JP5808538B2 - 前立腺癌治療後の再発に関する早期決定のための方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、処置後の前立腺疾患の早期段階の再発の検出に有用な組成物および方法に関する。

本発明の背景および序論
世界中で、毎年、およそ６７０，０００例の新たな前立腺癌の症例がみられる。英国前立腺癌発生数統計、ｈｔｔｐ：／／ｉｎｆｏ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒｓｔａｔｓ／ｔｙｐｅｓ／ｐｒｏｓｔａｔｅ／ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ／（２００９年１月２３日に最後にアクセス）。欧州では、２００４年、新たに２３７，８００例の症例が診断され、前立腺癌による死亡例は８５，２００例発生した。非特許文献１。癌の家族歴、喫煙状態、年齢および人種などの臨床的リスクファクターに加え、前立腺癌の最初の検出は、一般的に、正常、良性および悪性の前立腺上皮細胞によって産生される中性セリンプロテアーゼである前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）と称されるタンパク質の循環濃度が増大するという所見に基づく。前立腺細胞によって産生されるＰＳＡは、遊離形態および複合体形成形態の両方で、精液、血清、血漿および尿中に存在しており、該体液中において測定され得る。遊離形態と複合体形成形態の同時の測定値は「総ＰＳＡ」測定値と称され、正確には「ｔＰＳＡ」または「ＰＳＡ」のいずれかで称され得る。血中ＰＳＡ濃度は種々の前立腺疾患において、特に前立腺癌において増大し、この濃度増大は血清ＰＳＡ測定値に反映される。非特許文献２。したがって、過去２０年間、血清ＰＳＡに対する従来型イムノアッセイなどのアッセイが前立腺癌の初期検出に使用されてきた。非特許文献３。

一般的に、血清ＰＳＡ濃度の増大が患者において観察された場合、癌の存在を確認するため、および癌の病態を特性評価するために前立腺の生検が行なわれる。前立腺癌が確認されたら、患者のおよそ３分の２は、根治的前立腺摘除術（ＲＰ、前立腺の完全な外科的除去）、あるいはさまざまな方法による放射線、ホルモンまたは化学療法で処置される。しかしながら、該処置患者のうち４０％に至る患者に疾患が再発することがあり得る。非特許文献４参照。前立腺癌の再発は、生存に対する予後不良に関連する。しかしながら、予後は、再発が初期段階で検出され、サルベージ処置などの適切な管理法が開始され得るようになれば、改善され得る。残念ながら、再発の尤度を評価するための既存の方法は早期検出には不充分である。ＲＰ前またはＲＰ時に得られる臨床病理学的観測結果、例えば、癌の病期、グリーソンスコア、診断時の年齢、外科的切除縁（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｍａｒｇｉｎ）の関与（外科的切除縁部の癌の存在）、癌の局所組織浸潤、癌の前立腺被膜浸潤、癌の精嚢浸潤、癌の膀胱頸部（ｂｌａｄｄｅｒ ｎｅｃｋ）浸潤、癌のリンパ節浸潤、および総腫瘍体積により、疾患再発尤度の評価において、いくらか情報は得られるが、必ずしも予測的であるとは限らず、再発の正確な時点を特定するためには使用され得ない。生検または種々の型の画像化法を用いて疾患の再発が確認され得るが、このような方法は感度が不充分であるという欠点を有する。一般的に、生検または画像化試験によって新たな腫瘍が検出される時点までに、再発は、予後が特に不良な後期段階になっている。したがって、このような方法は、早期検出および早期検出に基づいた集中的処置のためには不充分である。

疾患再発の根拠を臨床病理学的所見および生検または画像化試験とすることの不充分さに対処するため、疾患再発は、現在では、主に処置後の患者の血清ＰＳＡ濃度が増大しているという所見を根拠にしている。例えば、根治的前立腺摘除術後、残存しているＰＳＡ分泌前立腺組織がなく、術前レベルのＰＳＡの生理学的クリアランスに充分な時間が経過した場合、ＰＳＡの血清濃度は最下点（ｎａｄｉｒ）まで低下する。その最下点後に血清ＰＳＡ濃度の上昇が開始した場合は、疾患再発の表示であり得る。この型の再発は、再発が局所または遠隔腫瘍の新たな所見ではなく、ＰＳＡの循環レベルの増大のみを反映しているため、「生化学的再発」（ＢＣＲ）と称される。ＰＳＡの生化学的再発は、現在、ＲＰなどの処置後の前立腺癌の医療的管理におけるケアの標準となっている。

生化学的再発が生じたとみなされる時点を確立するための種々の閾値が公表されている。非特許文献５。典型的には、ＰＳＡの最下点後の２００ｐｇ／ｍＬ（０．２ｎｇ／ｍｌ）の値が生化学的再発点の規定に用いられる。同一著者。ＰＳＡに対する従来型アッセイは１００ｐｇ／ｍｌの範囲の検出限界を有し、場合によっては、より高い実効感度（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を有する。１００ｐｇ／ｍＬの検出限界を有する従来型ＰＳＡアッセイを用いた生化学的再発の平均検出期間は３８．４ヶ月以上である。非特許文献６。

Ｂｏｙｌｅ，Ｐら Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １６：４８１−４８８（２００５） Ｖａｌｓａｎｅｎら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ ２：９１−９７（１９９９） Ｙｕら、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １５７：９１３−９１８（１９９７） Ｍｏｕｌ，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １６３：１６３２−１６４２（２０００） Ｃｏｏｋｓｏｎ ＭＳら、Ｊ Ｕｒｏｌｏｇｙ １７７：５４０−５４５（２００７） Ｖａｓｓｉｌｉｋｏｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３（２）：１１５−１２３（２０００）

発明の簡単な概要
本発明は、前立腺疾患の処置を受けた患者のモニタリング、ならびに前立腺癌の検出、および治療後、または臨床観測結果ならびに本発明のＰＳＡの値およびＰＳＡの指標に応じて前立腺摘除後治療を施さないと決定した後の癌再発または安定病態の検出に有用である。本発明は、従来型アッセイよりも優れたＰＳＡの検出の限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）および実効感度を有する新規なアッセイを提供することにより、処置後の前立腺癌の生化学的再発の特定に対して、従来型血清ＰＳＡアッセイよりも利点を有する。したがって、本発明は、前立腺疾患の処置を受けた患者のモニタリングおよびＲＰなどの一次治療後の安定病態（再発なし）とは対照的な癌再発の検出に有用である。

また、本明細書に記載の方法は、例えば、前立腺癌の初期段階の再発の検出、または患者が前立腺癌の根治的前立腺摘除術後、安定であることを早期に判定するためにも有用である。本発明の改善された検出の限界および実効感度により、再発の早期検出が可能になり、適切な場合では、癌の再発に対するサルベージ治療の早期開始が可能になる。

前立腺癌に対する治療は、根治的前立腺摘除術、放射線治療、化学療法、または抗アンドロゲン処置であり得る。安定病態の早期検出により、切除縁およびグリーソンスコアが不良であり、安定病態が検出されなかった場合は別な方法で処置されることになるであろう比較的若年齢の患者において、不必要な補助的治療が回避され得る。他方で、本発明の方法を用いて初期段階の再発が検出された患者にはより早期に処置を施すことができる。したがって、低レベルのＰＳＡを検出する能力により、ＰＳＡレベルが低いことからＢＲを有しないことがわかり得るため、逆戻り（ｒｅｌａｐｓｅ）の確率が高いために現状では処置を受けている一部の患者の治療を低減することが可能になり得る。また、ＢＲのこの早期検出により早期治療がもたらされ得る。Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．４，ｐｐ３１６−３８１，２００４。

一実施形態において、総ＰＳＡ（ｔＰＳＡまたはＰＳＡ）のレベル濃度は、治療後の患者において、治療後の患者から１つ以上の試料を採取し、少なくとも１ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および１０ｐｇ／ｍＬより低値の実効感度を有するＰＳＡアッセイを用いて各試料中のＰＳＡの量を測定することによりモニタリングされ得る。別の実施形態において、１ｐｇ／ｍＬより低い検出限界および実効感度を有するＰＳＡアッセイを使用し、ＰＳＡの値が、その対応するＰＳＡの指標カットオフを超えているかどうかを判定することにより、治療後の患者における前立腺癌の再発を判定する。より好ましい実施形態では、ＰＳＡアッセイは、少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および０．５ｐｇ／ｍＬ以下の実効感度を有する。

本発明の方法において使用されるＰＳＡアッセイの改善された検出の限界および実効感度により、早期段階での生化学的逆戻りまたは再発の検出が可能になる。この初期段階の生化学的再発の検出により、癌細胞は少ないが、かかる細胞が処置に対してより感受性である場合、早期段階でのサルベージ治療が可能になるはずである。サルベージ処置としては限局的放射線療法が挙げられ得、併用アンドロゲン枯渇とともに、またはなしで施され得る。例えば、サルベージ放射線療法は、６ヶ月より短いＰＳＡ倍加時間（血清ＰＳＡ濃度の倍加が起こったときの日数または月数または年数単位の期間）を有する男性の処置に使用した場合、標準的な従来型アッセイを用いて判定された生化学的再発後＜２年間のうちに処置を施すと、有益な効果を有することが示されている。Ｔｒｏｃｋら、ＡＳＣＯ ２００８ Ｕｒｏｇｅｎｉｔａｒｙ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．８５。また、初期段階の生化学的再発の検出により、安定病態を有する患者において、費用のかかるさらなる管理を行なう必要性が排除され得るか、または該患者において不必要な補助的治療およびサルベージ治療の必要性が回避され得る。

本発明の別の実施形態では、少なくとも１ｐｇ／ｍＬ未満の実効感度を有するＰＳＡに対するアッセイを使用し、前立腺癌の治療後の初期段階の生化学的再発を検出する。ＰＳＡ測定値に基づいた指標は、初期段階の生化学的再発の検出に使用される。このような指標としては、モニタリング中の観測された最大ＰＳＡレベル、最下点ＰＳＡレベル、最下点ＰＳＡレベルの乗数、最下点ＰＳＡレベルに対する観測された最大ＰＳＡレベルの比、または倍加数が挙げられる。ＰＳＡ速度の指標、例えば、ＰＳＡ増大速度 時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾き、第２の連続的増加（ｐｇ／ｍＬ／月）、および倍加時間などもまた使用され得る。このような指標はいずれも、単独または組合せで、患者が初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するのか、または安定病態を有するのかを判定するのに使用され得る。

一態様において、本発明に実施形態を示すＰＳＡアッセイは、患者が前立腺癌再発に対して早期のリスクを有するかどうかを判定するため、すなわち、初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を検出するため、または患者が安定病態の特徴を示す傾向にあるかどうかを判定するため、すなわち、安定病態を検出するために使用される。例えば、観測された最大［ＰＳＡ］が［ＰＳＡ］の指標以上である場合、患者はＥＳ−ＢＣＲを有すると判定され、観測された最大［ＰＳＡ］が［ＰＳＡ］の指標より小さい場合、患者は安定病態を有すると判定される。

別の例として、ＰＳＡアッセイは、前立腺癌の根治的前立腺摘除術後の患者から採取された連続試料中のＰＳＡ濃度レベルを測定するために使用され得る。該測定値は、ＰＳＡ速度の値を決定するために使用され得る。ＰＳＡ速度の増大値がＰＳＡ速度の増大の指標以上であるかどうかを判定することにより、患者がＥＳ−ＢＣＲを有するのか、または安定病態を有するのかを検出することが可能である。ＰＳＡの増大速度が速度の指標以上である場合、患者はＥＳ−ＢＣＲを有すると判定され、ＰＳＡの増大速度が閾値を下回った場合、患者は安定病態と判定される。ＰＳＡ速度の指標が倍加時間である場合、倍加時間の値が少なくとも倍加時間の指標まで低値である場合、倍加時間の値は倍加時間の指標以上である、すなわち、短い倍加時間は長い倍加時間よりも不良な予後と関連している。

別の態様において、１つ以上のＰＳＡの指標に基づいたさらなる解析により、患者をさらなる亜型に分類することが可能になり、臨床医が、該亜型に適切な処置をあつらえること、およびこのような治療を現行の診療よりも早期の時点で使用することが可能になる。サルベージ処置の早期開始により患者の転帰が改善され得る。

