JP2022535580A - 全ｌｎａオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ - Google Patents

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本報告は、完全にロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドのハイブリダイズに関するものである。本文書は、所与の時間間隔内で二本鎖を形成することができない、完全に相補的なｓｓ－オリゴヌクレオチドの対を用いたハイブリダイゼーション実験を示す。本報告は、そのような互換性のないオリゴヌクレオチド対を特定するための方法を提供する。別の態様では、本報告は、迅速な二本鎖形成が可能である相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対を提供する。本報告は、互換性のあるオリゴヌクレオチド対を特定及び選択する方法も提供する。更に別の態様では、本報告は、受容体ベースのアッセイ等の結合アッセイにおける結合パートナーとしての互換性オリゴヌクレオチド対の使用を提供する。

Description

本報告は、完全にロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドのハイブリダイズに関するものである。本文書は、所与の時間間隔内で二本鎖を形成することができない、完全に相補的なｓｓ－オリゴヌクレオチドの対を用いたハイブリダイゼーション実験を示す。本報告は、そのような互換性のないオリゴヌクレオチド対を特定するための方法を提供する。別の態様では、本報告は、迅速な二本鎖形成が可能である相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対を提供する。本報告は、互換性のあるオリゴヌクレオチド対を特定及び選択する方法も提供する。更に別の態様では、本報告は、結合アッセイ、例えばイムノアッセイにおける結合パートナーとしての互換性オリゴヌクレオチド対の使用を提供する。特定の実施形態では、互換性ＬＮＡオリゴヌクレオチド対が、サンプル中の分析物を検出又は定量するためのアッセイにおいて、分析物特異的捕捉分子を固定化するために用いられることについて検討する。
特に焦点を当てるのは、結合対の２個のパートナーの特定の相互作用と、分子認識によって、それらの最終的な相互連結が機能的な役割を果たす、一般的な生化学的用途である。非常に頻繁に、例えば、イムノアッセイでは、ビオチン：（ストレプト）アビジン結合対を使用して、分析物特異的捕捉受容体を固相に固定化する。本報告は、代替結合対を用いるイムノアッセイ等の用途を概念化し、説明し、詳述する。具体的には、ハイブリダイゼーションによって、二本鎖を形成することができる２個の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドからなる代替の結合対は、ビオチン：（ストレプト）アビジン結合対の技術的な代替を提供する。
本開示の焦点は、イムノアッセイの過程で、捕捉受容体が固相に係留される手段である。特に、本開示は、分析物を含むサンプルの存在下で分析物特異的捕捉受容体の固定化を容易にする、及び／又は複合体が形成された後に検出複合体を係留することができる、結合対に焦点を当てている。イムノアッセイにおける結合対は、特異的な技術的特徴を有することが必要である。まず、２つの結合パートナーの相互作用は特異的でなければならない。さらに、結合パートナーの接続を形成する動力学は速い速度を保証して、結合対の２つの別々のパートナーが相互作用させ、最終的に会合させ、すなわち互いに結合させなければならない。さらに、２個の結合パートナーの連結は、一度形成されると安定であることが望ましい。さらに、結合パートナーは、イムノアッセイに適用するために、分析物特異的受容体や固相表面等の他の分子との化学的抱合に適している必要がある。
イムノアッセイでは、受容体、及び通常検出される分析物も、特定の条件下でのみ立体構造及び機能を保持することを理解することが重要である。このような条件は、検討中の特定の受容体又は分析物によって異なる場合があるため、受容体分子又は分析物は、これらの条件からの限られた逸脱のみを許容する可能性がある。そのような条件は、ほんの数例を挙げると、約ｐＨ６～約ｐＨ８の範囲のｐＨを有する緩衝水溶液、一又は複数の溶解塩、一又は複数のヘルパー物質（例えば、安定剤、酸素スカベンジャー、防腐剤、洗浄剤から選択される）、総量約２００～約５００ｍｏｓｍ／ｋｇの溶質、特定の非水性溶媒等の変性化合物の非存在、ホルムアミド及びカオトロープ等のヘリックス不安定化剤、並びに０℃～４０℃の範囲の好ましい保存及び／又はアッセイ温度を含む。しかしながら、必須であるのは、アッセイされる分析物の変性を引き起こす可能性のある任意の成分及び／又は条件、又は特定のアッセイで使用される分析物特異的受容体である。
結合対の別々のパートナーは、抱合、特に捕捉分子すなわち受容体との抱合、及び固相表面との抱合に、互いに特異的に会合及び結合する能力を失うことなく、適している必要がある。イムノアッセイにおける抱合に関して、代替結合対の各別々の結合パートナーは、アッセイ条件下で機能的でなければならない。同じ理由が、分析物、担体材料、固相、及びアッセイの過程で存在する可能性のある他の物質又は化合物等、結合パートナーとの抱合に必要な他の全ての材料に当てはまるが、これらに限定されない。
相補的配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド、すなわち、ハイブリダイゼーションによって二本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチドは、高分子を連結するための、又は分子を固相に付着させるための結合対手段として以前に提案されてきた。欧州特許第０４８８１５２号は、抗体と固相を連結する核酸二本鎖によって分析物特異的捕捉抗体が固定化された固相を用いた不均一イムノアッセイを開示する。実施形態では、１個のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドが抗体に付着し、相補的なオリゴヌクレオチドが固相に付着し、それによって連結二本鎖を形成することが示されている。同様の開示は、文献欧州特許第０６９８７９２号、国際公開第１９９５／０２４６４９号、国際公開第１９９８／０２９７３６号、及び欧州特許第０９０５５１７号で提供される。国際公開第２０１３／１８８７５６号は、フローサイトメトリーの方法と、第１のオリゴヌクレオチドに結合した抗体、第１のオリゴヌクレオチドと同一の配列を有する第２のオリゴヌクレオチドに結合したオリゴスフェア、並びにラベルと第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドに相補的な第３の配列とを有するオリゴヌクレオチドプローブを含む組成物を開示している。特定の実施形態では、オリゴスフェアは磁性を有する。この文書は、標準化手順の参照としてオリゴスフェアの特定の使用を報告している。
ペプチド核酸（ＰＮＡ）やロック核酸（ＬＮＡ）等の修飾オリゴヌクレオチドは、主に生化学的用途の範囲で探索されてきた。ＬＮＡは、リボース部分の２’－酸素と４’－炭素の間にメチレンリンカーを有しており、その結果、糖がＣ３－エンド立体構造にロックされるため、「ロック核酸」という名前が付けられている。この化学修飾は、ＬＮＡモノマー含有オリゴヌクレオチドと相補的標的配列とのハイブリダイゼーションによる二本鎖形成を伴う用途において、ヌクレアーゼ耐性、並びにオリゴヌクレオチド標的に対するより高い親和性及びより高い特異性を与える。ＬＮＡモノマーは、２’－Ｏ、４’－Ｃ－メチレン－（Ｄ－リボフラノシル）ヌクレオシドモノマーとして提供される（Ｓｉｎｇｈ Ｓ．Ｋ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４（１９９８）４５５－４５６；Ｋｏｓｋｉｎ Ａ．Ａ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４（１９９８）３６０７－３６３０；Ｗｅｎｇｅｌ Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３２（１９９９）３０１－３１０）。さらに、国際公開第１９９８／３９３５２号は、ロック核酸（ＬＮＡ）構造を開示している。化学合成により、ＬＮＡヌクレオシド類似体モノマーのみからなる（「全ＬＮＡ」）一本鎖を合成することができる。
ＤＮＡ及びＬＮＡモノマーを含む混合ＤＮＡ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡにハイブリダイズされる場合に、熱安定性が大幅に向上する。実際、合成された他の高親和性核酸模倣物、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、及び２’－フルオロＮ３’－ホスホルアミデートと比較して、ＬＮＡは、並外れた結合親和性を示す。「ミキシマー（ｍｉｘｍｅｒ）」としても知られるＬＮＡ－ＤＮＡ混合オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度論は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｕ．らによって報告された（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５４（２００１）４８１－４８４）。それぞれが７個のＬＮＡモノマーからなる２個の相補的なｓｓ－オリゴヌクレオチドからの「全ロック（Ａｌｌ Ｌｏｃｋｅｄ）」核酸二本鎖の結晶構造がＥｉｃｈｅｒｔ Ａ．らによって報告された。（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８（２０１０）６７２９－６７３６）。
ほとんどの場合、一本鎖混合ＬＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＬＮＡ／ＤＮＡ及びＬＮＡ／ＲＮＡ、すなわちミキサー一本鎖）を分析した。これまでのところ、特にＫｏｓｈｋｉｎ Ａ．Ａ．ら（Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏ １２０（１９９８）１３２５２－１３２５３）及びＭｏｈｒｌｅ Ｂ．Ｐら（Ａｎａｌｙｓｔ １３０（２００５）１６３４－１６３８）によって、ＬＮＡモノマーのみから作られたハイブリダイズする一本鎖オリゴヌクレオチド（すなわち、「全ＬＮＡ」一本鎖オリゴヌクレオチド）の特性評価に関する報告はほとんどない。Ｅｚｅ Ｎ．Ａ．ら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １８（２０１７）１０８６－１０９６）は、ＤＮＡ／ＬＮＡミキシマーとＤＮＡプローブからの結合率が、１０５Ｍ－１ｓ－１未満であると報告している。これらの著者によると、溶液中のハイブリダイゼーション速度は、置換に利用可能なモノマーの３分の１を考慮すると、一又は複数のＤＮＡモノマーをＬＮＡモノマーで置換しても影響を受けないように思われる。Ｃｈｉｌｄｓ Ｊ．Ｌ．（ＰＮＡＳ ９９（２００２）１１０９１－１１０９６）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グループＩイントロンの自己スプライシングを濃度依存的に阻害できる全ＬＮＡオクタマー（ＴＡＣＣＴＴＴＣ）を報告している。オクタマーを標的ＲＮＡにアニーリングする目的で、オクタマーを６８℃の温度に加熱した後、３７℃に冷却した。アニーリングされたＬＮＡオリゴマーは、イントロンの三次構造を混乱させ、それによってその生物学的機能に影響を与えることがわかった。
国際公開第２０００／０６６６０４号及び国際公開第２０００／０５６７４６号は、ＬＮＡヌクレオシドモノマーの特定の立体異性体を開示している。
国際公開第１９９９／１４２２６号は、目的の分子及び固体支持体に付着するための親和性対の構築において、ＬＮＡモノマーと共にオリゴヌクレオチドを使用することを示唆している。しかしながら、相補的な全ＬＮＡ一本鎖のハイブリダイゼーションが技術的問題を引き起こすことも当技術分野で知られている。Ｊｅｓｐｅｒ Ｗｅｎｇｅｌによって作成され、Ｅｘｉｑｏｎによって発行されたＬＮＡ関連のユーザーマニュアルは、自己ハイブリダイゼーションとも呼ばれる、分子内ＬＮＡ：ＬＮＡ二本鎖を形成する一本鎖ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの傾向に言及ししている。したがって、この文書では、二次構造を用途を制限するもの、すなわち技術的な障害と見なしている（’’ＬＮＡ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ’’ ｉｎ：’’Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭ：Ａ ｂｒｉｅｆ ｏｖｅｒｖｉｅｗ’’、２０１９年５月８日にインターネットダウンロードで電子ファイルｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／ｌｓ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｌｏｃｋｅｄ％２０Ｎｕｃｌｅｉｃ％２０Ａｃｉｄ％２０Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ％２０ａ％２０ｂｒｉｅｆ％２０ｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｐｄｆとして取得）。したがって、ＬＮＡのみからなるオリゴヌクレオチド類縁体のハイブリダイゼーションの熱力学的分析は主に経験的であり、事前の変性工程（例えば、分子内二次構造を除去するためのハイブリダイゼーションの前の加熱）がない場合の相補的全ＬＮＡオリゴマーのハイブリダイズ対の配列予測はこれまでのところ、可能ではないように思われる。
ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドの熱力学的挙動に関する予測は、Ｔｏｌｓｔｒｕｐ Ｎらによって参照される専用のコンピュータープログラムによって支援される（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（２００３）３７５８－３７６２）。ただし、この報告では、実験データが不足しているのではなく、これらＬＮＡオリゴヌクレオチドの特性がより複雑であるため、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの予測誤差がより高いことに明示的に言及する。さらに、開示されるアルゴリズムは、全てのＬＮＡオリゴヌクレオチドの相補的対の設計におけるガイダンスを提供するとは考えられない。同じ結論は、ＤＮＡ／ＬＮＡミキサーオリゴヌクレオチドにおけるＬＮＡ：ＬＮＡ塩基対の分子熱力学について報告しているより最近の出版物（Ｆａｋｈｆａｋｈ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ６１（２０１５）２７１１－２７３１から導くことができる。
具体的には、この報告は、ＬＮＡモノマーのみからなる相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが、ワトソン－クリック塩基対合を有する二本鎖分子を形成するそれらの能力に関して実際に予測できない可能性があることを示している。したがって、そのような分子認識を特異的に使用する用途において、ビオチン：（ストレプト）アブジン結合対の技術的に適した代替物を提供するために、代替の結合対を選択及び提供するための技術的手段が必要であり、本報告の目的のために、そのような結合対は、ＬＮＡモノマーのみを含む相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドからなることが望まれ、
－ オリゴヌクレオチド対は相補的配列を含まなければならず、相補的配列は二本鎖形成及びワトソン－クリック塩基対形成が可能でなければならない。
－ 分子認識における保存及び日常的な生化学的用途の条件下では、オリゴヌクレオチド対は、或る用途で結合対を実際に使用する前にいかなる変性処理を必要としてはならず、これは、結合対の各オリゴヌクレオチドが、その結合パートナー、すなわち相補的オリゴヌクレオチド又はその中の相補的配列と整列し、二本鎖を形成する各オリゴヌクレオチドの能力を実質的に低下させ得る分子内又は分子間に形成されたあらゆる二次構造を含んではならないという技術的要件を意味する。
－ 日常的な生化学的用途の条件下では、一本鎖対は、分子認識において十分な特異性を同時に確保しながら、ワトソン－クリック対合されたオリゴヌクレオチドの二本鎖を十分に迅速に形成できなければならない。
－ 相補的オリゴヌクレオチドの対によって形成される二本鎖は、十分に安定であり、好ましくは、結合対の分子認識を使用する所与の生化学的用途の過程で不可逆的に形成されることが望ましい。
したがって、本報告の一般的な目的は、事前の変性工程なしにハイブリダイズすることができ、それにより、適切なアッセイ条件下での分析物検出アッセイにおける結合対としてワトソン－クリック塩基対合で二本鎖分子を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対の同定及び提供である。言い換えると、非変性条件下で、より具体的には、分析物検出アッセイ（イムノアッセイ等であるが、これに限定されない）における分析物特異的受容体の機能と互換性のある条件下で、二本鎖形成が可能な結合対を探求する。重要なことに、相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び二本鎖形成を阻害する可能性のある分子間又は分子内二次構造を形成することなく、周囲条件下で保存できるか、更には冷蔵することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドが求められている。また、周囲温度（例えば、室温）の水溶液中等のアッセイ条件下で、事前の変性なしに互いにハイブリダイズすることができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドが求められている。変性の非存在ということは、具体的には、分析物検出アッセイで結合対として使用される相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び二本鎖形成を阻害する可能性のある任意の分子間又は分子内二次構造を除去する断続的な工程を意味する。
本開示は、本明細書に開示される全ての他の態様及び実施形態に関する第１の態様において、予想外に、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であって、各オリゴヌクレオチドは５～１５個のＬＮＡモノマーからなり、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で、水溶液中で互いに逆平行二本鎖を形成することができる、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対を提供する。本報告は更に、第１の態様の別の実施形態を開示し、該実施形態は、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であって、各オリゴヌクレオチドは５～１５個のＬＮＡモノマーからなり、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で、水溶液中で５～１５個の連続した塩基対を含む逆平行二本鎖を互いに形成することができる、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対である。本報告は更に、第１の態様の別の実施形態を開示し、該実施形態は、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であって、各オリゴヌクレオチドは５～１５個のＬＮＡモノマーからなり、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で、水溶液中で５～７個の連続した塩基対を含む逆平行二本鎖を互いに形成することができる、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対である。本報告は更に、第１の態様の更に別の実施形態を開示し、該実施形態は、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であって、各オリゴヌクレオチドは５～７個のＬＮＡモノマーからなり、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で、水溶液中で５～７個の連続した塩基対を含む逆平行二本鎖を互いに形成することができる、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対である。
本開示は、本明細書に開示される全ての他の態様及び実施形態に関する第２の態様において、０℃～４０℃の温度の水溶液中で５～１５個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する方法を提供し、該方法は、
（ａ）５～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）５～１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、相補性により、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに逆平行二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は５～１５個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されている、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドとを別々に合成する工程、を含み、
それにより、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する。
本開示は、本明細書に開示される全ての他の態様及び実施形態に関する第２の態様において、水性溶媒と、第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合対とを含む液体組成物であって、
各オリゴヌクレオチドは、５～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなり、各モノマーは核酸塩基を含み、モノマーの核酸塩基は第１のオリゴヌクレオチドの第１の核酸塩基配列及び第２のオリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、
第１の核酸塩基配列及び第２の核酸塩基配列は、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、０℃～４０℃の温度で５～１５個の連続するワトソン－クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができるように選択され、
上記結合対は、本明細書に開示される第１の態様による方法によって得られる組成物を提供する。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、発明を限定することを意図するものではない。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つ又は、２つ以上（即ち、少なくとも１つ）指すために使用される。例として、「１つのアイテム」は、１つのアイテム（１つの単一のアイテム）又は２つ以上のアイテム（複数のアイテム）を意味する。「ａ」が２つのメンバーの対の一部であるメンバーに関する場合、「ａ」は対の１つのメンバー、又は複数の両方のメンバー、すなわち対の１つのメンバー又は２つのメンバー全体を示す。
本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び／又は「有する（ｈａｖｅ）」という用語は、記載された特徴、項目、工程、操作、要素、及び／又は成分の存在を指定するが、少なくとも１つ他の特徴、項目、工程、捜査、要素、成分、及び／又はそれらのグループの存在又は追加を排除するものではないことが更に理解される。同様に、「有する（ｗｉｔｈ）」は、記載された特徴等の存在も指定する。
本明細書で使用される場合、「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する、備える（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する、備える（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語、又はそれらの任意の他の変形は、非排他的包含を含むことを意図している。例えば、特徴のリストを含むプロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの特徴のみに限定されず、明示的に列挙されていない、又はそのようなプロセス、方法、物品、又は装置に固有の他の特徴を含むことができる。対照的に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、又はそれらの任意の他の変形は、特徴の排他的リストを指定する。特に、所与の特徴の排他的リストは、これらの特徴の非排他的リストの特定の実施形態を表すものとして理解される。
本明細書で使用される場合、反対のことが明示的に述べられていない限り、「又は」は、排他的論理和ではなく包括的論理和を指す。例えば、条件Ａ又はＢは、以下のいずれか１つによって満たされる。Ａが真（又は存在）かつ、Ｂが偽（又は非存在）であり、Ａが偽（又は非存在）かつＢが真（又は存在）であり、ＡとＢが両方とも真（又は存在）である。
本明細書で使用される場合、「実質的に」、「相対的に」、「一般的に」、「通常」、「約」及び「およそ」は、そのように修飾された特性からの許容可能な変動を示すことを意図した相対的な修飾語である。それらは、それが修飾する絶対値又は特性に限定されることを意図するものではなく、むしろそのような物理的又は機能的特性に近づくか、又は近似することを意図している。別段の記載がない限り、数値ｎ（「約ｎ」）と組み合わせた「約」という用語は、値の数値±５％によって与えられる区間内の値ｘ、すなわちｎ－０．０５＊ｎ≦ｘ≦ｎ＋０．０５＊ｎを示すことが理解される。数値ｎと組み合わせた「約」という用語が本発明の実施形態を説明する場合、他に指示がない限り、ｎの値が最も好ましい。
この詳細な説明において、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、又は「実施形態では（ｉｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」への言及は、言及されている特徴が、本開示によるその全ての態様に関して本技術の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。更に、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、又は「実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」への個々の言及は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。しかしながら、そのような実施形態は、特に明記しない限り、及び当業者に容易に明らかになることを除いて、相互に排他的ではない。したがって、本開示によるその全ての態様における技術は、本明細書に記載の実施形態の任意の様々な組み合わせ及び／又は統合が包含され得る。
本明細書で使用される「固相」という用語は、分子を捕捉するために当業者によって通常使用される固体、半固体、ゲル、フィルム、膜、メッシュ、フェルト、複合材料、粒子、紙、及び分子を分離する等を含む多種多様な材料を指す。固相は、非多孔性又は多孔性であり得る。適切な固相としては、固相結合アッセイにおいて固相として開発及び／又は使用されるものが挙げられる。例えば、参照することで組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｎｉａｎｄｉｓ ａｎｄ Ｔ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６の第９章を参照されたい。適切な固相の例としては、メンブレンフィルタ、セルロースベースの紙、ビーズ（ポリマー、ラテックス、及び常磁性粒子を含む）、ガラス、シリコンウェーハ、微粒子、ナノ粒子、ＴｅｎｔａＧｅｌｓ、ＡｇｒｏＧｅｌｓ、ＰＥＧＡゲル、ＳＰＯＣＣゲル、マルチウェルプレートが挙げられる。例えば、Ｌｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：２９９７，１９９８；Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０：１６５，２００１；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｍｅｄ．１：３２６，１９９９；Ｏｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４２：５１５，２００１；Ｐａｐａｎｉｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：２１７６，２００１；Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：２９９７，２００１を参照されたい。
