled antibody involved in this determination is not only derived from the solid phase-antibody-antigen-labeled antibody complex, but the labeled antibody is directly bound to the solid phase. Some of them cause so-called non-specific binding, and in such a case, there is a disadvantage that the measurement sensitivity is reduced.
  • immunocomplex transfer assay (S. Hashida et al., J. Biochem. 108, pp. 960-964, 199) has been developed. Has also realized high sensitivity.
  • This immunocomplex transfer assay is performed by the following process. That is, a substance in which a dinitrophenyl group (hereinafter, referred to as a DNP group) and biotin are bound to an antibody that recognizes a specific antigen, a test sample, and an antibody that is labeled with a rich element that recognizes the antigen are simultaneously mixed and mixed.
  • An immune complex (hereinafter referred to as IC) is formed by reacting the antigen contained in the test sample with each of the above antibodies.
  • the antibody against the DNP group is bound to the solid phase
  • the solid phase is prepared, and the previously formed IC is brought into contact with the solid phase, and the antigen-antibody reaction between the DNP group contained in the IC and an antibody against the DNP group on the solid phase is performed. And capture the IC on the solid phase ⁇
  • the captured IC is released by adding an excess of a DNP group compound.
  • the released IC is again captured on a different solid phase by reacting with the solid phase to which avidin is bound, and then the enzyme activity contained in the IC captured on the solid phase is measured in a new test tube.
  • one reagent detects and quantifies the presence of one or more antigens or one or more antibodies. None.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-188389 discloses a method of assaying a sample for a target molecule that is a biological binding pair.
  • the target molecule is contained in a first anti-ligand probe and a labeled second anti-ligand probe capable of binding to a target molecule to form a complex, and a recoverable support.
  • Contacting the sample and then substantially separating the recoverable support from the sample to form a separation product comprising the target molecule and the first and second probes in the presence of the target molecule in the sample In addition, it has been shown to monitor the separated products for the presence of a target component indicative of the presence of the target molecule.
  • Sho 63-188 839 involves the detection and quantification of the presence of one or more antigens or one or more antibodies with one reagent.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-273365 discloses that an antibody is bound to a solid phase via a nucleic acid, an antigen contained in the sample is captured by an antigen-antibody reaction, and further labeled.
  • a method for detecting antigens contained in a sample with high sensitivity by capturing the product, washing, and then selectively cleaving the nucleic acid portion and quantifying the separated label. There.
  • the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-273650 does not describe the detection and quantification of the presence of one or more antigens or one or more antibodies with one reagent. No indication or suggestion.
  • the reaction in which the labeled antibody is captured on the solid phase is an antigen-antibody reaction
  • the labeled antibody is captured on the solid phase.
  • Time is relatively long, on an hourly basis. Therefore, the time required for the labeled substance-incorporated substance contained in the reaction system to be exposed to the solid phase is prolonged. There was a problem of becoming low.
  • a first object of the present invention is to minimize the problem of lowering the measurement sensitivity by nonspecifically capturing a label-introduced substance added to a reaction system on a solid phase.
  • the present invention is to minimize the problem of lowering the measurement sensitivity by nonspecifically capturing a label-introduced substance added to a reaction system on a solid phase.
  • the second object is, in addition to the first object, an analysis reagent which can detect one or more kinds of antibodies or one or more kinds of antigens by a simple operation with one reagent, DISCLOSURE OF THE INVENTION FOR PROVIDING KITS AND MEASUREMENT METHODS USING THEM
  • the present invention provides an analytical reagent for one or more types of immunological ligands simultaneously containing the following substance group (A) and substance group (B).
  • the present invention relates to one or more immunological ligand analysis reagents simultaneously containing the following substance group (A) and substance group (B) and one or more kinds comprising the following solid phase (C).
  • a nucleotide having a specific and arbitrarily selected nucleotide sequence depending on the type of the immunological ligand is bound to each of the immunological ligands
  • Solid phase (C) A nucleotide having a base sequence capable of binding complementarily to a nucleotide of the substance group (A) is water-insoluble. A solid phase mononucleotide conjugate bound to the body.
  • immunological ligand refers to one molecule that forms a pair by binding immunologically
  • immunological antiligand refers to a molecule that binds to the immunological ligand. Refers to the other molecule that is performed.
  • DNA and RNA can be applied to the nucleotide having a complementary sequence of the present invention.
  • These nucleotides can be used either artificially synthesized or naturally obtained.
  • any of oligonucleotides and polynucleotides can be applied.
  • the binding between the antibody-nucleotide conjugate or the antigen-nucleotide conjugate and the nucleotide immobilized on the solid phase is due to the complementary binding of the nucleotide sequences of each other.
  • the complementary nucleotide sequences of the nucleotides of each other may be partially complementary in terms of the complementarity in which the nucleotide molecules of each other are capable of binding, or may be complementary nucleotide sequences of each other.
  • the sequences may be completely identical.
  • the time for reacting the above-mentioned antibody-nucleotide conjugate or antigen-nucleotide conjugate with the nucleotide-binding solid phase is determined by the time required for the antibody-binding solid phase, which is a conventional immunoassay.
  • the time required for binding the labeling substance to the antigen complex is extremely short. The reason is that, in the measurement of a conventional immunological ligand, that is, an antigen or an antibody, a method in which a measurement target including a labeled substance is captured in a solid phase is based on an antigen-antibody reaction.
  • the method of capturing the analyte containing the label-introduced substance on the solid phase is based on the complementation of nucleotides.
  • the advantage of this method is that it requires a very short time as compared with the antigen-antibody reaction.
  • the present invention does not allow sufficient time for the labeled substance-introduced substance, for example, a labeled antibody or the like to directly bind to the solid phase, so that non-specific reactions can be reduced and a highly sensitive measurement system can be provided. realizable.
  • one or more types of immunological ligands that is, antigens or antibodies can be detected or measured with one reagent. Can be dramatically shortened.
  • the solid phase mononucleotide conjugate of the solid phase (C)
  • water is added at the 5 ′ end or 3 ′ end of the nucleotide, or at any position other than the end of the nucleotide.
  • the nucleotide may be covalently bonded to the insoluble carrier directly or via a functional group introduced to form a solid-nucleotide conjugate of the solid phase (C).
  • the functional group introduced into the solid phase and the functional group introduced into the base constituting the nucleotide may be covalently bonded to form a covalent bond.
  • the binding may be performed by physical adsorption instead of covalent bonding. That is, at the 5 'end or 3' end of the nucleotide, or at any position other than the end of the nucleotide, the nucleotide is bonded to the linker by a covalent bond directly or via a functional group introduced into the linker.
  • a linker-nucleotide conjugate and the linker-nucleotide conjugate is physically adsorbed on the water-insoluble carrier to form a solid-phase (C) solid-phase nucleotide conjugate. May be formed.
  • This connector is preferably a protein. No.
  • the label to be introduced into the label-introduced substance includes, for example, an enzymatically active atomic group, piotin, avidin, digoxigenin, nucleotide, metal colloid. Particles, phosphors, phosphors, metal compounds, ligands having specific binding properties or radioisotopes can be used.
  • Particles, phosphors, phosphors, metal compounds, ligands having specific binding properties or radioisotopes can be used.
  • polystyrene is preferably used for example.
  • the method for analyzing one or more immunological ligands of the present invention will be described based on FIGS. 2 to 10 by taking, as an example, the case where the immunological ligand to be measured is an antigen. Will be described.
  • FIG. 2 shows an example in which one or more immunological ligand analysis reagents are one or more antigen analysis reagents, and one example in which antigens A, B, and C are detected.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram of reagents for analyzing more than one kind of antigen.
  • all parts surrounded by a frame indicate components contained in one reagent.
  • a-hi, ⁇ -C indicate antibodies against antigen ⁇ , antigen ⁇ , and antigen C, respectively. Labels are bound to each of these antibody ⁇ , antibody_ ⁇ and antibody CC to form different types of label-introducers, and this reagent contains three types of label-introducers at the same time. Have been.
  • This reagent further antibody monument - A, the antibody alpha-B, antibodies alpha-C to different sequences of nucleotidyl de 0 N,, quinuclidine Reochi de ⁇ 2, 3 types of the quinuclidine Reochi de Omikuron'nyu 3 coupled
  • the antibody-nucleotide conjugate of the present invention is contained at the same time as the three types of label-introduced products.
  • the quinuclidine Reochi de ⁇ _N 2, other quinuclidine Reochi de ON! Has a different nucleotide sequence from the null click Reochi de ON 3.
  • Antibodies of the same type have nucleotides of the same base sequence bound thereto.
  • the same kind of antibody includes a polyclonal antibody.
  • FIG. 3 shows one example of a nucleotide-bound solid phase used in combination with one or more antigen analysis reagents of the present invention
  • FIG. N complementary nucleocapsid click Reochi de having a nucleotide sequence ( ⁇ N) solid phase is bound (for antigen a solid phase)
  • FIG. 3 (b) is a complementary base to j click Reochi de oN 2 solid phase
  • j click Reochi de (oN) is coupled with the sequence (for antigen B solid phase)
  • FIG. N shows one example of a nucleotide-bound solid phase used in combination with one or more antigen analysis reagents of the present invention
  • FIG. N complementary nucleocapsid click Reochi de having a nucleotide sequence ( ⁇ N) solid phase is bound (for antigen a solid phase)
  • FIG. 3 (b) is a complementary base to j click Reochi de oN 2 solid phase
  • antigen A When a test sample containing antigen A, antigen B and antigen C is added to one or more antigen analysis reagents shown in FIG. 2, antigen A, antigen A, For each of antigen B and antigen C (antibody-nucleotide conjugate), a complex composed of one antigen-one labeled substance-introduced substance is formed. This is shown in FIG.