本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
患者が初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の該患者から試料を採取する工程；
ｂ）２．０ｐｇ／ｍＬ未満の検出の限界を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）１つ以上の試料のＰＳＡレベルを用いてＰＳＡの値を決定する工程
を含み、
該ＰＳＡの値が少なくともＰＳＡの指標であるか、または該ＰＳＡの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該ＰＳＡの値が該ＰＳＡの指標を超えていない場合は安定病態が検出される、方法。
（項目２）
前記ＰＳＡの指標が［ＰＳＡ］である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記検出の限界が少なくとも１．０ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記検出の限界が少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目１または１４に記載の方法。
（項目５）
前記検出の限界が少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目１または１４に記載の方法。
（項目６）
前記試料が前記患者からの一連の組の試料の１つであり、各試料中のＰＳＡの量が決定される、項目１、４、または１４いずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記ＰＳＡの指標が速度の指標である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記速度の指標が倍加時間である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記速度の指標が時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きである、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記速度の指標が［ＰＳＡ］の増加速度である、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記ＰＳＡの指標が観測されたＰＳＡ最大レベル／最下点ＰＳＡレベルである、項目６に記載の方法。
（項目１２）
前記ＰＳＡの値が［ＰＳＡ］である、項目６に記載の方法。
（項目１３）
前記ＰＳＡの値が第２の連続的増加（ｐｇ／ｍＬ／月）である、項目６に記載の方法。
（項目１４）
患者が初期段階の生化学的逆戻り（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の該患者から試料を採取する工程；
ｂ）２．０ｐｇ／ｍＬ未満の検出の限界を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）１つ以上の試料の該ＰＳＡレベルを用いて２つ以上のＰＳＡの値を決定する工程
を含み、
２つ以上のＰＳＡの値の各々が少なくともそのそれぞれのＰＳＡの指標であるか、または該そのそれぞれのＰＳＡの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出される、方法。
（項目１５）
前記検出の限界が少なくとも１．０ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
１つのＰＳＡの指標が速度の指標である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記ＰＳＡの指標の１つが時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きである、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記速度の指標が倍加時間である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記速度の指標が［ＰＳＡ］の増加速度である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記速度の指標が観測されたＰＳＡ最大レベル／最下点ＰＳＡレベルである、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記ＰＳＡの値が第２またはそれ以降の連続的増加（ｐｇ／ｍＬ／月）である、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
前記［ＰＳＡ］がＰＳＡの値であり、該［ＰＳＡ］が少なくとも測定された最小の［ＰＳＡ］の２倍であるか、または該測定された最小の［ＰＳＡ］を超えている、項目２または１２いずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記ＰＳＡレベルの測定が、さらに、
前記試料を、非核酸のＰＳＡ結合実体と核酸マーカーとを含むコンジュゲートと接触させる工程
を含む、項目１、１４、４５、または４９〜６０いずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記ＰＳＡレベルの測定が、さらに、
前記試料を、非核酸のＰＳＡ結合実体と核酸マーカーとを含むコンジュゲートと接触させる工程
を含む、項目６に記載の方法。
（項目２５）
前記倍加時間の指標が１５０日間である、項目８または１８いずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記倍加時間の指標が４００日間である、項目８または１８いずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記倍加時間の指標が５５０日間である、項目８または１８いずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記倍加時間の指標が７００日間である、項目８または１８いずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記倍加時間の値が１５０〜４００日間であり、２型ＥＳ−ＢＣＲが検出される、項目８または１８いずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの指標が少なくとも０．０３である、項目９または１７いずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記倍加時間の値が約１５０日間〜約４００日間である、項目８または１８いずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記倍加時間の値が約１０ヶ月〜２４ヶ月である、項目８または１８いずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記観測された最大ＰＳＡ／最下点が３〜１１である、項目１１または２０いずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記観測された最大ＰＳＡ／最下点が６である、項目１１または２０いずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記［ＰＳＡ］の指標が１０ｐｇ／ｍＬである、項目２または１２いずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記［ＰＳＡ］の指標が１５ｐｇ／ｍＬである、項目２または１２いずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記［ＰＳＡ］の指標が２０ｐｇ／ｍＬである、項目２または１２いずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記［ＰＳＡ］の指標が２５ｐｇ／ｍＬである、項目２または１２いずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記［ＰＳＡ］の指標が５０ｐｇ／ｍＬである、項目２または１２いずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記［ＰＳＡ］の指標が１０ｐｇ／ｍＬである、項目２２に記載の方法。
（項目４１）
前記［ＰＳＡ］の指標が１５ｐｇ／ｍＬである、項目２２に記載の方法。
（項目４２）
前記［ＰＳＡ］の指標が２０ｐｇ／ｍＬである、項目２２に記載の方法。
（項目４３）
前記［ＰＳＡ］の指標が２５ｐｇ／ｍＬである、項目２２に記載の方法。
（項目４４）
前記［ＰＳＡ］の指標が５０ｐｇ／ｍＬである、項目２２に記載の方法。
（項目４５）
患者が高速、中速または低速の初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の該患者から一連の組の血液血清試料得る工程；
ｂ）約０．５ｐｇ／ｍＬの検出の限界を有するＰＳＡアッセイを使用し、各試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）倍加時間および観測された最大ＰＳＡレベルを決定する工程；
ｄ）該倍加時間が倍加時間の指標より短いことを判定し、それによりＥＳ−ＢＣＲを検出する工程；ならびに
ｅ）該倍加時間および観測された最大ＰＳＡに基づいて、ＥＳ−ＢＣＲを急速、中速、または低速に分類する工程
を含む、方法。
（項目４６）
前記倍加時間が１５０日間より短い、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記倍加時間が１５０〜４００日間である、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記倍加時間が４００日間より長い、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
患者が初期段階の生化学的逆戻り（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の該患者から試料を採取する工程、ここで、該試料は該患者からの一連の組の試料の１つであり、各試料中のＰＳＡの量が決定される；
ｂ）２．０ｐｇ／ｍＬ未満の検出の限界を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）１つ以上の試料の該ＰＳＡレベルを用いて、時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きを決定する工程
を含み、
該時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの値が少なくとも時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの指標であるか、または該時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの値が該時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの指標を超えない場合は安定病態が検出される、方法。
（項目５０）
前記検出の限界が１．０ｐｇ／ｍＬ未満である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記検出の限界が少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目１４または４９いずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記検出の限界が少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目１４または４９いずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
患者が初期段階の生化学的逆戻り（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の該患者から試料を採取する工程、ここで、該試料は該患者からの一連の組の試料の１つであり、各試料中のＰＳＡの量が決定される；
ｂ）２．０ｐｇ／ｍＬ未満の検出の限界を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）１つ以上の該試料のＰＳＡレベルを用いて［ＰＳＡ］の増加速度を決定する工程
を含み、
該［ＰＳＡ］の増加速度の値が少なくとも［ＰＳＡ］の指標の増加速度であるか、または該［ＰＳＡ］の指標の増加速度を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該［ＰＳＡ］の増加速度の値が該［ＰＳＡ］の指標の増加速度を超えない場合は安定病態が検出される、方法。
（項目５４）
前記検出の限界が１．０ｐｇ／ｍＬ未満である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記検出の限界が少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記検出の限界が少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目５３に記載の方法。
（項目５７）
患者が初期段階の生化学的逆戻り（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の該患者から試料を採取する工程、ここで、該試料は該患者からの一連の組の試料の１つであり、各試料中のＰＳＡの量が決定される；
ｂ）２．０ｐｇ／ｍＬ未満の検出の限界を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程
を含み、
［ＰＳＡ］の値が少なくとも［ＰＳＡ］の指標であるか、または該［ＰＳＡ］の指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該ＰＳＡの値が該ＰＳＡの指標を超えていない場合は安定病態が検出される、方法。
（項目５８）
前記検出の限界が１．０ｐｇ／ｍＬ未満である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記検出の限界が少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記検出の限界が少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値である、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
患者が高速、中速または低速の初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の患者から一連の組の血液血清試料を得る工程；
ｂ）約０．５ｐｇ／ｍＬの実効感度を有するＰＳＡアッセイを使用し、各試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）ＰＳＡ速度の値を決定する工程；
ｄ）該ＰＳＡ速度の値がＰＳＡ速度の指標以下であることを判定し、それによりＥＳ−ＢＣＲを検出する工程；および
ｅ）ＥＳ−ＢＣＲを、該ＰＳＡ速度の指標に基づいて急速、中速または低速に分類する工程
を含む、方法。
（項目６２）
ＥＳ−ＢＣＲが検出された場合、抗アンドロゲン療法、放射線治療および化学療法から選択される治療が施されることになる、項目１、１０、１４、１９、４５、または４９〜６０、９２いずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
安定病態が検出された場合、その後ＥＳ−ＢＣＲが検出されないときはさらなる治療がもたらされない、項目１、１０、１４、１９、４５、または４９〜６０、９３、９４いずれか１項に記載の方法。
（項目６４）
ＥＳ−ＢＣＲが検出され、ＥＳ−ＢＣＲが高速と分類された場合、抗アンドロゲン療法、放射線治療および化学療法から選択される治療が施されることになる、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
ＥＳ−ＢＣＲが検出され、ＥＳ−ＢＣＲが中速と分類された場合、さらに（ｆ）臨床パラメータを得る工程を含み、グリーソンスコアカットオフを超えるグリーソンスコアを有し、カットオフ年齢より若い患者は抗アンドロゲン療法、放射線治療および化学療法から選択される治療が施されることになる、項目６１に記載の方法。
（項目６６）
ＥＳ−ＢＣＲが検出され、ＥＳ−ＢＣＲが低速と分類された場合、さらに（ｆ）臨床パラメータを得る工程を含み、グリーソンスコアカットオフを超えるグリーソンスコアを有し、カットオフ年齢より若い患者は抗アンドロゲン療法、放射線治療および化学療法から選択される治療が施されることになる、項目６１に記載の方法。
（項目６７）
安定病態が検出された場合、その後ＥＳ−ＢＣＲが検出されないときはさらなる治療がもたらされない、項目６１に記載の方法。
（項目６８）
第２のＰＳＡの指標が［ＰＳＡ］であり、該［ＰＳＡ］のカットオフが１５ｐｇ／ｍｌである、項目１７に記載の方法。
（項目６９）
第２のＰＳＡの指標が［ＰＳＡ］であり、該［ＰＳＡ］のカットオフが１０ｐｇ／ｍｌである、項目１７に記載の方法。
（項目７０）
第２のＰＳＡの指標が［ＰＳＡ］であり、該［ＰＳＡ］のカットオフが５ｐｇ／ｍｌである、項目１７に記載の方法。
（項目７１）
第１のＰＳＡの指標が［ＰＳＡ］であり、該［ＰＳＡ］のカットオフが５ｐｇ／ｍｌである、項目１４に記載の方法。
（項目７２）
第１のＰＳＡの指標が［ＰＳＡ］であり、該［ＰＳＡ］のカットオフが１０ｐｇ／ｍｌである、項目１４に記載の方法。
（項目７３）
第１のＰＳＡの指標が［ＰＳＡ］であり、該［ＰＳＡ］のカットオフが１５ｐｇ／ｍｌである、項目１４に記載の方法。
（項目７４）
前記［ＰＳＡ］のカットオフより小さい［ＰＳＡ］の値、および時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きが時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの指標より小さい場合、その後ＥＳ−ＢＣＲが検出されないときはさらなる治療がもたらされない、項目６８、６９または７０いずれか１項に記載の方法。
（項目７５）
前記［ＰＳＡ］のカットオフより小さい［ＰＳＡ］の値、および前記第２のＰＳＡの値が前記第２のＰＳＡの指標より小さい場合、その後ＥＳ−ＢＣＲが検出されないときはさらなる治療がもたらされない、項目６８、６９または７０いずれか１項に記載の方法。
（項目７６）
前記［ＰＳＡ］の値が５ｐｇ／ｍｌの前記［ＰＳＡ］のカットオフより小さく、第２のＰＳＡの値が前記ＰＳＡの指標より小さい場合、その後ＥＳ−ＢＣＲが検出されないときはさらなる治療がもたらされない、項目７１に記載の方法。
（項目７７）
前記［ＰＳＡ］の値が１０ｎｇ／ｍｌの前記［ＰＳＡ］のカットオフより小さく、第２のＰＳＡの値が前記ＰＳＡの指標より小さい場合、その後ＥＳ−ＢＣＲが検出されないときはさらなる治療がもたらされない、項目７２に記載の方法。
（項目７８）
前記［ＰＳＡ］の値が１５ｎｇ／ｍｌの前記［ＰＳＡ］のカットオフより小さく、第２のＰＳＡの値が前記ＰＳＡの指標より小さい場合、その後ＥＳ−ＢＣＲが検出されないときはさらなる治療がもたらされない、項目７３に記載の方法。
（項目７９）
さらに、患者をＥＳ−ＢＣＲについてモニタリングする工程を含む、項目７４および７５いずれか１項に記載の方法。
（項目８０）
ａ）ＰＣＲシグナル検出を用いてＰＳＡに対するサンドイッチイムノアッセイを行なうのに適した核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートを備えるキットであって、該アッセイが少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値の検出の限界を有する、キット。
（項目８１）
ａ）ＰＣＲシグナル検出を用いてＰＳＡに対するサンドイッチイムノアッセイを行なうのに適した核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートを備えるキットであって、該アッセイが少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および少なくとも１．０ｐｇ／ｍＬまで低値の検出の限界を有する、キット。
（項目８２）
ａ）ＰＣＲシグナル検出を用いてＰＳＡに対するサンドイッチイムノアッセイを行なうのに適した核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートを備えるキットであって、該アッセイが少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および少なくとも２．０ｐｇ／ｍＬまで低値の検出の限界を有する、キット。
（項目８３）
前記該核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートが、さらに、第１の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートと第２の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）−抗ＰＳＡコンジュゲートを含み、該第２の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートが固相支持体に結合されている、項目８０、８１または８２いずれか１項に記載のキット。
（項目８４）
さらに、１つ以上のＰＳＡの値を決定するためのソフトウェアを備える、項目８０、８１または８２いずれか１項に記載のキット。
（項目８５）
さらに、１つ以上のＰＳＡの値を決定するためのソフトウェアを備える、項目４６、４７または４８いずれか１項に記載の方法。
（項目８６）
患者が初期段階の生化学的逆戻り（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法の記載を含むラベルであって、
ａ）前立腺癌の治療後の該患者から試料を採取する工程；
ｂ）１ｐｇ／ｍＬ未満の検出の限界を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）１つ以上の試料の該ＰＳＡレベルを用いてＰＳＡの値を決定する工程
を含み、
該ＰＳＡの値がＰＳＡの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該ＰＳＡの値が該ＰＳＡの指標を超えていない場合は安定病態が検出される、ラベル。
（項目８７）
前立腺癌のサルベージ治療後の患者が初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有しているかどうかを検出する方法であって、
ａ）サルベージ治療後の該患者から試料を採取する工程；
ｂ）約０．５ｐｇ／ｍＬの検出の限界を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）１つ以上の試料の該ＰＳＡレベルを用いてＰＳＡの値を決定する工程；
を含み、
該ＰＳＡの値がＰＳＡの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該ＰＳＡの値が該ＰＳＡの指標を超えていない場合は安定病態が検出される、方法。
（項目８８）
前記［ＰＳＡ］の値が測定された最小の［ＰＳＡ］の少なくとも４倍を超えている、項目２または１２いずれか１項に記載の方法。
（項目８９）
前記ＰＳＡアッセイが、ＰＳＡに対するサンドイッチイムノアッセイを行なうのに適した２種類の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートを使用するサンドイッチイムノアッセイであり、さらに、ＰＣＲシグナル検出の使用を含む、項目１、１４、４５、４９、５３、５７、６１または８７いずれか１項に記載の方法。
（項目９０）
前記核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートが、さらに、第１の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートと第２の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートを含み、該第２の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートが固相支持体に結合されている、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記ＰＳＡに対するサンドイッチイムノアッセイが均一系アッセイである、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
前記［ＰＳＡ］の増加速度が前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度を超えており、ＥＳ−ＢＣＲが検出される、項目１０、１９、５３、５４、５５または５６いずれか１項に記載の方法。
（項目９３）
前記［ＰＳＡ］の増加速度が前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度を超えておらず、安定病態が検出される、項目１０、１９、５３、５４、５５または５６いずれか１項に記載の方法。
（項目９４）
前記［ＰＳＡ］の増加速度が前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度を超えておらず、その後ＥＳ−ＢＣＲが検出されないときはさらなる治療がもたらされない、項目１０、１９、５３、５４、５５または５６いずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
さらに、患者をＥＳ−ＢＣＲについてモニタリングする工程を含む、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約１．５ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９２に記載の方法。
（項目９７）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約１．５ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９３に記載の方法。
（項目９８）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約１．５ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９４に記載の方法。
（項目９９）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約１．５ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９５に記載の方法。
（項目１００）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約０．５ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９２に記載の方法。
（項目１０１）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約０．５ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９３に記載の方法。
（項目１０２）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約０．５ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９４に記載の方法。
（項目１０３）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約０．５ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９５に記載の方法。
（項目１０４）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約２．０ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９２に記載の方法。
（項目１０５）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約２．０ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９３に記載の方法。
（項目１０６）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約２．０ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９４に記載の方法。
（項目１０７）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約２．０ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９５に記載の方法。
（項目１０８）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約１．０ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９２に記載の方法。
（項目１０９）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約１．０ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９３に記載の方法。
（項目１１０）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約１．０ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９４に記載の方法。
（項目１１１）
前記［ＰＳＡ］の指標の増加速度が約１．０ｐｇ／ｍＬ／月である、項目９５に記載の方法。
（項目１１２）
前記核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートが、さらに、第１の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートと第２の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートを含み、該第２の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートが固相支持体に結合されている、項目８０、８１または８２いずれか１項に記載のキット。
（項目１１３）
前記サンドイッチイムノアッセイが均一系アッセイである、項目８０、８１または８２いずれか１項に記載のキット。
次に、本発明を、添付の図面および実施例に関してさらに充分に説明する。図面および実施例は、本概要、詳細説明、ならびに具体的に論考あるいは開示した任意の好ましいおよび／または具体的な実施形態とともに関連させて読まれたい。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態の実施形態で示され得、本明細書に示した実施形態に限定されると解釈されるべきでない；むしろ、本明細書に示した実施形態は例として示したものであるにすぎない。したがって、本開示は、当業者に対して充分で完全であり、本発明の充分な範囲を充分に伝達するものである。