上記のような固相の表面は、例えば、ブロモアセチル化、シリル化、硝酸を使用するアミノ基の付加、及び中間タンパク質、デンドリマー及び／又は星型ポリマーの付着によって、結合部位を提供するように修飾され得る。このリストは限定することを意味するものではなく、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。
粒子ベースの分析物特異的結合アッセイは、例えば、特定の比濁分析アッセイ、特定のラテックス凝集分析、及び多種多様な標識又は検出技術を採用した多くの高感度サンドイッチタイプ分析で広く使用されている。
粒子は固相の実施形態である。本明細書で使用される「粒子」は、体積、質量、又は平均サイズ等の物理的特性に帰することができる小さな局所的な物体を意味する。したがって、微粒子は、対称的、球状、本質的に球状若しくは球形であるか、又は不規則で非対称な形状若しくは形態であり得る。本発明によって想定される粒子のサイズは変動し得る。一実施形態では、使用されるのは球状の形状であり、例えば、ナノメートル及びマイクロメートルの範囲の直径を持つ微粒子である。一実施形態では、本開示による方法で使用される微粒子は、５０ナノメートル～２０マイクロメートルの直径を有する。更なる実施形態では、微粒子は、１００ｎｍ～１０μｍの間の直径を有する。一実施形態では、本開示による方法で使用される微粒子は、２００ｎｍ～５μｍ又は７５０ｎｍ～５μｍの直径を有する。
上記で本明細書で定義される微粒子は、当業者に知られている任意の適切な材料を含むか、又はそれからなり得、例えば、それらは、無機若しくは有機材料を含むか、又はそれからなるか、又は本質的にそれからなり得る。通常、それらは、金属若しくは金属の合金、又は有機材料を含むか、又はそれからなるか、又は本質的にそれからなり得、或いは炭水化物元素を含むか、又はそれからなるか、又は本質的にそれからなり得る。微粒子の想定される材料の例としては、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ、及び強磁性金属、合金、又は組成材料（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）が挙げられる。一実施形態では、微粒子は、磁性若しくは強磁性の金属、合金、又は組成物である。更なる実施形態では、材料は、特定の特性を有し得て、例えば疎水性又は親水性であり得る。このような微粒子は通常、水溶液に分散し、小さな負の表面電荷を保持して、微粒子を分離し、非特異的なクラスター化を回避する。
本発明の一実施形態では、微粒子は常磁性微粒子であり、本開示による測定方法におけるそのような粒子の分離は、磁力によって促進される。常磁性又は磁性粒子を溶液／懸濁液から引き出し、溶液／懸濁液の液体を除去して、それらを所望の通り保持しながら、溶液／懸濁液の液体を除去することができ、粒子を、例えば、洗浄することができるように磁力が適用される。本発明による方法で使用される微粒子は、特異的結合対の第１のメンバーでコーティングされている。
一般に、「受容体」という用語は、標的分子の特定の空間的及び極性組織、すなわち分析物のエピトープ部位を認識することができる任意の化合物又は組成物を意味する。したがって、本明細書で言及される「分析物特異的受容体」という用語は、分析物に結合するか又は複合体を形成することができる分析物特異的反応物を含む。これには、抗体、特にモノクローナル抗体又は抗体フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。このような受容体は、例えば分析物を固定するための分析物のキャッチャーとして機能することができる。抗体によって認識されるエピトープが結合し、続いて分析物の別のエピトープに特異的な標識抗体が結合する。他の受容体は当業者に知られている。受容体ベースのアッセイにおける様々な受容体の特定の使用は、本開示を参照して当業者によって理解されるであろう。
「分析物」は、分析物特異的受容体によって結合され得る任意の分子であり得る。一実施形態では、本開示の文脈内での分析物は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）分子、ペプチド、タンパク質、薬物分子、ホルモン又はビタミンである。一実施形態では、本開示の文脈内での分析物は、ペプチド、タンパク質、薬物分子、ホルモン又はビタミンである。別の実施形態では、分析物は、分析物の異なる遺伝子型、アイソザイム、アイソフォーム、血清型、又は突然変異体であるいくつかの変異体を含む。一実施形態では、分析物は感染性病原体の抗原である。感染性病原体の例は、ヒトに感染するウイルス、細菌、原生動物の病原体である。一実施形態では、分析物はウイルス抗原であり、一実施形態では、肝炎ウイルス抗原又はヒトレトロウイルス抗原である。一実施形態では、分析物は、Ｃ型肝炎ウイルス又はＢ型肝炎ウイルス又はＨＩＶ抗原である。
本開示の文脈では、「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン分子、具体的には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＧ、並びにＦａｂフラグメント又はＶＬ－、ＶＨ－又はＣＤＲ領域に関する。さらに、この用語は、キメラ抗体及びヒト化抗体のような修飾及び／又は改変された抗体に関する。この用語はまた、修飾又は改変されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、並びに組換え又は合成的に生成／合成された抗体に関する。この用語はまた、無傷の抗体、並びに分離された軽鎖及び重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗体フラグメント／その部分に関する。「抗体」という用語はまた、抗体誘導体、二機能性抗体、及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖ又は抗体融合タンパク質のような抗体構築物を含む。
「検出可能な標識」には、検出可能であるか、又は検出可能にすることができる部分が含まれる。当業者は、標識を、物理的活性化（又は励起）又は化学試薬と組み合わせて検出可能なシグナルを提供することができ、特定のシグナルが減少又は増加するように修飾することができる化合物又は組成物として知しっている。
検出可能な標識の特定の実施形態には、分析測定のために電気化学発光（ＥＣＬ）を利用する多くの市販の機器によって検出可能な標識が含まれる。ＥＣＬを放出するように誘導できる種（ＥＣＬ活性種）がＥＣＬ標識として使用される。ＥＣＬ標識の例としては、ｉ）金属が、例えば、Ｒｕ含有及びＯｓ含有のトリス－ビピリジル－ルテニウム（ＲｕＢｐｙ）部分等の有機金属化合物を含む、第ＶＩＩＩ族の貴金属に由来する有機金属化合物、並びにｉｉ）ルミノール及び関連化合物が挙げられる。ＥＣＬプロセスでＥＣＬ標識に関与する種は、本明細書ではＥＣＬ共反応物と呼ばれる。一般的に使用される共反応物としては、ＲｕＢｐｙからのＥＣＬ用の第三級アミン（例えば、米国特許第５，８４６，４８５号を参照されたい）、シュウ酸塩、及び過硫酸塩、並びにルミノールからのＥＣＬ用の過酸化水素（例えば、米国特許第５，２４０，８６３号を参照されたい）が挙げられる。ＥＣＬ標識によって生成された光を、診断手順のレポーターシグナルとして使用することができる（Ｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２３８，８０８号）。例えば、ＥＣＬ標識は、抗体、核酸プローブ、受容体又はリガンド等の結合試薬に共有結合させることができ、結合相互作用への結合試薬の関与は、ＥＣＬ標識から放出されたＥＣＬを測定することによってモニターすることができる。或いは、ＥＣＬ活性化合物からのＥＣＬシグナルは、化学的環境を示し得る（例えば、ＥＣＬ共反応物の形成又は破壊をモニターするＥＣＬアッセイを記載している米国特許第５，６４１，６２３号を参照されたい）。ＥＣＬ、ＥＣＬ標識、ＥＣＬアッセイ、及びＥＣＬアッセイを実施するための機器の詳細については、米国特許第５，０９３，２６８号、米国特許第５，１４７，８０６号、米国特許第５，３２４，４５７号、米国特許第５，５９１，５８１号、米国特許第５，５９７，９１０号、米国特許第５，６４１，６２３号、米国特許第５，６４３，７１３号、米国特許第５，６７９，５１９号、米国特許第５，７０５，４０２号、米国特許第５，８４６，４８５号、米国特許第５，８６６，４３４号、米国特許第５，７８６，１４１号、米国特許第５，７３１，１４７号、米国特許第６，０６６，４４８号、米国特許第６，１３６，２６８号、米国特許第５，７７６，６７２号、米国特許第５，３０８，７５４号、米国特許第５，２４０，８６３号、米国特許第６，２０７，３６９及び米国特許第５，５８９，１３６号、並びに国際公開第９９／６３３４７号、国際公開第００／０３２３３号、国際公開第９９／５８９６２号、国際公開第９９／３２６６２号、国際公開第９９／１４５９９号、国際公開第９８／１２５３９号、国際公開第９７／３６９３１及び国際公開第９８／５７１５４号を参照されたい。
生化学の分野における一般的な知識に沿って、「結合対」は、２つの異なるパートナーのセット、すなわち、第１のパートナー若しくはパートナーの種若しくはパートナー種及び第２のパートナー若しくはパートナーの種若しくはパートナー種、又は上記対の第１のメンバー及び第２のメンバー、又は第１の種及び第２の種であると理解される。非変性条件下では、パートナーは分子レベルで他の種のパートナーを特異的に認識することができる。認識されると、結合対のパートナーは、第１のパートナーと第２のパートナーを接続する安定した非共有分子間結合を形成する。結合対を作成するためにパートナー種を選択するときは、各パートナーが同じ種の別のパートナーと結合を形成しないことが重要である。つまり、２つの第１のパートナー又は２つの第２のパートナーの間に安定した分子内結合が形成されるべきではない。
この文書全体を通して、結合対の第１のメンバーと第２のメンバーとの間の句読点（「：」）は、結合対の第１のメンバーと第２のメンバーとの特定の結合、又はそのような特定の結合を形成する能力を示すために使用することができ、したがって「メンバー１：メンバー２」で表される。通常、第１のメンバー及び第２のメンバーは異なる種に属し、すなわち、第１のメンバー及び第２のメンバーは同一の化合物ではない。したがって、文脈に応じて、「メンバー１：メンバー２」は、メンバー１とメンバー２とが結合対を形成することができ、メンバー１がメンバー２を特異的に認識して結合することができることを意味し得る。又は、文脈に応じて、「メンバー１：メンバー２」は、メンバー１とメンバー２とが結合した対であることを意味し得る。また、特に記載のない限り、メンバーは、単離された化合物としてのメンバーだけでなく、別の実体に結合している、例えば別の実体の部分を形成しているメンバーも含むことが理解される。例として、「（ストレプト）アビジン：ビオチン」（「ビオチン：（ストレプト）アビジン」）結合対は、当業者に完全に公知である。一方ではビオチン又はビオチン部分、他方では（ストレプト）アビジン又は別の構造に結合した（ストレプト）アビジンは、この例示的な結合対の２つのメンバーを表す。
一本鎖の「核酸」は、ヌクレオチドの単量体単位で構成されるポリマーである。核酸を構成する各ヌクレオチドは、リン酸、糖、及び核酸塩基で構成されている。核酸のヌクレオチド鎖は、３’，５’ホスホジエステル結合によって連結されている。これは、１つのヌクレオチドの５’－ホスホル基が隣接するヌクレオチドの３’－ヒドロキシルとエステル化されていることを意味する。
一本鎖「オリゴヌクレオチド」は、通常、ある糖分子の３’炭素原子と別の糖分子の５’炭素原子との間のホスホジエステル結合によって接続された最大約１５ヌクレオチドのモノマーからなる短い核酸である。オリゴヌクレオチドに含まれるモノマー（一般的な意味で）は、天然に存在するモノマーだけでなく、ヌクレオチド類縁体とも呼ばれる非天然に存在するモノマーでもあり得る。非限定的な方法では、例示的な類縁体は、リボース又はデオキシリボース以外の糖部分、特に、糖の環が２’－Ｏ原子と４’－Ｃ原子を接続するメチレン架橋によって「ロック」されているリボースを含む。本開示の目的のため、ヌクレオチドという用語は、オリゴヌクレオチド中のモノマーとして天然及び非天然に存在するヌクレオチドを包含する。したがって、この定義によるオリゴヌクレオチドは、天然又は非天然に存在するモノマーのみから構成することができ、又はそれらの混合物から構成することができる。さらに、異なるクラスの非天然モノマー（例えば、ＰＮＡ、Ｄ－ＬＮＡ、Ｌ－ＬＮＡ、ホモＤＮＡ（ヘキソース糖を含む）、ＨＮＡ（ヘキシトール、ヘキシトール糖、ヘキシトール核酸を含む）、Ｌ－ＤＮＡ等）は、特に明記しない限り、オリゴヌクレオチドに含まれ得る。
非天然モノマーは、それ自体が天然に存在する核酸塩基又はその非天然に存在する類縁体であり得る核酸塩基を含み得る。「核酸塩基」は、窒素含有不飽和炭化水素化合物であり、平面複素環部分を含む。天然に存在する核酸塩基は、プリン及びピリミジンの２つの主要な形態に分類することができる。プリンとピリミジンはどちらも複素環式芳香族化合物であるが、化学構造に基づいて区別することができる。プリンは２つの炭素環として発生するが、ピリミジンは１つの炭素環として発生する。プリンは、イミダゾール環に融合したピリミジン環を持つ。ピリミジンにはピリミジン環しかなく、プリンには４つの窒素原子があるが、ピリミジンには２つの窒素原子がある。核酸塩基は、通常５炭素リボース又はデオキシリボース、或いはそれらの誘導体（ロックリボース等）である糖部分に結合すると、ヌクレオシドを形成する。したがって、ヌクレオシドはグリコシルアミンであり、例えば、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジン、及びイノシンが挙げられる。これらの例では、５炭素糖のアノマー炭素は、グリコシド結合を介してプリンのＮ９又はピリミジンのＮ１に結合している。
ヌクレオシドは、リン酸部分又はその誘導体若しくは機能的類縁体を更に含むヌクレオチドの成分である。ヌクレオチドは一本鎖核酸の単量体単位である。ＤＮＡのような二本鎖核酸では、核酸塩基は対になっている。相補的な２つの核酸塩基は水素結合によって接続されている。
「核酸塩基」という用語は、標準的及び非標準的な天然に存在する核酸塩基及びそれらの類縁体を含む。天然に存在しない多数の核酸塩基が知られている。本開示の目的のため、これらの核酸塩基類縁体は具体的には実施形態と見なされ、第１のオリゴヌクレオチド鎖の一部である核酸塩基類縁体は、第２のオリゴヌクレオチド鎖において別の隣接する核酸塩基と一又は複数の水素結合を形成することができ、２つのオリゴヌクレオチド鎖は、対になって二本鎖、具体的には逆平行二本鎖を形成する。通常、二本鎖の塩基対の核酸塩基は平面配向にある。本開示の目的のため、核酸塩基の非限定的な編集物としては、Ｎ４－アセチルシトシン、５－アセチルウラシル、４－アミノ－６－クロロピリミジン、４－アミノ－５－フルオロ－２－メトキシピリミジン、６－アミノ－１－メチルウラシル、５－アミノオロチン酸、５－アミノウラシル、６－アミノウラシル、６－アザウラシル、Ｎ４－ベンゾイルシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、６－クロロウラシル、６－クロロメチルウラシル、６－クロロ－３－メチルウラシル、シトシン、５，６－ジメチルウラシル、５－エチルウラシル、５－エチニルウラシル、５－フルオロシトシン、５－フルオロオロチン酸、５－フルオロウラシル、５－ヨード－２，４－ジメトキシピリミジン、５－ヨードウラシル、イソシトシン、５－メチルシトシン、６－メチル－５－ニトロウラシル、２－メチルチオ－４－ピリミジノール、５－メチル－２－チオウラシル、６－メチル－２－チオウラシル、６－メチルウラシル、５－ニトロウラシル、オロチン酸、６－フェニル－２－チオウラシル、６－プロピル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、チミン、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、ウラシル、アデニン、８－アザヒポキサンチン、８－アザグアニン、アロプリノール、４－アミノピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、２－アミノプリン、２－アセトアミド－６－ヒドロキシプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２－アミノ－６－ヨードプリン、アザチオプリン、４－アミノ－６－ヒドロキシピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、アミノフィリン、Ｎ６－ベンジルアデニン、Ｎ６－ベンゾイルアデニン、６－ベンジルオキシプリン、８－ブロモテオフィリン、８－ブロモ－３－メチルキサンチン、８－ブロモ－７－（２－ブチン－１－イル）－３－メチルキサンチン、６－クロロプリン、８－クロロテオフィリン、６－クロロ－２－フルオロプリン、６－クロロ－７－デアザプリン、２－クロロアデニン、６－クロロ－７－ヨード－７－デアザプリン、２，６－ジアミノプリン、２，６－ジクロロプリン、６－（ジメチルアミノ）プリン、２，６－ジクロロ－７－デアザプリン、５，６－ジクロロベンズイミダゾール塩酸塩、７－デアザヒポキサンチン、２－フルオロアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、イソグアニン、３－ヨード－１Ｈ－ピラゾロ－［３，４－ｄ］ピリミジン－４－アミン、キネチン、６－メルカプトプリン、６－メトキシプリン、３－メチルキサンチン、１－メチルキサンチン、３－メチルアデニン、Ｏ６－（シクロヘキシルメチル）グアニン、６－チオグアニン、２－チオキサンチン、キサンチン、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニル－シチジン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニル－シトシン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－プロピニル－７－デアザアデニン、７－プロピニル－７－デアザグアニン、及びその誘導体からなる群から選択される化合物が挙げられる。
相補的な一本鎖オリゴ又はポリヌクレオチドは、二本鎖（「二本鎖」）核酸を形成することができる。二本鎖形成は、結合対の実施形態としての２つの少なくとも部分的に相補的な一本鎖核酸の配列特異的相互作用による、部分的又は完全に二本鎖（二本鎖）核酸（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＬＮＡ：ＤＮＡ、ＬＮＡ：ＬＮＡ等）の形成を示す「ハイブリダイゼーション」という用語でも知られている。相補的な一本鎖核酸の会合又は分離された（変性した）二本鎖の再生は、完全に相補的な鎖間のハイブリダイゼーションを説明するためにしばしば使用される。
「アニーリング」としても知られる水溶液中でのハイブリダイゼーションは、本開示の不可欠な部分である。ハイブリダイズしたオリゴ又はポリヌクレオチド（その類縁体を含む）の二本鎖分子に関して、当業者は、融解温度、ハイブリダイゼーション速度、並びに解離速度及び温度が相互に関連していることを理解している。
常識に沿って、「ワトソン－クリック塩基対」は、二本鎖核酸ヘリックス（二本鎖）内の単一の非共有結合架橋であり、二本鎖の各一本鎖はオリゴヌクレオチドである。したがって、二本鎖の例示的な実施形態では、２つのオリゴヌクレオチド鎖は、オリゴヌクレオチド骨格糖から内側に突出するプリン及びピリミジン塩基の対によって架橋され、水素結合によって結合されて、例えば、アデニンはチミンと対になり、シトシンはグアニンと対になる。上記と一致して、核酸塩基の対が相補的に相互作用し、それによって二本鎖核酸ヘリックス（二本鎖）に単一の非共有結合架橋を形成することができる限り、核酸塩基は天然に存在する核酸塩基又はその類縁体であり得る。
一本鎖核酸の二次構造モチーフが一般に意図されたハイブリダイゼーション反応を損なうことは一般的な知識である（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ Ｒ．Ｔ．＆Ｐｅｙｒｅｔ Ｎ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２９（２００５）３９３－３９７によって考察されている）。この知見は、一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含むｓｓ－オリゴヌクレオチドにも当てはまる。二次構造は、水素結合又は疎水性相互作用等の分子内相互作用によって駆動される、一本鎖分子の内部フォールディングによって生じる可能性がある。第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの特定の場合において、特定の折り畳まれた構造が熱力学的に有利になり得、折り畳まれた構造は、次に、相補的な第２のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列の妨害されない提示を妨げる。したがって、そのような構造を予測して回避するための努力が必要である。逆に、標的結合部位の二次構造もハイブリダイゼーションを損なう可能性がある。したがって、オリゴヌクレオチドからなる結合対の両方のパートナーの二次構造の評価が必要である。予測の根底にある不完全な経験的規則及びパラメーター、並びにフォールディングアルゴリズムが配列の長さに関してスケーリングが不十分であるという事実等、いくつかの課題がこの目標を混乱させる。
さらに、同じオリゴヌクレオチド種のメンバー、すなわち同一の核酸塩基配列を共有するオリゴヌクレオチドの間に、部分的に相補的であり得、それにより一又は複数の核酸塩基のワトソン－クリック塩基対合による分子間相互作用を潜在的に生じさせることができる一又は複数の部分が存在し得る。そうでなければ、非ワトソンクリック（例えばフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ））塩基対合による、又は他の形態の分子間相互作用によって分子間相互作用を引き起こす可能性がある配列内に１つ以上の部分が存在する可能性もある。分子内フォールディング（上記参照）の場合のように、第１の一本鎖オリゴヌクレオチドのメンバー間の分子内相互作用は、熱力学的に有利な構造をもたらす可能性があり、次いで、そのような構造は、相補的な第２のオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列の妨げのない提示を妨げる。
不要な分子間又は分子内構造が発生した場合、変性によってそれらを排除することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術分野でのｓｓ－オリゴヌクレオチドの使用から、アニーリング工程の前に通常は加熱工程があり、それによって加熱工程でオリゴヌクレオチドが変性する、すなわち分子内二次構造が破壊されることが知られている。加熱工程では、通常オリゴヌクレオチドと標的配列との間のアニーリングの適切な条件を提供することを目的とした、段階的で制御された温度低下が続く。しかしながら、ＰＣＲは、十分に熱安定性のある反応パートナー、例えば、オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオシド三リン酸、塩、緩衝液、及び熱安定性ポリメラーゼ酵素を含むプロセスである。しかしながら、オリゴヌクレオチドのアニーリングが役割を果たす可能性のある他のプロセスは、熱又は他の種類の変性処理を適用することを禁じており、そのようなプロセスには、不可逆的に分解する可能性のある変性感受性成分が含まれる可能性があるためである。これは特に（排他的ではないが）、抗体等のタンパク質性分析物特異的受容体が重要な機能的役割を果たす分析物検出アッセイの場合である。したがって、本開示及び驚くべき知見の報告は、熱の適用、具体的には６８℃を超える温度でのインキュベーション（Ｃｈｉｌｄｓ Ｊ．Ｌ．ＰＮＡＳ ９９（２００２）１１０９１－１１０９６のように）が不可能な技術的設定を具体的に扱う。実用上の理由から、イムノアッセイ等のほとんどのアッセイでは、４０℃を超える温度は望ましくない。すなわち、相補的なオリゴヌクレオチドからなる結合対を実際に使用する場合、特に望ましい条件は０℃～４０℃である。そして、これらの条件下では、任意の技術的応用は、オリゴヌクレオチド結合対の単離された結合パートナーに関しておそらく当てはまるであろう分子内又は分子間構造の影響を受けない必要がある。
オリゴヌクレオチドを含む核酸の変性のための他の選択肢は、ＤＮＡに関する報告から当業者に知られている。ＤＮＡ変性のいくつかの方法は当該技術分野で知られており、加熱、水中の０．０１ｍｏｌ／Ｌ超のＮａＯＨ（ｐＨ１２以上）に相当するアルカリ性条件下でのインキュベーション、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下でのインキュベーション、ホルムアミドの存在下でのインキュベーション、カオトロピック化合物の存在下でのインキュベーション、超音波処理の存在下でのインキュベーションを含む。そのような処理は、ｓｓ－ＤＮＡだけでなくｓｓ－ＬＮＡを作製及び／又は安定化するための条件を提供するだけでなく、それにもかかわらず、抗体等のタンパク質性分析物特異的受容体が重要な機能的役割を果たす分析物を検出するアッセイでは望ましくないことが明らかである。
したがって、本報告に提示される技術的アプローチの任意の態様及び実施形態では、一方では水溶液中の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの種の望ましくない分子内及び分子間構造を打ち消すことができるかもしれないが、他方では回避されるべき「変性条件」は、４０℃を超える温度の適用、６８℃を超える温度（熱）の適用、超音波処理の適用、水中０．０１ｍｏｌ／Ｌ超のＮａＯＨに相当するアルカリ性条件下でのインキュベーション、分子内及び分子間構造を破壊できる濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下でのインキュベーション、分子内及び分子間構造を破壊することができる濃度のホルムアミドの存在下でのインキュベーション、分子内及び分子間構造を破壊することができる濃度のカオトロピック化合物の存在下でのインキュベーション、及びこれらの混合からなる群から選択される。本報告の目的のため、変性条件が存在しない実施形態（非変性条件下での実施形態）は、４０℃を超える温度、６８℃を超える温度（熱）、超音波処理の適用、水中０．０１ ｍｏｌ／Ｌ超のＮａＯＨに相当するアルカリ性条件下でのインキュベーション、分子内及び分子間構造を破壊することができる濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下でのインキュベーション、分子内及び分子間構造を破壊することができる濃度のホルムアミドの存在下でのインキュベーション、分子内及び分子間構造を破壊することができる濃度のカオトロピック化合物の存在下でのインキュベーション、及びそれらの混合の適用の不在及び／又は欠如である。
具体的には、非変性条件下では、結合対の各パートナーは、他の種のパートナーとの結合を形成できなくなる状態にする分子内結合を全く形成しないことが望ましい。前に説明したように、例として、そのような望ましくない場合には、分子内フォールディング及びパートナー種における特定のフォールディングの安定化は、非変性条件下で、結合対の２つの異なる種の所望の分子内結合を阻害又は防止をするのに十分安定である二次構造をもたらすであろう。
５個以上のモノマーを含む全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、非変性条件を考慮して、具体的には本明細書に詳述される変性処理の適用を除外して、当業者が利用できる本ツールによって確実に予測できない特徴を有する。実用上の理由から、本研究は、変性条件の非存在下で、２つの別々の一本鎖種からハイブリダイズした二本鎖を形成することができるｓｓ－オリゴヌクレオチドを同定するために、最大１５個のＬＮＡモノマーからなるｓｓ－オリゴヌクレオチドに限定した。すなわち、結合対の各メンバーは、あらゆる分子間又は分子内構造を十分に欠いている必要がある。相補的な全ＬＮＡオリゴヌクレオチドに関してそのような場合を当然のことと見なすことはできないということは、本報告に示されている。
したがって、本開示は、本明細書に開示される全ての他の態様及び実施形態に関する第１の態様において、予想外に、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対を提供し、各オリゴヌクレオチドは、５～１５個のＬＮＡモノマーからなり、二本鎖形成前の変性条件の非存在下で、水溶液中の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、互いに逆平行二本鎖を形成することができる。信頼性が不確かな理論的及び／又はコンピュータにより実施されるモデルとは無関係に、そのような対は、次のような第２の態様の方法によって、予想外に識別及び提供される可能性がある。この報告の作成者の知る限り、このような方法はこれまでに示されておらず、提案もされていない。
したがって、本開示は、本明細書に開示される全ての他の態様及び実施形態に関する第２の態様において、０℃～４０℃の温度の水溶液中で５～１５個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する方法であって、