  • the reaction solution containing the complex consisting of the (antibody-nucleotide conjugate) —antigen-labeled substance-introduced product was separately prepared from the above-mentioned solid phase for antigen A,
  • the nucleotide contained in the complex and the nucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide were bound by contacting the solid phase for B and the solid phase for antigen C, respectively.
  • Nucleotide of the solid phase for antigen A, solid phase for antigen B, and solid phase for antigen C is complementarily bound by hybridization.
  • FIG. 5 shows a complex containing antigen A captured by complementary binding of nucleotides to the antigen A solid phase.
  • FIG. 6 shows a complex containing antigen B captured by complementary binding of nucleotides to the solid phase for antigen B.
  • FIG. 7 shows a complex containing antigen C captured on the solid phase for antigen C by complementary binding of nucleotides.
  • FIG. 8, FIG. 9, and FIG. 10 show that the three types of complexes captured on each of the independently present solid phases were washed and impurities were removed, that is, FIG.
  • the antigen A solid phase contains a complex containing antigen A
  • the antigen B solid phase contains a complex containing antigen B
  • the solid phase for use shows the state after each of the complexes containing antigen C has been washed. Judgment is performed on the label contained in the complex captured on each solid phase.
  • an enzyme reaction or the like is performed in each independent reaction system, and judgment is made based on each color tone.
  • the target is a fluorescent substance, a dye, a metal colloid, or the like
  • the determination can be performed by omitting the enzymatic reaction.
  • the above-described method for measuring one or more antigens is described by taking as an example the case where the test substance is three kinds of antigens.
  • One or more antibodies that have different nucleotide properties by changing the sequence of the nucleotide to be bound to the above antibodies, test samples, and antibodies that recognize each test substance
  • a nucleotide having a partially or completely complementary sequence is bound to the nucleotide bound to the antibody.
  • a solid phase nucleotide-bound solid phase
  • the amount of the label in the immune complex is measured or detected to determine the amount in the test sample.
  • One or more substances to be measured can be measured or detected.
  • FIG. 11 conceptually illustrates one or more types of antibody detection reagents for detecting antibody A, antibody B, and antibody C.
  • FIG. 12 shows an example of a nucleotide-bound solid phase used in combination with one or more kinds of antibody analysis reagents of the present invention
  • FIG. 12 (a) shows the nucleotides.
  • de oN the solid phase j click Reochi de is coupled with a complementary base sequence (antibody a solid phase)
  • the first 2 diagram (b) is a nucleotide sequence complementary to the nucleocapsid click Reochi de oN 2 solid quinuclidine Reochi de is coupled with phase (antibody B solid phase)
  • the first 2 diagram (c) the solid phase quinuclidine Reochi de is coupled with a complementary base sequence to null click Reochi de ⁇ _N 3 (Solid phase for antibody C) is shown.
  • Each of these different types of solid phases exists individually and independently.
  • Each of these solid phases is used in combination with one or more types of antibody analysis reagents shown in FIG. 11 and constitutes an example of one or more types of antibody analysis
  • antibody A in one reaction solution is added.
  • antibody B and antibody C antigen-nucleotide conjugate—a complex consisting of an antibody-labeled substance-introduced product is formed. This is shown in FIG.
  • the above (antigen-nucleotide conjugate) antibody-labeled substance introduction
  • the reaction solution containing the complex comprising the complex is brought into contact with each of the above-described solid phases for antibody A, antibody B, and antibody C, which are present independently and independently, and the complex is obtained.
  • the antibody A the antibody B and the solid phase for the antibody C in which the nucleotide contained in the above and the nucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide are bound. And complementarily bind by hybridization.
  • FIGS. 14, 15, and 16 show the complexes captured on each solid phase by hybridization.
  • FIG. 14 shows a state in which a complex containing antibody A is captured by complementary binding of nucleotides to the solid phase for antibody A.
  • FIG. 15 shows a state in which a complex containing antibody B is captured on the antibody B solid phase by complementary binding of nucleotides.
  • FIG. 16 shows a state in which a complex containing antibody C is captured by complementary binding of nucleotides to the solid phase for antibody C.
  • the complex captured on each of the solid phases is washed to remove impurities not bound to the solid phase, for example, the labeled substance-introduced substance.
  • the complex with the impurities removed and captured on each of the three types of solid phases that is, the complex containing antibody A captured on the antibody A solid phase shown in FIG. A complex containing the antibody B captured on the solid phase for antibody B shown in FIG. 18 and a complex containing the antibody B captured on the solid phase for antibody C shown in FIG. 19 are obtained.
  • Judgment is performed on the label contained in the complex captured on each solid phase. For example, an enzyme reaction or the like is performed in each independent reaction system, and judgment is made based on each color tone.
  • the label is a fluorescent substance, a dye, a metal colloid, or the like
  • the determination can be performed by omitting the enzymatic reaction.
  • the solid phase-nucleotide conjugate of the substance group (C) used in the analysis reagent for one or more immunological ligands in the present invention is safe even in a dry state. It is stable in the presence of EDTA even in solution, and is stable as a reagent.
  • FIG. 1 is a general process diagram of a conventional immunological detection method using a labeled compound.
  • FIG. 2 shows one example of an analysis reagent for one or more antigens of the present invention, and conceptually shows one or more antigen analysis reagents for detecting antigen A, antigen B, and antigen C.
  • FIG. 3 shows an example of a nucleotide-bound solid phase used in combination with one or more antigen analysis reagents of the present invention.
  • FIG. 4 shows how a complex consisting of (antibody-nucleotide conjugate) / antigen / labeled substance is formed for one or more antigens contained in one reaction solution in the present invention. Show.
  • FIG. 5 shows a state in which a complex containing antigen A is captured by the complementary binding of nucleotides to the solid phase for antigen A in the present invention.
  • FIG. 6 shows a state in which a complex containing antigen B is captured by the complementary binding of nucleotides to the solid phase for antigen B in the present invention.
  • FIG. 7 shows a state in which a complex containing antigen C is captured by the complementary binding of nucleotides to the solid phase for antigen C in the present invention.
  • FIG. 8 shows a state after the complex containing antigen A, which is complementary to the solid phase for antigen A in the present invention, has been washed.
  • FIG. 9 shows a state after the complex containing antigen B complementary to the solid phase for antigen B in the present invention has been washed.
  • FIG. 10 shows a state after the complex containing antigen C complementary to the solid phase for antigen C of the present invention has been washed.
  • FIG. 11 shows one example of a reagent for detecting one or more antibodies of the present invention.
  • detection of one or more antibodies is described.
  • the outlet reagent is shown conceptually.
  • FIG. 12 shows an example of a nucleotide-bound solid phase used in combination with one or more antibody analysis reagents of the present invention.
  • FIG. 13 shows that a complex consisting of (antigen-nucleotide conjugate) -antibody-labeled substance-introduced body is formed for each of antibody A, antibody B, and antibody C in one reaction solution of the present invention. It shows how it works.
  • FIG. 14 shows a state in which a complex containing antibody A is captured by complementary binding of nucleotides to the solid phase for antibody A in the present invention.
  • FIG. 15 shows a state in which a complex containing antibody B is captured by complementary binding of nucleotides to the solid phase for antibody B in the present invention.
  • FIG. 16 shows a state in which a complex containing antibody C is captured by complementary binding of a nucleotide to the solid phase for antibody C in the present invention.
  • FIG. 17 shows the state after the complex containing antibody A complemented to the solid phase for antibody A in the present invention has been washed.
  • FIG. 18 shows a state after the complex containing antibody B complemented to the antibody B solid phase in the present invention has been washed.
  • FIG. 19 shows the state after the complex containing antibody C complemented to the solid phase for antibody C in the present invention has been washed.
  • FIG. 20 shows the absorbance of the labeled substance-introduced substance captured on solid phase A, solid phase B, and solid phase C by one or more immunological ligand analysis methods of Example 1.
  • FIG. 21 shows the absorbance of the label-introduced substance captured on solid phase A, solid phase B, and solid phase C according to the method for analyzing one or more immunological ligands in Example 2.
  • oligonucleotides having an amino group at the 5 'end were synthesized using an automatic DNA synthesizer 3991A manufactured by Applied Biosystems.
  • oligonucleotides were covalently bonded to polystyrene beads into which an amino group had been introduced using glutaraldehyde, and then 0.1% skim milk and 0.1% azide It was stored in 0.1 M sodium phosphate buffer, 0.1 M sodium phosphate, pH 7.0 containing sodium and 5 mM EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid).
  • F (ab ') 2 was prepared from IgG according to the method of Y. Oku et al. (Microbiol. Immunol., 32, 807-816, 18988), and then F ab ' Prepared.
  • Nucleotide pair 1 (1) having a nucleotide sequence complementary to nucleotide pair 1 (+) was covalently bound to anti-CT-Fab '.
  • anti-TDH—Fab ′ has nucleotide pair 2 (—) having a nucleotide sequence complementary to nucleotide pair 2 (+)
  • anti-CJ-Fab ′ has nucleotide pair 2 (—).