図１は、本発明の一実施形態の結果を示し、指数関数フィットによる再発患者番号１１の核酸検出イムノアッセイ、ＮＡＤＩＡ（登録商標）［ＰＳＡ］（ＰＳＡ濃度）（ｐｇ／ｍＬ）の根治的前立腺摘除術後の日数に対するプロットを具体的に示す。ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイ［ＰＳＡ］は、詳細説明に記載のＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイ試験において測定された［ＰＳＡ］であった。 図２は、再発患者番号３１の根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。 図３は、再発患者番号３８の根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。 図４は、安定患者番号８６の根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。 図５は、安定患者番号１２０の根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。 図６は、安定患者番号１２６の根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。 図７は、図に示された全４３名の再発患者の根治的前立腺摘除術後の日数に対するプロット（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 図８は、ＰＳＡレベルの範囲を１０００ｐｇ／ｍｌまでに限定した、４３名の再発患者の前立腺摘除後の期間に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。 図９は、患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する第１の前立腺摘除後総［ＰＳＡ］のプロットを示す。 図１０は、患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する最下点総［ＰＳＡ］のプロットを示す。 図１１は、患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する観測された最大［ＰＳＡ］レベル（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。 図１２は、患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する最大［ＰＳＡ］レベル／最下点レベル［ＰＳＡ］のプロットを示す。 図１３は、患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する［ＰＳＡ］レベルの第２の連続的増加（ｐｇ／ｍＬ／月）のプロットを示す。 図１４は、患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する倍加時間データ（日間）のプロットを示す。 図１５Ａ〜Ｃは、それぞれ、＜１５０日間、１５０〜４００日間、または＞４００日間の倍加時間を有する再発患者のオーバーレイプロットを示す。図１５Ａは、範囲を１０００ｐｇ／ｍＬまでに限定した、＜１５０の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。 図１５Ａ〜Ｃは、それぞれ、＜１５０日間、１５０〜４００日間、または＞４００日間の倍加時間を有する再発患者のオーバーレイプロットを示す。図１５Ｂは、範囲を１０００ｐｇ／ｍＬまでに限定した、１５０〜４００の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。 図１５Ａ〜Ｃは、それぞれ、＜１５０日間、１５０〜４００日間、または＞４００日間の倍加時間を有する再発患者のオーバーレイプロットを示す。図１５Ｃは、範囲を１０００ｐｇ／Ｍｌまでに限定した、＞４００の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。 図１６Ａ〜Ｄは、それぞれ、倍加時間による、範囲を１０００ｐｇ／ｍＬまでに限定した再発患者のサブクラスのオーバーレイプロットを示す。＞４００日間の倍加時間を有する再発患者を、さらに、観測された最大ＰＳＡが２００ｐｇ／ｍＬより上であるか下であるかに細分した。図１６Ａは、＜１５０日間の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。 図１６Ａ〜Ｄは、それぞれ、倍加時間による、範囲を１０００ｐｇ／ｍＬまでに限定した再発患者のサブクラスのオーバーレイプロットを示す。＞４００日間の倍加時間を有する再発患者を、さらに、観測された最大ＰＳＡが２００ｐｇ／ｍＬより上であるか下であるかに細分した。図１６Ｂは、＜１５０〜４００日間の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。 図１６Ａ〜Ｄは、それぞれ、倍加時間による、範囲を１０００ｐｇ／ｍＬまでに限定した再発患者のサブクラスのオーバーレイプロットを示す。＞４００日間の倍加時間を有する再発患者を、さらに、観測された最大ＰＳＡが２００ｐｇ／ｍＬより上であるか下であるかに細分した。図１６Ｃは、＞４００日間の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する最大［ＰＳＡ］＞２００ｐｇ／ｍＬのオーバーレイプロットを示す。 図１６Ａ〜Ｄは、それぞれ、倍加時間による、範囲を１０００ｐｇ／ｍＬまでに限定した再発患者のサブクラスのオーバーレイプロットを示す。＞４００日間の倍加時間を有する再発患者を、さらに、観測された最大ＰＳＡが２００ｐｇ／ｍＬより上であるか下であるかに細分した。図１６Ｄは、再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。 図１７は、術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示すが、ほんの少数の例外を除いて、安定病態患者が概ね１５ｐｇ／ｍＬを超えないＰＳＡ最大を有する。 図１８は、患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対するモニタリング中の倍加数を示すデータのモザイクプロットを示す。 図１９は、前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０）の患者部分母集団に対する連続倍加数を示すデータのモザイクプロットを示す。 図２０Ａおよび２０Ｂは、ＮＡＤＩＡ（登録商標）の観測された最大［ＰＳＡ］レベルに関する単変量ＲＯＣ曲線と比較した多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２０Ａは多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２０Ｂは、多変量ＲＯＣ曲線（点線）に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）の観測された最大［ＰＳＡ］レベル（黒線）の単変量ＲＯＣ曲線を示す。 図２１Ａおよび２１Ｂは、ＮＡＤＩＡ（登録商標）の最大総［ＰＳＡ］／最下点［ＰＳＡ］レベルに関する単変量ＲＯＣ曲線と比較した多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２１Ａは多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２１Ｂは、多変量ＲＯＣ曲線（点線）に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）の最大総［ＰＳＡ］／最下点［ＰＳＡ］レベル（黒線）の単変量ＲＯＣ曲線を示す。 図２２Ａおよび２２Ｂは、［ＰＳＡ］の第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）に関する単変量ＲＯＣ曲線と比較した多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２２Ｂは多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２２Ａは、多変量ＲＯＣ曲線（点線）に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）の［ＰＳＡ］の第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）（黒線）の単変量ＲＯＣ曲線を示す。表２２は、ロジスティック回帰およびＲＯＣコンピュータ計算の結果を示す。 図２３Ａ〜Ｃは、最大総［ＰＳＡ］、第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）指標、および最大総［ＰＳＡ］／最下点総［ＰＳＡ］の単変量解析を示す。 図２３Ａ〜Ｃは、最大総［ＰＳＡ］、第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）指標、および最大総［ＰＳＡ］／最下点総［ＰＳＡ］の単変量解析を示す。 図２３Ａ〜Ｃは、最大総［ＰＳＡ］、第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）指標、および最大総［ＰＳＡ］／最下点総［ＰＳＡ］の単変量解析を示す。 図２４は、安定患者のおよそ８年間の期間にわたる時間（ヶ月）に対する［ＰＳＡ］のレベル（ｐｇ／ｍＬ）の線形曲線フィットを示す。 図２５は、再発患者のおよそ５年間の期間にわたる時間（ヶ月）に対する［ＰＳＡ］のレベル（ｐｇ／ｍＬ）の線形曲線フィットを示す。

発明の詳細な説明
本発明によれば、少なくとも１ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および１０ｐｇ／ｍＬ未満の実効感度を有する総血清ＰＳＡ（総血清ＰＳＡは、血清中のＰＳＡの遊離形態と複合体形成形態の両方の同時の測定値である）に対するアッセイが、前立腺癌の治療後の患者をモニタリングするために使用され、術後の安定病態とは対照的な治療後の初期段階の生化学的再発を検出するために使用され得る。

しかしながら、ＰＳＡに対する従来型アッセイを使用した場合は、前立腺癌再発の指標として生化学的再発を使用しても限界がある。根治的前立腺摘除術後の血清ＰＳＡの最低値は、従来型アッセイを用いてＰＳＡを測定した場合、たいてい検出の限界未満である。Ｊｕｎｋｅｒら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：２６２５−２６５８（１９９９）参照。したがって、ＲＰ後の血清ＰＳＡの値は、従来型アッセイでは、ＰＳＡが循環中に実際に存在しない場合であるゼロナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）と報告され得る。Ｓｔａｍｅｙ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２（６）：８４９−８５２参照。ＰＳＡの値が従来型アッセイの検出限界より上である場合であってもなお、この濃度は、該アッセイの「実効感度」（正確性および精密性を伴って低レベルの血清ＰＳＡの濃度を定量できる能力）より低いことがある。これは、従来型アッセイでは血清ＰＳＡの真の最下点濃度が検出できないか、または正確性および精密性を伴って報告できないかのいずれかであることを意味する。これは、最下点濃度自体が、最下点濃度が低いほど再発の尤度が低い可能性があるために再発の予測量であり得、残念なことである。さらに、血清ＰＳＡレベルが上昇し始めた場合、従来型アッセイでは、再発が再び予後不良となり得る段階になる時点まで該レベルが検出可能でないことがあり得る。

急速進行性の（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）癌は、はるかにより急速に再発することがあり得るが、従来型アッセイでは、その検出の限界および不充分な実効感度のため、このような再発が検出できないであろう。急速進行性でない癌であっても、従来型アッセイでは検出可能でない血清ＰＳＡの上昇を示し始めることがあり得る。したがって、血清ＰＳＡに対する従来型アッセイでは、前立腺癌再発の早期検出において医師を補助し得るものではない。

ＦＤＡに承認された現行の従来型ＰＳＡアッセイのほとんどは、およそ１００ｐｇ／ｍＬまで測定され、該検出の限界は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ Ｐａｎｅｌによって最近推奨されている生化学的再発の定義に反映されている（０．２ｎｇ／ｍＬ（２００ｐｇ／ｍＬ）より高い［ＰＳＡ］、０．２ｎｇ／ｍＬより高いＰＳＡの第２の確認レベルを伴う）。Ｃｏｏｋｓｏｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １７７：５４０−５４５（２００７）参照。実効感度の限界のため、従来型ＰＳＡアッセイでは、アッセイの実効感度より低い［ＰＳＡ］を有する試料中のＰＳＡは非存在と示される。例えば、Ｓｔａｍｅｙ（１９９６）；Ｖａｓｓｉｌｉｋｏｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３（２）：１１５−１２３（２０００）。

治療後の初期段階の再発の検出のためには、治療後の試料中のＰＳＡがアッセイの実効感度の範囲内であるかどうかがわかることが臨床的に重要である。そうでなければ、臨床医および患者は、陰性結果が、ＰＳＡの「非存在」を反映しているのか、あるいはＰＳＡ産生細胞の存在にもかかわらずアッセイの検出の限界であるのかがわからない。

本発明の方法では、本明細書に記載のような低値実効感度限界を有するアッセイを使用し、女性の血清試料において０．２〜０．５ｐｇ／ｍＬ範囲までのＰＳＡレベルが測定された。該アッセイの０．５ｐｇ／ｍＬの実効感度により、女性の血清中のＰＳＡのレベルが、通常ゼロとみなされていたのがゼロではなく０．５〜３ｐｇ／ｍＬの範囲であることを決定することが可能となった。根治的前立腺摘除術後、男性は、女性で見られるレベルと少なくとも同等のＰＳＡレベルを有することが予測される。したがって、０．５ｐｇ／ｍＬまでの実効感度を有するアッセイは、根治的前立腺摘除術後の男性に見られることが予測されるＰＳＡの最低レベルを測定することができる。

０．５ｐｇ／ｍＬ未満の実効感度を有するＰＳＡアッセイを用いてＰＳＡレベルを測定することにより、治療後の前立腺癌患者において、その低いＰＳＡレベルの精密な測定が可能になった。核酸検出イムノアッセイ（ＮＡＤＩＡ（登録商標）試験）を用いた［ＰＳＡ］の測定では、根治的前立腺摘除術後、多くの患者が安定な低いＰＳＡレベルを有することが示され、これは、該患者が非常に低速で増殖する癌を有するか、または治癒したことを示す。時間とともに血清ＰＳＡレベルの増大を示す患者では、ＰＳＡレベルは正確であった。患者のＰＳＡ血清レベルは、ＰＳＡ増加の傾きを決定するのに充分正確であり、および以前では現行のアッセイの実効感度未満であったＰＳＡレベルを含む試料に関する再現性のあるデータの取得のために充分正確であった。ＰＳＡのレベルを測定するとは、総ＰＳＡあるいはｔＰＳＡのレベルを測定することをいう。

より感度のよいＰＳＡアッセイの使用により、ＲＰ後の最下点の後、ＰＳＡレベルが指数関数的に増大することが確立された。ＮＡＤＩＡ（登録商標）ＰＳＡアッセイの結果により、癌細胞は、［ＰＳＡ］レベルが２００ｐｇ／ｍＬに達するときよりはるか以前から存在しており、指数関数的に増殖していることが示された。データセットの遡及的解析の結果では、前立腺癌細胞が、ＰＳＡ血清レベルが現行の生化学的再発点である２００ｐｇ／ｍＬに達する前から存在しており、相当長い期間をかけて増殖していることを示している。

本発明の一態様において、少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度および／または０．２ｐｇ／ｍＬの検出限界を有するＰＳＡアッセイを使用し、初期段階で前立腺癌の再発を測定する。また、それによって、初期段階の再発を検出するのに必要とされる期間が、従来型アッセイの場合よりも例えば３０ヶ月も短縮される。また、このようなＰＳＡアッセイを用いた０．５〜１００ｐｇ／ｍＬ範囲のＰＳＡの精密な測定により、初期段階の生化学的再発の認識および現行の診療に基づいたものよりずっと早期での処置の開始が可能になる。