（ａ）５～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）５～１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、相補性により、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに逆平行二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は５～１５個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されている、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドとを別々に合成する工程、を含み、
それにより、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する。
実施形態では、具体的には、工程（ｃ）及び工程（ｄ）は、上記のように「変性条件」として指定された条件の非存在下で実施される。
この第２の態様の特定の実施形態、本明細書に開示される他の全ての態様及び実施形態に関連する特定の実施形態は、０℃～４０℃の温度で水溶液中で５～７個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択し提供する方法を提供し、該方法は、
（ａ）５～７個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）５～１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、相補性により、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は５～７個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されている、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドとを別々に合成する工程、を含み、
それにより、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する。
実施形態では、具体的には、工程（ｃ）及び工程（ｄ）は、上記のように「変性条件」として指定された条件の非存在下で実施される。
各一本鎖オリゴヌクレオチドはモノマーからなり、各モノマーはリボヌクレオシド類縁体であり、リボヌクレオシド類縁体のリボース部分において、メチレンが２’－酸素原子と４’－炭素原子を接続し、それによってリボースをＣ３－エンドコンフォメーションにロックする。本開示による全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、標準的な技術を使用して、単一のＬＮＡヌクレオシドの保護されたホスホルアミダイト等のビルディングブロックを使用して化学的に合成することができる。
各ＬＮＡモノマーは、核酸塩基を含み、核酸塩基は、カノニカル又は非カノニカルの天然に存在する核酸塩基及び天然に存在しない核酸塩基から選択される。実施形態では、ＬＮＡモノマーは、Ｎ４－アセチルシトシン、５－アセチルウラシル、４－アミノ－６－クロロピリミジン、４－アミノ－５－フルオロ－２－メトキシピリミジン、６－アミノ－１－メチルウラシル、５－アミノオロチン酸、５－アミノウラシル、６－アミノウラシル、６－アザウラシル、Ｎ４－ベンゾイルシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、６－クロロウラシル、６－クロロメチルウラシル、６－クロロ－３－メチルウラシル、シトシン、５，６－ジメチルウラシル、５－エチルウラシル、５－エチニルウラシル、５－フルオロシトシン、５－フルオロオロチン酸、５－フルオロウラシル、５－ヨード－２，４－ジメトキシピリミジン、５－ヨードウラシル、イソシトシン、５－メチルシトシン、６－メチル－５－ニトロウラシル、２－メチルチオ－４－ピリミジノール、５－メチル－２－チオウラシル、６－メチル－２－チオウラシル、６－メチルウラシル、５－ニトロウラシル、オロチン酸、６－フェニル－２－チオウラシル、６－プロピル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、チミン、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、ウラシル、アデニン、８－アザヒポキサンチン、８－アザグアニン、アロプリノール、４－アミノピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、２－アミノプリン、２－アセトアミド－６－ヒドロキシプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２－アミノ－６－ヨードプリン、アザチオプリン、４－アミノ－６－ヒドロキシピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、アミノフィリン、Ｎ６－ベンジルアデニン、Ｎ６－ベンゾイルアデニン、６－ベンジルオキシプリン、８－ブロモテオフィリン、８－ブロモ－３－メチルキサンチン、８－ブロモ－７－（２－ブチン－１－イル）－３－メチルキサンチン、６－クロロプリン、８－クロロテオフィリン、６－クロロ－２－フルオロプリン、６－クロロ－７－デアザプリン、２－クロロアデニン、６－クロロ－７－ヨード－７－デアザプリン、２，６－ジアミノプリン、２，６－ジクロロプリン、６－（ジメチルアミノ）プリン、２，６－ジクロロ－７－デアザプリン、５，６－ジクロロベンズイミダゾール塩酸塩、７－デアザヒポキサンチン、２－フルオロアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、９－（２－ヒドロキシエチル）アデニン、イソグアニン、３－ヨード－１Ｈ－ピラゾロ－［３，４－ｄ］ピリミジン－４－アミン、キネチン、６－メルカプトプリン、６－メトキシプリン、３－メチルキサンチン、１－メチルキサンチン、３－メチルアデニン、Ｏ６－（シクロヘキシルメチル）グアニン、６－チオグアニン、２－チオキサンチン、キサンチン、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニル－シチジン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－プロピニル－７－デアザアデニン、７－プロピニル－７－デアザグアニン、及びその誘導体からなる群から選択される核酸塩基を含む。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態による全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、いくつかのモノマーを含み得、その数は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４及び１５からなる群から選択される。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、８～１５個のモノマー（すなわち、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５個のモノマーから選択される数）からなる。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する別の実施形態では、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、９～１１個のモノマー（すなわち、９、１０及び１１個のモノマーから選択される数）からなり、また本明細書に開示される全ての態様及び実施形態のより特定の実施形態では、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、９個のモノマーからなる。
最初の実験では、第一に、結合パートナーに対する高い結合特異性、第二に、結合対の２つのパートナーがハイブリダイズして二本鎖を形成する好ましい速度、そして第三に、再び一本鎖に解離する実質的な検出可能な傾向を持たない安定した二本鎖の形成の組合せを提供するために、これらのオリゴサイズを使用した。驚くべきことに、７、６、更には５個の連続したＬＮＡモノマーからなる相補的核酸塩基配列を持つ全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの結合対であっても、十分な特異性、対合速度、及び二本鎖安定性の基準を満たすことができることがわかった。更に驚くべきことに、これらの基準は、限定されるものではないが、イムノアッセイ等の標的分析物の検出のためのアッセイにおける分子認識の手段として全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの結合対を使用するための前提条件である特定の周囲条件下で満たされた。したがって、本明細書に開示される他の全ての態様に関連する特定の実施形態は、０℃～４０℃の温度の水溶液中で５、６又は７個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供するための方法であって、該方法は、記載される特定の実施形態である。
本明細書に開示される全ての他の態様及び実施形態に関連する別の特定の実施形態は、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であり、各オリゴヌクレオチドは５～７個のＬＮＡモノマーからなり、水溶液中の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成前の変性条件の非存在下で互いに逆平行二本鎖を形成することができる。他の全ての態様に関連する別の実施形態は、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドに含まれる５、６、又は７個のＬＮＡモノマーの相補的核酸塩基配列を共有するｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であり、該結合対は、水溶液中、変性条件の非存在下で、全ＬＮＡ二本鎖を形成することができる。上で既に説明したように、変性条件の非存在下とは、ｓｓ－オリゴヌクレオチドのいずれも二本鎖形成の前に変性を受けておらず、結合対のメンバーが水溶液中で互いに接触した後のインキュベーションの変性処理部分でもないことを意味する。
より短いＬＮＡオリゴマーはさほど複雑ではなく、合成がより経済的であり、水溶液中での分子認識のための相補的結合パートナーの理想的な供給源を提供する。
この報告の全ての態様に関連する特定の実施形態では、結合対のメンバーは、全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドであり、全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、より大きな全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドのフラグメントであり、より大きなｓｓ－オリゴヌクレオチドは、本明細書で提供される第２の態様による、一本鎖全ＬＮＡの結合対を選択及び提供するための方法によって選択及び提供される結合対の１つのメンバー、パートナー又は種である。その特定の実施形態では、より大きなオリゴヌクレオチドは、８～１５個のＬＮＡモノマーを含み、フラグメントはより大きなフラグメントの隣接する核酸塩基部分配列を含み、該フラグメントは５～７個のＬＮＡモノマーを含む。したがって、或る実施形態における結合対は、それぞれが５、６又は７個のＬＮＡモノマーを含む第１の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドからなり、第１の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は相補的であり、それにより５、６又は７個の塩基対と逆平行二本鎖を形成することができ、結合対の各メンバーは、本明細書で提供される第２の態様による方法によって選択及び提供される、より大きな全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドのフラグメントである。特定の実施形態では、第１の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、それぞれ５個のモノマーからなる。別の特定の実施形態では、第１の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、それぞれ６個のモノマーからなる。更に別の特定の実施形態では、第１の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、それぞれ７個のモノマーからなる。
したがって、本開示は、本明細書に開示される特に第２の態様のみならず全ての他の態様及び実施形態に関する第３の態様において、０℃～４０℃の温度の水溶液中で５～７個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する方法であって、
（ａ）８～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）８～１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、相補性により、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに逆平行二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は８～１５個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されている、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）工程（ｆ）で選択された結合対のオリゴヌクレオチドから第１の隣接する核酸塩基部分配列を選択し、それにより、オリゴヌクレオチドのフラグメントを作製し、該フラグメントは５～７個のＬＮＡモノマーからなる、工程、
（ｈ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の他のオリゴヌクレオチドから第２の隣接する核酸塩基部分配列を選択し、第２の部分配列は、工程（ｇ）の第１の部分配列に相補的であり、それにより、他のオリゴヌクレオチドを作製し、該フラグメントは５～７個のＬＮＡモノマーからなる、工程、
（ｉ）工程（ｇ）のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントと工程（ｈ）のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントを別々に合成する工程、を含み、
それにより、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する。
実施形態では、具体的には、工程（ｃ）及び工程（ｄ）は、上記のように「変性条件」として指定された条件の非存在下で実施される。
選択したフラグメントは、０℃～４０℃の温度の水溶液中で逆平行二本鎖を形成できるという特性に関して容易に確認することができる。したがって、特定の実施形態では、該方法は、以下の追加の工程を含む。
（ｋ）（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメント及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメント及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントを混合する工程、
（ｌ）（ｋ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチドフラグメント及び第２のオリゴヌクレオチドフラグメントを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチドフラグメント及び第２のオリゴヌクレオチドフラグメントを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｍ）工程（ｌ）の二本鎖であるが、ｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントが検出可能に存在しない場合に、結合対を選択する工程。
本報告は、ビオチン及び（ストレプト）アビジン等の他の結合対を置き換えることができる結合対として一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。すなわち、本明細書の全ての態様及び実施形態に関連して、ＬＮＡモノマーからなり、上に提示された第２及び／又は第３の態様による方法によって得られる、ｓｓ－オリゴヌクレオチドの全ての結合対（そのフラグメントである結合対を含む）は、具体的には、非変性条件下で二本鎖形成が可能である。したがって、非変性条件下で提供され、任意に保存されるそのような各ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、非変性条件下でその結合パートナーとのハイブリダイゼーションが可能であり、非変性条件下でこの品質を保持する。
より具体的には、本開示の文脈における「変性条件」は、実施形態として、長さが２０塩基対で、１５℃以上で５０％のＧ＋Ｃ含量を有するＤＮＡ二本鎖の融解温度を低下させることができる変性剤の任意の存在又は添加を含む。
変性条件は、これらの化合物の必要な能力及び機能を維持するために、タンパク質性分析物特異的受容体を使用して標的分析物を検出するためのアッセイを実行しなければならない条件を除外する。すなわち、これらの化合物に必要な能力及び機能は、変性状態の存在下で失われる可能性がある。同時に、これらの非変性条件は、６８℃を超える温度、超音波処理の適用、水中０．０１ｍｏｌ／Ｌ超のＮａＯＨに相当するアルカリ性条件下でのインキュベーション、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下でのインキュベーション、ホルムアミドの存在下でのインキュベーション、カオトロピック化合物の存在下でのインキュベーション、及びこれらの混合のいずれかを除外し、一本鎖全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドが存在する場合に、これらの条件のいずれかが一本鎖全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの分子内及び分子間構造を破壊することができる程度に適用されると、分子内及び分子間構造は、オリゴヌクレオチドと相補的一本鎖全ＬＮＡｓｓ－オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション及び二本鎖形成を妨げる可能性がある。重要なことに、本報告によって教示される全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、そのような変性条件のいずれも必要とせず、単離された形態のオリゴヌクレオチドも、結合対としてのオリゴヌクレオチドも、すなわち、一方のメンバーが他方と接触している間も必要としない。
第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、同じサイズである必要はない、すなわち、同じ数のモノマーからなる必要はない。しかしながら、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを構成する同数のモノマーは、本明細書に開示される全ての態様及び実施形態にお関連する特定の実施形態である。
当業者に知られているように、２個のオリゴヌクレオチドは、互いに平行に走るが反対の配列で走る場合、逆平行である。具体的な例は、互いに並んで反対方向に走っている二本鎖の２本の相補鎖によって与えられる。結果として、二本鎖の各末端は、反対側の第２の鎖の３’末端に隣接する／整列する第１の鎖の５’末端を含む。ＤＮＡ及びＲＮＡと同様に、ＬＮＡはワトソン－クリック塩基対合を示す（Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２０（１９９８）１３２５２－１３２６０）。
相補的な反対の鎖上の水素結合形成塩基を含む特定のワトソン－クリック塩基対形成は、当業者によく知られており、当技術分野で広く公開されている特徴である。例として、標準的な塩基対であるアデニン：チミン、アデニン：ウラシル、及びシトシン：グアニンが挙げられる。他のワトソン－クリック塩基対としては、５－メチルシトシン：グアニン、５－ヒドロキシメチルシトシン：グアニン、７－デアザグアニン：シトシン、及び５－クロロウラシル：７－デアザアデニンが挙げられる。更に多くのことが当技術分野で知られている。
結合対の２つのメンバーを結合するには、一方を他方に接続する必要がある。接触工程に続いて、２つのメンバーは互いに相互作用して二本鎖を形成することができる。上で説明したように、この目的のために変性条件は必要ない。重要なことに、２つの異なる（すなわち、第１及び第２の）ｓｓ－オリゴヌクレオチドと接触した後（例えば、上に開示される第２の態様による工程（ｃ）を参照されたい）、本明細書で報告される方法の工程（ｄ）は、２０分以下の時間間隔でのインキュベーションを指定する。すなわち、二本鎖の形成は迅速であり、二本鎖を形成できる範囲で、このプロセスは２０分以内に実質的に完了する。この点に関して、本明細書に開示される全ての態様及び実施形態では、一本鎖全ＬＮＡ結合パートナー（オリゴヌクレオチド）は、特に分子認識及び結合に関して、ビオチン及び（ストレプト）アビジンに匹敵する条件下で互いに結合することができることに留意されたい。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する特定の実施形態では、二本鎖形成のための（すなわち、接触工程に続く）時間間隔は、１秒～２０分、１秒～１５分、１秒～１０分、１秒～５分、１秒～１分、１秒～３０秒、１秒～２０秒、１秒～１０秒、及び１秒～５秒からなる群から選択される。非常に望ましい有利な時間間隔は、１秒～１０秒、及び１秒～５秒から選択される。
重要なことに、工程（ｃ）の前に、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは変性処理を必要としないが、非変性条件下、特に非変性温度で、同時に保存又は保持して望ましくない結果を回避する。特に、本明細書で報告されているｓｓ－オリゴヌクレオチドは、存在しないとは言わないまでも、二次構造に安定して折りたたまれる傾向が非常に低く、相補的な全ＬＮＡオリゴヌクレオチドが二本鎖を形成する能力を妨げる可能性があることを特徴とする。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、－８０℃～４０℃で、具体的には０℃～４０ ℃、より具体的には２５℃～３７ ℃の温度で保たれる。５～１５個のモノマーを含む一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの非変性温度は、６８℃未満、より具体的には４０℃未満の温度である。
工程（ｃ）及び／又は工程（ｄ）で本明細書に開示される全ての（具体的には第２及び第３の）態様及び実施形態に関連する特定の実施形態では、温度は６８℃より低く、より具体的には、温度は４０℃より低く、更に具体的には、温度は０℃～３７℃である。第２又は第３の態様の方法では、工程（ｃ）において、温度は、工程（ｄ）における温度とは独立して選択され、逆もまた同様である。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する特定の実施形態では、工程（ｃ）及び工程（ｄ）の温度は５℃を超えて異ならないか、又は両工程は同じ温度で実施される。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する更により特定の実施形態では、工程（ｃ）及び／又は工程（ｄ）において、温度は２５℃～４０℃、更により具体的には２５℃～３７℃である。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する別の特定の実施形態では、工程（ｃ）の前に、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、－８０℃～４０℃で、具体的には０℃～４０℃、より具体的には２５℃～３７℃の温度で保たれる。
本明細書に開示される全ての（具体的には第２及び第３の）態様及び実施形態に関連する別の実施形態では、工程（ｃ）の前に、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、溶液のｐＨをｐＨ６～ｐＨ８、より具体的にはｐＨ６．５～ｐＨ７．５に維持する緩衝液を含む水溶液中に保管及び／又は保持される。
本明細書に開示される全ての（具体的には第２及び第３の）態様及び実施形態に関連する更に別の実施形態では、工程（ｃ）において、水溶液は、溶液のｐＨをｐＨ６～ｐＨ８、より具体的にはｐＨ６．５～ｐＨ７．５に維持する緩衝液を含む。本明細書に開示される全ての（具体的には第２及び第３の）態様及び実施形態に関連する別の実施形態では、工程（ｃ）において、水溶液は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ～５００ｍｍｏｌ／Ｌ、より具体的には、２００ｍｍｏｌ／Ｌ～３００ｍｍｏｌ／Ｌ、より具体的には、１０ｍｍｏｌ／Ｌ～１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より具体的には５０ｍｍｏｌ／Ｌ～２００ｍｍｏｌ／Ｌの溶解物質の総量を含む。
混合（工程（ｃ））及びインキュベーション（工程（ｄ））の工程中に適用される本明細書に記載の条件は、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドが保持される条件にも同様に適用される。したがって、実施形態では、工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれかの各ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、工程（ｃ）の前に変性条件の非存在下に保たれる。これには、工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれかの各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが、工程（ｃ）の前に変性条件の非存在下でプレインキュベートされる任意の実施形態が含まれる。実施形態では、工程（ｃ）の前に、工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれかの各ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、－８０℃～４０℃、具体的には０℃～４０℃、より具体的には２５℃～３７℃の温度で水溶液中に保持される。更なる実施形態では、工程（ｃ）の前に、工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれかの各ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、変性化合物の非存在下、具体的にはホルムアミド及びＤＭＳＯのいずれの非存在下でも水溶液中に保持される。
工程（ｄ）のインキュベーションは、２つの相補的な全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドが実際に互いに分子的に認識できるという条件で、二本鎖形成の条件を提供する。さらに、疑わしい結合対の一方又は両方の種内の分子間及び分子内構造について説明する。例えば、工程（ｃ）の前の１つの種の二次構造構造が存在する場合、工程（ｄ）の二本鎖形成が阻害される可能性がある。次の工程（ｅ）は、変性の非存在下で二本鎖形成が起こったかどうかを調べるために必要である。工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドの検出及び定量化を行う工程（ｅ）。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、工程（ｅ）が、工程（ｄ）のインキュベートされた混合物を、移動相として水性溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーに供することを含む。したがって、カラムクロマトグラフィーは、ｓｓ－オリゴヌクレオチドから別々の二本鎖分子を分離するために有利に使用することができる。ＨＰＬＣ等の適切なカラムクロマトグラフィー方法は、この点に関して当業者によく知られている。しかしながら、ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖を区別及び定量化することができる任意の代替方法も適切である。このような代替方法としては、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴；例えばＢｉａｃｏｒｅ）及び電気泳動が挙げられる。