  • Nucleotide pair 3 (—) having a complementary nucleotide sequence to 3 (+) was covalently bonded.
  • Y. Oku et al. (Microbiol. Immunol., 32, 807-816, 18988)
  • HRPO Horseradish peroxidase
  • Nucleotide pair 1 (one) conjugated anti-CT-Fab '
  • Nucleotide pair 2 (-) conjugated anti-TDH—Fab'
  • Nucleotide pair 3 (one) conjugated anti-CJ—Fab '
  • There are 2 0 pmol Zm l also HR PO conjugated anti over CT one F ab '
  • HR PO conjugated anti over TDH - F ab' respectively 8 0 0 11/11 1
  • HR PO conjugated anti - CJ- F ab ' The mixture containing at least six different complexes consisting of more than 160 ng gZml was mixed with lOmM Bicine buffer, 0.3 M sodium chloride, 0.1% bovine serum albumin, 0% It was prepared using 0.002% thimerosal, 5 mM EDTA pH 8.3.
  • 1.5 ml of this solution was dispensed into three different test tubes.
  • One of these tubes contains 1.5 ml of sample 1 containing 10 ng / ml CT, and one tube contains 1.5 ml of sample 2 containing 10 ng / ml TDH.
  • 1.5 ml of sample 3 containing () having a turbidity of 0.005 at 600 nm was added and reacted at 37 for 1 hour.
  • each test tube was dispensed into six test tubes at 0.5 m1 each, with two of them containing solid phase A and the other two containing solid phase B. The remaining two tubes were charged with solid phase C and reacted at 37 ° C for 1 hour. The reaction solution was removed, and each solid phase was washed with 3 ml of a 0.3 M sodium chloride solution (5 ml). Washed twice. Each washed solid phase was transferred to a separate test tube, and the HRPO bound to each solid phase was transferred to Y. Oku et al. (Microbiol. Immunol., 32, 807-816, 1988). We investigated according to the method. The results are shown in Table 1 and Figure 20 below.
  • sample 1 containing CT was significantly different from solid phase A, which is a solid phase for CT detection
  • sample 3 containing CJ was 3 It reacted significantly with a certain solid phase C, and it was found that one or more kinds of analytes can be examined with one reagent by the substances and methods described in the section of this example.
  • Step 1 The following four types of oligonucleotides having an amino group at the 5 ′ end were synthesized using a DNA synthesizer 39A of Applied Biosystems.
  • Amino group AAG CTT GCA TGC CTG CAG GT (This is called nucleotide 3 (+).)
  • Amino group — GGC GAC TGT CGA ACC GGA AA (this is nucleotide 5 (+))
  • oligonucleotides were covalently bonded to polystyrene beads having an amino group introduced thereto using glutaraldehyde, and then 0.1% gelatin and 0.02% thimerosal were used. And 1 mM mM sodium phosphate buffer containing 5 mM ED solution (ethylenediamintracetaldehyde) in 0.1 M sodium chloride, pH 7.0.
  • Step 2 A sulfhydryl group was introduced into the allergen.
  • diagnostic wheat flour, egg white, soybean, and rice purchased from Torii Pharmaceutical Co., Ltd. as allergens were concentrated under ice-cooling, respectively, using the YM-2 ultrafiltration membrane manufactured by Amicon.
  • Step 3 An oligonucleotide having a sequence complementary to the oligonucleotide synthesized in the above step 2 is synthesized in the same manner as described above, and has an amino group at the 5 ′ end. Ori Gonuk Leotide 4 types I got The oligonucleotide complementary to nucleotide pair 1 (+) is referred to as nucleotide pair 1 (one), and similarly, the other complementary oligonucleotides are referred to as nucleotide pair 1 (one). They were named nucleotide pair 3 (—), nucleotide pair 5 (—), and nucleotide pair 6 (-).
  • Step 4 An excess amount of N— ( ⁇ —malemidocaproyloxy) succinimide (abbreviation: EMCS) with respect to the four kinds of complementary oligonucleotides obtained in step 3 above was reacted at 37 ° C. for 1 hour to introduce a maleimide group at the 5 ′ end of each of the oligonucleotides. After the reaction, four kinds of maleimide group-introduced oligonucleotides were purified by ethanol precipitation according to a conventional method.
  • N— ( ⁇ —malemidocaproyloxy) succinimide abbreviation: EMCS
  • Step 5 The four kinds of concentrated solutions of the sulfhydryl group-introduced allergen prepared in the step 3 and the four kinds of maleimide group-introduced oligonucleotides synthesized in the step 4 are mixed. The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour to prepare an oligonucleotide-introduced allergen.
  • Nucleotide pair 1 (1) contains flour allergen
  • nucleoside pair 3 (—) contains soybean allergen
  • nucleoside pair 5 (—) contains egg white allergen
  • nucleoside pair 6 (—). ) was combined with rice allergen.
  • Step 6 The four kinds of oligonucleotide-binding allergens prepared in the above step 5 were each adjusted to have a final protein concentration of 1 jg Zm1 and a horseradish peroxidase-labeled anti-human antibody. 10 mM sodium phosphate buffer containing 0.1% gelatin, 0.3 M sodium chloride, and 5 mM EDTA so that the final concentration of IgE is 100 ng Zm1 p Diluted with H 7.0, this was Reagent A. 7.2 ml of this reagent A was poured into a test tube, and 2.4 ml of patient serum was added thereto and reacted at 37 ° C for 1 hour. This reaction solution is used as the reagent A mixture.
  • Step 7 After the reaction, the nucleotide pair 1 (+)-bound solid phase, the nucleotide pair 3 (10) -bound solid phase, the nucleotide pair 5 (+)-bound solid phase prepared in step 1 above, Each of the solid phases bound with the nucleotide pair 6 (+) was dispensed into a test tube, and 400 p. 1 of the mixed solution of the reagent A after the reaction was dispensed, and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • Step 8 After the reaction, the solid phase is washed three times with a 0.3 M sodium chloride solution, each solid phase is transferred to a new test tube, and the enzyme activity bound to the solid phase is measured for 3, 3 ', 5, 5'. —Measured using tetramethylbenzidine. The measurement was performed in duplicate.
  • the horizontal axis represents the type of each allergen and the classification of each allergen for each of three patient sera
  • the vertical axis represents the absorbance at 450 nm.
  • the time for reacting the mixture containing the immunocomplex-labeled substance-introduced substance with the nucleotide-bound solid phase is the same as the reaction time utilizing the antigen-antibody reaction for binding to the solid phase in the conventional method. Since the time can be extremely short in comparison, it is possible to reduce the so-called non-specific binding, in which the labeled substance is directly bound to the solid phase, and a highly sensitive measurement system can be realized.
  • one or more immunological ligands that is, one or more antigens or one or more antibodies can be simultaneously detected or measured by one reagent, so that they can be detected.
  • the time for measurement can be significantly reduced.
  • the combination of nucleotide sequences of complementary nucleotides is theoretically considered to be close to infinity, so that each one of the immunological pairs, that is, one or more antigens or one or more antibodies The number of combinations that can be detected is close to infinity.

