WO1993023530A1

WO1993023530A1 - Novel protease

Info

Publication number: WO1993023530A1
Application number: PCT/JP1993/000592
Authority: WO
Inventors: Etsuo Nakamura; Hiroshige Tsuzuki; Kengo Kitadokoro; Masaru Shin; Hiroshi Teraoka
Original assignee: Shionogi Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1992-05-19
Filing date: 1993-04-30
Publication date: 1993-11-25
Also published as: EP0647710A1; ES2173888T3; DE69331742T2; US5665586A; EP0647710A4; JP3396033B2; EP0647710B1; ATE214731T1; DE69331742D1

Description

明細書

新規プロテア一ゼ

技術分野

本発明は、ポリべプチドのァミノ酸配列中のグルタミン酸残基のカルボキシル基側を開裂する新規プロテアーゼ、および該プロテア一ゼをコ一ドする D N A配列に関する。タンパク質（ポリペプチド）に作用して、グルタミン酸（

Glu) 残基のカルボキシル基側を特異的に開裂する酵素として、スタフイロコッカスァゥレウス（ St aphylococcus aureus) V 8株由来の V 8 プロテア一ゼが知られている（ Gabriel R . Drapeauら、 J. Biol. Chem. 247, 20, 6720-6726 (1972)) o この酵素はセリンプロテアーゼに分類される。 C. Carmonaら（ Nucl. Acids Res. , 15, 6757 ( 1987 )) は、この酵素をコードする DNA配列をクローンィ匕している。

同様の酵素としては、放線菌であるストレブトマイセスグリセウス（ Strep tomyces grlseus) 由来の酸性アミノ酸特異的ェンドぺプチダーゼも知られている（ Norio Yo shi daら、 J . Biochem. 104, 3, 451-456 (1988 )) ₀ 最近、 I . Svendsen らは、このストレブトマイセスグリセウスから精製した酸性ァミノ酸特異的ヱンドぺプチダーゼのァミノ酸配列を報告した ( FEBS LETTERS 292 165- 167 ( 1991 ) ) 。さらにノ ' シラスサチリス（Bacillus subtil is) 由来のグルタミン酸特異的エンドぺプチダーゼも知られている（Takuro Ni idomeら、 J. Biochem. 108, 965— 970 (1990) ) 。これらのプロテアーゼの中では、性質が調べられているものや、そのプロテアーゼに対する阻害物質が明らかになっているものもある（K. Nagat aら、 J. Biochem. 110, 859 -862 (1991)および T. Komiyama J . Biol. Che . 266, 17. 10727-10730 (1991)) 。

上記酵素は、タンパク質構造解析などの目的のためにタンパク質を上記位置で特異的に切断したい場合；遺伝子組換え技術により目的夕ンパク質を融合夕ンパク質として生産させた時に、該融合タンパク質を切断して目的のタンパク質を得る場合などに有用である。後者の場合では、例えば、目的夕ンパク質を Glu残基を介して他のタンパク質と結合させて生産した後、この酵素で切断処理することにより目的タンパク質を分離することができる。そのため、上記以外にもこのような酵素活性を有するプロテァーゼがさらに求められている。発明の開示

本発明の目的は、 G 1 u残基のカルボキシル基側を開裂する酵素活性を有する新規プロテアーゼ、および該プロテアーゼをコードする DNA配列を提供することにある。

発明者らは、上記微生物以外の微生物菌株から、酸性アミノ酸特異的エンドぺプチダーゼ（特にグルタミン酸特異的ェンドぺプチダ一ゼ）活性を有するプロテア一ゼを得ようと種々の検討を行った。その結果、ストレブトマイセスフラディ株由来の上記性質を有する新規プロテアーゼを見いだし、その性質を詳しく検討した。さらに、このプロテア一ゼをコードする DNA配列を決定して、本発明を完成するに至った。本発明のプロテアーゼは、ぺプチドのグルタミン酸残基のカルボキシル基を含むぺプチド結合を切断し、次の性質を有する：

( 1 ) 至適 p H：約 8. 2、および

( 2 ) 安定 p H範囲： 3 7 °Cにおいて 6. 0 〜 9. 0。

好ましい実施態様では、上記プロテアーゼは、ストレプトマイセスフラディ（ Streptomyces f radiae) 由来である。好ましい実施態様では、上記プロテアーゼは、ストレプトマイセスフラディ ATCC 14544株由来である。