工程（ｃ）の前に分子間及び分子内構造が一方又は両方のｓｓ－オリゴヌクレオチドに存在する場合（これは、水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合している）、二本鎖形成が阻害される。阻害が完了すると、工程（ｄ）（混合物をインキュベートしている）の後にｓｓ－オリゴヌクレオチドのみが検出可能に存在する。ただし、抑制は不完全な場合がある。したがって、分子間及び分子内構造の強度に応じて、これらは一時的に「アンフォールディング」を受ける可能性があり、つまり、特定の変化が、阻害された第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基を十分に露出させる。折りたたまれていない形態では、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、次に、相補的な第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドと二本鎖を形成することができる。アンフォールディングの同じ要件は、相補的な第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドにも当てはまる可能性がある。そのような場合、形成された二本鎖の量は、インキュベーション時間中のアンフォールディング事象の数、すなわち、工程（ｄ）で適用されたインキュベーション時間を反映している。理想的な場合では、工程（ｄ）に続いて、実質的にｓｓ－オリゴヌクレオチドはもはや検出可能に存在せず、二本鎖のみが検出可能である。
Ｋｄ値は、結合対の第１と第２のメンバー間の平衡解離定数である。この値は、結合対の結合パートナーの親和性を特徴付ける定量的測定値を提供する。平衡解離定数Ｋｄは、結合対の第１と第２のメンバー間のｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率である。Ｋｄと親和性は反比例の関係にある。Ｋｄ値は、分子的に相互作用して他のメンバーに結合するのにまだ十分なメンバーの濃度に関連し、Ｋｄ値が低い（濃度が低い）ほど、第１のメンバーと他のメンバーとの親和性が高くなる。実施形態では、本明細書の方法によって選択される結合パートナーであって、それぞれが互いに５～１５個のロック核酸モノマーからなる第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合パートナーの親和性Ｋｄは、
１×１０－１５Ｍ未満～１×１０－５Ｍ超である。更なる実施形態では、本明細書の方法によって選択される結合パートナーであって、それぞれが互いに５～１５個のロック核酸モノマーからなる第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合パートナーの親和性Ｋｄは、１×１０－１２Ｍ未満～１×１０－５Ｍ超である。更なる実施形態では、本明細書の方法によって選択される結合パートナーであって、それぞれが互いに８～１５個のロック核酸モノマーからなる第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合パートナーの親和性Ｋｄは、２×１０－１２Ｍ～１×１０－１５Ｍである。
更なる実施形態では、本明細書の方法によって選択される結合パートナーであって、それぞれが互いに５～７個のロック核酸モノマーからなる第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合パートナーの親和性Ｋｄは、１×１０－１２Ｍ～２×１０－５Ｍである。
特に、結合パートナーのＫｄは、結合対のＧ＋Ｃ含有量に大きく影響される。すなわち、所与の数の相補的塩基対との結合対の場合、一般に、結合パートナーの親和性は、Ｇ＋Ｃ含有量の増加と共に生じる。
天然に存在するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、ＬＮＡオリゴヌクレオチドからなる結合対の分子認識（すなわち、二本鎖形成）との干渉を排除するために、ＬＮＡモノマーの立体異性体が、全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの合成における構成要素として有利に使用される。このアプローチの理論的根拠は、ｓｓ－オリゴヌクレオチドが天然に存在するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと二本鎖を形成できないようにする、特に天然に存在するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとワトソン－クリック二本鎖を形成できないようにする立体異性モノマーを選択することである。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチド（及びそれらの任意のフラグメント）は、ベータ－Ｄ－ＬＮＡモノマーからなる。つまり、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドは完全にベータ－Ｄ－ＬＮＡモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは完全にベータ－Ｄ－ＬＮＡモノマーからなる。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する更に別の実施形態では、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチド（及びそれらの任意のフラグメント）は、ベータ－Ｌ－ＬＮＡモノマーからなる。つまり、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、完全にベータ－Ｌ－ＬＮＡモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは完全にベータ－Ｌ－ＬＮＡモノマーからなる。天然に存在する核酸の存在下で二本鎖形成が妨げられないため、ベータ－Ｌ－ＬＮＡの使用が有利であることが明らかになった。これに関して、現在、全Ｄ－ＬＮＡオリゴヌクレオチド対及び全Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチド対のハイブリダイゼーション条件に関する豊富な技術的経験はかなり限られていることに留意されたい。
本報告は、各オリゴヌクレオチドが５～１５個のＬＮＡモノマーからなる別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対を開示し、水溶液中の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成前又は二本鎖形成中に変性条件の非存在下で互いに逆平行二本鎖を形成することができる。本報告の教示は、便利かつ有利に、そのようなｓｓ－オリゴヌクレオチドを選択し提供することを可能にし、該モノマーはＬＮＡモノマーである。この報告の著者の知る限り、本明細書に記載の方法は、全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を予測する際に当技術分野で知られているアルゴリズムの限界を克服するための最初に成功したアプローチとなる。第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、逆平行配向の２つのｓｓ－オリゴヌクレオチドの対合が二本鎖を形成できるようにするため、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列と相補的である。
全ての他の態様及び実施形態に関連する実施形態では、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対が提供され、各オリゴヌクレオチドは５～１５個のＬＮＡモノマーからなり、水溶液中の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で互いに逆平行二本鎖を形成することができ、ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対は、０℃～４０℃の温度の水溶液中で、５～１５個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供するための方法を実施することによって取得可能であり、及び／又は得られ、該方法は、
（ａ）５～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）５～１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、相補性により、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに逆平行二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は５～１５個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されている、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドとを別々に合成する工程、を含み、
それにより、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する。
全ての他の態様及び実施形態に関連する実施形態では、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対が提供され、各オリゴヌクレオチドは５～７個のＬＮＡモノマーからなり、水溶液中の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で互いに逆平行二本鎖を形成することができ、ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対は、０℃～４０℃の温度の水溶液中で、５～７個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供するための方法を実施することによって取得可能であり、及び／又は得られ、該方法は、
（ａ）８～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）８～１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、相補性により、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに逆平行二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は８～１５個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されている、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）工程（ｆ）で選択された結合対のオリゴヌクレオチドから第１の隣接する核酸塩基部分配列を選択し、それにより、オリゴヌクレオチドのフラグメントを作製し、該フラグメントが５～７個のＬＮＡモノマーからなる、工程、
（ｈ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の他のオリゴヌクレオチドから第２の隣接する核酸塩基部分配列を選択し、第２の部分配列は、工程（ｇ）の第１の部分配列に相補的であり、それにより、他のオリゴヌクレオチドを作製し、該フラグメントは５～７個のＬＮＡモノマーからなる、工程、
（ｉ）工程（ｇ）のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントと工程（ｈ）のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントを別々に合成する工程、を含み、
それにより、５～７個の一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する。一実施形態では、具体的には、工程（ｃ）及び工程（ｄ）は、上記のように「変性条件」として指定された条件の非存在下で実施される。選択したフラグメントは、０℃～４０℃の温度の水溶液中で逆平行二本鎖を形成できるという特性に関して容易に確認することができる。したがって、特定の実施形態では、該方法は、以下の追加の工程を含む。
（ｋ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメント及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメント及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントを混合する工程、
（ｌ）（ｋ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチドフラグメント及び第２のオリゴヌクレオチドフラグメントを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチドフラグメント及び第２のオリゴヌクレオチドフラグメントを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｍ）工程（ｌ）の二本鎖であるが、ｓｓ－オリゴヌクレオチドフラグメントが検出可能に存在しない場合に、結合対を選択する工程。
各一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、４つの異なる核酸塩基を含むことができる。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、３個の異なる核酸塩基を含む。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する別の実施形態では、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、２個の異なる核酸塩基を含む。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する更に別の実施形態では、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、１個のみの異なる核酸塩基を含む。この後者の実施形態では、ｓｓ－オリゴヌクレオチド中の全ての核酸塩基は同じである。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基のＧ＋Ｃ含有量は、７５％未満である。特定の実施形態では、Ｇ＋Ｃ含有量は、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％から選択される値よりも低い。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する更に別の実施形態では、結合対における各ＬＮＡモノマーは、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、及び５－メチルシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む。より特定の実施形態では、各ｓｓ－オリゴヌクレオチド中の核酸塩基のうち、各シトシンは、５－メチルシトシンによって置換されている。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、２個の別々の適合性結合パートナーの結合対は、以下からなる群から選択される全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対である。
５’ｔｇｃｔｃｃｔｇ３’（配列番号１）及び５’ｃａｇｇａｇｃａ３’（配列番号２）、
５’ｔｇｃｔｃｃｔｇｔ３’（配列番号９）及び５’ａｃａｇｇａｇｃａ３’（配列番号１０）、
５’ｇｔｇｃｇｔｃｔ３’（配列番号１１）及び５’ａｇａｃｇｃａｃ３’（配列番号１２）、及び
５’ｇｔｔｇｇｔｇｔ３’（配列番号１３）及び５’ａｃａｃｃａａｃ３’（配列番号１４）。
特定の実施形態では、前述の群の任意の選択された対におけるｓｓ－オリゴヌクレオチドのモノマーは、いずれもベータ－Ｄ－ＬＮＡモノマーである。更に別の特定の実施形態では、前述の群の任意の選択された対におけるｓｓ－オリゴヌクレオチドのモノマーは、いずれもベータ－Ｌ－ＬＮＡモノマーである。
一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドのいくつかのそのような対が見出され、例示的な実施形態として、すなわち、非変性条件下でハイブリダイゼーション及び二本鎖形成によって互いに結合することができる別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対を示す非限定的な例として本明細書に報告される。表１に、その非限定的な編集を示す。記載される配列は、全てのＬＮＡヌクレオシド、すなわち、ＬＮＡモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを示すことが理解される。配列は、従来の方向、すなわち５’末端から３’末端に向かって与えられる。
Figure 2022535580000001
表１に示されている結合対は、特定の実施形態を反映している。結合対の「第１の」メンバー及び「第２の」メンバーへの任意の言及は、第２のメンバーが「第１の」メンバーに置き換えられられる場合である限り、「第２の」メンバーが等しく第１のメンバーと見なすことができるという点で恣意的であることが理解される。すなわち、表に示されている「第１」及び「第２」としての参照は任意であり、それらの表示方法は変更することができる。したがって、例示的に、結合対（配列番号１６）：（配列番号２０）は、（配列番号２０）：（配列番号１６）と同じである。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、２個の別々の互換性結合パートナーの結合対は、以下からなる群から選択される全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対である。
（配列番号１）：（配列番号２）、
（配列番号９）：（配列番号１０）、
（配列番号１１）：（配列番号１２）、
（配列番号１３）：（配列番号１４）、
（配列番号９）：（配列番号１５）、
（配列番号１６）：（配列番号２０）、
（配列番号２１）：（配列番号１８）、
（配列番号２１）：（配列番号２０）、
（配列番号２１）：（配列番号１９）、
（配列番号２３）：（配列番号１７）、
（配列番号２５）：（配列番号２８）。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、２個の別々の互換性結合パートナーの結合対は、配列番号１６及び配列番号２０の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対である。したがって、結合対はｇｔｔｇｇｔ：ａｃｃａａｃである。
特定の実施形態では、前述の群の任意の選択された対におけるｓｓ－オリゴヌクレオチドのモノマーは、ベータ－Ｄ－ＬＮＡモノマーである。更に別の特定の実施形態では、前述の群の任意の選択された対におけるｓｓ－オリゴヌクレオチドのモノマーは、ベータ－Ｌ－ＬＮＡモノマーである。
対照的に、非変性条件下では二本鎖形成ができないか、又は十分にできない一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対が見出された。表２に、その非限定的な編集を示す。
Figure 2022535580000002
配列番号２９及び配列番号３９によって与えられる対は、配列の複雑さが最小であり、結合対の１つのメンバーが４つのモノマーのみを含む場合を例示している。この特定の結合対を特徴付ける結合特性は不十分であることがわかった。考えられる解釈の１つは、４ｍｅｒが単純に短すぎるため、対応する一本鎖との分子内相互作用が不十分であるということである。この知見は、４ｍｅｒが６ｍｅｒに置き換えられた設定（配列番号２７と配列番号３９の組合せ）とは著しく対照的である。
表２に提示される全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの他の対に関して、配列「ｇｃｃｔｇａｃｇ」（配列番号３）を含むか又はそれからなる１つの結合パートナーが常に存在することがわかった。したがって、この特定の配列及びその相補は、そのような全てのＬＮＡオリゴヌクレオチドが非変性条件下で二本鎖を形成する能力に悪影響を与えるように思われる。この特に驚くべき知見は、実際に、当業者を、８モノマー以上を有する一本鎖の有利なオリゴヌクレオチド対を選択するように導くことができる。したがって、本明細書で提供される他の全ての態様の実施形態及び実施形態は、別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であり、各オリゴヌクレオチドは８～１５個のＬＮＡモノマーからなり、水溶液中の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で互いに逆平行二本鎖を形成することができ、ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対は、０℃～４０℃の温度の水溶液中で、８～１５個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供するための方法を実施することによって取得可能であり、及び／又は得られ、該方法は、
（ａ）８～１５個（すなわち、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５個のいずれかから選択された数）のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーは核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第１の核酸塩基配列を形成し、第１の核酸塩基配列は５’ｇｃｃｔｇａｃｇ３’（配列番号３）及び５’ｃｇｔｃａｇｇｃ３’（配列番号４）から選択される配列で構成されていない、又はそれを含まない、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）８～１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、相補性により、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は８～１５個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されており、第２の核酸塩基配列が５’ｇｃｃｔｇａｃｇ３’（配列番号３）及び５’ｃｇｔｃａｇｇｃ３’（配列番号４）から選択される配列で構成されていない又はそれを含まない、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドとを別々に合成する工程、を含み、
それにより、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する。
本明細書に開示される第２の態様の方法又は第３の態様の方法によって、また、表１に示される結合対を含むがこれらに限定されないその実施形態のいずれかを利用することによって、また代替的又は追加的に、一方又は両方のオリゴヌクレオチドのモノマーの数が８～１５個である場合に５’ｇｃｃｔｇａｃｇ ３’（配列番号３）及び５’ｃｇｔｃａｇｇｃ ３’（配列番号４）から選択される配列を除く結合対を選択することによって、本開示は、相補的一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの非変性対から、２５℃～４０℃の事前に選択された温度での非変性条件下で取得可能な及び／又は得られる、逆平行全ＬＮＡ二本鎖を提供する。水溶液中のそのような二本鎖は、本報告の第４の態様と見なすことができる。二本鎖の各オリゴヌクレオチド鎖は、ＬＮＡモノマーを含み、ＬＮＡモノマーの数は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５個からなる群から選択され、より具体的には、その数は５、６、及び７個からなる群が選択される。二本鎖は相補的なワトソン－クリック塩基対によって形成され、二本鎖の塩基対の数は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４及び１５個からなる群から選択される数であり、より具体的には、８～１５のいずれか、又は５～７のいずれかから選択されるいずれかの選択された数である。
本開示は、本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関する第５の態様において、水性溶媒及び第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合対を含む液体組成物を提供し、各オリゴヌクレオチドは、５～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなり、各モノマーは、第１のオリゴヌクレオチドの第１の核酸塩基配列及び第２のオリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成するモノマーの核酸塩基を含み、第１の核酸塩基配列及び第２の核酸塩基配列は、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、０℃～４０℃の温度で５～１５個の連続するワトソン－クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができ、結合対は本明細書に開示される第２又は第３の態様の方法に従う方法によって得られる。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する特定の実施形態では、水性溶媒及び第１の一本鎖オリゴヌクレオチド及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドからなる結合対を含む液体組成物を提供し、各オリゴヌクレオチドは、５～１５個、具体的には５～７個又は８～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなり、各モノマーは、第１のオリゴヌクレオチドの第１の核酸塩基配列及び第２のオリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成するモノマーの核酸塩基を含み、第１の核酸塩基配列及び第２の核酸塩基配列は、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、０℃～４０℃の温度で、５～１５個、具体的には５～７個又は８～１５個の連続するワトソン－クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成することができ、結合対は本明細書に開示される第２又は第３の態様の方法に従う方法によって得られる。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する別の実施形態では、各オリゴヌクレオチドは、５～１５個のＬＮＡモノマーからなり、第１の核酸塩基配列及び第２の核酸塩基配列は、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、０℃～４０℃の温度で、５個以上の連続するワトソン－クリック塩基対の逆平行二本鎖を形成できるように選択され、結合対は、第２又は第３の態様の方法及びその実施形態に従う方法によって取得可能であるか、又は得られる。
別の実施形態として、更に驚くべきことに、非変性条件下で逆平行二本鎖を形成することができる更に長い相補的全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドが存在することが発見された。したがって、本開示は、０℃～４０℃の温度の水溶液中で、１６～２０個の連続する塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）１６～２０個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）１６～２０個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、相補性により、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに逆平行二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は１６～２０個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されている、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドとを別々に合成する工程、を含み、
それにより、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する。
一実施形態では、具体的には、工程（ｃ）及び工程（ｄ）は、上記のように「変性条件」として指定された条件の非存在下で実施される。
この第２の態様の特定の実施形態、本明細書に開示される全ての他の態様及び実施形態に関連する特定の実施形態は、０℃～４０℃の温度で水溶液中で５～１５個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択し提供する方法を提供し、該方法は、