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Description

明 細 書 一種類以上の免疫学的配位子の分析法、 その分析試薬およびその キッ ト
技術分野
本発明は、 抗原抗体反応を利用した免疫生体成分分析法に関し、 一種類以上の抗原または一種類以上の抗体の分析が一度に無限に近 い種類の組合せで行なう こ とができる一種類以上の抗原または一種 類以上の抗体の分析法、 その分析試薬およびそのキッ トに関する。
背景技術
臨床検査の分野において免疫学的検出法は、 微量の生体成分を定 量、 検出するために使用されている方法であり、 種々の方法が開発 されている。 そのなかで蛍光物質、 発光性物質、 酵素等の非放射性 物質を抗体の標識物として使用する免疫学的検出法は、 標識物とし て放射性物質を用いた際のように特殊な施設を必要とせず、 試薬の 扱いやすさ、 大量処理が可能などの点から生体成分分析法で広く利 用されている。
このような前記免疫学釣検出法は、 一種類の臨床診断試料で一種 類の抗原のみを測定あるいは検出する分析法がほとんどである。 例 えば、 試料中に複数種類存在する抗原の種類を抗原 A、 抗原 B、 抗 原 C とすれば、 抗原 Aを検出するためにはその抗原 Aを特異的に検 出するための個別の試薬が必要で、 抗原 B、 抗原 C等についても同 様に、 それぞれの試薬を必要としていた。 しかしながら、 臨床検査 において患者の罹患している疾病を決定する際には、 通常、 数種の 検査結果を総合して判断するこ とがほとんどであり、 患者は的確な 診断と治療を受けるために複数種類の検査を受けるこ とが一般的て ある。 そのため、 ほとんどの場合は患者が受ける検査数に比例して 採取される検体量は増加し、 患者の身体的な負担の一つとなってい る。 しかし、 こう した負担を軽減する要望に対して、 簡単で感度の 高い満足できる測定法は存在しないというのが現状である。
ところで、 試料中に存在する一種類以上の抗体の存在またはその 量を同時に検出する免疫学的検出法として ドッ トブロッ ト法が、 従 来、 例えば、 特開平 4 一 2 3 2 4 6 5号公報により知られている。 この ドッ トブロッ ト法とは、 ニトロセル口一スの膜上に種類の異な る種々の抗原を予めスポッ ト しておき、 このニ トロセルロース膜上 で検出すべき複数の抗体が含まれる疑いのある試料と反応させ、 つ いで、 ニトロセルロース膜上に捕捉された抗体に対して標識物導入 体を結合させることを基にして抗体の存在またはその量を検出して いた。 しかしながら、 この ドッ トプロッ ト法による一種類以上の抗 体の検出方法の全体のプロセスは時間を要し、 しかも大量の検体を 必要とする問題があった。 また、 この ドッ トプロ ッ ト法は固相に抗 原を結合させたものをその測定に用いるために、 その保存性が悪い という問題があった。
一方、 第 1 図は、 前記ドッ トブロッ ト法とは別の免疫学的検出法 であり、 標識化合物を用いた従来の免疫学的検出方法であるサン ド ィ ッチ法といわれている一般的プロセス図である。 第 1 図に基づい て標識化合物を用いた従来のサン ドイ ッチ法を次に説明する。 1 は 水不溶性担体からなる固相、 2は固相に結合している抗体、 3は抗 体に反応して結合した測定対象となる抗原であり、 4 は標識された 標識抗体である。
先ず固相 1 に結合している抗体 2に被検試料を接触させて被検試 料に含まれる検出すべき抗原 3をその抗体 2に結合させる （第 1 図 ( a ) ) 。 その反応系に含まれる未反応の夾雑物質を取り除く ため に洗浄を行なう （第 1 図 （ b ) ) 。 清浄された固相一抗体 -抗原複 合体に対して、 標識された標識抗体 4 と反応させて、 固相一抗体一 抗原一標識抗体複合体を形成させる （第 1図 （ c ) ) 。 前記工程の 反応系に含まれる未反応の標識抗体等の夾雑物を除去するための洗 浄を行なう （第 1図 （d) ) 。 清浄された固相一抗体一抗原一標識 抗体複合体をその標識物を検出することにより判定する （第 1図 （ e ) ) o
このような一般的な免疫学的検出方法において、 この判定に関わ る標識抗体が固相一抗体一抗原 -標識抗体複合体に由来するものだ けではなく、 標識抗体が直接固相に結合するいわゆる非特異結合を 起こすものもあり、 このような場合、 測定感度が低く なつてしまう 欠点がある。
ところで、 特定のホルモンや癌マーカ一、 細菌などの病原因子な どは検体中に極く微量しか含まれていないものも多く、 このような 測定または検出においては高感度な測定系が要望され、 開発されて きた （例えば、 石川栄治ら編， 酵素免疫測定法， 医学書院， 1 9 8 7 ； Y. Oku ら， Microbiol. Immunol.， 3 2, 8 0 7 - 8 1 6 , 1 9 8 8参照） 。 前記高感度な測定系を構築する際に大きな問題点 は固相への標識された抗体の非特異的な結合である。
この非特異的な反応を除去する目的で免疫複合体転移測定法 （S. Hashida ら， J. Biochem. 108 ， 960-964 頁， 1 9 9 0 ) などが開 発され、 従来の測定法より も高感度化を実現している。 この免疫複 合体転移測定法は、 次のようなプロセスで行なわれる。 すなわち、 特定の抗原を認識する抗体に Dinitrophenyl 基 （以下 DNP基と言 う） とピオチンを結合させた物質、 被検試料、 および同抗原を認識 する醇素標識された抗体を同時に混合し、 被検試料に含まれている 抗原と前記各抗体と反応させることによって免疫複合体 （以下 I C と言う） を形成させる。 一方、 DNP基に対する抗体を固相に結合 させたものを用意し、 この固相に先に形成された前記 I Cを接触さ せて、 前記 I C中に含まれる D N P基と、 この固相の D N P基に対 する抗体との抗原抗体反応を行なわせ、 固相上に前記 I Cを捕捉す ο
つぎに、 反応系に含まれている酵素標識された抗体の固相に対す る非特異結合の影響を排除するために、 前記捕捉された I Cを過剰 の D N P基化合物を添加することにより遊離させ、 遊離された I C をアビジンが結合された固相と反応させることによって再度異なる 固相上に捕捉し、 次いで、 該固相上に捕捉した I Cに含まれる酵素 活性を新たな試験管中で測定するこ とによって、 酵素標識された抗 体の固相に対する非特異結合の影響を排除し、 高感度化を実現して いる。 しかしながら、 この免疫複合体転移測定法を用いた従来知ら れている方法によれば、 1試薬で一種類以上の抗原または一種類以 上の抗体の存在の検出および定量することについて示しているもの は何もない。
また、 特開昭 6 3 - 1 8 8 3 9 9号公報には、 生物学的結合対で ある標的分子について試料を検定する方法が示されている。 具体的 には、 標的分子と結合して複合体を形成することができる第 1抗リ ガン ドプローブおよび標識された第 2抗リガン ドプローブ、 並びに 回収可能な支持体に対して、 標的分子が含まれる試料を接触させ、 つぎに、 試料から回収可能な支持体を実質的に分離して、 試料中の 標的分子の存在下で標的分子と第 1 および第 2プローブを含む分離 生成物を形成させ、 さらにその分離生成物を、 標的分子の存在を示 す標的成分の存在について監視することが明らかにされている。 し かしながら、 この特開昭 6 3— 1 8 8 3 9 9号公報に示された方法 には、 1試薬で一種類以上の抗原または一種類以上の抗体の存在の 検出および定量することについては何も示されていない。 また、 特開平 4 — 2 7 3 0 6 5号公報には、 核酸を介して抗体を 固相上に結合させておき、 抗原抗体反応により試料中に含まれてい る抗原を捕捉させ、 さらに標識物を捕捉させて、 洗浄後、 核酸部分 において選択的に切断して、 分離された標識物を定量するこ とによ り、 試料中に含まれる抗原を高感度に検出する方法が示されている 。 しかしながら、 この特開平 4 — 2 7 3 0 6 5号公報に示された方 法には、 1試薬で一種類以上の抗原または一種類以上の抗体の存在 の検出および定量することについはて何も示しておらずその示唆も ない。
前記したように従来の ドッ トプロッ ト法による一種類以上の抗体 の検出方法の全体のプロセスは時間を要し、 しかも比較的大量の検 体を必要とするという問題があった。
また、 第 1 図で示される前記従来の免疫学的検出方法においては 、 標識された抗体が固相に捕捉される反応は抗原抗体反応であるの で、 その標識抗体が固相に捕捉されることに要する時間が比較的長 く、 時単位となっている。 したがって、 反応系に含まれている標識 物導入体が固相に暴露される時間が長くなり、 そのためその標識物 導入体が直接固相に結合する、 いわゆる非特異的反応が生じ、 測定 感度が低くなるという問題があった。
また、 高感度な測定を実現するための従来の免疫複合体転移測定 法は、 操作工程数が多く操作も煩雑で、 その反応に長時間が必要で あるこ とが最大の欠点であった。
そこで、 本発明の第 1 の目的は、 反応系に加えられる標識物導入 体が固相に非特異的に捕捉されることにより測定感度を低めるとい う問題点をできるだけ抑えることを目的とする。 また、 本発明の第
2の目的は、 前記第 1 の目的に加えて一種類以上の抗体または一種 類以上の抗原の検出を一つの試薬で簡単な操作で行える分析試薬、 キッ ト、 およびそれらを用いた測定方法を提供するこ とを目的とす 発明の開示
前記した問題点を解決するために、 本発明は次の物質群 （A) お よび物質群 （B) を同時に含む一種類以上の免疫学的配位子の分析 試薬とするものである。
物質群 （A) ： 種類の異なる被測定物質である免疫学的配位子の 各々に対応して特異的な免疫学的結合性を有する各々の免疫学的抗 配位子に、 前記免疫学的配位子の種類に応じた特定の且つそれぞれ 任意に選択された塩基配列を有するヌク レオチ ドが結合されてなる 一種類以上の免疫学的抗配位子一ヌク レオチ ド結合体、
物質群 （B) ： 種類の異なる被測定物質である免疫学的配位子の 各々に対応して特異的な免疫学的結合性を有する各々の標識物導入 体。
また、 本発明は次の物質群 （A) および物質群 （B) を同時に含 む一種類以上の免疫学的配位子分析試薬と下記の固相 （C) から構 成される一種類以上の免疫学的配位子分析キッ トとするものである ( 物質群 （A) ： 種類の異なる被測定物質である免疫学的配位子の 各々に対応する特異的な免疫学的結合性を有する各々の免疫学的抗 配位子に、 前記免疫学的配位子の種類に応じて、 特定の且つそれぞ れ任意に選択された塩基配列を有するヌク レオチ ドが結合された、 一種類以上の免疫学的配位子—ヌク レオチ ド結合体、