初期段階の再発前立腺癌に対するサルベージ処置の必要性をより早く検出することにより、患者のフォローアップ処置（これは、現在、一般的にはＰＳＡレベルが２００ｐｇ／ｍＬを超えた後でのみ行なわれる）を開始するのに必要とされる期間が短くなる。本明細書に記載のように、０．５ｐｇ／ｍｌの実効感度を有するＰＳＡアッセイを用いて患者をモニタリングすることで、さらなる治療に対する評価が、生化学的再発の現行の尺度を使用したときよりも少なくとも３０ヶ月も早くにもたらされ得る。これにより、細胞がより局在している可能性がある場合および／または治療に対して感受性である場合、早期処置を提供する手助けとなる。

一態様において、本発明の方法により、疾患進行のリスクのある男性および初期処置の不奏功患者をより早期に、より正確に特定することが可能になる。また、本発明の方法は、患者が再発を有していないことを早期に判定するために使用され得る。したがって、より感度のよいＰＳＡアッセイが利用可能になると、患者を安定であるか、または初期段階の生化学的再発を有するとして、より早期に分類することが可能になり、システムコストおよび患者の不安が軽減される。

一部の態様において、本発明の高感度で早期検出の方法は、根治的前立腺摘除術後の処置選択肢の評価に使用され得る。一部の実施形態において、本発明は、患者が安定病態を有するかどうか、患者を再発に関してモニタリングすべきかどうか、どの程度の頻度でモニタリングすべきか、およびサルベージ処置（抗アンドロゲン処置、放射線療法または化学療法など）を施すべきかどうか、いつ施すべきかを検出するために使用され得る。

前立腺摘除後処置は、主にはグリーソンスコア、診断時の年齢、外科的切除縁、Ｔ−病期、組織浸潤、被膜浸潤、精嚢浸潤、膀胱頸部浸潤、リンパ節浸潤、および腫瘍体積などの臨床観測結果に基づいて決定されている。再発の予測価を有する臨床パラメータとしては、高いグリーソンスコア、現行のアッセイで使用される高いＰＳＡ（現行のアッセイで測定したとき２００ｎｇ／ｍｌより高い）、ｐＴ３疾患、陽性外科的切除縁および精嚢浸潤が挙げられる。Ｎｉｌｓｓｏｎの３４６頁参照。

前立腺癌を有する患者は高率でＲＰでは治癒されず、２７〜５３％は１０年以内に［ＰＳＡ］の上昇を示す。Ｎｉｌｓｓｏｎら、“Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ，” Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ，４３（４）：３１６−３８１（２００４）。しかしながら、現在補助的治療を受けている患者の３０％〜７０％は再発しない。したがって、年齢、グリーソンスコアおよび外科的切除縁などの臨床観測結果のみに基づいて前立腺摘除後患者に補助的治療を施すことは、安定病態を有する相当な割合の患者に対して不必要な費用のかかる処置および合併症の可能性に晒されることになり得る。

一例として、補助的処置は不良な臨床徴候を示す患者に施され得る。このような患者としては、不良な切除縁およびグリーソンスコアを有する比較的若年の患者が挙げられる。例えば、不良な切除縁および＞７のグリーソンスコアを有する５０代の患者は、通常、体外放射線療法（ＲＴ）などの治療を受ける。病期ｐＴ３疾患を有する患者における体外照射放射線療法を伴う前立腺摘除後処置では、生化学的疾患なしで生存期間が長くなり、遅れてサルベージ治療を施すのではなく処置を早期に施した場合、ＲＰでは治癒しない患者において安定病態が得られる尤度が高くなる。Ｎｉｌｓｓｏｎら、３１６頁参照。

しかしながら、本発明の高感度のアッセイおよび［ＰＳＡ］の値および指標の使用は、単独で使用しても、臨床観測結果と組み合わせて使用しても、安定病態の早期検出がもたらされ得、現在施されている不必要な補助的治療が回避され得る。例えば、安定病態の早期検出がなされなければ処置を受けているであろう比較的若年齢の患者における安定病態の早期検出により、不必要な処置の必要性および副作用のリスクの付随が回避され得る。前立腺摘除後治療の副作用としては、失禁、頻尿、夜間多尿、膀胱炎、下痢、直腸出血、性欲減退および／または性的不能が挙げられ得る。したがって、一部の態様において、本発明の検出方法を用いて安定病態の早期検出することにより、現行では臨床観測結果に基づいて常套的に補助的治療を受ける患者において不必要な補助的治療が回避され得る。他方、従来法を用いて得られた［ＰＳＡ］が２００ｐｇ．ｍＬに達するまでサルベージ処置が遅れることにより、安定病態が得られる尤度が低下する。Ｎｉｌｓｓｏｎ３４５頁参照。

したがって、一部の態様において、本発明のＰＳＡの値およびＰＳＡの指標を臨床観測結果と組み合わせて使用し、補助的治療および／またはサルベージ治療を施すべきかどうかを判定する。例えば、通常であれば臨床観測結果に基づいて患者に補助的および／またはサルベージ治療が施され得るが、１つ以上の（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）ＰＳＡの値がＰＳＡの指標を超えておらず、安定病態が検出されたならば、不必要な処置は回避され得る。このような方法に使用され得るＰＳＡの値および指標については、本文中の至る箇所で記載している。一例として、［ＰＳＡ］が１５ｐｇ／ｍｌ未満であり、時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きが時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの指標よりも小さい場合は、比較的若年齢の患者が不良な切除縁および＞７のグリーソンスコアを有する場合であっても、補助的処置は回避され得、患者は、１つ以上の［ＰＳＡ］の値が［ＰＳＡ］の指標を超えるまでモニタリングされ得る。

他の態様において、本発明の方法を臨床観測結果と組み合わせて使用し、初期段階の再発を検出する場合、ＥＳ−ＢＣＲを有する患者に早期の処置を施すことができ、予後の向上がもたらされる。放射線および化学療法は、当業者に公知の方法およびプロトコルに従って行なわれ得る。抗アンドロゲン処置は、前立腺摘除後患者の処置における補助的治療またはサルベージ治療のための当業者に公知の薬物および生物製剤の薬物組成物、併用剤、剤形および投薬量を用いて行なわれ得る。

約０．５ｐｇ／ｍＬの実効感度および０．２ｐｇ／ｍＬの検出限界を有する本発明によるＰＳＡアッセイの一例は、シグナル生成のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するサンドイッチ形式イムノアッセイである。本発明の方法において血清または血漿試料中のＰＳＡを検出するのに有用なかかるアッセイの一例を後述する。タンパク質のアッセイのためのイムノＰＣＲ形式は、米国特許第５，６６５，５３９号（引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。少なくとも指定値まで低値の実効感度を有する任意のＰＳＡアッセイが本発明の方法において使用され得る。タンパク質の検出およびタンパク質アッセイにおけるシグナル生成のための方法は当業者に公知である。例えば、本発明の方法では、他のアッセイ形式（例えば、サンドイッチイムノアッセイ形式）、および本発明の方法における使用のために必要とされる実効感度がもたらされ得る任意のシグナル生成方法が使用され得る。例えば、シグナル生成方法としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）アレイ、生物発光、放射能、化学蛍光、ナノ粒子、またはオリゴナノ粒子を、単独または組合せのいずれかで使用することが挙げられ得る。

また、より詳細に後述するように、倍加時間および／または観測された最大ＰＳＡ濃度などのＰＳＡの値は、初期段階再発患者を多数の群にさらに分類するために使用され得る。このような分類は、潜在的に、異なる亜群の患者に対して異なる治療を推奨するために使用され得る。したがって、本発明の方法の使用により、臨床医および患者に、処置不奏功または初期段階の生化学的再発の正確な表示が提供され、疾患を抑制するために、よりタイムリーで適切な治療の選択が可能になる。また、早期検出の結果としての早期の処置治療により、患者転帰が改善され、安定病態を有する患者に対して、より費用のかかる管理の必要性が回避され得る。

一実施形態において、本発明は、患者が初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の患者から試料を採取する工程；
ｂ）少なくとも２０ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程、
ｃ）１つ以上の試料のＰＳＡレベルを用いてＰＳＡの値を決定する工程を含み、
ＰＳＡの値が１つ以上の試料においてＰＳＡの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出される、方法である。

該ＰＳＡのアッセイは、前立腺癌の処置後の患者から採取された試料中のＰＳＡレベルを測定するために使用され得る。ＰＳＡレベルとしては、試料中のＰＳＡの量または濃度が挙げられ得る。試料は、血漿または血清試料であり得る。ＰＳＡレベルの測定値は、前立腺癌の治療によって該障害が有効に処置されたかどうかをモニタリングおよび評価するために使用され得る。好ましくは、ＰＳＡアッセイは、少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度および０．２ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界を有する。

「ＰＳＡの値」は、観測ＰＳＡレベルの関数であるパラメータである。ＰＳＡの値としては、例えば、最下点ＰＳＡレベル後に測定された観測ＰＳＡレベル、最下点ＰＳＡレベルに対する観測ＰＳＡレベルもしくは観測された最大ＰＳＡレベルの比、時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾き、ＰＳＡレベルの増加速度、ＰＳＡレベルの倍加時間、またはＰＳＡレベルの第２の連続的増加が挙げられ得る。観測ＰＳＡレベルは濃度または量であり得る。

「ＰＳＡの指標」は、統計学的有意性を伴って安定病態を有する患者の部分母集団と、生化学的再発および／または疾患再発を有している患者、または有するであろう患者の部分母集団を識別する所定のカットオフ、閾値または数値である。

「初期段階の生化学的再発」は、少なくとも１ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度を有するＰＳＡアッセイ用いて得られた１つ以上の選択されたＰＳＡの値が、対応するＰＳＡの指標を超えた場合に検出される。該値および対応する指標は、単独または組合せで、患者がＥＳ−ＢＣＲを有するのか、または安定病態を有するのか、の判定に使用され得る。

疾患の再発は、生化学的に、または画像化もしくは生検などの臨床観測結果に基づいて判定され得るが、該方法は、再発に対して感度が不充分であるという欠点を有する。また、本発明の方法を用いて得られた１つ以上のＰＳＡの値およびＰＳＡの指標は、患者に対する処置選択肢を助長または決定するために、臨床観測結果と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の方法を用いたＥＳ−ＢＣＲの検出により、さらなる治療、例えば、放射線治療、化学療法または抗アンドロゲン療法が施されることになり得る。場合によっては、さらなる治療は、［ＰＳＡ］の値に早期で急速な増大がみられる場合、および／または早期のＰＳＡ速度の測定値がＰＳＡ速度の指標を超えた場合に正当とされ得る。別の例として、早期であまり急速でない［ＰＳＡ］速度の増大により、他の患者パラメータ（例えば、臨床観測結果）に応じてさらなる治療が施されることになることもあり、ならないこともある。臨床観測結果としては、グリーソンスコア、診断時の年齢、外科的切除縁、Ｔ−病期、組織浸潤、被膜浸潤、精嚢浸潤、膀胱頸部浸潤、リンパ節浸潤、生検、または腫瘍体積が挙げられ得る。一部の実施形態において、さらなる治療を支持するパラメータとしては、カットオフ年齢未満の年齢、グリーソンスコアカットオフを超えるグリーソンスコア、本発明の方法を用いた高いＰＳＡ、陽性外科的切除縁および精嚢浸潤が挙げられる。年齢カットオフ（ｃｕｔｔｏｆｆ）は、例えば、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０、６５、７０、７５または８０歳であり得る。グリーソンスコアカットオフは、例えば、４、５、６、７、８、９、１０であり得る。

別の例として、［ＰＳＡ］速度の値の低速増加では、臨床観測結果で再発がないことが示された場合（低いグリーソンスコアなど）、または高齢（例えば、７０歳もしくは８０歳超）でもある場合、さらなる治療は施されないことがあり得る。また、本発明の方法で安定病態が検出された場合、さらなる治療は施されない。さらなる治療が施されない任意の場合において、単独または臨床観測結果を組合せるかのいずれかで本発明の方法を使用して、１つ以上のＰＳＡの値をさらにモニタリングし、後の時点でさらなる治療を施すべきかどうかを判定することが望ましいことがある。

ＰＳＡの指標は、観測された最大ＰＳＡレベルの所定のカットオフまたは閾値、最下点ＰＳＡレベルの乗数、観測された最大ＰＳＡレベル、最下点ＰＳＡレベル、時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾き、ＰＳＡの増加速度、またはＰＳＡの倍加時間であり得る。倍加時間は（Ｌｎ（２）／Ｋ）であり、式中、Ｋは、時間に対するＰＳＡレベルのプロットの指数関数フィットの傾きである。倍加時間の場合、ＰＳＡの値は、倍加時間の値がＰＳＡの指標以下である場合、ＰＳＡの指標を「超えている」。ＰＳＡの指標は、本明細書に記載のものなどの標準的な統計学的方法を用いて決定される。一例として、ＰＳＡレベル指標は、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｐｇ／ｍＬの［ＰＳＡ］の指標であり得る。より好ましくは、ＰＳＡレベル指標は、少なくとも約１５ｐｇ／ｍＬ、２０ｐｇ／ｍＬまたは２５ｐｇ／ｍＬの［ＰＳＡ］の指標であり得る。また、ＰＳＡレベル指標の範囲は、指定されたものであり得る。［ＰＳＡ］の指標の範囲は、例えば、１５〜２５ｐｇ／ｍＬ、１５〜２２ｐｇ／ｍＬまたは２０〜２５ｐｇ／ｍＬであり得る。ＰＳＡレベル指標は、単独または他のＰＳＡの指標と組み合わせてもしくは臨床指標と組み合わせて使用され、患者が安定病態を有するか、またはＥＳ−ＢＣＲを有するかが判定され得る。

「ＰＳＡ最下点」は、根治的前立腺摘除術などの治療後の患者由来の試料中のＰＳＡの最低測定量を意味する。ＰＳＡ最下点は、処置中に除去された、または死滅した増殖前立腺組織による、産生されたＰＳＡのクリアランスの結果である。ＰＳＡは、２．２日間〜３．５日間の半減期を有し、３〜４週間または６〜８週間までかけて血流から排除され得る。Ｅｌｌｉｓら、Ａｄｕｌｔ Ｕｒｏｌｏｇｙ，５０（４），５７３−５７９，（１９９７）。根治的前立腺摘除術などの処置後、増殖性前立腺細胞を除去するかまたは死滅させる処置の後に、血清ＰＳＡレベルは最下点まで減少する。安定病態を有する患者では、ＰＳＡレベルは、低い点に達した後、横ばい状態のままであり得る。試料は、ＰＳＡレベルが測定される一連の組の血液血清試料のうちの１つであり得る。一連の組の血液血清試料は、根治的前立腺摘除術またはサルベージ処置などの治療後の同じ患者から異なる時点で採取された２つ以上の試料である。