（ａ）５～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）１６～２０個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーからなり、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、相補性により、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに逆平行二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は５～１５個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されている、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドとを別々に合成する工程、を含み、
それにより、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する。
一実施形態では、具体的には、工程（ｃ）及び工程（ｄ）は、上記のように「変性条件」として指定された条件の非存在下で実施される。
第１の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２の全ＬＮＡ ｓｓ－オリゴヌクレオチドの例示的な結合対は、以下のように表３に反映されるように同定された。これらの結合対は特定の実施形態である。
Figure 2022535580000003
結局のところ、表３に示されている配列には、部分配列ｇｃｃｔｇａｃｇ（配列番号３）又はその相補が含まれておらず、これらについては上記で詳しく説明される。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する実施形態では、結合対の１個のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、合成有機ポリマー（ラテックス）ビーズ、多糖ビーズ、試験管、マイクロウェルプレートキャビティ、キュベット、膜、足場分子、水晶、フィルム、フィルタ、ディスク、及びチップからなる群から選択される固相に付着する（共有結合的に又は非共有結合的に付着する）。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する別の実施形態では、結合対の１個のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖、グリカン、ハプテン、及び色素からなる群から選択される分子に連結する（共有結合的に又は非共有結合的に付着する）。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する更に別の実施形態では、ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、リンカーに共有結合的に付着する。本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関連する更に別の実施形態では、ｓｓ－オリゴヌクレオチドは、イムノアッセイ等であるがこれに限定されない受容体ベースのアッセイにおいて、有用な分析物特異的受容体に、共有結合的に付着する。
非常に一般的に言えば、イムノアッセイは、標的分析物に特異的に結合することができる一又は複数の受容体を提供する。このような受容体としては、分析物特異的イムノグロブリンが例示され得る。そのために、この名前がイムノアッセイである。しかしながら、本開示の目的のために、他のタイプの分析物特異的受容体もまた考慮される。したがって、より一般的な用語である受容体ベースのアッセイが適切であり、イムノアッセイという用語と同義で使用される。
したがって、本明細書に開示される全ての他の態様及び実施形態に関する第６の態様は、分析物を決定するための受容体ベースのアッセイにおける第１の態様の一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対の使用であり、受容体ベースのアッセイは、分析物特異的受容体と、分析物を固相に固定化するための固相とを含み、該対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドは分析物特異的受容体に結合され、該対の第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは固相に結合されている。この態様の実施形態は、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対のそのような使用のいずれかであり、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対は、本報告の第２又は第３の態様のいずれかによる実施形態によって得られる
受容体ベースのアッセイでは、分析物は分析物特異的受容体に結合するようになる。分析物が結合した受容体は、一本鎖の全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対によって形成される二本鎖を介して固相に固定化することができる。したがって、結果として、複合体が形成され、複合体は、固相、二本鎖、受容体、及び分析物を含む。更なる工程では、それ自体が標識されているか、又は他の手段によってその存在を検出することができる更なる分析物特異的結合物質を使用して、固定化された分析物を検出することができる。競合アッセイ形式では、これ以上の結合物質は必要ない。代わりに、所定量の標識分析物が添加され、その存在及び／又は濃度が検出されるべき非標識分析物との結合について競合する。
通常、分析物はサンプルに含まれ、このサンプルは異なる分子の複雑な混合物である。本開示の目的のために、液体サンプルが考慮される。液体サンプルは、液相、すなわち通常は水性溶媒である液体溶媒を含む。水性溶媒中には、複数の分子が溶解状態で存在する。したがって、特定の実施形態では、サンプルは液体の凝集状態にあり、それは単相の均一な混合物である。別の特定の実施形態では、サンプルは不溶性部分を含み、したがって異相混合物であり、分析物はサンプル中に均一に分布している。通常、分析物は、溶解形態の混合物に含まれ、更に、一又は複数の更なる分子が、溶解形態のその混合物中に存在する。
液体サンプル中に存在する、又はその中に存在すると疑われる標的分析物の検出に関して、必須の工程において、分析物は特異的に結合する。特異的結合は、分析物特異的受容体が存在する又は添加されることを意味し、この受容体は、標的分析物に対して高い結合親和性及び結合特異性を有し、またサンプル中にまた存在する更なる分子に対して低い又は存在しない。特定の実施形態（及び例示する多数の既存のアッセイ）では、分析物に特異的に結合することができる受容体を含む化合物をサンプルに添加する。重要なことに、サンプルと受容体を含む化合物の混合物は、サンプル中の受容体と標的分析物との特定の相互作用を許容する条件を提供しなければならない。これは、混合物における条件は、受容体による分析物の実際の結合に許容的でなければならないことを含み、また、その条件は、結合された標的分析物で受容体を安定化することが望ましい。同時に、サンプルと化合物の混合物は、受容体、又は受容体全体を含む化合物への更なる分子の非特異的結合を支持又は安定化しないことが望ましい。
続いて、分析物を固定化する。固定化は、分析物を周囲の複雑な混合物、特にサンプルの更なる分子から分離できる、検出プロセスの重要な工程である。固定化には、標的分析物が付着するようになる固相が必要である。固定化されると、相分離によって分析物を混合物から分離することができる。次に、混合物から分離されて（すなわち、精製されて）、分析物が検出される。
受容体ベースのアッセイ及び固定化工程を考慮すると、固相を提供し、固相と標的分析物との間の連結を構築する必要がある。連結は、自己組織化プロセスで構築されることが望ましい。
イムノアッセイは、特定の実施形態であり、分析物の検出又は定量化を行い、分析物と少なくとも１つの分析物特異的受容体との反応に依存し、その結果、分析物：受容体の複合体を形成する、確立された生物分析法である。非限定的な例は、それぞれ、抗原と抗体との間の反応である。
したがって、本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関する第７の態様は、分析物を決定するための受容体ベースのアッセイを実施する方法であって、分析物を、本明細書に開示される第１の態様の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーを、それに付着させた分析物特異的受容体、及び該対の第２のメンバーを付着させた固相と接触させ、インキュベートする工程を含み、それにより、固相、該固相に結合した分析物特異的受容体、及び該分析物特異的受容体に結合した分析物を含む複合体を形成し、逆平行二本鎖が形成され、該二本鎖が上記対の第１のメンバー及び第２のメンバーからなり、上記二本鎖が複合体において分析物特異的受容体及び固相を接続し、続いて複合体に結合した分析物を検出し、それによって分析物を決定する、方法である。一実施形態では、検出の後者の工程は、例えば、「サンドイッチ」アッセイとしても当技術分野で知られている、複合体中の分析物に結合することができる標識された分析物特異的抗体を使用して行うことができる。
「サンドイッチ」イムノアッセイの特定の実施形態は、複数の認識エピトープ（すなわち、２以上の認識エピトープ）を有する分析物に使用することができる。したがって、サンドイッチアッセイには、分析物上の重複しないエピトープに付着する少なくとも２つの受容体が必要である。「不均一サンドイッチイムノアッセイ」では、受容体の１つが分析物特異的捕捉受容体の機能的役割を果たし、この受容体は、固相に固定化されているか、又は（アッセイの過程で）固定化される。第２の分析物特異的受容体は、液相中の溶解形態で供給される。それぞれの分析物が第１の受容体及び第２の受容体によって結合されると、サンドイッチ複合体が形成される（受容体－１：分析物：受容体－２）。サンドイッチ複合体は、「検出複合体」とも呼ばれる。検出複合体内では、分析物は受容体の間に挟まれている。すなわち、そのような複合体内では、分析物は、第１の受容体と第２の受容体との間の連結要素を意味する。
（「均一」に対するものとして）「不均一」という用語は、アッセイ手順における２つの必須で別個の工程を示す。第１の工程では、ラベルを含む検出複合体が形成され、固定化されるが、結合していないラベルがまだ複合体を囲んでいる。ラベル依存信号を判定する前に、非結合ラベルは固定化された検出複合体から洗い流される。そのため、第２の工程に相当する。対照的に、均一アッセイは、単一工程インキュベーションによって分析物依存の検出可能なシグナルを生成し、洗浄工程を必要としない。
不均一アッセイでは、固相は、分析物と接触する前に、その表面に機能的捕捉受容体（第１の受容体）に結合する場合があるように機能化されるか、又は固相の表面は、分析物と反応した（すなわち、分析物に結合した）後、第１の受容体を係留できるように機能化される。後者の場合、係留プロセスは、分析物を特異的に捕捉して結合する受容体の能力を妨げてはならない。液相に存在する第２の分析物特異的受容体は、結合した分析物、すなわち、固定化されているか、又は固相に固定化される分析物の検出に使用される。したがって、イムノアッセイでは、分析物は第１の（捕捉）受容体及び第２の（検出）受容体に結合することができる。それにより、分析物が、捕捉受容体と検出受容体との間に挟まれた、「検出複合体」が形成される。典型的な実施形態では、検出受容体は、分析物と接触する前にラベルされる。或いは、分析物が結合した後、ラベルが検出受容体に特異的に付着する。検出複合体が固相に固定化されている場合、固相で検出可能なラベルの量は、サンドイッチされた分析物の量に相当する。洗浄工程で未結合のラベルを除去した後、分析物の存在と量を示す固定化されたラベルを検出できる。
不均一イムノアッセイにおいて洗浄工程は、十分に安定するために、第１の結合パートナーと第２の結合パートナーの非共有の連結を必要とする。ただし、連結に必要な安定性の程度は、適用する洗浄工程の強度によって異なる。重要かつ予想外に、本明細書に示されるような結合対は、イムノアッセイにおける固定化工程を容易にするのに並外れてよく適している。すなわち、イムノアッセイでは、固相に付着している全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対の第１の結合パートナー、及び分析物特異的捕捉受容体に付着している結合対の第２の結合パートナーは固相への受容体の固定化を促進するのに適している。同様に、そのような固定化は、標的分析物に結合した捕捉受容体、及び検出複合体に対しても有利に機能する。
別のよく知られている実施形態は、その最も単純な形態では、第２の検出受容体の欠乏によって、サンドイッチ型フォーマットとは異なる、競合的イムノアッセイである。対照的に、分析物を含むサンプルは、分析物特異的受容体と交差反応することができる人工的に生成されてラベルされた類縁体と混合される。アッセイでは、分析物及び類縁体は、固定化されているか又は固定化される捕捉受容体への結合について競合する。この結合工程に続いて、固定化されたラベルの量が多いほど、捕捉受容体をめぐって競合することができた非ラベル分析物の量が少なくなる。固定化されたラベルは、洗浄工程の後に定量される。したがって、固相で検出可能なラベルの量は、サンプルに最初に存在した分析物の量に反対に相応する。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態では、全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対によって形成される二本鎖における結合力は、分析物及び分析物特異的（捕捉及び／又は検出）受容体のいずれかを一緒に保持する結合力のいずれかを超え、これらは、分析物検出のアッセイ（限定されるものではないが、イムノアッセイ等）で使用される。二本鎖の結合力を微調整する必要がある場合は、異なる長さ及び／又は異なる塩基対組成のワトソン－クリック対合領域を提供できるように、結合対を選択することができる。より一般的には、相補的な一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対は、全ＬＮＡ結合対によって互いに結合される第１の成分及び第２の成分に関して、特定の技術的必要性に従って提供され選択され得る。
所定の数の対の核酸塩基を有するワトソン－クリック対の相補的全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの二本鎖における結合力は、二本鎖の個々の塩基対を変更することによって（例えば、Ａ：Ｔ塩基対をＣ：Ｇ塩基対に置き換えることによって）、又は二本鎖を長くしたり短くしたりする微調整することができる。いずれの場合も、微調整された一本鎖全ＬＮＡの対は、この文書の他の場所で開示されているように、０℃～４０℃の温度の水溶液中で５～１５個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する方法に供する必要がある。
しかしながら、本明細書に開示される全ての他の態様及び実施形態に関する第８の態様は、分析物を決定するための受容体ベースのアッセイを実施するためのキットであり、該キットは、第１の容器内に、本明細書に開示される第１の態様による別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対の第１のメンバー、又は本明細書に開示される第２の態様若しくは第３の態様による方法によって得られる別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーがそれに付着した分析物特異的受容体を含み、該キットは、上記対の第２のメンバーを付着させた固相を第２の容器内に更に含む。
より一般的な用語であっても、第１の成分及び第２の成分を非共有結合するためのキットが提供され、該キットは、第１の別々のコンパートメントにおいて、本明細書に開示される第１の態様による別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーが付着している、又は本明細書に開示される第２の態様若しくは第３の態様による方法によって得られる第１のメンバーが付着している第１の成分を含み、該キットは、第２の容器内に、上記対の第２のメンバーが付着している第２の成分を更に含む。
本報告に開示されている結合対は、ビオチン：（ストレプト）アビジン等の確立された結合対の一般的な代替物として役立つことができると理解されている。したがって、全ＬＮＡ結合対は、非変性条件下で二本鎖を形成することができるｓｓ－オリゴヌクレオチドの相補的対の第１のメンバー及び第２のメンバーにそれぞれ付着した第１の成分及び第２の成分を接続するのに役立つことができる。当業者は、本明細書でより詳細に説明される分析物検出アッセイを超える多数の用途をよく知っているが、例えば組織サンプル中の標的抗原のｉｎ ｓｉｔｕ分析にも拡大される。
原則として、本開示の結合対はまた、同じ水溶液中に別々の異なる結合対を提供することを可能にし、それにより、多重化アッセイへの道を開く。相補的な塩基配列を共有しないオリゴヌクレオチドの異なる結合対を同定したおかげで、多くの異なる追加の用途が実現可能になる。
特定の態様及び実施形態は、以下のより正式な項目のリストを含む。この番号付きの項目のリストは、本報告の最初の開示の一部を形成する。
１．０℃～４０℃の温度の水溶液中で５～１５個の連続した塩基対を有する逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する方法であって、
（ａ）５～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｂ）５～１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーを含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーは核酸塩基を含み、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの核酸塩基は第２の核酸塩基配列を形成し、第２の核酸塩基配列は、逆平行配向で第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに逆平行二本鎖を形成する能力を予測し、予測される二本鎖は５～１５個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合されている、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程、
（ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程、
（ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程、続いて、
（ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、結合対を選択する工程、
（ｇ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドとを別々に合成する工程、を含み、
それにより、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する、方法。
２．工程（ａ）において、第１オリゴヌクレオチドのモノマー数が８～１５個の場合、第１の核酸塩基配列が、５’ｇｃｃｔｇａｃｇ３’（配列番号３）及び５’ｃｇｔｃａｇｇｃ３’（配列番号４）から選択される配列で構成されないか、又はそれらを含まない、項１に記載の方法。
３．第２オリゴヌクレオチドのモノマー数が８～１５個の場合、第２の核酸塩基配列が、５’ｇｃｃｔｇａｃｇ３’（配列番号３）及び５’ｃｇｔｃａｇｇｃ３’（配列番号４）から選択される配列で構成されないか、又はそれらを含まない、項１又は２に記載の方法。
４．工程（ｅ）の前に、工程（ｄ）で得られた混合物を、ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを分離する追加の工程に供する、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．工程（ｃ）及び工程（ｄ）が非変性温度、具体的には０℃～５℃、５℃～１０℃、１０℃～１５℃、１５℃～２０℃、２０℃～２５℃、２５℃～３０℃、３０℃～３５℃、及び３５℃～４０℃からなる群から選択される温度で実施される、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
６．工程（ｃ）及び工程（ｄ）が２５℃～３７℃の温度で実施される、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．工程（ｃ）の前に、工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれかの各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが、変性条件の非存在下で維持される、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．工程（ｃ）の前に、工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれかの各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが、－８０℃～４０℃、具体的には０℃～４０℃、より具体的には２５℃～３７℃の温度で水溶液中に保持される、項７に記載の方法。
９．工程（ｃ）の前に、工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれかの各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが、長さが２０塩基対でＧ＋Ｃ含量が５０％以上のＤＮＡ二本鎖の融解温度を少なくとも１５℃低下させることができる変性剤化合物の非存在下、具体的にはホルムアミド及びＤＭＳＯの非存在下で水溶液中に保持される、項７に記載の方法。
１０．工程（ｄ）において、時間間隔が、１秒～２０分、１秒～５分、１秒～６０秒、及び１秒～３０秒からなる群から選択される、項１～９のいずれか一項に記載の方法。
１１．工程（ｃ）の混合物が、該混合物のｐＨをｐＨ６～ｐＨ８、より具体的にはｐＨ６．５～ｐＨ７．５に維持する緩衝液を含む、項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．工程（ｃ）の混合物が、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、具体的には約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約５００ｍｍｏｌ／Ｌ、より具体的には約２００ｍｍｏｌ／Ｌ～約３００ｍｍｏｌ／Ｌの量の溶解物質を含む、項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．工程（ｃ）及び工程（ｄ）が、２０塩基対の長さの、５０％のＧ＋Ｃ含有量を有するＤＮＡ二本鎖の融解温度を少なくとも１５℃低下させることができる変性剤化合物の非存在下で、より具体的にはホルムアミド及びジメチルスルホキシドのいずれも非存在で、実施される、項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．各ＬＮＡモノマーが、Ｎ４－アセチルシトシン、５－アセチルウラシル、４－アミノ－６－クロロピリミジン、４－アミノ－５－フルオロ－２－メトキシピリミジン、６－アミノ－１－メチルウラシル、５－アミノオロチン酸、５－アミノウラシル、６－アミノウラシル、６－アザウラシル、Ｎ４－ベンゾイルシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、６－クロロウラシル、６－クロロメチルウラシル、６－クロロ－３－メチルウラシル、シトシン、５，６－ジメチルウラシル、５－エチルウラシル、５－エチニルウラシル、５－フルオロシトシン、５－フルオロオロチン酸、５－フルオロウラシル、５－ヨード－２，４－ジメトキシピリミジン、５－ヨードウラシル、イソシトシン、５－メチルシトシン、６－メチル－５－ニトロウラシル、２－メチルチオ－４－ピリミジノール、５－メチル－２－チオウラシル、６－メチル－２－チオウラシル、６－メチルウラシル、５－ニトロウラシル、オロチン酸、６－フェニル－２－チオウラシル、６－プロピル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、チミン、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、ウラシル、アデニン、８－アザヒポキサンチン、８－アザグアニン、アロプリノール、４－アミノピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、２－アミノプリン、２－アセトアミド－６－ヒドロキシプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２－アミノ－６－ヨードプリン、アザチオプリン、４－アミノ－６－ヒドロキシピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、アミノフィリン、Ｎ６－ベンジルアデニン、Ｎ６－ベンゾイルアデニン、６－ベンジルオキシプリン、８－ブロモテオフィリン、８－ブロモ－３－メチルキサンチン、８－ブロモ－７－（２－ブチン－１－イル）－３－メチルキサンチン、６－クロロプリン、８－クロロテオフィリン、６－クロロ－２－フルオロプリン、６－クロロ－７－デアザプリン、２－クロロアデニン、６－クロロ－７－ヨード－７－デアザプリン、２，６－ジアミノプリン、２，６－ジクロロプリン、６－（ジメチルアミノ）プリン、２，６－ジクロロ－７－デアザプリン、５，６－ジクロロベンズイミダゾール塩酸塩、７－デアザヒポキサンチン、２－フルオロアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、イソグアニン、３－ヨード－１Ｈ－ピラゾロ－［３，４－ｄ］ピリミジン－４－アミン、キネチン、６－メルカプトプリン、６－メトキシプリン、３－メチルキサンチン、１－メチルキサンチン、３－メチルアデニン、Ｏ６－（シクロヘキシルメチル）グアニン、６－チオグアニン、２－チオキサンチン、キサンチン、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニル－シチジン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－プロピニル－７－デアザアデニン、７－プロピニル－７－デアザグアニン、及びその誘導体からなる群から選択される核酸塩基を含む、項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．各ＬＮＡモノマーが、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、及び５－メチルシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む、項１４に記載の方法。
１６．工程（ｅ）の前に、工程（ｄ）のインキュベートされた混合物を、ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを分離する工程に供する、項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．工程（ｄ）のインキュベートされた混合物をカラムクロマトグラフィー及び／又は電気泳動に供する、項１６に記載の方法。
１８．工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれかのｓｓ－オリゴヌクレオチドのモノマーがベータ－Ｄ－ＬＮＡモノマーである、項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれかのｓｓ－オリゴヌクレオチドのモノマーがベータ－Ｌ－ＬＮＡモノマーである、項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
２０．別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であって、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが５～１５個のＬＮＡモノマーからなり、水溶液中の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドが、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で互いに逆平行二本鎖を形成することができる、別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
２１．別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であって、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが８～１５個のＬＮＡモノマーからなり、水溶液中の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドが、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で互いに逆平行二本鎖を形成することができ、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが、５’ｇｃｃｔｇａｃｇ ３’（配列番号３）及び５’ｃｇｔｃａｇｇｃ ３’（配列番号４）からなる群から選択される配列を含まない、別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