物質群 （B) ： 種類の異なる被測定物質である免疫学的配位子の 各々に対応して特異的な免疫学的結合性を有する各々の標識物導入 体、
固相 （C) ： 前記物質群 （A) のヌク レオチ ドに対して、 それぞ れ相補的に結合できる塩基配列を有するヌク レオチ ドが水不溶性担 体に結合されている固相一ヌク レオチ ド結合体。
本発明において、 免疫学的配位子とは、 各々免疫学的に結合して ペアを形成する一方の分子をいい、 免疫学的抗配位子とは、 前記免 疫学的配位子に結合されるもう一方の分子をいう。 これらの免疫学 的配位子および免疫学的抗配位子は、 具体的には、 抗原または抗体 のいずれか一方を意味する。
本発明の相補的な配列を有するヌク レオチ ドには、 D N A、 R N Aが適用できる。 これらのヌ ク レオチ ドは人工的に合成したもの、 および天然から得られたものでも何れも利用できる。 これらのヌ ク レオチ ドは、 オリゴヌ ク レオチ ド、 ポリ ヌ ク レオチ ドの何れも適用 できる。
抗体—ヌ ク レオチ ド結合体または抗原一 ヌ ク レオチ ド結合体と、 固相に固定されたヌク レオチ ドとの結合は、 互いのヌク レオチ ドの 塩基配列の相補的な結合による。 互いのヌク レオチ ドの相補的塩基 配列については、 互いのヌク レオチ ド分子が結合可能な状態となる 、 相補的という点において部分的に対応しているものでもよく、 ま た互いの相補的塩基配列が完全に一致しているものでもよい。. ところで、 一般的にヌク レオチ ドの相補的結合は非常に特異性が 高く相補的な結合が形成されるのに要する時間は、 抗原一抗体複合 体が形成されるのに必要とされる時間に比較して極めて短くてもす むという特性がある。 本発明によれば、 上述した抗体ーヌ ク レオチ ド結合体または抗原— ヌク レオチ ド結合体をヌ ク レオチ ド結合固相 と反応させる時間は、 従来の免疫測定法である抗体結合固相一抗原 複合体に対して標識物導入体を結合させる時間に比較して極めて短 時間ですむ。 その理由は、 従来の免疫学的配位子、 即ち、 抗原また は抗体の測定においては、 標識物導入体が含まれる測定対象物が固 相に捉えられる方法は、 抗原—抗体反応によっており、 その反応の ため十分な時間が必要であつたが、 本発明の免疫学的配位子の測定 においては、 標識物導入体が含まれる測定対象物が固相に捉えられ る方法は、 ヌク レオチ ドの相補的な結合によっているので、 前記抗 原一抗体反応に比較して非常に短時間ですむという利点がある。
したがって、 本発明では標識物導入体、 例えば、 標識抗体等が固 相へ直接結合する十分な時間を与えないので、 非特異的な反応を低 減化することが可能となり高感度な測定系が実現できる。
また、 本発明によれば、 一つの試薬で一種類以上の免疫学的配位 子、 即ち、 抗原または抗体を検出または測定することができるので 、 前記従来法に比べそれらを検出または測定する時間を飛躍的に短 くすることができる。
前記固相 （ C ) の固相一ヌ ク レオチ ド結合体については、 ヌ ク レ ォチ ドの 5 ' 末端または 3 ' 末端に、 あるいはヌ ク レオチ ドの末端 以外の任意の位置において、 水不溶性担体に直接または導入された 官能基を介してそのヌ ク レオチ ドが共有結合されて、 前記固相 （ C ) の固相— ヌ ク レオチ ド結合体が形成されていてもよい。 またこの ように固相に導入した官能基と、 さらにヌク レオチ ドを構成する塩 基中に導入した官能基とを共有結合させて共有結合を形成してもよ い。
ヌ ク レオチ ドと固相との結合の別の方法として、 共有結合ではな く物理的吸着によって行なってもよい。 即ち、 ヌク レオチ ドの 5 ' 末端または 3 ' 末端に、 あるいはヌク レオチ ドの末端以外の任意の 位置において、 そのヌク レオチ ドが連結子に直接あるいは導入され た官能基を介して共有結合により結合されて連結子一ヌク レオチ ド 結合体が形成され、 この連結子一ヌク レオチ ド結合体が水不溶性担 体に物理的に吸着されて、 固相 （ C ) の固相一ヌク レオチ ド結合体 が形成されていてもよい。 この連結子は蛋白質とすることが好ま し い。
本発明の免疫学的配位子分析試薬において、 標識物導入体に導入 される標識物には、 例えば、 酵素学的に活性な原子団、 ピオチン、 アビジン、 ジゴキシゲニン、 ヌ ク レオチ ド、 金属コロイ ド粒子、 蛍 光体、 発光体、 金属化合物、 特異的な結合性を有する配位子または 放射性同位元素を使用することができる。 本発明で使用される固相 には、 例えば、 ポリスチレンが好適に使用される。
本発明の一種類以上の免疫学的配位子の分析法を、 測定すべき免 疫学的配位子を抗原とした場合を例にして第 2図〜第 1 0図に基づ いて、 次に説明する。
第 2図は、 一種類以上の免疫学的配位子の分析試薬が一種類以上 の抗原の分析試薬である場合の 1例を示し、 抗原 A、 抗原 B、 抗原 Cを検出する場合の一種類以上の抗原の分析試薬を概念的に図示し たものである。 第 2図において、 枠で囲ってある部分は全て一つの 試薬中に含まれる成分を示す。 第 2図中、 a— ひ 一 Β、 α - C は、 各々抗原 Α、 抗原 Β、 抗原 Cに対する抗体を示す。 この抗体ひ 一 Α、 抗体 _ Β、 抗体ひ 一 Cには標識物が結合されて各々種類の 異なる標識物導入体となっており、 この試薬中には 3種類の標識物 導入体が同時に含まれている。 この試薬中には、 さらに抗体ひ — A 、 抗体 α— B、 抗体 α— Cに各々異なる配列のヌ クレオチ ド 0 N , 、 ヌク レオチ ド ΟΝ2 、 ヌク レオチ ド ΟΝ3 が結合された 3種類の 抗体一ヌ ク レオチ ド結合体が前記 3種類の標識物導入体と同時に含 まれている。 このヌク レオチ ド ON, は、 他のヌ ク レオチ ド〇 N2 、 ヌ ク レオチ ド ON3 とは異なる塩基配列となっている。 またヌク レオチ ド〇N2 は、 他のヌク レオチ ド ON ! 、 ヌ ク レオチ ド O N3 とは異なる塩基配列を有する。 またヌ ク レオチ ド〇N3 は、 他のヌ ク レオチ ド ON, 、 ヌク レオチ ド〇N2 とは異なる塩基配列を有す る。 同一種類の抗体は同じ塩基配列のヌ ク レオチ ドが結合されてい る。 本発明において、 同一種類の抗体は、 ポリ ク ローナル抗体であ る場合も含む。
第 3図は、 本発明の一種類以上の抗原の分析試薬と組み合わされ て使用される ヌ ク レオチ ドが結合した固相の 1 例を示し、 第 3図 （ a ) はヌ ク レオチ ド〇 N , に相補的な塩基配列を有する ヌ ク レオチ ド （〇 N ) が結合された固相 （抗原 A用固相） 、 第 3図 （ b ) はヌ ク レオチ ド O N 2 に相補的な塩基配列を有する ヌ ク レオチ ド （ O N ) が結合された固相 （抗原 B用固相） 、 第 3図 （ c ) はヌ ク レオチ ド〇 N 3 に相補的な塩基配列を有する ヌ ク レオチ ド （ O N ) が結合 された固相 （抗原 C用固相） をそれぞれ示す。 これらの種類の異な る各固相は個別に独立して存在している。 これらの各固相は、 第 2 図に示される一種類以上の抗原の分析試薬と組み合されて使用され 、 これらは本発明の分析キッ トの 1 例を構成している。
第 2図に示される一種類以上の抗原の分析試薬に対して、 抗原 A 、 抗原 B、 抗原 Cが含まれている被検試料の添加が行なわれると、 一つの反応溶液中において抗原 A、 抗原 B、 抗原 Cの各々 について (抗体ー ヌ ク レオチ ド結合体） 一抗原一標識物導入体からなる複合 体が形成される。 この様子を第 4図に示す。
つぎに、 前記 （抗体一ヌ ク レオチ ド結合体） —抗原一標識物導入 体からなる複合体を含んでいる反応溶液を、 個別に独立して存在す る前記の抗原 A用固相、 抗原 B用固相、 抗原 C用固相にそれぞれ接 触させて、 前記複合体に含まれる ヌ ク レオチ ドと、 そのヌ ク レオチ ドに相補的な塩基配列を有する ヌ ク レオチ ドが結合された抗原 A用 固相、 抗原 B用固相および抗原 C用固相のヌ ク レオチ ドとハイプリ ダイゼ一ショ ンにより相補的に結合させる。
第 5 図、 第 6図、 第 7図に、 ヌ ク レオチ ドのハイブリ ダィゼーシ ヨ ンにより各固相に捕捉された複合体を示す。 第 5図は抗原 A用固 相に、 ヌ ク レオチ ドの相補的結合により捕捉された、 抗原 Aを含む 複合体を示す。 第 6図は抗原 B用固相に、 ヌク レオチ ドの相補的結 合により捕捉された、 抗原 Bを含む複合体を示す。 第 7図は抗原 C 用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相補的結合により捕捉された、 抗原 Cを 含む複合体を示す。
つぎに、 前記の各固相に捕捉された複合体に対して、 洗浄を行な レ、、 固相に結合していない不純物、 例えば、 標識物導入体等を除く 。 第 8図、 第 9図、 第 1 0図には、 独立して存在する各固相に捕捉 された 3種類の複合体が洗净されて不純物が除去された様子、 即ち 、 第 8図に示すように抗原 A用固相には抗原 Aを含む複合体が、 第 9図に示すように抗原 B用固相には抗原 Bを含む複合体が、 第 1 0 図に示すように抗原 C用固相には抗原 Cを含む複合体が各々洗浄さ れた後の状態を示している。 この各固相に捕捉された複合体に含ま れる標識物に対して、 判定を行なう。 例えば、 それぞれの独立した 反応系で酵素反応等を行ない、 それぞれの色調などで判定する。 標 識物が蛍光体、 色素、 金属コロイ ド等である場合は、 酵素反応を省 略して判定を行なう ことができる。
上記一種類以上の抗原の測定方法は、 被検物質が 3種類の抗原で ある場合を例にして説明しているが、 本発明においては、 一種類以 上の被測定物質を各々結合できる各々の抗体に、 結合させるヌ ク レ ォチ ドの配列を変化させることによってそれぞれ異なるヌ ク レオチ ドの性質を付与した一種類以上の抗体、 被検試料、 それぞれの被測 定物質を認識する抗体に標識物を結合させた化合物を反応させ免疫 複合体を形成させた後、 前記抗体に結合したヌ ク レオチ ドにそれぞ れ部分的あるいは完全に相補的な配列を有するヌク レオチ ドを結合 させた固相 （ヌ ク レオチ ド結合固相） と反応させるこ とにより免疫 複合体を固相上に捕捉し、 次に免疫複合体が結合した固相を洗浄し たのち、 免疫複合体中の標識物の量を測定あるいは検出するこ とに よつて被検試料中の一種類以上の被測定物質を測定あるいは検出す ることができる。