治療は、前立腺疾患の臨床管理における１つ以上の処置をいう。前立腺疾患に対する処置は、好ましくは、前立腺癌の処置である。前立腺癌の処置は、好ましくは根治的前立腺摘除術である。また、前立腺癌に対する処置としては、放射線治療（例えば、サルベージ放射線治療）ならびにホルモン療法または化学療法が挙げられ得る。

総ＰＳＡに対するアッセイは、好ましくは、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および少なくとも２０ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度を有する。ＰＳＡアッセイは、好ましくは、少なくとも約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、または０．５ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度を有するものであり得る。ＰＳＡアッセイは、好ましくは、０．２ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および／または約０．５ｐｇ／ｍＬの実効感度を有するものであり得る。あるいはまた、検出限界（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ）は、本明細書において、機能的検出限界または検出の限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）と称する。検出の限界（ＬＯＤ）は、５％に設定したＩ型およびＩＩ型のエラー率で検出され得る試料中の被検物質の最低量である。

一部の実施形態において、検出の限界は、少なくとも１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５または０．２ｐｇ／ｍＬまで低値であり得る。また、ＰＳＡアッセイは０．５ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界を有するものであり得、実効感度は１、２、３、４、または５ｐｇ／ｍＬまで低値である。一部の実施形態において、ＰＳＡアッセイは、０．２ｐｇ／ｍＬの機能的検出限界および０．５ｐｇ／ｍＬの実効感度を有し、さらに、非核酸のＰＳＡ結合実体と核酸マーカーとを含み、ＰＣＲシグナルを生成させるために使用され得るコンジュゲートと、該試料を接触させることを含む。

生化学的再発の最も一般的な定義は、最近では、０．２ｎｇ／ｍＬ（２００ｐｇ／ｍＬ）より大きい［ＰＳＡ］であるが、１００〜２０００ｐｇ／ｍＬの範囲のレベルが使用されている。Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８３（１１）：１４３２−１４３６（２０００）。少なくとも１．０ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度を有するＰＳＡアッセイでは、初期段階の生化学的再発が起こっているか否かを判定することが可能である。初期段階の生化学的再発の検出は、従来型ＰＳＡアッセイを用いた慣用的に定義された生化学的再発の検出より早期である。

本発明の一態様において、ＰＳＡレベルに基づいたＥＳ−ＢＣＲは、観測された最大ＰＳＡレベルとＰＳＡレベル指標との比較によって検出され得る。少なくとも１０〜６０ｐｇ／ｍＬの間の任意のレベル、好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは１０、１５、２０、２５、または３０ｐｇ／ｍＬのＰＳＡレベルが、ＥＳ−ＢＣＲを判定するためのＰＳＡの指標として使用され得る。例えば、観測された最大ＰＳＡレベル指標が１５ｐｇ／ｍＬである場合、１５ｐｇ／ｍＬより大きい観測された最大ＰＳＡレベルとＰＳＡの指標との比較により、ＥＳ−ＢＣＲが検出される。

別の態様において、最下点ＰＳＡに対する観測された最大ＰＳＡの比が、ＥＳ−ＢＣＲが起こっているかどうか判定するためのＰＳＡの指標として使用され得る。例えば、観測された最大ＰＳＡ／最下点ＰＳＡは、３〜１１の間の任意の数値、好ましくは３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１、より好ましくは６であり得る。最下点ＰＳＡレベルの乗数は、２倍、４倍または８倍、好ましくは４倍であり得る。

本発明の別の実施形態において、ＰＳＡに対するアッセイは、治療後の患者から採取された連続試料中のＰＳＡを測定するために使用され得る。経時的に採取された連続試料のＰＳＡ測定値は、ＰＳＡの変化の速度、時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾き、またはＰＳＡの増加の倍加時間を示すＰＳＡ速度の値を計算するために使用され得る。このようなＰＳＡ速度の１つ以上（ｏｒ ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）の値と、その対応する速度の指標との比較により、ＥＳ−ＢＣＲが起こっているかどうかの判定が可能になる。

この実施形態において、本発明は、例えば、患者が初期段階の生化学的逆戻り（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかの判定方法であって、
ａ）患者から連続試料を採取する工程；
ｂ）少なくとも１ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度を有するＰＳＡアッセイを使用し、各試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）該ＰＳＡ速度の値がＰＳＡ速度の指標を超えていることを判定し、それによりＥＳ−ＢＣＲを検出する工程；または
該ＰＳＡ速度の値が速度の指標を超えていないことを判定し、それにより疾患が安定であることを検出する工程
を含む方法である。

ＰＳＡの値の測定における使用のための最初の試料は、治療後の任意の時点で、治療前ＰＳＡレベルのクリアランスの時点およびＰＳＡ最下点の時点で、または治療前ＰＳＡレベルのクリアランス後の任意の時点およびＰＳＡ最下点後の任意の時点で採取され得る。一般的に、最初の試料は、処置後２週間〜８週間の間の任意の時点で採取される。試料は、前立腺疾患の臨床的モニタリングで使用されている任意の間隔の組で採取され得る。好ましくは、最初の試料は処置の３０日または４５日後に採取され、その後の試料は、好ましくは３ヶ月間隔で採取される。このタイムコースは、試料のＰＳＡの値によってＥＳ−ＢＣＲが起こっていることが示された場合、または処置不奏功が示された場合には修正され得る。

ＰＳＡレベルの上昇速度は、ＰＳＡ最下点から測定すべきである。ＰＳＡの増加速度が指標レベルより上まで上昇している患者は、初期段階の生化学的再発が起こっていると特性評価され得る。速度の指標は、統計学的解析を用いて、例えば、単変量ロジスティック回帰および受信者動作特性（ＲＯＣ）解析、二変量解析もしくは多変量解析、または安定病態を有する患者部分母集団とＥＳ−ＢＣＲを有する患者部分母集団との良好な識別がもたらされる指標値を得るための他の適切な統計学的方法を使用することにより取得、評価または測定され得る。

さらに後述するように、経時的なＰＳＡレベルの上昇速度は、患者がＥＳ−ＢＣＲを有するのか、または安定病態を有するのかの良好な指標である。また、第２の連続的上昇などの速度の指標は、患者がＥＳ−ＢＣＲを有するのか、または安定病態を有するのかの指標として使用され得る。［ＰＳＡ］の変化の速度の指標または第２の連続的上昇の指標は、０．２〜２．５ｐｇ／ｍＬ／月の任意の量、好ましくは０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、または４．０ｐｇ／ｍＬ／月、より好ましくは０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０または２．０ｐｇ／ｍＬ／月、または該量のいずれかの前後であり得る。別の例として、時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの指標は、約０．０１５〜約０．０４２５の任意のレベル、好ましくは０．０１５、．０１７５、０．０２０、０．０２２５、０．０２５、０．０２７５、０．０３０、０．０３２５、０．０３５、０．０３７５、０．０４０、０．０４２５、または０．０４５、より好ましくは０．０３より上であり得る。

また、一実施形態において、患者がＥＳ−ＢＣＲを有するかどうかの倍加時間の指標は、４００〜８００日間の任意の日数、より好ましくは４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５または８００日間、最も好ましくは５５０日間であり得る。ＰＳＡ速度の値がＰＳＡ速度の指標を超えない場合、疾患が安定であるという判定が行われる；ＰＳＡ速度の値がＰＳＡ速度の指標以上である場合、ＥＳ−ＢＣＲが検出される。倍加時間の指標の場合、ＰＳＡ倍加時間が倍加時間の指標以下の日数であれば、ＥＳ−ＢＣＲと判定される。倍加時間の値および指標について、倍加時間の値が倍加時間の指標より小さい場合、倍加時間の値は倍加時間の指標を超えていると判定される。

他の実施形態において、観測された最大ＰＳＡの指標および時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの指標を組み合わせて使用し、患者が安定病態を有するのか、またはＥＳ−ＢＣＲを有するのかを判定する。例えば、該方法は、さらに、ｃ）ＥＳ−ＢＣＲを検出するために、ＰＳＡレベルが１５ｐｇ／ｍＬであるＰＳＡの指標より上であること、および時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの値が、時間に対するＬｎ［ＰＳＡ］の傾きの指標である約０．０３より上であることを判定することを含み得る。他方で、ＰＳＡレベルが１５ｐｇ／ｍＬ未満であるか、またはＰＳＡレベルの上昇速度が約０．０３未満である場合、安定病態が検出される。この例では、ＰＳＡレベルの増大速度が速度の指標以上、および観測ＰＳＡの値が観測された最大ＰＳＡの指標以上の両方の場合、ＥＳ−ＢＣＲであると判定される。

別の態様において、本発明は、患者が高速、中速または低速の初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の患者から一連の組の血液血清試料を得る工程；
ｂ）約０．５ｐｇ／ｍＬの実効感度を有するＰＳＡアッセイを使用し、各試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）ＰＳＡ速度の値を決定する工程；
ｄ）ＰＳＡ速度の値がＰＳＡ速度の指標以下であることを判定し、それによりＥＳ−ＢＣＲを検出する工程；および
ｅ）ＥＳ−ＢＣＲを、ＰＳＡ速度の指標に基づいて急速、中速または低速に分類する工程
を含む方法である。

ＰＳＡ倍加時間の値が速度の閾値以上である患者は、倍加時間に基づいて、高速、中速または低速の初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有すると分類され得る。一例として、一部の実施形態において、約１０ヶ月以下の倍加時間は、高速または急速な再発を示す；約１０ヶ月より長く約２４ヶ月までの倍加時間は中速ＥＳ−ＢＣＲを示し、約２４ヶ月より長い倍加時間は、低速再発を示す。

別の態様において、本発明は、患者が高速、中速または低速の初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）前立腺癌の治療後の患者から一連の組の血液血清試料を得る工程；
ｂ）約０．５ｐｇ／ｍＬの実効感度を有するＰＳＡアッセイを使用し、各試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）倍加時間の値および観測された最大ＰＳＡの値を測定する工程；
ｄ）倍加時間が倍加時間の指標以下であることを判定し、それによりＥＳ−ＢＣＲを検出する工程；および
ｅ）該倍加時間および観測された最大ＰＳＡに基づいて、ＥＳ−ＢＣＲを急速、中速、または低速に分類する工程
を含む方法である。

他の態様において、ＰＳＡ倍加時間の値が倍加時間の閾値以上である患者は、倍加時間および／または観測された最大ＰＳＡに基づいて、ＥＳ−ＢＣＲの４つのサブクラスに分類され得る。１型の再発患者は１５０日間未満の倍加時間を有する。２型の再発患者は１５０〜４００日間の倍加時間を有し、３型の再発患者および４型の再発患者は、４００日間より長いＰＳＡ倍加時間を有する。３型の患者は、観測された最大ＰＳＡが２００ｐｇ／ｍＬを超えているが、４型の患者は、４００日間より長い長期期間に２００ｐｇ／ｍＬを超えない観測された最大ＰＳＡの値を有する。

別の態様において、本発明は、前立腺癌のサルベージ治療後、患者が初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法であって、
ａ）サルベージ治療後の患者から試料を採取する工程；
ｂ）約０．５ｐｇ／ｍＬの実効感度を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）１つ以上の試料のＰＳＡレベルを用いてＰＳＡの値を決定する工程；
を含み、
ＰＳＡの値がＰＳＡの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、ＰＳＡの値がＰＳＡの指標を超えていない場合は安定病態が検出される、方法である。

別の態様において、本発明は、ＰＣＲシグナル検出を用いてＰＳＡに対するサンドイッチイムノアッセイを行なうのに適した核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートを備えるキットであって、該アッセイが少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度を有するキットである。該キットは、さらに、１つ以上のＰＳＡの値を決定するためのソフトウェアを備えるものであってもよい。

別の態様において、本発明は、患者が初期段階の生化学的逆戻り（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するかどうかを検出する方法の記載を含むラベルであって、
ａ）前立腺癌の治療後の患者から試料を採取する工程；
ｂ）１ｐｇ／ｍＬ未満の実効感度を有するＰＳＡアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程；
ｃ）１つ以上の試料からのＰＳＡレベルを用いてＰＳＡの値を求める工程
を含み、
ＰＳＡの値がＰＳＡの指標以上である場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、ＰＳＡの値がＰＳＡの指標を超えていない場合は安定病態が検出される、ラベルである。

実施例
総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）に対する高感度アッセイを用いた臨床試験において、該高感度アッセイを用いて血清ＰＳＡの変化をモニタリングすることにより、生化学的再発が早期に検出できることが示された。対照的に、既報の従来型アッセイの実効感度は限定的であり、約０．０１ｎｇ／ｍＬ（１０ｐｇ／ｍＬ）未満のＰＳＡレベルは信頼性のある報告は不可能である。したがって、高感度［ＰＳＡ］アッセイの使用により、より信頼性のある早期のＢＣＲ検出がもたらされる。

実施例１：非常に低いレベルの前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の検出のための核酸検出イムノアッセイ（ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイ）
血清試料中の総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）を、０．５ｐｇ／ｍＬの実効感度を有する核酸検出イムノアッセイ（ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイ）を用いて測定した。Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３（６）補遺、２００７，＃Ｃ−１５参照。ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイはサンドイッチイムノアッセイ形式で行なわれる。

ＰＳＡ上の異なるエピトープに対する２種類の抗体を、根治的前立腺摘除術を受けた男性の患者試料中のｐｇ／ｍＬレベルのＰＳＡが検出されるように設計されたアッセイにおいて使用した。

実施例１Ａ：シグナル核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートの作製
一次抗体を６０塩基のオリゴヌクレオチドに、ＪａｂｌｏｎｓｋｉおよびＡｄａｍｓによるＩＶＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６年１１月）に記載のようにしてコンジュゲート（化学的に連結）させる。次いで、このレポーター抗体を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および界面活性剤を含有する緩衝希釈剤中でおよそ１０〜３０ピコモル（ｐＭ）濃度まで希釈し、７．０〜７．５のｐＨ範囲での非特異的結合を低減させる。