２２．別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であって、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが５～７個のＬＮＡモノマーからなり、水溶液中の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドが、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で互いに逆平行二本鎖を形成することができる、別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
２３．ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対が、項１～１９のいずれか一項に記載の方法を実施することによって得られる、項２０～２２のいずれか一項に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
２４．別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であって、該対が以下からなる群から選択される、別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
（配列番号１）：（配列番号２）、
（配列番号９）：（配列番号１０）、
（配列番号１１）：（配列番号１２）、
（配列番号１３）：（配列番号１４）、
（配列番号９）：（配列番号１５）、
（配列番号１６）：（配列番号２０）、
（配列番号２１）：（配列番号１８）、
（配列番号２１）：（配列番号２０）、
（配列番号２１）：（配列番号１９）、
（配列番号２３）：（配列番号１７）、
（配列番号２５）：（配列番号２８）。
２５．上記対が以下からなる群から選択される、項２４に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対：
（配列番号１）：（配列番号２）、
（配列番号２８）：（配列番号２４）、
（配列番号１６）：（配列番号２０）。
２６．上記対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドが第１の標的に付着し、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが第２の標的に付着する、項２０～２５のいずれか一項に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
２７．ｓｓ－オリゴヌクレオチドがそれぞれの標的に共有結合又は非共有結合している、項２６に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
２８．標的が、固相、生体分子、及び化学的に合成された化合物からなる群から独立して選択される、項２６又は２７に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
２９．標的が、そのアミノ酸又は類縁体、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸塩基、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、核酸、脂質、並びに分析物特異的受容体、抗体を含む受容体、抗体誘導体、及び抗体フラグメントからなる群から独立して選択される、項２６～２８のいずれか一項に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
３０．標的が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ステロイド又は非ステロイドホルモン、ハプテン、及びそれらのコンジュゲートからなる群から独立して選択される、項２６～２８のいずれかの別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
３１．標的が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ステロイド又は非ステロイドホルモン、ハプテン、核酸塩基、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、核酸、脂質、分析物特異的受容体、分析物架橋剤、及びそれらの混合物からなる群から選択される複数の異なる分子からなるコンジュゲートを含む、項２６～２８のいずれか一項に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
３２．標的が固相を含む、項２６～２８のいずれか一項に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
３３．標的が検出可能な標識を含む、項２６～２８のいずれか一項に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
３４．変性条件の非存在下で逆平行全ＬＮＡ二本鎖を形成する方法であって、
（ａ）項２０～３３のいずれか一項に記載の一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーと第２のメンバーとを別々に提供する工程であって、各一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドを変性剤の非存在下で水溶液に別々に溶解させ、０℃～４０℃の温度に保持する、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーと第２のメンバーとを別々に提供する工程と、
（ｂ）変性剤の非存在下で、０℃～４０℃の温度で上記対の一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドを互いに接触させる工程と、を含み、
それにより、逆平行全ＬＮＡ二本鎖を形成する、方法。
３５．一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対の第１のメンバー及び第２のメンバーによって形成される逆平行二本鎖であって、項３４に記載の方法によって得られる、逆平行二本鎖。
３６．複合体の第１の成分及び第２の成分を接続するための液体水性媒体中の項２０～３３のいずれか一項に記載の一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対の使用であって、第１の成分が対の第１のメンバーに付着し、第２の構成要素は、上記対の第２のメンバーに付着している、使用。
３７．分析物を決定するための受容体ベースのアッセイにおける、項２０～３３のいずれか一項に記載の一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対の使用であって、受容体ベースのアッセイが、分析物特異的受容体と、分析物を固相に固定化するための固相とを含み、上記対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドが分析物特異的受容体に結合され、上記対の第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが固相に結合される、使用。
３８．分析物を決定するための受容体ベースのアッセイを実施するためのキットであって、第１の容器内に、項２０～３３のいずれか一項に記載の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーをそれに付着させた分析物特異的受容体を含み、キットが、第２の容器内に、上記対の第２のメンバーを付着させた固相を更に含む、キット。
３９．分析物を決定するための受容体ベースのアッセイを実施する方法であって、分析物を、項２０～３３のいずれか一項に記載の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーを、それに付着させた分析物特異的受容体、及び対の第２のメンバーを付着させた固相と接触させ、インキュベートする工程を含み、それにより、固相、固相に結合した分析物特異的受容体、及び分析物特異的受容体に結合した分析物を含む複合体を形成し、逆平行二本鎖が形成され、二本鎖が上記対の第１のメンバー及び第２のメンバーからなり、二本鎖が複合体において分析物特異的受容体及び固相を接続し、続いて複合体に結合した分析物を検出し、それによって分析物を決定する、方法。
本明細書に開示される全ての態様及び実施形態に関して、当業者は、分析物特異的受容体が抗体又は抗体フラグメントを特異的に含むことを理解する。
以下の実施例及び図は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。
適合性の全ＬＮＡオリゴヌクレオチド結合対のスクリーニングアプローチを示す概略図（実施例２）。黒いバーは、それぞれの一本鎖分子、二本鎖分子、又は他の複合分子の量を表す。第１（１）及び第２（２）の一本鎖オリゴヌクレオチドは互いに接触している。Ａ：２つのオリゴヌクレオチドはいずれも分子間又は分子内の二次構造を特徴としておらず、どちらもそれぞれのパートナーの分子認識を妨げることはない。結果として、二本鎖が主に豊富な結果として生じる生成物であり、一本鎖は検出できないか、わずかな量で存在する（望ましい結果）。 適合性の全ＬＮＡオリゴヌクレオチド結合対のスクリーニングアプローチを示す概略図（実施例２）。黒いバーは、それぞれの一本鎖分子、二本鎖分子、又は他の複合分子の量を表す。第１（１）及び第２（２）の一本鎖オリゴヌクレオチドは互いに接触している。Ｂ：２つのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、分子間又は分子内の二次構造を特徴とする。その結果、二本鎖はそれほど豊富ではなく、一本鎖の大部分が依然として存在し、二本鎖が形成されるが、速度は低下する（望ましくない結果）。 適合性の全ＬＮＡオリゴヌクレオチド結合対のスクリーニングアプローチを示す概略図（実施例２）。黒いバーは、それぞれの一本鎖分子、二本鎖分子、又は他の複合分子の量を表す。第１（１）及び第２（２）の一本鎖オリゴヌクレオチドは互いに接触している。Ｃ：両方のオリゴヌクレオチドは、分子間又は分子内の二次構造を特徴とする。その結果、二本鎖は形成されないか、又はわずかな量の二本鎖が形成され、長時間のインキュベーション後でも一本鎖が依然として存在する（望ましくない結果）。 一本鎖ＬＮＡ１のＨＰＬＣ分析（配列番号１；実施例２）；メインピークの表示された保持時間は３．３５３分である。 一本鎖ＬＮＡ２のＨＰＬＣ分析（配列番号２；実施例２）；マイナーピークの表示された保持時間は６．４４０分、メインピークの表示された保持時間は７．１４５分である。 混合ＬＮＡ１及びＬＮＡ２のＨＰＬＣ分析、ＨＰＬＣシステムへの即時注入（実施例２）。マイナーピークの表示された保持時間は１．６７１分、メインピークの表示された保持時間は６．６４１分である。 注入前の熱変性後の混合ＬＮＡ１及びＬＮＡ２のＨＰＬＣ分析（実施例２）。陽性対照：二本鎖形成；マイナーピークの表示された保持時間は１．７１０分、メインピークの表示された保持時間は６．６５６分である。 一本鎖ＬＮＡ３のＨＰＬＣ分析（配列番号５；実施例２）；メインピークの表示された保持時間は３．３５３分である。 一本鎖ＬＮＡ４のＨＰＬＣ分析（配列番号６；実施例２）；マイナーピークの表示された保持時間は６．４４０分、メインピークの表示された保持時間は７．１４５分である。 混合ＬＮＡ３及びＬＮＡ４のＨＰＬＣ分析、ＨＰＬＣシステムへの即時注入（実施例２）。遅い二本鎖形成（比率＜０．０５）。第１のピークの表示された保持時間は３．３８７分、メインピークの表示された保持時間は７．１５７分である。 混合ＬＮＡ３及びＬＮＡ４のＨＰＬＣ分析、５０分後の注入（実施例２）。遅い二本鎖形成（比率＝０．０５）。第１のピークの表示された保持時間は３．３６５分、第２のピークの表示された保持時間は６．８７１分、第３のピークの表示された保持時間は７．１４８分である。 注入（実施例２）前の熱変性後の混合ＬＮＡ３及びＬＮＡ４のＨＰＬＣ分析。陽性対照：二本鎖形成。メインピークの表示された時間は６．８８２分である。 一本鎖ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’（５’修飾された配列番号２０）のＨＰＬＣ分析。メインピークの表示された保持時間は６．１８４分である。 一本鎖ＬＮＡ ５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１６）のＨＰＬＣ分析。マイナーピークの表示された保持時間は１．４９６であり、メインピークの表示された保持時間は１．８６５分である。 混合ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’’（配列番号２０）及び５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１６）のＨＰＬＣ分析（室温で混合し、即時注入）。メインピークの示された保持時間は６．５６８分である。高速二本鎖形成（１００％二本鎖形成：比率１．０）。 ５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１４）は二本鎖形成に使用され、いくつかの残留一本鎖ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’（配列番号２０）が検出可能であった。 混合 ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’（配列番号２０）及び５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１６）のＨＰＬＣ分析（＋４℃～＋６℃で保存及び混合し、即時注入）。メインピークの表示された保持時間は６．５８８分であり、７．０５６分の別の保持時間が示されている。高速二本鎖形成（１００％二本鎖形成：比率１．０）。５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１６）は二本鎖形成に使用され、少量の残留一本鎖ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’（配列番号２０）が検出可能であった。 混合ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’（配列番号２０）及び５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１６）のＨＰＬＣ分析（０℃で保存及び混合（氷浴）し、即時注入）。メインピークの示された保持時間は６．５５２分である。高速二本鎖形成（１００％二本鎖形成：比率１．０）。５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１６）は二本鎖形成に使用され、少量の残留一本鎖ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’（配列番号２０）が検出可能であった。 混合ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’（配列番号２０）及び５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１６）のＨＰＬＣ分析（－１０℃で保存及び混合（塩化マグネシウム／氷浴）し、即時注入）。メインピークの示された保持時間は６．５４７分である。高速二本鎖形成（１００％二本鎖形成：比率１．０）。５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１６）は二本鎖形成に使用され、少量の残留一本鎖ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’（配列番号２０）が検出可能であった。 注入前の熱変性及びアニーリング後の混合５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ａｃｃａａｃ－３’（配列番号２０）及び５’－ｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号１６）のＨＰＬＣ分析。メインピークの表示された保持時間は６．５８３分であり、６．９６７分の別の保持時間が示されている。二本鎖形成の陽性対照。 一本鎖ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ｃｇｔｃａｇｇｃａｇｔｔｃａｇ－３’（５’修飾配列番号４７）のＨＰＬＣ分析。メインピークの表示された保持時間は６．８４０分である。 一本鎖ＬＮＡ ５’－ｃｔｇａａｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ－３’（配列番号４８）のＨＰＬＣ分析。メインピークの表示された保持時間は３．４８８分である。 混合ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ｃｇｔｃａｇｇｃａｇｔｔｃａｇ－３’（配列番号４７）／５’－ｃｔｇａａｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ－３’（配列番号４８）のＨＰＬＣ分析（室温で混合し、即時注入）。第１のピークの表示された保持時間は３．５９４分であり、それぞれのピークの表示された２の保持時間は６．５８０分である。二本鎖形成が遅い配列対の同定。遅い二本鎖の形成（比率＜０．５）。 混合ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ｃｇｔｃａｇｇｃａｇｔｔｃａｇ－３’（配列番号４７）／５’－ｃｔｇａａｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ－３’（配列番号４８）のＨＰＬＣ分析（０℃で保存及び混合し、即時注入）。第１のピークの表示された保持時間は３．５４１分であり、それぞれのピークの表示された第２の保持時間は６．８５３分である。遅い二本鎖の形成（比率＜０．５）。 混合ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ｃｇｔｃａｇｇｃａｇｔｔｃａｇ－３’（配列番号４７）／５’－ｃｔｇａａｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ－３’（配列番号４８）のＨＰＬＣ分析（－１０℃で保存及び混合（塩化マグネシウム／氷浴）し、即時注入）。第１のピークの表示された保持時間は３．５１６分であり、それぞれのピークの表示された第２の保持時間は６．８４８分である。遅い二本鎖の形成（比率＜０．５）。 注入前の熱変性及びアニーリング後の混合ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ｃｇｔｃａｇｇｃａｇｔｔｃａｇ－３’（配列番号４７）／５’－ｃｔｇａａｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ－３’（配列番号４８）のＨＰＬＣ分析。メインピークの表示された保持時間は６．５８０分である。陽性対照：二本鎖形成。 Ａ：実施例４で使用されたＢｉａｃｏｒｅセンサーの概略図。Ｂ：Ａに示される個々の成分。１：センサー表面、２：センサー表面に付着したストレプトアビジン、３：ビオチン ４：第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドをビオチンに共有結合するリンカー分子、５：第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド、６：第２のｓｓ－オリゴヌクレオチド。ａ：描かれているのは、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドを付着したセンサーと接触したときの状況である。ｂ：描かれているのは、２つのｓｓ－オリゴヌクレオチドが適合性であり、非変性条件下で二本鎖が形成される結果である。その結果、結合した第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、Ｂｉａｃｏｒｅ機器で検出できる変化を引き起こす。 Ａ：実施例４で使用されたＢｉａｃｏｒｅセンサーの概略図。Ｂ：Ａに示される個々の成分。１：センサー表面、２：センサー表面に付着したストレプトアビジン、３：ビオチン ４：第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドをビオチンに共有結合するリンカー分子、５：第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド、６：第２のｓｓ－オリゴヌクレオチド。ａ：描かれているのは、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドを付着したセンサーと接触したときの状況である。ｂ：描かれているのは、２つのｓｓ－オリゴヌクレオチドが適合性であり、非変性条件下で二本鎖が形成される結果である。その結果、結合した第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドは、Ｂｉａｃｏｒｅ機器で検出できる変化を引き起こす。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例４の結果。 実施例５のＢｉａｃｏｒｅ実験の概略図。 実施例５のＢｉａｃｏｒｅ実験の概略図。 実施例５のＢｉａｃｏｒｅ実験の概略図。 実施例５の結果。 実施例５の結果。 実施例５の結果。 実施例５の結果。 実施例６のＢｉａｃｏｒｅ実験の概略図。 Ｂｉ－ＬＮＡ－コンストラクトに結合しているＬＮＡ－コンストラクト；２５℃での結合定数。 Ｂｉ－ＬＮＡ－コンストラクトに結合しているＬＮＡ－コンストラクト；２５℃での結合定数。 Ｂｉ－ＬＮＡ－コンストラクトに結合しているＬＮＡ－コンストラクト；３７℃での結合定数。 Ｂｉ－ＬＮＡ－コンストラクトに結合しているＬＮＡ－コンストラクト；３７℃での結合定数。
実施例１
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの合成
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、標準の自動固相ＤＮＡ合成手順を使用し、ホスホロアミダイト化学を適用して、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡシンセサイザーで１μモルスケールの合成で合成された。Ｇｌｅｎ ＵｎｙＳｕｐｐｏｒｔ ＰＳ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号２６－５０４０）及びＬＮＡホスホルアミダイト（Ｑｉａｇｅｎ／Ｅｘｉｑｏｎ カタログ番号３３９７０（ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、３３９７０２（ＬＮＡ－Ｔ）、３３９７０５（ＬＮＡ－ｍＣ（Ｂｚ）及び３３９７０６（ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）；ベータ－Ｌ－ＬＮＡ類縁体を、Ａ．Ａ．Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ２００１，６６，８５０４－８５１２）に従ってＬ－グルコース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ、カタログ番号ＭＧ０５２４７）から開始してＤ－ｂｅｔａ－ＬＮＡホスホルアミダイトと同様に合成し、同様にスペーサーホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｔｅ）１８（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号１０－１９１８）及び５’－ビオチンホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｔｅ）（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号１０－５９５０）をビルディングブロックとして使用した。全てのホスホロアミダイトは、ＤＮＡグレードのアセトニトリルに０．１Ｍの濃度で適用された。ＬＮＡオリゴヌクレオチドの組み立てには、延長したカップリング時間（１８０秒）、延長した酸化（４５秒）、脱トリチル化時間（８５秒）での標準ＤＮＡサイクル、及び標準合成試薬と溶媒を使用した。５’－ビオチン化ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合成されたＤＭＴｏｆｆであったが、未修飾のＬＮＡオリゴヌクレオチドはＤＭＴｏｎとして合成された。次に、標準的な切断プログラムを適用して、濃縮アンモニアによって、支持体からＬＮＡオリゴヌクレオチドの切断を行った。残留保護基は、濃縮アンモニアでの処理によって切断された（５６℃で８時間）。粗ＬＮＡオリゴヌクレオチドを蒸発させ、ＲＰ ＨＰＬＣ（カラム：ＰＲＰ－１、７μｍ、２５０ｘ２１．５ｍｍ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ｐａｒｔ ｎｏ．７９３５２）又はＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ ＯＢＤ、５μｍ、１０ｘ２５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ ｐａｒｔ ｎｏ．１８６００８１６７）で、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ７／アセトニトリルグラジエントを使用して、精製した。生成物画分を合わせ、水に対する透析（ＭＷＣＯ １０００、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ ６、ｐａｒｔ ｎｏ．１３２６３８）によって３日間脱塩し、それによってＤＭＴｏｎ精製オリゴヌクレオチドのＤＭＴグループも切断した。最後に、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを凍結乾燥した。
収量は、８５～３６０ｎｍｏｌの範囲であった。
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム ｐＨ７／アセトニトリルグラジエントを使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で分析した。典型的な純度は、＞９０％であった。ＬＮＡオリゴヌクレオチドの同一性は、ＬＣ－ＭＳ分析によって確認された。
各種のオリゴヌクレオチドを合成し、別々に保管した。
実施例２
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析を適用した事前の変性なしに二本鎖を形成することができるＬＮＡオリゴヌクレオチド配列の同定
ａ）一般的な方法：
実施例１のＬＮＡオリゴヌクレオチドを緩衝液（０．０１ＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ）に溶解し、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分間で８～２４％アセトニトリル、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で分析した。
鎖及び対応する対向鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを等モル濃度でｒ．ｔ．（室温）で混合し、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（８～１０分で２４％Ｂ；２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で直ちに分析した。
第１の対照実験では、鎖及び対応する対向鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを等モル濃度で室温で混合し、室温で１時間インキュベートした。その後、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分で８～２５％アセトニトリル、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で分析した。
二本鎖形成（陽性対照）鎖及び対応する対向鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを示す第２の対照実験では、室温で等モル濃度で混合し、９５℃（１０分）で熱変性させ、それから室温に達した後、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分で８～２４％アセトニトリル、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で再度分析した。
個々の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドと比較して異なる保持時間で新たなピークが形成される場合、二本鎖形成を検出することができる。陽性対照では、混合鎖と対向鎖が注入前に熱変性され、二本鎖が生成される。室温で、鎖と対向鎖ＬＮＡを混合した後の時間依存注入によって、事前の変性なしで、二本鎖形成の動態をモニターすることができる。