また、 上記の例は、 被検試料に含まれる抗原についての測定法で あるが、 本発明は、 被検試料に含まれる抗体についての測定法とす るこ とも包含している。 つぎに測定すべき免疫学的配位子を抗体と した場合の一種類以上の抗体の分析法を第 1 1 図〜第 1 9図を基に して説明する。 第 1 1 図は、 抗体 A、 抗体 B、 抗体 Cを検出する場 合の一種類以上の抗体の検出試薬を概念的に図示したものである。
また、 第 1 2図は、 本発明の一種類以上の抗体の分析試薬と組み 合わされて使用されるヌク レオチ ドが結合した固相の 1例を示し、 第 1 2図 （ a ) はヌク レオチ ド O N , に相補的な塩基配列を有する ヌ ク レオチ ドが結合された固相 （抗体 A用固相） 、 第 1 2図 （ b ) はヌ ク レオチ ド O N 2 に相補的な塩基配列を有するヌク レオチ ドが 結合された固相 （抗体 B用固相） 、 第 1 2図 （ c ) はヌ ク レオチ ド 〇N 3 に相補的な塩基配列を有するヌク レオチ ドが結合された固相 (抗体 C用固相） をそれぞれ示す。 これらの種類の異なる各固相は 個別に独立して存在している。 これらの各固相は、 第 1 1 図に示さ れる一種類以上の抗体の分析試薬と組み合されて使用され、 本発明 の一種類以上の抗体の分析キッ トの 1例を構成している。
第 1 1 図に示される一種類以上の抗体の分析試薬に対して、 抗体 A、 抗体 B、 抗体 Cが含まれている被検試料の添加が行なわれると 、 一つの反応溶液中において抗体 A、 抗体 B、 抗体 Cの各々につい て （抗原— ヌ ク レオチ ド結合体） —抗体一標識物導入体からなる複 合体が形成される。 この様子を第 1 3図に示す。
つぎに、 前記 （抗原一 ヌ ク レオチ ド結合体） —抗体一標識物導入 体からなる複合体を含んでいる反応溶液を、 個別に独立して存在す る前記の抗体 A用固相、 抗体 B用固相、 抗体 C用固相にそれぞれ接 触させて、 前記複合体に含まれるヌク レオチ ドと、 そのヌ ク レオチ ドに相補的な塩基配列を有するヌ ク レオチ ドが結合された抗体 A用 固相、 抗体 B用固相および抗体 C用固相のヌク レオチ ドとハイプリ ダイゼーショ ンにより相補的に結合させる。
第 1 4図、 第 1 5図、 第 1 6図に、 ハイブリダィゼーシヨ ンによ り各固相に捕捉された複合体を示す。 第 1 4図は抗体 A用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相補的結合により抗体 Aを含む複合体が捕捉されて いる状態を示す。 第 1 5図は抗体 B用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相補 的結合により抗体 Bを含む複合体が捕捉されている状態を示す。 第 1 6図は抗体 C用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相補的結合により抗体 C を含む複合体が捕捉されている状態を示す。
つぎに、 前記の各固相に捕捉された複合体に対して、 洗浄を行な い、 固相に結合していない不純物、 例えば、 標識物導入体等を除く 。 このようにして、 不純物が除去された、 3種類の各固相に捕捉さ れた複合体、 即ち、 第 1 7図に示す抗体 A用固相に捕捉された抗体 Aを含む複合体、 第 1 8図に示す抗体 B用固相に捕捉された抗体 B を含む複合体、 第 1 9図に示す抗体 C用固相に捕捉された抗体 Bを 含む複合体がそれぞれ得られる。
この各固相に捕捉された複合体に含まれる標識物に対して、 判定 を行なう。 例えば、 それぞれの独立した反応系で酵素反応等を行な し、、 それぞれの色調などで判定する。 標識物が蛍光体、 色素、 金属 コロイ ド等である場合は、 酵素反応を省略して判定を行なう こ とが できる。
本発明における一種類以上の免疫学的配位子の分析試薬に用いら れる物質群 （ C ) の固相ー ヌ ク レオチ ド結合体は、 乾燥状態でも安 定であり、 また溶液中においても、 E D T Aの存在下では安定して 保存され、 試薬として安定している。
図面の簡単な説明
第 1 図は、 標識化合物を用いた従来の免疫学的検出方法の一般的 プロセス図である。
第 2図は、 本発明の一種類以上の抗原の分析試薬の 1例を示し、 抗原 A、 抗原 B、 抗原 Cを検出する場合の一種類以上の抗原の分析 試薬を概念的に示す。
第 3図は、 本発明の一種類以上の抗原の分析試薬と組み合わされ て使用されるヌ ク レオチ ドが結合した固相の 1 例を示す。
第 4図は、 本発明における一つの反応溶液中に含まれる一種類以 上の抗原について、 （抗体一ヌク レオチ ド結合体） 一抗原一標識物 導入体からなる複合体が形成される様子を示す。
第 5図は、 本発明において抗原 A用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相補 的結合により、 抗原 Aを含む複合体が捕捉されている状態を示す。 第 6図は、 本発明において抗原 B用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相補 的結合により、 抗原 Bを含む複合体が捕捉されている状態を示す。 第 7図は、 本発明において抗原 C用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相補 的結合により、 抗原 Cを含む複合体が捕捉されている状態を示す。 第 8図は、 本発明における抗原 A用固相に相補された抗原 Aを含 む複合体が洗浄された後の状態を示す。
第 9図は、 本発明における抗原 B用固相に相補された抗原 Bを含 む複合体が洗浄された後の状態を示す。
第 1 0図は、 本発明における抗原 C用固相に相補された抗原 Cを 含む複合体が洗浄された後の状態を示す。
第 1 1 図は、 本発明の一種類以上の抗体の検出試薬の 1例を示し 、 抗体 A、 抗体 B、 抗体 Cを検出する場合の一種類以上の抗体の検 出試薬を概念的に示す。
第 1 2図は、 本発明の一種類以上の抗体の分析試薬と組み合わさ れて使用されるヌ ク レオチ ドが結合した固相の 1例を示す。
第 1 3図は、 本発明における一つの反応溶液中に抗体 A、 抗体 B 、 抗体 Cの各々について、 （抗原一 ヌク レオチ ド結合体） —抗体一 標識物導入体からなる複合体が形成される様子を示す。
第 1 4図は、 本発明において抗体 A用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相 補的結合により、 抗体 Aを含む複合体が捕捉されている状態を示す
0
第 1 5図は、 本発明において抗体 B用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相 補的結合により、 抗体 Bを含む複合体が捕捉されている状態を示す ο
第 1 6図は、 本発明において抗体 C用固相に、 ヌ ク レオチ ドの相 補的結合により、 抗体 Cを含む複合体が捕捉されている状態を示す 。
第 1 7図は、 本発明における抗体 A用固相に相補された抗体 Aを 含む複合体が洗浄された後の状態を示す。
第 1 8図は、 本発明における抗体 B用固相に相補された抗体 Bを 含む複合体が洗浄された後の状態を示す。
第 1 9図は、 本発明における抗体 C用固相に相補された抗体 Cを 含む複合体が洗浄された後の状態を示す。
第 2 0図は、 実施例 1 の一種類以上の免疫学的配位子の分析法に よる固相 A、 固相 B、 固相 Cに捕捉された標識物導入体の吸光度を 示す。
第 2 1 図は、 実施例 2の一種類以上の免疫学的配位子の分析法に よる固相 A、 固相 B、 固相 Cに捕捉された標識物導入体の吸光度を 示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例 1
5 ' 末端にア ミ ノ基を有する以下のような 3種類のォリ ゴヌ ク レ ォチ ドをァプライ ド バイオシステム社製自動 DN A合成装置 3 9 1 Aを用いて合成した。
ア ミ ノ基ー GAA TTC C C G G G G AT C C G T C G (これをヌ ク レオチ ドペア 1 (+ ) とする。 ）
ア ミ ノ基ー G C C A AG CTT G G C T G C A G G T C (これをヌ ク レオチ ドペア 2 ( + ) とする。 ）
ア ミ ノ基一 AAG CTT G C A TG C CTG CAG G T (これをヌ ク レオチ ドペア 3 ( + ) とする。 ）
これらのォリ ゴヌ ク レオチ ドをそれぞれァ ミ ノ基が導入されたポ リ スチレンビーズにグルタルアルデヒ ドを用いて共有結合させた後 、 0. 1 %スキム ミ ルク、 0. 1 %アジ化ナ ト リ ウムおよび 5 mM E DTA (エチレンジア ミ ンテ トラァセチッ クァシ ド） を含む 1 O mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 0. 1 M塩化ナ ト リ ウム p H 7. 0 中に保存した。 （以下、 ヌ ク レオチ ドペア 1 (+ ) を結合させたも のを固相 A、 ヌ ク レオチ ドペア 2 ( + ) を結合させたものを固相 B 、 ヌ ク レオチ ドペア 3 ( + ) を結合させたものを固相 Cとする。 ） また抗原と してコ レラ菌が産生するコ レラ毒素 （ C T ： Chorela Toxin ) 、 腸炎ビブリ ォが産生する耐熱性溶血毒 （TDH ： Thermo -Stable Direct Haemolysin ) 、 およびカンピロバクター菌 （C J ： Campylobacter jejuni) をそれぞれ家兎に免疫して、 それぞれ の抗原に対する抗体を調製した。 それぞれの抗体を Y. O k uら （ Microbiol. Immunol.， 3 2， 8 0 7 - 8 1 6 , 1 9 8 8 ) の方法に したがって I g Gから F ( a b ' ) 2 を調製し、 ついで F a b ' を 調製した。 抗一 C T一 F a b ' にはヌク レオチ ドペア 1 (+ ) に 相補的塩基配列を有するヌ ク レオチ ドペア 1 (一） を共有結合させ た。 同様に、 抗ー TD H— F a b ' にはヌク レオチ ドペア 2 ( + ) に相補的塩基配列を有するヌ ク レオチ ドペア 2 (—） を、 抗— C J - F a b ' にはヌ ク レオチ ドペア 3 ( + ) に相補的塩基配列を有す るヌ ク レオチ ドペア 3 (—） をそれぞれ共有結合させた。 同時にそ れぞれの F a b ' のヒンジ部 S H基に Y. O k u ら （Microbiol.