実施例１Ｂ：捕捉核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートの作製
二次抗体を、直径がおよそ１ミクロンの常磁性粒子上に固定化させる。捕捉抗体は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート，カタログ番号２１３３５，Ｐｉｅｒｃｅによって供給）を用い、カタログに記載の方法を使用して、化学的に結合させたビオチンを有しており、続いて、製造業者Ｓｅｒａｄｙｎによって常磁性粒子に結合されたストレプトアビジンリンカー（カタログ番号３０１５−２１０４）を介して該磁性粒子に結合させる。

実施例１Ｃ：ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイのための条件
７５マイクロリットル（μｌ）のレポーター抗体を２０μｌの患者血清試料と、室温で２時間反応させる。次いで、不均質形式において、常磁性粒子上に固定化させた捕捉抗体をレポーター抗体および試料溶液に添加する。この混合物を、穏やかに攪拌して常磁性粒子を懸濁状態で維持しながら３０分間反応させる。

このインキュベーションの終了時、該粒子を磁気によって残余の溶液から分離する。該溶液を注意深く除去すると、磁性粒子がウェル側に残る。次いで、磁性粒子を３〜５回洗浄して非結合レポーター抗体を除去する。この溶液を、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ２０など）を含む中性ｐＨで緩衝化する。その結果、捕捉抗体とＤＮＡで標識されたレポーター抗体にサンドイッチされたＰＳＡのみ（存在するならば）を含む洗浄粒子がもたらされる。

次いで、該ＤＮＡに対する相補プライマーとＴａｑポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬を、この洗浄常磁性粒子に添加し、リアルタイムＰＣＲを行なう。このＰＣＲ増幅工程では、標準的な市販試薬を使用する。レポーター抗体に結合されたＤＮＡを含む免疫複合体の存在下で、ＤＮＡ鋳型の増幅がおこる。

次いで、既知のｔＰＳＡ濃度５、２５および１００ｐｇ／ｍＬの較正物質で作成した標準曲線から、未知試料を読み取る。また、各９６ウェルプレートに０．０、１０．０、および８０．０ｐｇ／ｍＬのＰＳＡの対照を含ませ、ＰＣＲ増幅工程が各プレートでの実行で適正な制御下にあることをさらに確実にする。

ＪａｂｌｏｎｓｋｉおよびＡｄａｍｓのＩＶＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６年１１月）に記載のように、該アッセイはまた均質形式で実行することもできる。例えば、一次抗ＰＳＡモノクローナル抗体をオリゴヌクレオチド配列（ａ）で標識し、二次抗体をオリゴヌクレオチド配列（ｂ）または（ｃ）にコンジュゲートさせた。オリゴヌクレオチド配列（ａ）は、それぞれ、配列（ｂ）および（ｃ）の３’末端の最後の９塩基および１５塩基に相補的であった。このコンジュゲートペアを、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１０ｍｍｏｌのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で１０〜１００ｐｍｏｌまで希釈し、ＰＳＡの存在下で２時間結合させた。次いで、この溶液をＴｒｉｓ／ＢＳＡを用いて希釈し、バルクコンジュゲート濃度を１ｐｍｏｌ未満まで低下させ、５２℃で１分間保持し、未結合コンジュゲートを充分融解させた。Ｔａｑポリメラーゼと下流プライマーを含むＰＣＲ試薬混合物を添加し、反応液を密封した。免疫複合体と会合しているＤＮＡ鎖に充分ハイブリダイズさせるため、および最初の鎖伸長を開始させるために温度を２３℃まで低下させた。遊離ＭＡｂ−ＤＮＡは、希釈溶液中では、最初の伸長の時間枠内で同程度にハイブリダイズすることができず、その後の指数関数的増幅に参与し得ない。ＰＳＡ免疫複合体と会合したオーバーラップＤＮＡ標識を５分間伸長させ、温度を３分間で８５℃まで上昇させることにより終了させた。形成された鋳型のリアルタイムＰＣＲ増幅は即時に開始され、免疫複合体が破壊されて、もはや必要でなくなった。アッセイの感度は約１００ｆｇ／ｍＬであると決定された。

ＮＡＤＩＡ（登録商標）ＰＳＡアッセイの性能を実証するため、Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ Ｍ．Ｄ．Ｐｈ．Ｄ．の研究所（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎｄ Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，トロント，ＯＮ，カナダ）からＩＭＤで患者試料を採取した。このような試料には、以前にＤｉａｍａｎｄｉｓ博士によって安定であると特性評価された４２名の患者、および上昇ＰＳＡの値を有し、生化学的再発を有すると分類された４３名の患者を含めた。試料は前立腺摘除後に採取されたものであり、術後のＰＳＡの値が１００ｐｇ／ｍＬ未満に低下した場合に組み入れた。生化学的再発は、いくつかの基準を用いて規定し、試験期間中に得た時点の値に基づいた。Ｙｕ，Ｈｅ；Ｄｉａｍａｎｄｉｓ，Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉｏｓ，Ｐ．Ｗｏｎｇ，Ｐｕｉ−Ｙｕｅｎ；Ｎａｍ，Ｒｏｂｅｒｔ；Ｔｒａｃｈｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊｏｈｎ “Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｌａｐｓｅ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｔ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ．００１ ｔｏ ０．１ｕｇ／Ｌ” Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １５７：９１３−１８（１９９７）参照。

ＮＡＤＩＡ（登録商標）ＰＳＡアッセイは、すべての女性試料のｔＰＳＡの値および男性集団の試料で観察された最低値を、遡及的臨床試験において、バックグラウンド値から精密に識別するのに充分感度のよいものであった。

実施例２：疾患の転帰の指標を評価するための遡及的試験
ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイを使用し、根治的前立腺摘除術後の前立腺癌患者由来の連続血清試料におけるｔＰＳＡレベルを測定した。結果を、蛍光免疫測定（ＩＦＭ）アッセイに基づいた研究アッセイを用いて、血清試料中の先のＰＳＡレベルの測定値と比較した。Ｖａｓｓｉｌｉｋｏｓら、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：１１５−１２３（２０００）。次いで、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイの結果を解析し、患者の臨床転帰との一致を調べた。

試料
先の公表された試験（Ｊ Ｕｒｏｌ １５７：９１３−８，１９９７）後に保存しておいた血清試料（Ｎ＝４３５）をこの試験に使用した。試料は１９９３年および１９９４年に収集したものであり、ＰＳＡレベルはＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩＭｘアッセイを用いて測定し、試料は−４０℃で凍結保存した。また、試料は、ＶａｓｓｉｌｉｋｏｓらによってＩＦＭアッセイを用いてｔＰＳＡレベルを測定した試験でも使用された。ＩＦＭアッセイは、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３９：２１０８-１４，１９９３にさらに記載されている。Ｖａｓｓｉｌｉｋｏｓらの試験で使用された血清試料は、ＲＰ後のベースラインｔＰＳＡ＜１００ｐｇ／ｍＬ（ＩＭｘアッセイを用いて測定）を有し、それぞれＲＰ後に採取された３つより多くの連続試料（平均値５．０、中央値５、範囲３〜６）を有する８５名の患者から採取されたものであった。中央値（範囲）年齢は６３歳（４９〜７３歳）であり、ＲＰ前ｔＰＳＡは７．１ｎｇ／ｍＬ（０．１〜４９．０）であり、グリーソンスコアは７（５〜９）であり、腫瘍関与％（％ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）は２５％（１〜９０％）であった。臨床病期はＴ１ａ−ｃ（１６）、Ｔ２ａ−ｂ（３５）および未知（３３）であった。４名の患者はＲＰ前治療（ホルモン＝１；放射線療法＝２）を受けていた。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙの試験では、ｔＰＳＡの値をＡｂｂｏｔｔ ＩＭｘアッセイで最初に決定した血清試料を、ＩＦＭ法によって再解析したが、元の値と比べて有意差は示されなかった。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙの論文では、ＢＣＲは、≧２個の連続ｔＰＳＡの増大が≧１００ｐｇ／ｍＬに達すること、逆戻りは最初のｔＰＳＡ増大に遡ることと定義された。

根治的前立腺摘除術（ＲＰ）後の患者由来の血清試料を、ＲＰ後のＰＳＡレベルが、現在ＦＤＡに承認されている従来型ＰＳＡアッセイを用いて検出可能限界未満の場合、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイのＰＳＡ試験に含めた。従来型アッセイの多くでは、患者が術後ゼロまたは＜０．１ｎｇ／ｍＬ（＜１００ｐｇ／ｍＬ）の値を有すると報告されている。ＮＡＤＩＡ（登録商標）ＰＳＡアッセイでは、ＦＤＡ承認ＰＳＡアッセイよりも、およそ２００倍低いレベルのＰＳＡを検出することができる。したがって、高感度ＰＳＡアッセイの使用により、前立腺摘除後患者におけるＰＳＡの真のレベルの測定が初めて可能になった。より感度がよく精密なＰＳＡレベルの測定により、患者を２つの群−安定病態および初期段階の生化学的逆戻りに配することが可能になった。

試験における患者の記述統計
７名の患者は、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイデータが入手可能でなかったため、または手術データが入手可能でなかったため、プロスペクティブにこの解析から除外した。この試験に含めた患者の最終人数は８５名であった。試験に含めた各患者の試料採取の時点までに取得した［ＰＳＡ］の測定値（ｐｇ／ｍＬ）を以下の表１に示す。

Ｄｉａｍａｎｄｉｓ研究アッセイに基づき、４３名は再発と分類され、４２名は安定病態と分類された。Ｙｕら、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １５７：９１３−１８（１９９７）。患者集団に関する臨床病理学的変量の記述統計を得た。再発分類患者と安定病態分類患者間の臨床変量の分布における差の有意性を以下の表２にまとめる（ｐ＜０．０５は、再発集団と安定病態集団間の変量の分布における有意差を示した）。

本試験では、８４名（９８．８％）の患者が、ｔＰＳＡを測定するためにＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイを使用する生化学的評価で評価可能であり、６０〜７０％が臨床病理学的に評価可能であった。ＮＡＤＩＡ（登録商標）を用いたｔＰＳＡの測定により、ＲＰ後の最下点の中央値（範囲）または第１のｔＰＳＡの値は４．１ｐｇ／ｍＬ（０．２〜１６７．９ｐｇ／ｍＬ）であることが示された。

また、再発分類と安定病態分類間の臨床変量の分布における差の有意性の上記の表に示されるように、グリーソン、外科的切除縁、前立腺周囲浸潤、被膜浸潤、および腫瘍体積はすべて、部分母集団間に有意差を示し、転帰の予測量となり得る。

実施例３：疾患の転帰の指標（１つまたは複数）としての［ＰＳＡ］に基づいた測定値の評価
該試料の組で収集されたデータの解析により、種々のＰＳＡ測定値の指標によって疾患の転帰が予測されるという仮説の評価が可能となり、前立腺癌の治療後の患者のモニタリングに有用であり得る。このような指標には、患者由来の連続試料中のｔＰＳＡのＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイでの測定値に基づいた以下の値：ｔＰＳＡ倍加時間（ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイのＰＳＡの値が指数関数フィット可能な患者のみから計算）；第１の前立腺摘除後レベル（最下点値は、常に第１の前立腺摘除後の値と同じとは限らない）；最下点後に観察された最大ｔＰＳＡレベル（モニタリング中の任意の点であり得る）；最下点に対する最大ｔＰＳＡレベルの比（再発の可能性を示すためには、最下点後のある時点での見かけの最下点レベルよりも高い少なくとも１つの値を必要とする）；第２の連続的増加（ｐｇ／ｍＬ／月）；増大速度；モニタリング期間中の倍加数；モニタリング中の連続倍加数が含まれた。

この試験で解析した各患者について、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイを用いて測定したｔＰＳＡ（ｐｇ／ｍＬ）を、手術後の日数の関数としてプロットした。例えば、図１は、指数関数フィットによる再発患者番号１１の、根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）のｔ［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。図２は、指数関数フィットによる再発患者番号３１の、根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）のｔ［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。図３は、指数関数フィットによる再発患者番号３８の、根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）のｔ［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。図４は、指数関数フィットによる安定患者番号８６の、根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）のｔ［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。図５は、指数関数フィットによる安定患者番号１２０の、根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）のｔ［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。図６は、指数関数フィットによる安定患者番号１２６の、根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。

全患者に対するプロットを、患者が再発カテゴリーに分類されるか、安定病態カテゴリーに分類されるかによって分けた。図７は、４３名の全再発患者の根治的前立腺摘除術後の日数に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）のｔ［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを示す。図８は、範囲を１０００ｐｇ／ｍｌまでに限定した（意味なし）、４３名の再発患者の前立腺摘除後の期間に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）のｔ［ＰＳＡ］のオーバーレイプロットを示す。

倍加時間の解析では、プロットが指数関数的にフィットされ得ない安定病態患者を試験から除外した。４２名のうち１０名の安定病態患者を倍加時間の解析に含めた。他の解析（観測された最大ＰＳＡレベル、第１の前立腺摘除後ＰＳＡレベル、最下点ＰＳＡレベル、観測された最大ＰＳＡレベル／最下点レベル比、倍加数、連続倍加数、および第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月））ではすべて、４３名の全再発患者および４２名の全安定病態患者のデータを使用した、すなわち除外は行わなかった。

実施例４：疾患の転帰の潜在的指標の解析
再発または安定病態に対する各ＰＳＡ可能性指標（第１の前立腺摘除後ＰＳＡレベル、最下点ＰＳＡレベル、観測された最大ＰＳＡレベル、観測された最大ＰＳＡレベル／最下点レベル比、倍加数、連続倍加数、第２の上昇ｐｇ／ｍ．／月、倍加時間（指数関数フィットが可能であった場合））の解析を行ない、再発の予測量（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）としての各転帰に対する相対的有用性を評価した。患者は安定である、または疾患再発を有するという臨床的分類を、参照転帰として使用した。使用した統計学的検定は、連続的変量ではウィルコクソン順位和検定、およびカテゴリー別変量ではピアソンカイ２乗検定とした。

この解析により、計算［ＰＳＡ］パラメータはすべて、臨床転帰（再発または安定病態）の有意な予測量である（ウィルコクソン順位和またはピアソンカイ２乗ｐ＜０．０５）ことが示された。観測された最大ｔＰＳＡレベル、第２の連続的増加（ｐｇ／ｍＬ／月）、および倍加時間は、患者部分母集団の識別において最良であった。また、最下点レベルに対する最大ＰＳＡレベルの比および倍加数でも、公正な識別が示された。