ＬＮＡ配列は、事前に変性させずに室温で５～６０分間焼き戻した後（ＨＰＬＣ％は吸光係数で補正され、二本鎖の高色度は考慮されてない）、形成された二本鎖と両方の一本鎖ＬＮＡの一方のＨＰＬＣ％比（吸光係数で補正され、両方の鎖が正確に等モルではない場合は、より高い比率の値が考慮される）が、＞０．９の場合、迅速に二本鎖を形成できると判断される。
ｂ）二本鎖を高速で形成する配列の同定
ＬＮＡ １：５’－ｔｇｃｔｃｃｔｇ－３’（配列番号１）
ＬＮＡ ２：５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ｃａｇｇａｇｃａ－３’（５’修飾された配列番号２）
Ｈｅｇ＝ヘキサエチレングリコール
Ｂｉ＝ビオチンの吉草酸部分のカルボキシ機能を介して付着したビオチンラベル
図２～図１０に結果を示す。
ｃ）ゆっくりと二本鎖を形成する配列の同定
１０ｂｐハイブリダイゼーション実験では、以下の比率の計算を行った。
ＬＮＡ ３：５’－ｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ－３’
ＬＮＡ ４（コンジュゲート）：５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ｃｇｔｃａｇｇｃａｇ－３’
Figure 2022535580000004
 ＨＰＬＣ％＊ε－１＊１０００（ＬＮＡ３／ＬＮＡ４二本鎖）／ＨＰＬＣ％＊－１＊１０００（ＬＮＡ３一本鎖）＝０．０２３／０．４５６＝０．０５
ＨＰＬＣ％＊－１＊１０００（ＬＮＡ３／ＬＮＡ４二本鎖）／ＨＰＬＣ％＊－１＊１０００（ＬＮＡ４一本鎖）＝０．０２３／０．４５７＝０．０５
実施例３
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析を適用した事前の変性なしに二本鎖を形成できるＬＮＡオリゴヌクレオチド配列の同定
ａ）一般的な方法：
実施例１のＬＮＡオリゴヌクレオチドを緩衝液（０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）に溶解し、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分間で８～２４％アセトニトリル、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ、Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で、分析した。
鎖及び対応する対向鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチド（すなわち、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチド）を等モル濃度でｒ．ｔ．（室温）又は０℃～４０℃から選択した温度で混合し、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（８～１０分で２４％Ｂ；２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で直ちに分析した。
あるタイプの対照実験では、鎖及び対応する対向鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを等モル濃度で室温で混合し、室温で１時間インキュベートした。その後、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分で８～２５％アセトニトリル、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で分析した。他の実験を種々の温度で行った。温度を０℃～７０℃、より具体的には０℃～５℃、０℃～５℃、０℃～１０℃、０℃～２０℃、０℃～３０℃、５℃～１０℃、１０℃～１５℃、１５℃～２０℃、２０℃～２５℃、２５℃～３０℃、３０℃～３５℃、及び３５℃～４０℃から選択した。クロマトグラフィー分析を室温で行った。
二本鎖形成（陽性対照）鎖及び対応する対向鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドを示す対照実験では、室温で等モル濃度で混合し、９５℃（１０分）で熱変性させ、再び室温まで冷却した後、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウムｐＨ７／アセトニトリルグラジエント（１０分で８～２４％アセトニトリル、２６０ｎｍで検出）を使用して、ＲＰ１８ ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ１８ｅ，Ｍｅｒｃｋ ｐａｒｔ ｎｏ．１．０２１２９．０００１）で再度分析した。
個々の一本鎖ＬＮＡオリゴヌクレオチドに対応するピークとは異なる保持時間で、新たなピークが現れる場合、二本鎖の形成が検出される。陽性対照（対照実験、上記を参照）では、混合鎖と対向鎖を注入前に熱変性させたため、細孔があり、二本鎖の形成を防ぐことができる構造が破壊された。したがって、熱変性に続いて、二本鎖が得られた。室温で、鎖と対向鎖ＬＮＡを混合した後の時間依存注入によって、事前の変性なしで、二本鎖形成の動態をモニターした。
ＬＮＡ配列を、二本鎖を迅速に形成する能力に関して分析した。例示的であるが非限定的な場合において、事前に変性させずに室温で５～６０分間焼き戻した後（ＨＰＬＣ％は吸光係数で補正され、二本鎖の高色度は考慮されてない）、形成された二本鎖と両方の一本鎖ＬＮＡの一方のＨＰＬＣ％比（吸光係数で補正され、両方の鎖が正確に等モルではない場合は、より高い比率の値が考慮される）が、＞０．９の場合、陽性の結果が得られた。
ｂ）非変性条件下で高速二本鎖形成が可能な例示的な配列対の同定。
最初の実験では、第１のＬＮＡオリゴヌクレオチド５’－ｔｇｃｔｃｃｔｇ－３’（配列番号１）及び第２のＬＮＡオリゴヌクレオチドＢｉ－Ｈｅｇ－５’－ｃａｇｇａｇｃａ－３’（５’修飾配列番号２）が得られた。
Ｈｅｇ＝ヘキサエチレングリコール
Ｂｉ＝ビオチンの吉草酸部分のカルボキシ機能を介して付着したビオチンラベルこれらの結果等は図に反映されている。
ＨＥＧ部分の存在は、それぞれのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に影響を与えないことがわかった。核酸塩基配列及びハイブリダイゼーション特性に関して、ベータ－Ｄ－ＬＮＡオリゴヌクレオチド対及びベータ－Ｌ－ＬＮＡオリゴヌクレオチド対に関して差異は見られなかった。
以下のリストは、非変性条件下で別々に保持することができ、互いに接触したときに非変性条件下で二本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチド対の更なる例示的な結果を提示する。
１５－ｍｅｒ ５’ｃａｃｃａａｃａｃａｃｃａａｃ ３’（配列番号３２、５’修飾Ｂｉ－Ｈｅｇ分子として試験）及び１５－ｍｅｒ ５’ｇｔｔｇｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｇ ３’（配列番号３１）は、互いに接触すると高速二本鎖形成を示した。
ワトソン－クリックの相補的塩基対の数：５
５’ｇｇａａｇ ３’／５’ｃｔｔｃｃ ３’は、高速二本鎖形成で見出された；
（それぞれ、配列番号３４及び配列番号３３）。
５’ｇｇａｇｃ ３’／５’ｇｃｔｃｃ ３’は、二本鎖形成が速いことがわかった。
（それぞれ、配列番号４３及び配列番号４２）。
ワトソン－クリックの相補的塩基対の数：６
５’ａｃｃａａｃ ３’／５’ｇｔｔｇｇｔ ３’は、二本鎖形成が速いことがわかった。
（それぞれ、配列番号２０及び配列番号１６）。
５’ｔｔｔｔｔｔ ３’／５’ａａａａａａ ３’は、二本鎖形成が速いことがわかった。
（それぞれ、配列番号２７及び配列番号３９）。
５’ｇｇａｇｃａ ３’／５’ｔｇｃｔｃｃ ３’は、二本鎖形成が速いことがわかった。
（それぞれ、配列番号４５及び配列番号４４）。
５’ｃｔｇｔｃａ ３’／５’ｔｇａｃａｇ ３’は、二本鎖形成が速いことがわかった。
（それぞれ、配列番号４０及び配列番号４１）。
５’ｇｇａａｇａ ３’／５’ｔｃｔｔｃｃ ３’は、二本鎖形成が速いことがわかった。
（それぞれ、配列番号３６及び配列番号３５）。
ワトソン－クリックの相補的塩基対の数：８
５’ｃａｇｇａｇｃａ ３’／５’ｔｇｃｔｃｃｔｇ ３’は、二本鎖形成が速いことがわかった。
（それぞれ、配列番号２及び配列番号１）。
ワトソン－クリックの相補的塩基対の数：９
５’ｇｇａａｇａｇａａ ３’／５’ｔｔｃｔｃｔｔｃｃ ３’は、二本鎖形成が速いことがわかった。
（それぞれ、配列番号３８及び配列番号３７）。
ワトソン－クリックの相補的塩基対の数：１５
５’ｃａｃｃａａｃａｃａｃｃａａｃ ３’／５’ｇｔｔｇｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｇ ３’は、二本鎖形成が速いことがわかった。
（それぞれ、配列番号３２及び配列番号３１）。
通常、前述の結合対の第１のオリゴを、最初の実験で説明されるように、Ｂｉ－Ｈｅｇコンジュゲートとして使用した。
説明については、図１１～図１７を参照されたい。
ｃ）ゆっくりと二本鎖を形成する配列の同定
可能なワトソン－クリック相補的塩基対の数：１０
５’ｃｇｔｃａｇｇｃａｇ ３’／５’ｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ ３’は、二本鎖形成が遅いことがわかった。
（それぞれ、配列番号６及び配列番号５）。
可能なワトソン－クリック相補的塩基対の数：１５
５’ｃｇｔｃａｇｇｃａｇｔｔｃａｇ ３’／５’ｃｔｇａａｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ ３’は、二本鎖形成が遅いことがわかった。（それぞれ配列番号４７及び４８）。
説明については、図１８～図２０及び図２１～図２３を参照されたい。
図２０は、遅いハイブリダイゼーションを示す結合対の同定を示す。５’－ｃｔｇａａｃｔｇｃｃｔｇａｃｇ－３’（配列番号４８）と組み合わせた混合ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ｃｇｔｃａｇｇｃａｇｔｔｃａｇ－３’（５’修飾された配列番号４７）の比率の計算。
Figure 2022535580000005
 ＨＰＬＣ％＊ε－１１０００（ＬＮＡ二本鎖）／ＨＰＬＣ％＊ε－１１０００（ＬＮＡ一本鎖）＝０．１０４／０．２３７＝０．４４
実施例４
生体特異的相互作用分析、第２のＬＮＡオリゴヌクレオチドと接触した固定化された第１のＬＮＡオリゴヌクレオチド、３つの異なるモチーフ；２５℃及び３７℃での速度論的特性
ａ）アプローチの概要
・ １２の異なるオリゴヌクレオチドＬＮＡ配列を設計し、最終的にビオチン化した（Ｂｉ－ＬＮＡ配列）
・ ７つのＬＮＡオリゴヌクレオチド配列を、２５℃／３７℃で１２の固定化Ｂｉ－ＬＮＡ配列への結合について分析した。
・ 流速６０μｌ／分で３分の会合時間と５つのそれぞれ３０分の解離時間
・ ＬＮＡサンプルを、メーカーの推奨に従って、ＲＴ（室温）で一晩、わずかに塩基性の干渉液でプレインキュベートした（化学的不活性化）。
・ 試験セットアップを図２４に示す。
ｂ）技術的手順
速度論的調査を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ ８ｋ機器で実施した。
Ｂｉａｃｏｒｅビオチン捕捉キット、シリーズＳセンサー（カタログ番号２８－９２０２－３４）を機器に据え付け、製造元の説明書により、流体力学的にアドレス指定し、事前調整した。システム緩衝液はＨＢＳ－Ｔ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）であった。試料緩衝液はシステム緩衝液であった。製造業者であるＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供するビオチン捕捉試薬をシステム緩衝液で１：５０に希釈し、全ての測定フローセルに１０μｌ／分で６０秒間注入した。参照細胞は固定化されず、ブランク対照のままであった。１０ｎＭのそれぞれのビオチン化リガンドを３０μｌ／分で注入し、４ＲＵ～３０ＲＵのリガンド捕捉レベルを得た。溶液中の一連の分析対象物の濃度を６０μｌ／分で３分間注入した。解離を５分間モニターした。高親和性相互作用を３０分の解離時間モニターした。分析対象物の濃度系列は、０ｎＭ（バッファー）、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、３ｎＭ、９ｎＭ、２７ｎＭであった。別の実施形態では、０ｎＭ、０．５６ｎＭ、１．６７ｎＭ、５ｎＭ、１５ｎＭ及び４５ｎＭであった。ＣＡＰセンサーを、１００ｍＭ ＮａＯＨを１分間注入することで完全に再生した。速度論的データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して決定した。
結果
３つの異なる配列モチーフを表す７つの異なるＬＮＡオリゴヌクレオチドを、２５℃と３７℃の２つの異なる温度で、様々な長さの配列を持つ１２の異なる相補的ビオチン化ＬＮＡオリゴヌクレオチド（Ｂｉ－ＬＮＡ）の結合について分析した。
ＳＰＲ測定では、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を界面活性剤として使用した。
初期モル比ＭＲ＝１．０～０．７（データは示していない）は１：１の結合を示し、ＭＲは分析サイクル中に減少し（ＭＲ＝０．５～０．３）、おそらく再生工程での過酷な塩基性ｐＨの使用によるストレプトアビジン表面の不活性化が原因である。
モチーフ「配列１」
９ｍｅｒ ＬＮＡは、モチーフ１の相補的Ｂｉ－ＬＮＡ７－９ｍｅｒへの結合を示した。
３７℃で’’Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ｃａｇｇａｇｃａ ３’（５’修飾された配列番号２）’及び’Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ｃａｇｇａｇｃ ３’（５’修飾された配列番号１５）は、（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’－タグの有無にかかわらず、相補的オリゴヌクレオチド５’ｔｇｃｔｃｃｔｇｔ ３’（配列番号９）’との高い複合体安定性を示した。
ｔ／２ ｄｉｓｓ（Ｂｉ－ＬＮＡ ７及び８ｍｅｒ／９ｍｅｒ）＝＞２４７／２２８分、
ｔ／２ ｄｉｓｓ（Ｈｅｇ４－ＭＨ５’を含むＢｉ－ＬＮＡ ７及び８ｍｅｒ／９ｍｅｒ））＝＞７３４／８００分、高親和性を生じた（ＫＤ＝６～９ｐＭ）：
「配列２」－ＬＮＡとのハイブリダイゼーションは、配列１ Ｂｉ－ＬＮＡ７－９ｍｅｒへの結合が弱いことを示した。
（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’－タグを含む９－ｍｅｒ Ａ配列’５’ａａａａａａａａａ’３’（配列番号２８）の結合は検出されない。
モチーフ「配列２」
様々な長さ（１２ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、８ｍｅｒ、７ｍｅｒ、及び６ｍｅｒ）のモチーフ２を表すＢｉ－ＬＮＡは、ＬＮＡモチーフ１又は３への結合を示さなかった。
様々な長さのモチーフ２－ＬＮＡ結合は、６～８ｍｅｒで同等の複合体形成を示し、１２ｍｅｒではわずかに遅い複合体形成のみを示した。
複合体安定性は様々である：Ｂｉ－ＬＮＡ ７ｍｅｒはこれらの実験で最も高い複合体の安定性を示し、Ｂｉ－ＬＮＡ ８ｍｅｒがそれに続いた。
ｔ／２ ｄｉｓｓ（Ｂｉ－ＬＮＡ ７ｍｅｒ／６ｍｅｒ）＝２３８分、
ｔ／２ ｄｉｓｓ（Ｂｉ－ＬＮＡ ７ｍｅｒ／７ｍｅｒ）＝７２０分、
ｔ／２ ｄｉｓｓ（Ｂｉ－ＬＮＡ ７ｍｅｒ／８ｍｅｒ）＝６４４分、
ｔ／２ ｄｉｓｓ（Ｂｉ－ＬＮＡ ８ｍｅｒ／７ｍｅｒ）＝５４５分、
ｔ／２ ｄｉｓｓ（Ｂｉ－ＬＮＡ ８ｍｅｒ／８ｍｅｒ）＝４３３分、高親和性をもたらす（ＫＤ＝１～５ｐＭ）
モチーフ２はモチーフ１よりも優れていると推定された
モチーフ「配列３」
５’修飾ポリＡ配列（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’配列５’ａａａａａａａａａ ３’（配列番号２８）’’を陰性対照として使用した。この対照は、ビオチン化配列１及び２のいずれにも結合を示さなかった。しかしながら、「グループ３」の相補的なＰｏｌｙ－Ｔ－配列で特異的結合が検出された。
３７℃では、ＬＮＡの長さが６～９ｍｅｒから１０００倍（ｔ／２ ｄｉｓｓ＝１～１１６０分超）に増加すると複合体安定性が大幅に向上し、複合体の形成が５５倍に減少し、結果として親和性はＫＤ＝３００ｐＭ～１０ｐＭの範囲であった。
－ｓｓＬ－ＤＮＡハイブリダイゼーションは、長さが６ｍｅｒから９ｍｅｒに増加するにつれて遅くなり、複合体安定性は持続的に高くなり、対になっていないヌクレオチドが２つを超えるオーバーハングは、ＰｏｌｙＡ／ＰｏｌｙＴ対合について複合体安定性を明らかに低下させた。
ｄ）結論
ストレプトアビジン：ビオチン結合対の代替品を提供することを念頭に置いて、すでに２５℃で非常に速い結合速度定数を持ち、３７℃での高い複合体安定性が持続する、低親和性（ｐＭ範囲にあることが望ましい）結合対を選択することが重要である。
モチーフ「配列２」を表す４～５個の相補的ＬＮＡ核酸塩基対合を有する全ＬＮＡオリゴヌクレオチド二本鎖は、飽和への迅速な結合及び高い複合体安定性を示すという点で、目的の結合対の要求を満たす。
迅速な会合を確保するため、結合対は、時間のかかる「ミスプライミング」中間体を回避するために可能な限り短くすることが望ましい。５’ｇｔｔｇｇｔ ３’ ’及びＢｉ－（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’ｇｔｔｇｇｔｇｔ ３’（５’修飾された配列番号１６）’に結合している’Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ｃａｃｃａａｃ ３’７ｍｅｒオリゴヌクレオチド、配列番号１９）は、ｔ／２ ｄｉｓｓ＝７２０、それぞれ６４４分で複合体形成及び複合体安定性を示し、３７℃で高い親和性（ＫＤ＝２ｐＭ）をもたらした。（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’ｇｔｔｇｇｔｇ ３’（５’修飾された配列番号２１）に結合及び（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’ｇｔｔｇｇｔｇｔ ３’（５’修飾された配列番号１３）’に結合している’Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ａｃａｃｃａａｃ ３’（８ｍｅｒ、５’修飾された配列番号１４）は、それぞれｔ／２ ｄｉｓｓ＝５４５及び４３３分で十分な複合体形成及び複合体安定性を示し、３７℃で高い親和性（ＫＤ＝２ｐＭ）をもたらした。
様々な長さのモチーフ「配列１」を有するＬＮＡは結合しなかった。陰性対照として、（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’－タグを含む配列 ５’ａａａａａａａａａ ３’（配列番号２８）を試験したが、「測定可能な分子間相互作用は観察されなかった。
実施例５
生体特異的相互作用分析
ａ）アプローチ及びアッセイのセットアップの概要
・ ＣＡＰ－Ｋｉｔを介した可逆的捕捉ストレプトアビジンコンジュゲート
・ ストレプトアビジンは相補的なｓｓ－ＬＮＡと結合している
・ ＳＣＭ上で事前に固定化されたｓｓ－ＬＮＡオリゴに可逆的なオリゴ結合
以下の決定：
・ 捕捉レベル（ＣＬ）、会合速度定数ｋａ、
・ 解離速度定数ｋｄ、
・ 解離平衡定数ＫＤ
・ モル比（ＭＲ）
・ 試験のセットアップを図５１Ａに示す。
・ 様々な長さ（６～８ｍｅｒ及び１２ｍｅｒ）の４つの遊離ＬＮＡコンストラクト「モチーフ２」及びＬＮＡ－Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞コンジュゲート（ＬＮＡ－Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞＝ＴＳＨ抗原に特異的な抗体Ｆａｂフラグメント）を、２５°／３７℃での相補的Ｂｉ－ＬＮＡ－配列への結合について分析した。
・ Ｂｉ－ＬＮＡ－配列を、可逆的Ｂｉｏｔｉｎ－Ｃａｐｔｕｒｅ－Ｋｉｔを介してＣＡＰ－Ｃｈｉｐ上のリガンドとして捕捉し、
・ 遊離ＬＮＡ又はＬＮＡ－Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞－コンジュゲートを溶液中の分析物として使用した
・ ハイブリダイゼーションを、３分の会合時間及び３０分の解離時間で分析した。
・ 流量６０μｌ／分
・ Ｃ（遊離ＬＮＡｓ）＝９～０．１ｎＭ、ｃ（ＬＮＡ－Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞－コンジュゲート）＝４５～０．６ｎＭ、ｃ（１２ｍｅｒＬＮＡ／Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞－コンジュゲート）＝４５～０．６ｎＭ
・ ＬＮＡサンプルは、顧客からの推奨に従い、わずかに塩基性の緩衝液中、ＲＴで一晩プレインキュベートした（化学的不活性化）
ｂ）試薬：配列「モチーフ２」
ビオチン化リガンド
’Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ａｃｃａａｃ ３’（配列番号２０）
ＢＭＯ ２８．５４２７４０，ＧＯ４０９４，ＩＤ ６６８１，６ｍｅｒ，ＭＷ ３．８ ｋＤａ
’Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ｃａｃｃａａｃ ３’（配列番号１９）
ＢＭＯ ２８．５４２７３９，ＧＯ４０９３，ＩＤ ６６８１，７ｍｅｒ，ＭＷ ４．１ ｋＤａ
’Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ａｃａｃｃａａｃ ３’（配列番号１４）
ＢＭＯ ２８．５４２７３８，ＧＯ４０９２，ＩＤ ６６８０，８ｍｅｒ，ＭＷ ４．４ ｋＤａ
’Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ｃａａｃａｃａｃｃａａｃ ３’（配列番号５２）
ＢＭＯ ２８．５４２７４２，ＧＯ４０９６，ＩＤ ６６８４，１２ｍｅｒ，ＭＷ ５．８ ｋＤａ
分析物
２３００／１０３（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’ｇｔｔｇｇｔ ３’（配列番号１６）’
ＢＭＯ ２８．１７０３３３，ＡＯ５８１，ＩＤ ６７１９，６ｍｅｒ，ＭＷ ３．８ ｋＤａ
２３００／１０４（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’ｇｔｔｇｇｔｇ ３’（配列番号２１）’
ＢＭＯ ２８．１７０３３４，ＡＯ５８２，ＩＤ ６７２０，７ｍｅｒ，ＭＷ ４．１ ｋＤａ
２３００／１０５（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’ｇｔｔｇｇｔｇｔ ３’（配列番号１３）’
ＢＭＯ ２８．１７０３３５，ＡＯ５８３，ＩＤ ６７２１，８ｍｅｒ，ＭＷ ４．４ ｋＤａ
２３００／１０２（ＨＥＧ）４－ＭＨ－５’ｇｔｔｇｇｔｇｔｇｔｔｇ ３’（配列番号５３）’
ＢＭＯ ２８．５４２７２７，ＧＯ４０７３，ＩＤ ６６５３，１２ｍｅｒ，ＭＷ ５．８ ｋＤａ
’ｍＡｂ＜ＴＳＨ＞Ｍ－Ｔｕ１．２０－Ｆ（ａｂ’）２－ＳＡＴＰ－Ｄ－ＬＮＡ－コンジュゲート
２３３１／１１１ ｍＡｂ＜ＴＳＨ＞Ｍ－Ｔｕ１．２０－Ｆ（ａｂ’）２－ＳＡＴＰ－Ｄ－ＬＮＡ－５’ｇｔｔｇｇｔ ３’（配列番号１６），６ｍｅｒ，ＭＷ １０４ ｋＤａ
２３３１／１１２ ｍＡｂ＜ＴＳＨ＞Ｍ－Ｔｕ１．２０－Ｆ（ａｂ’）２－ＳＡＴＰ－Ｄ－ＬＮＡ－５’ｇｔｔｇｇｔｇ ３’（配列番号２１），７ｍｅｒ，ＭＷ １０４ ｋＤａ
２３３１／１１３ ｍＡｂ＜ＴＳＨ＞Ｍ－Ｔｕ１．２０－Ｆ（ａｂ’）２－ＳＡＴＰ－Ｄ－ＬＮＡ－５’ｇｔｔｇｇｔｇｔ ３’（配列番号１３），８ｍｅｒ，ＭＷ １０４ ｋＤａ
２３３１／１１４ ｍＡｂ＜ＴＳＨ＞Ｍ－Ｔｕ１．２０－Ｆ（ａｂ’）２－ＳＡＴＰ－Ｄ－ＬＮＡ－５’ｇｔｔｇｇｔｇｔｇｔｔｇ ３’（配列番号５３），１２ｍｅｒ，ＭＷ １０６ ｋＤａ
ｍＡｂ＜ＴＳＨ＞Ｍ－Ｔｕ１．２０－Ｆ（ａｂ’）２は、ヒト甲状腺－刺激ホルモンであるＴＳＨに特異的なモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントを意味する。Ｄ－ＬＮＡは、後続の核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドがＤ－ＬＮＡモノマーで構成されていることを意味する。Ｄ－ＬＮＡオリゴヌクレオチドを使用した
ｃ）結果
上記の４つの異なる５’修飾ＬＮＡオリゴヌクレオチド、及び同じそれぞれの配列を有するがＦ（ａｂ’）２＜ＴＳＨ＞コンジュゲートに含まれるオリゴヌクレオチドは、６－、７－、８－及び１２ｍｅｒの長さの配列「モチーフ２」を表した。２５°／３７℃で相補的なＢｉ－ＬＮＡ－配列の結合について全てを分析した。
ハイブリダイズしたＬＮＡ－Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞コンジュゲートへのＴＳＨ結合（ＴＳＨが分析物）も分析した。
配列「モチーフ２」
様々な長さのＢｉ－ＬＮＡは、同等の複合体形成を示し、複合体安定性は、２５℃でｐＭ親和性範囲（ＫＤ ３～１０ｐＭ）でｔ／２ ｄｉｓｓ １５４～２３２分超の範囲である。３７℃では、複合体の形成はｐＭ親和性範囲（ＫＤ １１～２６ｐＭ）にある。遊離オリゴのハイブリダイゼーション速度は、２５℃及び３７℃で物質移動制限され（データは赤で示される）、ＳＷスクラバーを使用してＭＴＬの補正を行った。モル比（ＭＲ）０．８～１．１は、両方の温度で化学量論的な１：１のハイブリダイゼーションを示した。２５℃での１２ｍｅｒ会合相の過飽和。
ＬＮＡ－Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞コンジュゲートは、コンジュゲートしていないＬＮＡオリゴヌクレオチドと比較して、２～４倍の複合体形成の遅延を示した。Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞－ＬＮＡ－コンジュゲートのハイブリダイゼーション中にＭＴＬはない。複合体安定性ｔ／２ ｄｉｓｓ ２３２分超、２５℃でｐＭ親和性範囲（ＫＤ＝２２～１１ｐＭ）をもたらす。
３７℃では、ＦＡｂ＜ＴＳＨ＞－ＬＮＡコンジュゲート（７、８及び１２ｍｅｒ）は、同じ長さの遊離ＬＮＡと比較した場合、複合体形成に有意差を示さず、ｐＭ親和性範囲（ＫＤ＜１２～１４ｐＭ）の範囲で、複合体安定性ｔ／２ ｄｉｓｓ＞ ２３２分を示した。
ＬＮＡ－Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞コンジュゲートのモル比ＭＲ０．１～０．６は、化学量論以下の１：１結合を示した。様々な長さのハイブリダイズしたＬＮＡ－ＦＡｂ＜ＴＳＨ＞コンジュゲートへのＴＳＨ結合を分析した。ＬＮＡ－Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞コンジュゲート（６～８ｍｅｒ及び１２ｍｅｒ）へのＴＳＨ結合は、同等の速度論的プロファイルを示した。高速複合体形成及びｔ／２ ｄｉｓｓ ３１～３３分での十分な複合体形成、親和性ＫＤ＝０．７ｎＭをもたらす
結合定数は、この相互作用の既知の親和性範囲にある。
モル比（ＭＲ）１．８／１．９は、完全に機能的な化学量論的２：１結合を示し、機能的コンジュゲートの結合を示す。
ハイブリダイズしたＦａｂコンジュゲートは、コンジュゲート中の抗体部分の完全な抗原結合活性を示すことが見出された。結果 図５２を参照されたい。
次のデータについては、図５１Ｃも参照されたい。
Figure 2022535580000006
 表：４つの抗ｈＴＫ抗体のｈＴＫサンドイッチ形成を示すモル比エピトープアクセシビリティマトリックス。ＭＲＥＡ＝１、完全に独立したエピトープ、ＭＲＥＡ ＜１の重複エピトープ。
抗体Ａは、２３Ｃ１１、６Ｃ６、及び４Ｈ４と免疫複合体を形成することができる。２３Ｃ１１、６Ｃ６及び４Ｈ４は同じエピトープを共有する。
ｄ）代替アプローチ（図５１Ｂ、結果 図５３を参照されたい）
・ 様々な長さ（６、７、８、及び１２ｍｅｒ）のプレハイブリダイズしたＬＮＡ－ＦＡｂ＜ＴＳＨ＞コンジュゲートへのＴＳＨ結合を、３７℃で分析した。
・ アッセイフォーマットはスライド１０を参照されたい、結合プロファイルはスライド１１を参照されたい。
・ ３つのＢｉ－ＬＮＡ－配列をＦｃ２－４のＳＡチップに不可逆的に結合した
・ ＬＮＡ－Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞コンジュゲーション（６－、７－、及び８ｍｅｒ）は、３７℃で相補的なＢｉ－ＬＮＡとプレハイブリダイズした
・ ＴＳＨを、３分の結合時間及び５分の解離時間
・ 流量６０μｌ／分、ｃＴＳＨ＝２７０ｎＭで分析物溶液として使用した
図５３を参照されたい。
実施例６
生体特異的相互作用分析
ａ）アプローチ及びアッセイのセットアップの概要
・ 実験の概略図を図５４に示す。
・ 様々な長さ（５、－６、９、又は１５ｍｅｒ）の遊離ＬＮＡコンストラクトと配列を、２５°／３７℃で相補的なＢｉ－ＬＮＡ配列（４、６、９、又は１５ｍｅｒ）への結合について分析した。
・ Ｂｉ－ＬＮＡ－配列を、可逆的Ｂｉｏｔｉｎ－Ｃａｐｔｕｒｅ－Ｋｉｔを介してＣＡＰ－Ｃｈｉｐ上のリガンドとして捕捉した