Immunol.,^ 2 , 8 0 7 - 8 1 6 , 1 9 8 8 ) の方法にしたがって 、 西洋わさびペルォキシダーゼ （HR P O) を導入した。
ヌ ク レオチ ドペア 1 (一） 結合抗一 C T一 F a b ' 、 ヌ ク レオチ ドペア 2 ( -) 結合抗- T D H— F a b ' およびヌ ク レオチ ドペア 3 (一） 結合抗— C J— F a b ' がそれぞれ 2 0 p m o l Zm l、 また HR P O結合抗ー C T一 F a b ' 、 HR P O結合抗ー T D H - F a b ' がそれぞれ 8 0 0 11 /11 1、 HR P O結合抗— C J— F a b ' が 1 6 0 0 n gZm l からなる以上 6種類の複合体を含む混 合液を l O mM B i c i n e緩衝液、 0. 3 M塩化ナ ト リ ウム、 0. 1 %牛血清アルブミ ン、 0. 0 0 2 %チメロサール、 5 mM E D TA p H 8. 3を用いて調製した。
この溶液 1 . 5 m 1 を 3本の異なる試験管にそれぞれ分注した。 これらの試験管のうち 1本には 1 0 n g/m l の C Tを含む試料 1 を 1 . 5 m l、 1 本には 1 0 n g/m l の TD Hを含む試料 2を 1 . 5 m l、 1 本には 6 0 0 n mにおける濁度が 0. 0 0 5の（ を 含む試料 3を 1 . 5 m l 加えて 3 7 で 1 時間反応を行なつた。
つぎにそれぞれの試験管中の溶液を 6本の試験管に 0. 5 m 1 ず つ分注し、 このうちの 2本には固相 Aを、 別の 2本には固相 Bを、 残りの 2本には固相 Cを投入して 3 7 °Cで 1 時間反応を行なった後 、 反応液を除き、 各固相を 0. 3 M塩化ナ ト リ ウム溶液 5 m 1 で 3 回洗浄した。 洗浄した各固相をそれぞれ別の試験管に移し、 各固相 に結合した H R P Oを Y. 0 k u ら （Microbiol. Immunol. , 3 2 , 8 0 7 - 8 1 6， 1 9 8 8 ) の方法にしたがって調べた。 その結果 を次の表 1 および第 2 0図に示す。
表 1
Figure imgf000020_0001
上記表 1、 第 2 0図のグラフから明らかなように C Tを含む試料 1 は C T検出用の固相である固相 Aと有意に、 また C Jを含む試料 3はじ J検出用の固相である固相 Cに対して有意に反応し、 本実施 例の項に記載した物質、 方法により 1つの試薬で一種類以上の測定 対象物を調べられることがわかった。
実施例 2
工程 1 ： 5 ' 末端にアミ ノ基を有する以下のような 4種類のオリ ゴヌク レオチ ドをアプライ ドバイオシステム社 D N A合成装置 3 9 1 Aを用いて合成した。
ア ミ ノ基— GAA TTC CCG GGG ATC CGT CG (これをヌ ク レオチ ドべ ァ 1 (+ ) とする。 ）
ァ ミ ノ基一 AAG CTT GCA TGC CTG CAG GT (これをヌ ク レオチ ドぺ ァ 3 ( + ) とする。 ） ア ミ ノ基— GGC GAC TGT CGA ACC GGA AA (これをヌ ク レオチ ドべ ァ 5 ( + ) とする。 ）
ア ミ ノ基— CCA CCC CTA CTC CTA ATC CC (これをヌ ク レオチ ドべ ァ 6 ( + ) とする。 ）
これらのオリ ゴヌ ク レオチ ドをそれぞれァ ミ ノ基が導入されたポ リ スチレ ン ビーズにグルタルアルデヒ ドを用いて共有結合させた後 、 0. 1 %ゼラチン、 0. 0 0 2 %チメ ロサール及び 5 mM E D Τ Α (エチレンジア ミ ンテ トラァセチッ クァシ ド） を含む 1 O mM リ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液 0. 1 M塩化ナ ト リ ウム p H 7. 0 中に保 存した。 工程 2 ： アレルゲンにスルフ ヒ ドリル基を導入した。 す なわち、 ア レルゲンと して鳥居薬品株式会社より購入した診断用小 麦粉、 卵白、 大豆、 米をそれぞれ氷冷下で、 ア ミ コ ン社製 YM - 2 限外濾過膜を用いて濃縮しながら、 0. 1 Mリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝 液 P H 7. 0 に対して透析した。 透析後、 過剰量のピアス （Pierce ) 社製 N—スクシンィ ミ ジル— S—ァセチルチオアセテー ト （略号 ： S A TA) を 3 7 °C 1 時間反応させ、 反応後 1 M ト リスー塩酸緩 衝液 p H 7. 0 および 1 Mハイ ドロキシルァ ミ ン p H 7. 0をそれ ぞれ終濃度 0. 1 Mになるように添加し、 3 7 °C 1 5分間反応させ 、 脱保護を行なった。 反応後 5 mM E D TAを含む 0. 1 Mリ ン 酸ナ ト リ ゥ厶緩衝液 p H 6. 0で平衡化したフ ァルマシア社製ゲル 濾過担体セフ アデッ クス G— 2 5 にアプライ し、 タ ンパク質に相当 するフラ ク ショ ンを収集した。 このフラ ク ショ ンを YM— 2限外濾 過膜によ り濃縮して、 4種類の、 スルフ ヒ ドリ ル基導入ア レルゲン の濃縮液を得た。
工程 3 ： 前記工程 2において合成したオリ ゴヌ ク レオチ ドに対し て相補的な配列を有するォリ ゴヌ ク レオチ ドを前記方法により同様 に合成し、 5 ' 末端にア ミ ノ基を有するオリ ゴヌ ク レオチ ド 4種類 を得た。 ヌ ク レオチ ドペア 1 ( + ) に対して相補的なオリ ゴヌ ク レ ォチ ドを、 ヌ ク レオチ ドペア 1 (一） と呼び、 同様に、 他の相補的 なオリ ゴヌ ク レオチ ドをヌ ク レオチ ドペア 3 (—） 、 ヌ ク レオチ ド ペア 5 (—） 、 ヌ ク レオチ ドペア 6 ( - ) と命名 した。
工程 4 ： 前記工程 3において得られた 4種類の相補的なオ リ ゴヌ ク レオチ ドに対し過剰量の N— （ ε —マレイ ミ ドカプロィルォキシ ) スク シンイ ミ ド （略号 ： EMC S ) を 3 7 °C 1 時間反応させ、 各 オ リ ゴヌ ク レオチ ドの 5 ' 末端にマレイ ミ ド基を導入した。 反応後 、 常法に従ってエタノ ール沈澱により 4種類のマレイ ミ ド基導入ォ リ ゴヌ ク レオチ ドを精製した。
工程 5 ： 前記工程 3において調製した 4種類の、 スルフ ヒ ドリ ル 基導入ア レルゲンの濃縮液と、 前記工程 4 において合成した 4種類 のマレイ ミ ド基導入ォリ ゴヌ ク レオチ ドを混合して 3 7 °C 1 時間反 応させるこ とにより、 オリ ゴヌ ク レオチ ド導入アレルゲンを調製し た。 なお、 ヌ ク レオチ ドペア 1 (一） に小麦粉アレルゲンを、 ヌ ク レオチ ドペア 3 (—） には大豆アレルゲンを、 ヌ ク レオチ ドペア 5 (―) には卵白アレルゲンを、 ヌ ク レオチ ドペア 6 (—） には米ァ レルゲンを結合させた。
工程 6 ： 前記工程 5において調製した 4種類のオリ ゴヌ ク レオチ ド結合アレルゲンをそれぞれタ ンパク質濃度として終濃度 1 j g Z m 1 となるように、 また西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト I g Eが終濃度 1 0 0 n g Zm 1 となるように 0. 1 %ゼラチン、 0 . 3 M塩化ナ ト リ ウム、 5 mM E D T Aを含む 1 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 p H 7. 0で希釈し、 これを試薬 Aと した。 この試 薬 A 7. 2 m 1 を試験管に注ぎ、 これに 2. 4 m l の患者血清を 添加し、 3 7 °C 1 時間反応させた。 この反応液を試薬 A混合液とす る。 なお患者血清は 3人の異なる患者より採取したものを用いた。 工程 7 ： 反応後、 前記工程 1 において調製したヌ ク レオチ ドペア 1 ( + ) 結合固相、 ヌ ク レオチ ドペア 3 (十） 結合固相、 ヌ ク レオ チ ドペア 5 ( + ) 結合固相、 ヌ ク レオチ ドペア 6 ( + ) 結合固相を それぞれ試験管に分注し、 こ こに反応後の試薬 A混合液 4 0 0 p. 1 を分注し、 3 7 °C 1 時間反応させた。