各［ＰＳＡ］の指標の解析を以下に論考する。

実施例４Ａ：患者部分母集団（再発または安定病態）に対する第１の前立腺摘除後レベルの解析

患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する第１の前立腺摘除後ｔＰＳＡレベルのプロットを図９に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の分位点（ｑｕｉｎｔｉｌｅ）を表４に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の平均値および標準偏差を表５に示す。患者部分母集団（再発または安定病態）に対する第１の前立腺摘除後ｔＰＳＡレベルのプロットのデータ解析によれば、このパラメータによって該２つの集団が有意に識別され、したがって転帰の予測量である。安定群の平均値（ＳＥＭ）［ＰＳＡ］の平均値＋／−標準誤差は４．１ｐｇ／ｍＬ＋／−０．５８であり、一方、再発を有する群の［ＰＳＡ］の平均値＋／−ＳＥＭは２８．２＋／−５．７２であった。ｐは＜０．０００１であった。しかしながら、安定集団は最大で中央値および中央値を超えると、再発集団とオーバーラップする。

実施例４Ｂ：患者部分母集団（再発または安定病態）に対する最下点ｔＰＳＡレベルの解析

患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する最下点ｔ［ＰＳＡ］レベル（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを図１０に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の分位点を表６に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の平均値および標準偏差を表７に示す。最下点［ＰＳＡ］レベルのデータ解析によれば、このパラメータによって該２つの集団が有意に識別され、したがって転帰の予測量である。安定群の最下点［ＰＳＡ］の平均値＋／−ＳＥＭは２．４ｐｇ／ｍＬ＋／−０．４２であり、一方、再発を有する群の最下点［ＰＳＡ］の平均値＋／−ＳＥＭは２７．２＋／−５．８であった。ｐは＜０．０００１であった。しかしながら、安定集団は最大で中央値および中央値を超えると、再発集団とオーバーラップする。

実施例４Ｃ：患者部分母集団（再発または安定病態）に対する観測された最大ｔＰＳＡレベルの解析

患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する観測された最大［ＰＳＡ］レベル（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを図１１に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の分位点を表８に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の平均値および標準偏差を表９に示す。患者部分母集団に対する観測された最大［ＰＳＡ］レベルの解析により、最大ｔＰＳＡレベルによって安定患者と再発患者の２つの集団が有意に識別され、したがって、転帰の予測量であることが示された。安定群の［ＰＳＡ］の平均値＋／−ＳＥＭは９．０ｐｇ／ｍＬ＋／−３．１１であり、一方、再発を有する群の平均値＋／−ＳＥＭ［ＰＳＡ］は１２９５．９＋／−４０３．９１であった。ｐは＜０．０００１であった。安定集団は、１０〜２５％の一部の個所でのみ再発集団とオーバーラップし、したがって良好に識別された。この試験では、１名のみ、１５ｐｇ／ｍＬより高い観測ＰＳＡレベルを有する安定病態患者がみられた。

実施例４Ｄ：患者部分母集団（再発または安定病態）に対する最大ｔＰＳＡレベル／最下点レベルの解析

患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する最大［ＰＳＡ］レベル（ｐｇ／ｍＬ）／最下点レベル［ＰＳＡ］（ｐｇ／ｍＬ）のプロットを図１２に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の分位点を表１０に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の平均値および標準偏差を表１１に示す。患者部分母集団に対する最大ＰＳＡレベル／最下点レベルＰＳＡの解析により、最下点［ＰＳＡ］に対する最大ＰＳＡレベルの比によって該２つの集団が有意に識別され、したがって転帰の予測量であることが示された。ｐは＜０．００１であった。安定集団の平均値＋／−ＳＥＭは３．６＋／−０．６であり、一方、再発集団の平均値＋／−ＳＥＭは８７．５＋／−２０．３であった。しかしながら、安定集団は再発集団と中央値付近ではオーバーラップする。

実施例４Ｅ：患者部分母集団（再発または安定病態）に対する第２の連続増大（ｐｇ／ｍＬ／月）の解析

患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する［ＰＳＡ］レベルの第２の連続的増加（ｐｇ／ｍＬ／月）のプロットを図１３に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の分位点を表１２に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の平均値および標準偏差を表１３に示す。第２の連続的増加（ｐｇ／ｍＬ／月）の解析により、このパラメータによって該２つの集団が有意に識別され、したがって転帰の予測量であることが示された。安定群の第２の連続的増加の平均値＋／−ＳＥＭは０．１５ｐｇ／ｍＬ／月＋／−０．１３であり、一方、再発を有する群の（ｏｒ）平均値＋／−ＳＥＭは６３．５＋／−３６．７８であった。ｐは＜０．０００１であった。安定集団は再発集団とおよそ２５％オーバーラップし、したがって良好な識別力を示す。

実施例４Ｆ：患者部分母集団（再発または安定病態）に対する倍加時間（日間）の解析

患者部分母集団（前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０））に対する倍加時間データ（日間）のプロットを図１４に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の分位点を表１４に示す。疾患安定群（０）および再発群（１）の平均値および標準偏差を表１５に示す。このデータの解析により、倍加時間（日間）によって該２つの集団は有意に識別され、したがって転帰の予測量であることが示された。ｐは＜０．０００１であった。安定集団の平均値は１２０８＋／１４２．９であり、一方、再発集団の平均は３１８．６＋／−２６．０４であった。安定集団は、わずか１０〜２５％再発集団とオーバーラップし、したがって良好に識別される。

ＰＳＡアッセイを用いて観測した倍加時間に基づいた患者のさらなるカテゴリー化
患者の再発部分母集団のさらなるサブクラス間の識別を行なうために、倍加時間が使用され得るかどうかを判定するためのさらなる解析を行なった。ＰＳＡ倍加時間の解析により、患者を、＜１５０日間（急速再発）、１５０〜４００日間（中速再発）、および＞４００日間（低速再発）にカテゴリー化される３つの群にさらに区分することが可能であった。速度は指数関数的増殖速度を反映しており、したがって、癌の増殖の急速進行性を反映していることが予測された。

図１５Ａ〜Ｃは、それぞれ、＜１５０日間、１５０〜４００日間、または＞４００日間の倍加時間を有する再発患者のオーバーレイプロットを示す。図１５Ａは、範囲を１０００ｐｇ／ｍＬまでに限定した、＜１５０の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。

図１５Ｂは、範囲を１０００ｐｇ／ｍＬまでに限定した、１５０〜４００の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。

図１５Ｃは、範囲を１０００ｐｇ／Ｍｌまでに限定した、＞４００の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。

再発患者は、４つの類型、倍加時間が１５０日未満の第１群、倍加時間が１５０〜４００日間の第２群、ともに４００日間より長い倍加時間を有した第３群および第４群に分けられ得る。第３群では観測された最大ＰＳＡが２００ｐｇ／ｍＬを超えたが、第４群では観測された最大ＰＳＡは２００ｐｇ／ｍＬを超えなかった。

図１６Ａ〜Ｄは、それぞれ、倍加時間による、範囲を１０００ｐｇ／ｍＬまでに限定した再発患者のサブクラスのオーバーレイプロットを示す。＞４００日間の倍加時間を有する再発患者を、さらに、観測された最大ＰＳＡが２００ｐｇ／ｍＬより上であるか下であるかに細分した。

図１６Ａは、＜１５０日間の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。

図１６Ｂは、＜１５０〜４００日間の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。

図１６Ｃは、＞４００日間の倍加時間を有する再発患者の術後の日数に対する最大［ＰＳＡ］＞２００ｐｇ／ｍＬのオーバーレイプロットを示す。

図１６Ｄは、再発患者の術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示す。

図１７は、術後の日数に対する［ＰＳＡ］ｐｇ／ｍｌのオーバーレイプロットを示すが、安定病態患者は、ほんの少数例を除いて、概ね１５ｐｇ／ｍＬを超えないＰＳＡ最大を有する。

実施例４Ｇ：患者部分母集団（再発または安定病態）に対する倍加数の単変量解析

上記の表１６は、倍加数が、安定病態を有する４２名の患者に対して前立腺癌の再発を有する４３名の患者で増大していることを示す。差はｐ＜０．０００１（カイ２乗）で有意であった。部分母集団間には、１回の倍加と２回の倍加の領域において一部オーバーラップがみられる。オーバーラップの程度は集団全体のおよそ６０％であるが、（ａ）再発では常に倍加が観察されること、および（ｂ）安定病態では３回または４回の倍加を有する患者は見られないことは興味深い。前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０）患者部分母集団に対するモニタリング中の倍加数を示すデータのモザイクプロットを図１８に示す。

実施例４Ｈ：患者部分母集団（再発または安定病態）に対する連続倍加数の単変量解析

上記の表１７は、連続倍加数が、安定病態を有する４２名の患者に対して前立腺癌の再発を有する４３名の患者で増大していることを示す。差はｐ＜０．０００１（カイ２乗）で有意であった。オーバーラップの程度は集団全体のおよそ８０％である。前立腺癌の再発（１）または安定病態を有する（０）患者部分母集団に対する連続倍加数を示すデータのモザイクプロットを図１９に示す。

実施例５：単変量ロジスティック回帰および受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を用いた指標の評価
単変量ロジスティック回帰および受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析を、ＰＳＡ測定値に基づいた種々の指標（第１の前立腺摘除後ＰＳＡレベル、最下点ＰＳＡレベル、観測されたＰＳＡ最大レベル、倍加数、連続倍加数、第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月））によって疾患の転帰が予測されるかどうかの評価に使用した。患者は安定であるか、または疾患の再発を有するという臨床的分類を参照として使用した。また、倍加時間の計算では、統計学的解析により、指数関数フィットおよび他のフィットが、４３名の再発患者のうち４０名および４２名の安定病態患者のうち１０名で適切であることが示された。Ｒ２が少なくとも約０．５であれば、たとえ他のフィットがより良好なフィットを与えたとしても、指数関数的パラメータを倍加時間の計算に採用した。また、倍加時間の計算では、ｔＰＳＡの値が経時的に上昇していたはずであった。

候補ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイの指標によって前立腺癌の生化学的再発を予測する能力を評価するため、ロジスティック回帰およびＲＯＣ解析を使用した。各候補指標を（その独自のモデルにおいて）、例えば、観測された最大値、倍加時間、観測されたＰＳＡ最大レベル／最下点レベル比、第２のｐｇ／ｍＬ／月、および倍加数を個々に採用したロジスティック回帰モデルを使用し、オッズ比（処置群におけるある型の転帰の確率と対照群の転帰とを比較する処置効果の尺度；１．０の値から有意に外れるオッズ比が望ましい）およびワルド検定によるｐ値を得た。ＲＯＣ解析により、ＲＯＣ曲線下面積（１００−特異性に対する感度としてプロット；１．０の面積が理想的である）の推定値、および関連する９５％信頼区間（９５％ＣＩ）、最良識別指標値、ならびに最良識別指標値における関連する感度および特異性を得た。結果を以下の表１８および１９にまとめる。

単変量解析の結果のまとめ

ＲＯＣ曲線下面積は１．０の理想的な状態に近く、感度と特異性の組合せは、倍加数の指標以外で高かった。倍加時間および倍加数のロジスティック回帰モデルでは、観測結果の制限のため、収束しなかった。したがって、部分母集団（安定病態および初期段階の生化学的再発）の最強の指標は、観測された最大レベル、最大ＰＳＡレベル／最下点レベル比、およびＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイのＰＳＡレベルの第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）であった。これらの指標すべては、生化学的再発の有意な予測量であった（ワルドｐ値はすべて＜０．０５であった）。

実施例６：多変量ロジスティック回帰およびＲＯＣを用いた指標の評価
単変量解析において強力な予測量であることがわかった候補指標（観測された最大レベル、最大レベル／最下点比、および第２のＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイのＰＳＡの上昇（ｐｇ／ｍＬ／月））をさらに評価するため、多変量ロジスティック回帰およびＲＯＣ解析を行なった。その意図は、モデルにおいて臨床病理学的予後指標が存在していても、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイの候補指標によって予測能力が維持され得るかどうかを判定することであった。このような臨床病理学的指標はすべて、再発の有意な予測量であることが以前に示されたものであり、外科的切除縁の罹患（ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）；癌の被膜浸潤；および癌の前立腺周囲組織浸潤が含まれた。

各モデルについて、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイの指標および臨床病理学的指標のオッズ比およびワルドｐ値を示す。また、ＲＯＣの全曲線下面積（ＡＵＣ）およびその関連する９５％ＣＩも示す。さらに、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイの指標の変量モデルのＡＵＣに対する多変量モデルのＡＵＣとの間の差の有意性を統計学的に調べた。この統計学的解釈に関するｐ値が＜０．０５であるとした場合、多変量モデルがＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイの指標単独よりも高い予測力を示すことが示され、逆に、ｐ値＞０．０５では、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイの指標が強力で独立した予測量であること、および臨床病理学的指標をモデルに加えても前立腺癌再発の検出の予測能力は有意に改善されないことが示される。

以下の図および表は、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイの指標のみを使用した単変量ＲＯＣ曲線と比較した多変量ＲＯＣ曲線、ならびにロジスティック回帰およびＲＯＣコンピュータ計算の結果を示す。

実施例６Ａ：多変量結果−観測された最大ＰＳＡ：

図２０Ａおよび２０Ｂは、ＮＡＤＩＡ（登録商標）の観測された［ＰＳＡ］最大レベルに関する単変量ＲＯＣ曲線と比較した多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２０Ａは多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２０Ｂは、多変量ＲＯＣ曲線（点線）に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）の観測された［ＰＳＡ］最大レベル（黒線）に対する単変量ＲＯＣ曲線を示す。表２０は、ロジスティック回帰およびＲＯＣコンピュータ計算の結果を示す。観測された［ＰＳＡ］最大値に対するロジスティック回帰モデルを使用し、ワルド検定からオッズ比とｐ値を得た。ＲＯＣ解析によって曲線下面積（ＡＵＣ）の推定値を得、また、その関連９５％ＣＩも示す。

ＮＡＤＩＡ（登録商標）の観測されたＰＳＡ最大レベルは、独立した有意な転帰の予測量であり（ｐ＝０．０４９７）、多変量モデルでは、該パラメータ単独の使用と比べて、ＡＵＣは有意に改善されない（ｐ＝０．７９７）。