・ 溶液中の分析物として遊離ＬＮＡを使用した
・ ハイブリダイゼーションを、３分の会合時間及び３０分の解離時間で分析した。
・ 流量６０μｌ／分
・ Ｃ（遊離ＬＮＡｓ）＝相互作用ごとに最適化
以下の決定：捕捉レベル（ＣＬ）、会合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ、解離平衡定数ＫＤ、モル比（ＭＲ）。
事前に固定化されたｓｓ－ＬＮＡオリゴに可逆的な相補的ｓｓ－ＬＮＡオリゴ結合とコンジュゲート化されたストレプトアビジン（＝ＳＡ）である、ＣＡＰ－Ｋｉｔを介して可逆的に捕捉されたＳＡ－コンジュゲート
ｂ）試薬
ビオチン化リガンド
２３８７／Ｌ０１ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ａｃｃａａｃ ３’（配列番号２０）
ＢＭＯ ２８．１７０３４１，ＡＯ５９１，ＩＤ ６７３０，６ｍｅｒ，ＭＷ ２．７１ ｋＤａ
２３８７／Ｌ０２ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ｃａｃａｃｃａａｃ ３’（配列番号３０）
ＢＭＯ ２８．１７０３４２，ＡＯ５９２，ＩＤ ６７３１，９ｍｅｒ，ＭＷ ３．７１ ｋＤａ
２３８７／Ｌ０３ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ｃａｃｃａａｃａｃａｃｃａａｃ ３’（配列番号５４）
ＢＭＯ ２８．１７０３４３，ＡＯ５９３，ＩＤ６７３２，１５ｍｅｒ，ＭＷ ５．７３ ｋＤａ
２３８７／Ｌ０４ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ｇｇａａｇ ３’（配列番号３４）
ＢＭＯ ２８．１７０３４７，ＡＯ５９７，ＩＤ６７３６，５ｍｅｒ，ＭＷ ２．４４ ｋＤａ
２３８７／Ｌ０５ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ｇｇａａｇａ ３’（配列番号３６）
ＢＭＯ ２８．１７０３４８，ＡＯ５９８，ＩＤ ６７３７，６ｍｅｒ，ＭＷ ２．７８ ｋＤａ
２３８７／Ｌ０６ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ｇｇａａｇａｇａａ ３’（配列番号３８）
ＢＭＯ ２８．１７０３４９，ＡＯ５９９，ＩＤ ６７３８，９ｍｅｒ，ＭＷ ３．８２ ｋＤａ
２３００／１２ Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ｔｔｔｔｔｔ ３’（配列番号２７）
ＢＭＯ ２８．１７０３３６，ＡＯ５８４，ＩＤ ６７２２，６ｍｅｒ，ＭＷ ３．７１ ｋＤａ
２３８７／Ｌ０８ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ｃｔｇｔｃａ ３’（配列番号４０）
ＢＭＯ ２８．１７０３５４，ＡＯ６０４，ＩＤ ６７４３，６ｍｅｒ，ＭＷ ２．７１ ｋＤａ
２３８７／Ｌ０９ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ｃｇｔｃａｇｇｃａｇｔｔｃａｇ ３’（配列番号５５）
ＢＭＯ ２８．１７０３５６，ＡＯ６０６，ＩＤ ６７４５，１５ｍｅｒ，ＭＷ ５．１２ ｋＤａ
２３８７／Ｌ１０ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ｇｇａｇｃ ３’（配列番号４３）
ＢＭＯ ２８．１７０３５８，ＡＯ６０８，ＩＤ ６７４７，５ｍｅｒ，ＭＷ ２．４３ ｋＤａ
２３８７／Ｌ１１ Ｂｉ－（ＨＥＧ）－５’ｇｇａｇｃａ ３’（配列番号４５）
ＢＭＯ ２８．１７０３６０，ＡＯ６１０，ＩＤ ６７４９，６ｍｅｒ，ＭＷ ２．７７ ｋＤａ
２３８７／Ｌ１２ Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’－ｃｃａａｃ ３’（配列番号４６）
ＢＭＯ ２８．５４２７４８，ＧＯ４１０５，ＩＤ ６７６４，５ｍｅｒ，ＭＷ ３．４０ ｋＤａ
２３８７／Ｌ１３ Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ｃａａｃ ３’（配列番号５６）
ＢＭＯ ２８．５４２７４９，ＧＯ４１０６，ＩＤ ６７６５，４ｍｅｒ，ＭＷ ３．０７ ｋＤａ
２３８７／Ｌ１４ Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ｔｔｔｔｔ ３’（配列番号５７）
ＢＭＯ ２８．５４２７５０，ＧＯ４１０７，ＩＤ ６７６６ ５ｍｅｒ，ＭＷ ３．３８ ｋＤａ
２３８７／Ｌ１５ Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－５’ｔｔｔｔ ３’（配列番号５８）
ＢＭＯ ２８．５４２７５１，ＧＯ４１０８，ＩＤ ６７６８ ４ｍｅｒ，ＭＷ ３．０５ ｋＤａ
分析物
２３８７／Ａ０１ ３’－ＴＧＧ ＴＴＧ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３４４，ＡＯ５９４，ＩＤ，６７３３，６ｍｅｒ，ＭＷ ２．０１ ｋＤａ
２３８７／Ａ０２ ３’－ＧＴＧ ＴＧＧ ＴＴＧ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３４５，ＡＯ５９５／ ＩＤ ６７３４，９ｍｅｒ，ＭＷ ３．０５ ｋＤａ
２３８７／Ａ０３ ３’－ＧＴＧ ＧＴＴ ＧＴＧ ＴＧＧ ＧＴＴ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３４６，ＡＯ５９６，ＩＤ ６７３５，１５ｍｅｒ，ＭＷ ５．１２ ｋＤａ
２３８７／Ａ０４ ３’－ＣＣＴ ＴＣ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３５０，ＡＯ６００，ＩＤ ６７３９，５ｍｅｒ，ＭＷ １．６０ ｋＤａ
２３８７／Ａ０５ ３－’ＣＣＴ－ＴＣＴ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３５１，ＡＯ６０１，ＩＤ ６７４０，６ｍｅｒ，ＭＷ １．９３ ｋＤａ
２３８７／Ａ０６ ３’－ＣＣＴ ＴＣＴ ＣＴＴ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３５２，ＡＯ６０２，ＩＤ ６７４１，９ｍｅｒ，ＭＷ ２．９２ ｋＤａ
２３８７／Ａ０７ ３’－ＡＡＡ ＡＡＡ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３５３，ＡＯ６０３，ＩＤ ６７４２，６ｍｅｒ，ＭＷ １．９９ ｋＤａ
２３８７／Ａ０８ ３’－ＧＡＣ ＡＧＴ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３５５，ＡＯ６０５，ＩＤ ６７４４，６ｍｅｒ，ＭＷ ２．００ ｋＤａ
２３８７／Ａ０９ ３’－ＧＣＡ ＧＴＣ ＣＧＴ ＣＡＡ ＧＴＣ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３５７，ＡＯ６０７，ＩＤ ６７４６，１５ｍｅｒ，ＭＷ ５．０４ ｋＤａ
２３８７／Ａ１０ ３’－ＣＣＴ ＣＧ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３５９，ＡＯ６０９，ＩＤ ６７４８，５ｍｅｒ，ＭＷ １．６２ ｋＤａ
２３８７／Ａ１１ ３’－ＣＣＴ ＣＧＴ－５’
ＢＭＯ ２８．１７０３６１，ＡＯ６１１，ＩＤ ６７５０，６ｍｅｒ，ＭＷ １．９５ ｋＤａ
ｃ）結果
異なる配列を持つ１１のＬＮＡを、それらの相補的なＢｉ－ＬＮＡ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓへの結合について分析した。さらに、長さの異なる２つのＢｉ－ＬＮＡ（５ｍｅｒ及び４ｍｅｒ）と遊離ＬＮＡ ６ｍｅｒとの対合を、２５°／３７℃で分析した。
配列「モチーフ２」（２３８７／Ｌ０１－Ｌ０３）及び「Ｓｈｏｒｔモチーフ２」（２３８７／Ｌ１２＆Ｌ１３）６ｍｅｒ及び９ｍｅｒ Ｂｉ－ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＡＣＣ ＡＡＣ－３’及び５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＡＣ－３’は、それらの相補的ＬＮＡ ６ｍｅｒ ３’－ＴＧＧ ＴＴＧ－５’、９ｍｅｒ ３’－ＧＴＧ ＴＧＧ ＴＴＧ－５’それぞれへの高い親和性結合を示す。速度論的な特性は、高速ハイブリダイゼーション、複合体安定性が ｔ／２ ｄｉｓｓ＝１６０～２３２分超及び２５°と３７℃でのｐＭ親和性範囲（ＫＤ＝１～９ｐＭ）で持続的に高いことを特徴とし、ハイブリダイゼーション速度は２５℃と３７℃で物質移動制限されており、ＭＴＬの補正も行われた。
モル比（ＭＲ）１．１／１．２は、６ｍｅｒ対の両方の温度での化学量論的１：１ハイブリダイゼーションを示し、ＭＲ１．３／１．５は、９ｍｅｒ対の化学量論的結合が過剰であることを示している。Ｂｉ－ＬＮＡ １５ｍｅｒは、６及び９ｍｅｒと比較してハイブリダイゼーション速度が遅くなり、親和性がわずかに低くなる。両方の温度でＫＤ＝２４／５３ｐＭ、ＭＲ１．３は、わずかに化学量論的に過剰な結合を示す。
５ｍｅｒ（２３８７／Ｌ１２）Ｂｉ－ＬＮＡ ５’Ｂｉ－４ｘ（ＨＥＧ）－ＣＣＡ ＡＣ－３’遊離６ｍｅｒ－ＬＮＡ ３’－ＴＧＧ ＴＴＧ－５’に結合すると、２桁のｐＭ親和性範囲を伴って低下した複合体安定性ｔ／２ ｄｉｓｓ＝５０分を示し、４ｍｅｒ（２３８７／Ｌ１３）５’Ｂｉ－４ｘ（ＨＥＧ）－ＣＡＡ Ｃ－３’に結合すると、複合体安定性はｔ／２ ｄｉｓｓ ＜１分に低下し、２桁のｎＭ親和性が得られる。ＭＲ １．１～１．３は、化学量論的結合がわずかに過剰であることを示している。
したがって、１つ又は２つの一致しないヌクレオチドとのオーバーハングは、この場合、複合体安定性をある程度低下させると解釈される可能性がある。
「モチーフ３」Ｐｏｌｙ－Ｔ 対照「ｓｈｏｒｔ」（２３００／１２及び２３８７／Ｌ１４＆Ｌ１５）；様々な長さ（５及び６ｍｅｒ）の３つのＰｏｌｙＴ－対照Ｂｉ－ＬＮＡはＰｏｌｙＡ－６ｍｅｒへの結合を示し、典型的な高速オン／オフプロファイル、２５°及び３７℃での複合体半減期ｔ／２ ｄｉｓｓ＜２分を示し、Ｂｉ－ＬＮＡ ４ｍｅｒは、ＰｏｌｙＡ－６ｍｅｒへの結合が弱いか全くないことを示している。
「モチーフ４」（２３８７／Ｌ０４－Ｌ０６）５、６又は９ｍｅｒ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＧＧＡ ＡＧ－３’、５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＧＧＡ ＡＧＡ－３’、又は５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＡＡ－３’は、相補的なＬＮＡに結合する場合、「モチーフ２」より劣り、複合体半減期 ｔ ／２ ｄｉｓｓ ２０～６５分、２５℃で２～３桁のｐＭ親和性が得られる。
「モチーフ５」（２３８７／Ｌ０８）５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＣＴＧ ＴＣＡ－３’の相補的ＬＮＡ ３’－ＧＡＣ ＡＧＴ－５’への結合は、６ｍｅｒよりもわずかに遅いハイブリダイゼーションを示す。
「モチーフ２」、２５°及び３７℃で２桁のｐＭ親和性の複合体安定性。モル比０．３／０．４は、化学量論以下の結合を示す。
「モチーフ６」（２３８７／Ｌ０９）３’－ＧＣＡ ＧＴＣ ＣＧＴ ＣＡＡ ＧＴＣ－５’を結合している１５ｍｅｒ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＣＧＴ ＣＡＧ ＧＣＡ ＧＴＴ ＣＡＧ－３’は、ハイブリダイゼーションの速度低下及び複合体安定性の低下によって引き起こされる１桁のｎＭ親和性相互作用を示し、モル比０．１／０．４は、化学量論以下の結合を示す。
「モチーフ７」（２３８７／Ｌ１０及びＬ１１）
５ｍｅｒ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＧＧＡ ＧＣ－３’は、相補的なＬＮＡに結合する６ｍｅｒ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＧＧＡ ＧＣＡ－３’を上回り、複合体の半減期 ｔ／２ ｄｉｓｓ １７４～６２分、２５℃で３２／１８６ｐＭの親和性範囲であり、５ｍｅｒは３７℃で２９ｐＭの相互作用を示し、モル比ＭＲ０．５／０．３は２５℃で化学量論以下の結合を示し、３７℃で増加（ＭＲ１．２／０．６）した。
ｄ）結論
Ｂｉ－ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＡＣＣ ＡＡＣ－３’と５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＡＣ－３’（「モチーフ２」）はどちらも、相補的なＬＮＡ ６ｍｅｒ ３’－ＴＧＧ ＴＴＧ－５’、９ｍｅｒ ３’－ＧＴＧ ＴＧＧ ＴＴＧ－５’それぞれへの高親和性結合を示す。モル比は、完全に機能する１：１のＬＮＡハイブリダイゼーションを示す。５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＡＣＣ ＡＡＣ－３’／３’－ＴＧＧ ＴＴＧ－５’は、複合体安定性が２倍向上したため、５’－Ｂｉ－（ＨＥＧ）４－ＡＣＣＡＡＣ－３’／３’－ＴＧＧ－ＴＴＧ－５’－Ｈｅｇ４－ＭＨ－５’と比較して、わずかに改善されたハイブリダイゼーション速度を示す。
実験で使用されたセンサー表面で捕捉されたＢｉ－ＬＮＡ ５’－Ｂｉ－Ｈｅｇ－ＡＣＣ ＡＡＣ－３’の絶対密度は、ベンダー情報１０００ＲＵ＝１ｎｇ／ｍｍ２に基づいて、１１ｆｍｏｌ／ｍｍ２（３０ｐｇ／ｍｍ２）であった。ハイロゲルでは、０．３ｍｇ／ｍＬの濃度に対応すると想定される。

Claims (22)

  1. ０℃～４０℃の温度の水溶液中で、５～１５個の連続した塩基対を持つ逆平行二本鎖を形成することができる一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する方法であって、
    （ａ）５～１５個のロック核酸（ＬＮＡ）モノマーからなる第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、各モノマーが核酸塩基を含み、前記第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基が第１の核酸塩基配列を形成する、第１の一本鎖（ｓｓ－）オリゴヌクレオチドを提供する工程と、
    （ｂ）５～１５個のＬＮＡモノマーからなる第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが少なくとも前記第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドの数のモノマーを含み、前記第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの各モノマーが核酸塩基を含み、前記第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドの前記核酸塩基が第２の核酸塩基配列を形成し、前記第２の核酸塩基配列が逆平行配向で前記第１の核酸塩基配列に相補的な核酸塩基配列を含むか又はそれからなり、前記第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び前記第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが互いに逆平行二本鎖を形成する能力を予測し、前記予測される二本鎖が５～１５個の連続する塩基対を含むか又はそれからなり、各塩基対の２つの塩基が水素結合によって互いに結合している、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを提供する工程と、
    （ｃ）水溶液中でほぼ等モル量の前記第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び前記第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程であって、この工程が、非変性温度、より具体的には０℃～４０℃の温度で行われる、前記第１のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び前記第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドを混合する工程と、
    （ｄ）（ｃ）の混合物を２０分以下の時間間隔でインキュベートし、それにより、ｓｓ－オリゴヌクレオチドとして前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドを依然として含む混合物、又は二本鎖として前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドを含むか若しくはそれからなる混合物を得る工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）で得られた前記混合物中のｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを検出及び定量化する工程と、続いて、
    （ｆ）工程（ｅ）で二本鎖が検出可能に存在する場合、及び前記二本鎖のモル量がｓｓ－オリゴヌクレオチドのモル量よりも高い場合、前記結合対を選択する工程と、
    （ｇ）任意に、工程（ｆ）で選択された結合対の前記第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドと第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドとを別々に合成する工程と、を含み、
    それにより、前記一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの結合対を選択及び提供する、方法。
  2. 工程（ｅ）の前に、工程（ｄ）で得られた前記混合物を、ｓｓ－オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチドを分離する追加の工程に供する、請求項１に記載の方法。
  3. 工程（ｃ）及び工程（ｄ）が非変性温度、具体的には０℃～５℃、５℃～１０℃、１０℃～１５℃、１５℃～２０℃、２０℃～２５℃、２５℃～３０℃、３０℃～３５℃、及び３５℃～４０℃からなる群から選択される温度で実施される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 工程（ｃ）の前に、前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）のいずれかの各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが、変性条件の非存在下で維持される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 工程（ｃ）の前に、前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）のいずれかの各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが、－８０℃～４０℃、具体的には０℃～４０℃、より具体的には２５℃～３７℃の温度で水溶液中に保持される、請求項４に記載の方法。
  6. 工程（ｄ）において、前記時間間隔が、１秒～２０分、１秒～５分、１秒～６０秒、及び１秒～３０秒からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程（ｃ）及び工程（ｄ）が、２０塩基対の長さの、５０％のＧ＋Ｃ含有量を有するＤＮＡ二本鎖の融解温度を少なくとも１５℃低下させることができる変性剤化合物の非存在下で、より具体的にはホルムアミド及びジメチルスルホキシドのいずれも非存在で、実施される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 各ＬＮＡモノマーが、Ｎ４－アセチルシトシン、５－アセチルウラシル、４－アミノ－６－クロロピリミジン、４－アミノ－５－フルオロ－２－メトキシピリミジン、６－アミノ－１－メチルウラシル、５－アミノオロチン酸、５－アミノウラシル、６－アミノウラシル、６－アザウラシル、Ｎ４－ベンゾイルシトシン、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、６－クロロウラシル、６－クロロメチルウラシル、６－クロロ－３－メチルウラシル、シトシン、５，６－ジメチルウラシル、５－エチルウラシル、５－エチニルウラシル、５－フルオロシトシン、５－フルオロオロチン酸、５－フルオロウラシル、５－ヨード－２，４－ジメトキシピリミジン、５－ヨードウラシル、イソシトシン、５－メチルシトシン、６－メチル－５－ニトロウラシル、２－メチルチオ－４－ピリミジノール、５－メチル－２－チオウラシル、６－メチル－２－チオウラシル、６－メチルウラシル、５－ニトロウラシル、オロチン酸、６－フェニル－２－チオウラシル、６－プロピル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、チミン、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、ウラシル、アデニン、８－アザヒポキサンチン、８－アザグアニン、アロプリノール、４－アミノピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、２－アミノプリン、２－アセトアミド－６－ヒドロキシプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２－アミノ－６－ヨードプリン、アザチオプリン、４－アミノ－６－ヒドロキシピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン、アミノフィリン、Ｎ６－ベンジルアデニン、Ｎ６－ベンゾイルアデニン、６－ベンジルオキシプリン、８－ブロモテオフィリン、８－ブロモ－３－メチルキサンチン、８－ブロモ－７－（２－ブチン－１－イル）－３－メチルキサンチン、６－クロロプリン、８－クロロテオフィリン、６－クロロ－２－フルオロプリン、６－クロロ－７－デアザプリン、２－クロロアデニン、６－クロロ－７－ヨード－７－デアザプリン、２，６－ジアミノプリン、２，６－ジクロロプリン、６－（ジメチルアミノ）プリン、２，６－ジクロロ－７－デアザプリン、５，６－ジクロロベンズイミダゾール塩酸塩、７－デアザヒポキサンチン、２－フルオロアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、９－（２－ヒドロキシエチル）アデニン、イソグアニン、３－ヨード－１Ｈ－ピラゾロ－［３，４－ｄ］ピリミジン－４－アミン、キネチン、６－メルカプトプリン、６－メトキシプリン、３－メチルキサンチン、１－メチルキサンチン、３－メチルアデニン、Ｏ６－（シクロヘキシルメチル）グアニン、６－チオグアニン、２－チオキサンチン、キサンチン、５－プロピニル－ウラシル、５－プロピニル－シチジン、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－プロピニル－７－デアザアデニン、７－プロピニル－７－デアザグアニン、及びその誘導体からなる群から選択される核酸塩基を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 各ＬＮＡモノマーが、アデニン、チミン、ウラシル、グアニン、シトシン、及び５－メチルシトシンからなる群から選択される核酸塩基を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 一又は複数のシトシンが存在する場合、それが５－メチルシトシンで置き換えられている、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 各シトシンが５－メチルシトシンで置き換えられている、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）のいずれかの前記ｓｓ－オリゴヌクレオチドの前記モノマーがベータ－Ｌ－ＬＮＡモノマーである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対であって、各ｓｓ－オリゴヌクレオチドが５～１５個のＬＮＡモノマーからなり、水溶液中の前記別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドが、二本鎖形成前又は二本鎖形成中の変性条件の非存在下で互いに逆平行二本鎖を形成することができる、別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
  14. ｓｓ－オリゴヌクレオチドの前記対が、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法を実施することによって得られる、請求項１１に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
  15. 前記対が、
    （配列番号１）：（配列番号２）、
    （配列番号９）：（配列番号１０）、
    （配列番号１１）：（配列番号１２）、
    （配列番号１３）：（配列番号１４）、
    （配列番号１５）：（配列番号１６）、
    （配列番号１６）：（配列番号２０）、
    （配列番号１７）：（配列番号１８）、
    （配列番号１９）：（配列番号２０）、
    （配列番号２１）：（配列番号２２）、
    （配列番号２３）：（配列番号２４）、
    （配列番号２５）：（配列番号２６）
    からなる群から選択される、請求項１３又は１４に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
  16. 前記対の第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドが第１の標的に付着し、第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが第２の標的に付着する、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
  17. 標的が、固相、生体分子、及び化学的に合成された化合物からなる群から独立して選択される、請求項１６に記載の別々の相補的ｓｓ－オリゴヌクレオチドの対。
  18. 変性条件の非存在下で逆平行全ＬＮＡ二本鎖を形成する方法であって、
    （ａ）請求項１３又は請求項１４に記載の一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーと第２のメンバーとを別々に提供する工程であって、各一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドを変性剤の非存在下で水溶液に別々に溶解させ、０℃～４０℃の温度に保持する、一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーと第２のメンバーとを別々に提供する工程と、
    （ｂ）変性剤の非存在下で、０℃～４０℃の温度で前記対の一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドを互いに接触させる工程と、を含み、
    それにより、前記逆平行全ＬＮＡ二本鎖を形成する、方法。
  19. 一本鎖全ＬＮＡオリゴヌクレオチドの対の第１のメンバー及び前記第２のメンバーによって形成される逆平行二本鎖であって、請求項１８に記載の方法によって得られる、逆平行二本鎖。
  20. 分析物を決定するための受容体ベースのアッセイにおける、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対の使用であって、前記受容体ベースのアッセイが、分析物特異的受容体と、前記分析物を固相に固定化するための前記固相とを含み、前記対の前記第１のｓｓ－オリゴヌクレオチドが前記分析物特異的受容体に結合され、前記対の前記第２のｓｓ－オリゴヌクレオチドが前記固相に結合される、使用。
  21. 分析物を決定するための受容体ベースのアッセイを実施するためのキットであって、第１の容器内に、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーを付着させた分析物特異的受容体を含み、前記キットが、第２の容器内に、前記対の第２のメンバーを付着させた固相を更に含む、キット。
  22. 分析物を決定するための受容体ベースのアッセイを実施する方法であって、前記分析物を、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の別々のｓｓ－オリゴヌクレオチドの対の第１のメンバーを付着させた分析物特異的受容体、及び前記対の第２のメンバーを付着させた固相と接触させ、インキュベートする工程を含み、それにより、前記固相、前記固相に結合した前記分析物特異的受容体、及び前記分析物特異的受容体に結合した前記分析物を含む複合体を形成し、逆平行二本鎖が形成され、前記二本鎖が前記対の前記第１のメンバー及び前記第２のメンバーからなり、前記二本鎖が前記複合体において前記分析物特異的受容体及び前記固相を接続し、続いて前記複合体に結合した分析物を検出し、それによって前記分析物を決定する、方法。
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