工程 8 ： 反応後、 0 . 3 M塩化ナ ト リ ウム溶液で 3回洗浄し、 各 固相をそれぞれ新しい試験管に移し、 固相に結合した酵素活性を 3 ， 3 ' ， 5 , 5 ' —テトラメチルベンジジンを用いて測定した。 な お、 測定は 2重測定で行なった。
得られた結果を図 2 1 に棒グラフで図示した。 図 2 1 のグラフに おいて、 横軸に各アレルゲンの種類と、 各アレルゲンにつき 3人の 患者血清毎の区分けを設け、 縦軸に 4 5 0 n mにおける吸光度を示 した。
図 2 1 によれば、 オリゴヌ ク レオチ ド導入夕ンパク質を用いるこ とによつて同時に複数のァレルゲン特異 I g Eが検出できることが わ力、る。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 免疫複合体一標識物導入体を含む混合物をヌ ク レオチ ド結合固相と反応させる時間は、 従来法における固相との結 合に抗原抗体反応を利用した反応時間と比較すると極めて短時間と するこ とができるので、 標識物導入体が固相へ直接結合する、 いわ ゆる非特異的な結合を低減化することが可能となり高感度な測定系 が実現できる。
本発明によれば、 一つの試薬で一種類以上の免疫学的配位子、 即 ち、 一種類以上の抗原または一種類以上の抗体を同時に検出または 測定するこ とができるので、 それらを検出または測定する時間を飛 躍的に短くすることができる。 本発明によれば、 相補的ヌク レオチ ドの塩基配列の組合せは理論 的には無限大近く まで考えられるので、 免疫学的ペアの各一方、 即 ち一種類以上の抗原または一種類以上の抗体の検出される組合せの 種類数は無限大近く までの組合せが可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記の物質群 （A) および物質群 （B) を同時に含む一種類 以上の免疫学的配位子の分析試薬。
物質群 （A) ： 種類の異なる被測定物質である免疫学的配位子の 各々 に対応する特異的な免疫学的結合性を有する各々の免疫学的抗 配位子に、 前記免疫学的配位子の種類に応じた特定の且つそれぞれ 任意に選択された塩基配列を有するヌ ク レオチ ドが結合されてなる 一種類以上の免疫学的抗配位子—ヌク レオチ ド結合体、
物質群 （B) ： 種類の異なる被測定物質である免疫学的配位子の 各々に対応して特異的な免疫学的結合性を有する各々の標識物導入 体。
2. 下記の物質群 （A) および物質群 （B) を同時に含む一種類 以上の免疫学的配位子の分析試薬と下記の固相 （C) から構成され る一種類以上の免疫学的配位子の分析キッ ト。
物質群 （A) ： 種類の異なる被測定物質である免疫学的配位子の 各々に対応する特異的な免疫学的結合性を有する各々の免疫学的抗 配位子に、 前記免疫学的配位子の種類に応じて、 特定の且つそれぞ れ任意に選択された塩基配列を有するヌク レオチ ドが結合されてな る一種類以上の免疫学的抗配位子—ヌク レオチ ド結合体、
物質群 （B) ： 種類の異なる被測定物質である免疫学的配位子の 各々に対応して特異的な免疫学的結合性を有する各々 の標識物導入 体、
固相 （C) ： 前記物質群 （A) のヌク レオチ ドに対して、 それぞ れ相補的に結合できる塩基配列を有するヌク レオチ ドが水不溶性担 体に結合されている固相—ヌ ク レオチ ド結合体。
3. 前記固相 （C) の固相一ヌ ク レオチ ド結合体は、 ヌ ク レオチ ドの 5 ' 末端または 3 ' 末端に、 あるいはヌ ク レオチ ドの末端以外 の任意の位置において、 直接あるいは導入された官能基を介して、 ヌ ク レオチ ドが水不溶性担体に共有結合されて形成された ものであ る請求項 2記載の一種類以上の免疫学的配位子の分析キッ ト。
4 . 前記固相 （ C ) の固相—ヌ ク レオチ ド結合体は、 ヌ ク レオチ ドの 5 ' 末端または 3 ' 末端に、 あるいはヌ ク レオチ ドの末端以外 の任意の位置において、 直接あるいは導入された官能基を介して、 ヌ ク レオチ ドが連結子に共有結合されて連結子— ヌ ク レオチ ド結合 体が形成され、 該連結子一ヌ ク レオチ ド結合体が水不溶性担体に物 理的に吸着されて形成されたものである請求項 2記載の一種類以上 の免疫学的配位子の分析キッ ト。
5 . 前記連結子が蛋白質である請求項 4記載の一種類以上の免疫 学的配位子の分析キッ ト。
6 . 前記相補的に結合できる塩基配列を有するヌク レオチ ドは、 結合部位の塩基が一部相補的に一致していない部分的な相補配列、 またはその塩基が完全に相補的に一致した完全な相補配列であるこ とを特徴とする請求項 2、 3、 4 または 5記載の一種類以上の免疫 学的配位子の分析キッ ト。
7 . 前記標識物が酵素学的に活性な原子団、 ピオチン、 アビジン 、 ジゴキシゲニン、 ヌ ク レオチ ド、 金属コロイ ド粒子、 蛍光体、 発 光体、 金属化合物、 特異的な結合性を有する配位子または放射性同 位元素であることを特徴とする請求項 1、 2、 3、 4、 5 または 6 記載の一種類以上の免疫学的配位子の分析試薬または一種類以上の 免疫学的配位子の分析キッ ト。
8 . 前記ヌ ク レオチ ドが、 オリゴヌ ク レオチ ドまたはポリ ヌ ク レ ォチ ドであることを特徴とする請求項 1、 2、 3、 4、 5、 6 ま た は 7記載の一種類以上の免疫学的配位子の分析試薬または一種類以 上の免疫学的配位子の分析キッ ト。
9 . 前記免疫学的配位子が抗体である請求項 1、 2、 3、 4、 5 、 6、 7 または 8記載の一種類以上の免疫学的配位子の分析試薬ま たは一種類以上の免疫学的配位子の分析キッ ト。
1 0 . 前記免疫学的配位子が抗原である請求項 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7 または 8記載の一種類以上の免疫学的配位子の分析キッ h o
1 1 . ( 1 ) 前記請求項 2記載の物質群 （ A ) 、 前記請求項 2記 載の物質群 （ B ) 、 および被測定物質として 1 種類以上の免疫学的 配位子を含んでいると疑われる被検試料を一の反応容器内で反応さ せ、 各々の免疫学的配位子の種類に応じた、 （免疫学的抗配位子 - ヌ ク レオチ ド結合体） 一免疫学的配位子一標識物導入体からなる複 合体を反応溶液中に形成し、
( 2 ) 各々独立して存在している前記請求項 2記載の固相 （ C ) に対し、 前記 （免疫学的抗配位子一ヌク レオチ ド結合体） 一免疫学 的配位子一標識物導入体からなる一種類以上の複合体を含んでいる と思われる反応溶液を接触させることにより、 互いの相補的な塩基 配列有するヌク レオチ ド部分において結合した （固相ーヌク レオチ ド結合体） 一 （免疫学的抗配位子一ヌク レオチ ド結合体） 一免疫学 的配位子一標識物導入体からなる複合体を形成し、 次いで、
( 3 ) 前記 （ 2 ) で形成された複合体に含まれる標識物を検出ま たは定量することにより一種類以上の免疫学的配位子を同時に分析 する方法。
1 2 . 前記免疫学的配位子が抗原である請求項 1 1 記載の免疫学 的配位子を同時に分析する方法。
1 3 . 前記免疫学的配位子が抗体である請求項 1 1 記載の免疫学 的配位子を同時に分析する方法。
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