実施例６Ｂ：多変量結果−最大ｔＰＳＡ／最下点比：

図２１Ａおよび２１Ｂは、ＮＡＤＩＡ（登録商標）の最大総［ＰＳＡ］／最下点［ＰＳＡ］レベルに関する単変量ＲＯＣ曲線と比較した多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２１Ａは多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２１Ｂは、多変量ＲＯＣ曲線（点線）に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）の最大総［ＰＳＡ］／最下点［ＰＳＡ］レベル（黒線）の単変量ＲＯＣ曲線を示す。表２１は、ロジスティック回帰およびＲＯＣコンピュータ計算の結果を示す。最大総［ＰＳＡ］／最下点［ＰＳＡ］レベルのロジスティック回帰モデルを使用し、ワルド検定からオッズ比とｐ値を得た。ＲＯＣ解析によって曲線下面積（ＡＵＣ）の点推定値を得、また、その関連する９５％ＣＩも示す。

最下点ＰＳＡレベルに対する観測されたＰＳＡ最大レベルの比は、独立した転帰の予測量であり（ｐ＝０．００５１）、多変量モデルでは、観測された最大ＰＳＡ／最下点単独の使用と比べて、ＡＵＣは有意に改善されない（ｐ＝０．１９１）。

実施例６Ｃ：多変量結果−第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）

図２２Ａおよび２２Ｂは、［ＰＳＡ］の第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）に関する単変量ＲＯＣ曲線と比較した多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２２Ｂは多変量ＲＯＣ曲線を示す。図２２Ａは、多変量ＲＯＣ曲線（点線）に対するＮＡＤＩＡ（登録商標）の［ＰＳＡ］の第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）（黒線）の単変量ＲＯＣ曲線を示す。表２２は、ロジスティック回帰およびＲＯＣコンピュータ計算の結果を示す。［ＰＳＡ］の第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）のロジスティック回帰モデルを使用し、ワルド検定からオッズ比とｐ値を得た。ＲＯＣ解析によって曲線下面積（ＡＵＣ）の点推定値を得、また、その関連する９５％ＣＩも示す。

第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）は独立した転帰の予測量であり（ｐ＝０．００２３）、多変量モデルでは、第２の上昇単独の使用と比べて、ＡＵＣは有意に改善されない（ｐ＝０．７０１）。

実施例７：バイナリーカテゴリー別表示としての［ＰＳＡ］の指標の評価
バイナリーカテゴリー別表示としての観測されたＰＳＡ最大レベル、最大レベル／最下点レベル比、および第２の上昇（ｐｇ／ｍＬ／月）の効果を評価するための単変量ロジスティック回帰およびＲＯＣ解析もまた行なった。結果を表２３に示す。バイナリーカテゴリー別表示の指標カットオフは、観測された最大レベルでは２５ｐｇ／ｍＬ、第２の上昇では０．６ｐｇ／ｍＬ／月の値、および観測されたＰＳＡ最大レベル／最下点レベル比では６であった。各患者を、これらのカットオフを超えているか、または超えていないかのいずれかにカテゴリー化した。

図２３Ａ〜Ｃに示されるように、各［ＰＳＡ］の指標の単変量解析によって、これらの［ＰＳＡ］の指標のバイナリー表示はすべて非常に強力であることが示され、ｐ値は＜０．０００１であり、ＡＵＣ値は１．０に近かった。

試験に対する結論：
少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値の検出限界および少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度を有するＮＡＤＩＡ（登録商標）のｔＰＳＡアッセイにより、０．５ｐｇ／ｍＬまで低値のｔＰＳＡ濃度の信頼性のある測定が可能となり、精密なＰＳＡ最下点の結果およびＰＳＡ−倍加時間の計算がもたらされる。ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイなどの、少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値の低値実効感度を有するＰＳＡアッセイを用いたｔＰＳＡの測定により、安定病態患者群は、低くて一定レベルのＰＳＡを有し、おおよその平均値は３．５ＰＧ／ＭＬ（０．００３５ｎｇ／Ｍｌ）であることが示された。安定病態を有する患者と、生化学的再発を有する患者間の差は統計学的有意性が高い。

また、平均して、ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイでは、ｔＰＳＡの値が１００ｐｇ／ｍＬ（０．１ｎｇ／ｍＬ）に達する３４ヶ月前にｔＰＳＡの上昇が検出された。

観測された最大ＰＳＡレベルは、安定病態部分母集団または生化学的再発部分母集団の非常に強力な指標である。少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値の実効感度を有するＰＳＡアッセイを用いて得られた観測された最大ＰＳＡレベルは、早期の生化学的逆戻りを検出するために使用され得る。また、ｐｇ／ｍＬ／月の増大も、安定病態を有する部分母集団または生化学的再発部分母集団の非常に強力な指標である。また、最下点レベルに対する観測された最大ＰＳＡレベルの比も、安定病態を有する部分母集団または生化学的再発を有する部分母集団の非常に強力な指標である。

ＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイ試験により、部分母集団（安定病態および初期段階の生化学的再発）の最も識別力のある指標として供されるｔＰＳＡパラメータは、観測された最大レベル、第２の連続増大速度（ｐｇ／ｍＬ／月）、および倍加時間であることが示された。

実施例８：以前のデータが入手可能でなかった患者での差の有意性の計算
試料の組に対してＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイを用いてｔＰＳＡを測定したとき、１０、２５、１００および２００ｐｇ／ｍＬの［ＰＳＡ］が達成されるのに必要とされる日数の計算を、４０名の再発患者および１０名の安定病態患者の指数関数フィットに基づいて行なった。この型の解析により、根治的前立腺摘除術後、非常に早期の時点での再発集団と安定病態集団の比較が可能である。この遡及的試験では、利用可能なデータの指数関数的フィットに基づいた外挿では、再発患者のＰＳＡが１０ｐｇ／ｍＬに達するのに必要とされる時間に関連する低値の決定ではエラー率が大きくなった。しかしながら、２５、１００および２００ｐｇ／ｍｌに達するのに必要とされる時間の結果では、信頼性の増大が示された。ウィルコクソン順位和解析を使用し、該２つの部分母集団間の差の有意性を調べた。以下の表２４に示されるように、［ＰＳＡ］は、安定病態集団よりも再発疾患集団において、有意に早期に指定レベルに達した。

種々の時点（３、６、９、１２および１８ヶ月）でのＮＡＤＩＡ（登録商標）アッセイのＰＳＡ（ｐｇ／ｍＬ）の計算は、４０名の再発患者および１０名の安定病態患者の指数関数フィットを基にした。ウィルコクソン順位和解析を使用し、該２つの部分母集団間の差の有意性を調べた。以下の表２５に示されるように、これらの値はすべて、所与の時点で、安定病態部分母集団よりも再発部分母集団において高かった。この差の有意性は経時的に増大し、最終的に１８ヶ月目にｐ＜０．００１に達する。これは、これらの集団が時間が経過しても一貫して相違していることを示す。

実施例９：ＥＣ−ＢＣＲの指標としての速度の使用
１６名の安定患者および１３名の再発患者について、時間に対する根治的前立腺摘除術後の［ＰＳＡ］の線形プロットを比較する遡及的試験は、８年間までの期間で終了した。この試験では、ＮＡＤｉＡアッセイを使用し、実施例１〜６に記載のようにして総［ＰＳＡ］を測定した。安定患者は、患者が試験期間中に前立腺癌の再発の徴候を有しなかった場合、安定であると規定した。患者が前立腺癌再発に対して陽性骨スキャンおよびまたは前立腺癌による死亡のいずれかを有した場合は、再発と規定した。［ＰＳＡ］のレベルは、ＮＡＤｉＡアッセイを用いて、およそ８年間の期間にわたって測定した。線形曲線フィットを各患者について計算した。線形曲線フィットの一例を、安定患者（番号１００２）（図２４）および再発患者（番号２００１）（図２５）について示す。

各患者での傾きを決定し、以下の表２６に示す。

安定患者群（ｐｇ／ｍｌ−月）の最大傾きの値は０．４７２、すなわち、再発患者群の傾きの最小値６．５８よりも１３倍超小さい。このデータにより、この高感度アッセイを使用すると、患者が根治的前立腺摘除術後に前立腺癌の再発を有していないと仮定される場合、時間に対する［ＰＳＡ］の傾きが１未満であれば、安定患者と前立腺癌の再発患者との１００％の識別がもたらされることが示された。また、各患者群の平均値間に有意差がみられたことにも注目されたい。

実施例１０：高速、中速または低速のＥＳ−ＢＣＲの決定に基づいた前立腺摘除後治療の施行
前立腺摘除後患者の［ＰＳＡ］の値は、上記のようにして得られる。ＰＳＡ速度の値（倍加時間など）は、患者の再発部分母集団のさらなるサブクラス間の識別を行なうために測定される。

ＰＳＡ倍加時間の解析により、患者を、（１）約１０ヶ月以下の倍加時間（これは、高速または急速再発を示す）；（２）約１０ヶ月より長く約２４ヶ月までの倍加時間（これは、中速ＥＳ−ＢＣＲを示す）、および（３）約２４ヶ月より長いことを特徴とする倍加時間（これは、低速ＥＳ−ＢＣＲを示す）によって特性評価される３つの群に、さらに区分することが可能になる。

高速再発を示す患者には、体外放射線治療を使用する前立腺摘除後治療を施す。

中速または低速再発を示す患者では、グリーソンスコアおよび創傷切除縁の臨床観測結果を取得する。６０歳より若く、＞７のグリーソンスコアおよび不良な切除縁を有し、中速または低速再発を示す患者には、体外放射線治療を使用する前立腺摘除後治療を施す。

８０歳を超え、低速再発を示す患者には、さらなる治療を施さない。

他の患者は、生化学的再発についてモニタリングする。

本明細書に記載の発明の具体的な実施形態の記載は、本発明の範囲に含まれる他の実施形態を制限または排除することを意図しない。

Claims (14)

1. 患者が初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するか、または、安定病態を有するかを検出する方法であって、
   ａ）前立腺癌の治療後１８ヶ月以内の該患者から得られた２つ以上の試料を提供する工程；
   ｂ）２．０ｐｇ／ｍＬ未満の検出の限界を有するＰＳＡに対する不均質なサンドイッチ形式のイムノアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程であって、該サンドイッチ形式のイムノアッセイが、シグナル生成のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる、工程；
   ｃ）該試料のＰＳＡレベルを用いてＰＳＡの値を決定する工程
   を含み、
   該ＰＳＡの値が少なくともＰＳＡの指標であるか、または該ＰＳＡの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該ＰＳＡの値が該ＰＳＡの指標を超えていない場合は安定病態が検出され、該ＰＳＡの指標は、２．０ｐｇ／ｍＬ／月の［ＰＳＡ］の増加速度である、方法。
2. 前記検出の限界が少なくとも１．０ｐｇ／ｍＬまで低値である、請求項１に記載の方法。
3. 患者が初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するか、または、安定病態を有するかを検出する方法であって、
   ａ）前立腺癌の治療後１８ヶ月以内の該患者から得られた２つ以上の試料を提供する工程；
   ｂ）２．０ｐｇ／ｍＬ未満の検出の限界を有するＰＳＡに対する不均質なサンドイッチ形式のイムノアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程であって、該サンドイッチ形式のイムノアッセイが、シグナル生成のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる、工程；
   ｃ）該試料の該ＰＳＡレベルを用いてＰＳＡの値を決定する工程
   を含み、
   該ＰＳＡの値が少なくともＰＳＡの指標であるか、または該ＰＳＡの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該ＰＳＡの値が該ＰＳＡの指標を超えていない場合は安定病態が検出され、該ＰＳＡの指標は、４．０ｐｇ／ｍＬ／月の［ＰＳＡ］の増加速度である、方法。
4. 前記検出の限界が少なくとも１．０ｐｇ／ｍＬまで低値である、請求項３に記載の方法。
5. 前記検出の限界が少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値である、請求項１または３に記載の方法。
6. 前記検出の限界が少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値である、請求項１または３に記載の方法。
7. 前記試料が前記患者からの一連の組の試料の１つであり、各試料中のＰＳＡの量が決定される、請求項１、３、または５いずれか１項に記載の方法。
8. 患者が初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）を有するか、または、安定病態を有するかを検出する方法であって、
   ａ）前立腺癌の治療後１８ヶ月以内の該患者から得られた２つ以上の試料を提供する工程；
   ｂ）２．０ｐｇ／ｍＬ未満の検出の限界を有するＰＳＡに対する不均質なサンドイッチ形式のイムノアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程であって、該サンドイッチイムノアッセイが、シグナル生成のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる、工程；
   ｃ）該試料のＰＳＡレベルを用いて［ＰＳＡ］の増加速度を決定する工程
   を含み、
   該［ＰＳＡ］の増加速度の値が少なくとも［ＰＳＡ］の増加速度の指標であるか、または該［ＰＳＡ］の増加速度の指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該［ＰＳＡ］の増加速度の値が該［ＰＳＡ］の増加速度の指標を超えない場合は安定病態が検出され、該［ＰＳＡ］の指標は、６．５８ｐｇ／ｍＬ／月の［ＰＳＡ］の増加速度である、方法。
9. 前記検出の限界が１．０ｐｇ／ｍＬ未満である、請求項８に記載の方法。
10. 前記検出の限界が少なくとも０．５ｐｇ／ｍＬまで低値である、請求項８に記載の方法。
11. 前記検出の限界が少なくとも０．２ｐｇ／ｍＬまで低値である、請求項８に記載の方法。
12. 前記ＰＳＡレベルの測定が、さらに、
    前記試料を、非核酸のＰＳＡ結合実体と核酸マーカーとを含むコンジュゲートと接触させる工程
    を含む、請求項１〜１１いずれか１項に記載の方法。
13. 前立腺癌のサルベージ治療後の患者が初期段階の生化学的再発（ＥＳ−ＢＣＲ）または安定病態を有しているかどうかを検出する方法であって、
    ａ）サルベージ治療後の該患者から得られた２つ以上の試料を提供する工程；
    ｂ）０．５ｐｇ／ｍＬの検出の限界を有するＰＳＡに対する不均質なサンドイッチ形式のイムノアッセイを使用し、該試料中のＰＳＡレベルを測定する工程であって、該サンドイッチ形式のイムノアッセイが、シグナル生成のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる、工程；
    ｃ）該試料の該ＰＳＡレベルを用いてＰＳＡの値を決定する工程；
    を含み、
    該ＰＳＡの値がＰＳＡの指標を超えている場合はＥＳ−ＢＣＲが検出され、該ＰＳＡの値が該ＰＳＡの指標を超えていない場合は安定病態が検出され、該ＰＳＡの指標は、２．０ｐｇ／ｍＬ／月の［ＰＳＡ］の増加速度である、方法。
14. 前記核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートが、さらに、第１の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートと第２の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートを含み、該第２の核酸−抗ＰＳＡコンジュゲートが固相支持体に結合されている、請求項１〜１２いずれか１項に記載の方法。

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