好ましい実施態様では、上記プロテアーゼは、配列表の配列番号 1 の 1 位の Valから 1 8 7 位の Tyrまでのァミノ酸配列を含む。

本発明の D N A配列は、上記のいずれかに記載のプロテアーゼをコードする。好ましい実施態様では、上記 D N A配列は、配列表の配列番号 1 の 9 4 5 位の Gから 1 5 0 5 位の C までの塩基配列を有する。

好ましい実施態様では、上記 D N A配列は、配列表の配列番号 1 の— 1 7 0 位の Metから 1 8 7 位の Tyrまでのァミノ酸配列を含むプロテアーゼをコードする。

好ましい実施態様では、上記 D N A配列は、配列表の配列番号 1 の 4 3 5位の Aから 1 5 0 5 位の C までの塩基配列を有する。

本発明のプロテアーゼ（以下 S F a s e とする）は、ストレプトマイセス属菌、特にストレプトマイセスフラディに属する菌株により生産される。例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ ATCC) から入手できる、ストレプトマイセスフラディ ATCC 14 544株により生産される。図而の簡単な説明

第 1 図は、本発明の SF as eの成熟べプチド（上段）とストレブトマイセスグリセウス由来の同種酵素の成熟べプチド（下段）とのアミノ酸配列を比較した図である。点線で示してあるところは、同一のアミノ酸を意味する。

第 2 図は、本発明の SF as eを S-セファロースで溶出した時のパターンを示す図である。

発明を荬施するための最良の形態

以下に本発明を工程の順に詳細に説明する。

I . 培養条件

本発明の S F a s e は、ストレプトマイセスフラディ、例えば、ストレブトマイセスフラディ A TC C 14 544株を用いて生産される。 S F a s e を生産し得る菌株を培養する場合に、上記菌株の培地は、格別である必要はなく、通常の培地が甩いられる。例えば、グルコース、大豆粉、酵母エキス、コーンスティープリカ一、ポテトスターチ、各種塩類などを含有する培地が用いられる。培養 p Hは 5 〜 9、好ましくは、 p H約 7 . 0、培養温度は、 1 5 〜 5 0 °C、好ましくは、約 2 8 °Cであり、例えば好気的に攪拌あるいは振盪しながら約 3 〜 5 曰間培養を行う。 S F a s e は、主として細胞外に分泌される。

I I. 酵素の採取法

上記培養物から本発明の S F a s e を採取および精製するには、既知の製造法が単独で、あるいは組み合わされて利用され得る。例えば、培養液を遠心分離し、培養上清を得る。これを適当な手段で精製することにより本発明の酵素が得られる。

例えば、上記上清を硫酸アンモニゥム沈殿に供し、得られた沈鏺物を緩衝液に溶解させた溶液を、 s— セファロースを用いたクロマトグラフィーで分離する。次いで、ァフィニティ一クロマトグラフィーを行い、再度 s—セファロ一スにかけることにより、本酵素が得られる。後述の酵素の性質は、この酵素標品を用いて測定された。

I I I . 活性測定法

基質として Z-Phe-Leu-Glu-pNA (Zはカルボベンゾキシル基、そして pNAは p — 二トロア二リン残基を示す）を用い、該基質を、最終濃度が 0.2mMとなるように、 50mM Tris-HCl ( pH7.5.

2mM CaCl2および 2SKDMFを含有する）に溶解させる。これに酵素液を加え、 3 7 てにて 1 0 分間反応させる。酵素反応により遊離する反応液中の P — 二トロアニリンの吸光度を 4 1 0 n mにて測定する。吸光度が 1. 0 となるような酵素量を 1 単位（ U ) とする。

I V. 酵素の性質

本発明の S F a s e の酵素的並びにタンパク化学的性質を以下に示す。

( 1 ) 作用および基質特異性

①表 1 に示す合成基質を調製し、各合成基質を、表 1 に示す濃度となるように、 50mM Tris-HCl ( 2nM CaCl2および表 1 に示す割合でジメチルホルムアミド（ DMF) またはジメチルスルホキシド（DMS0) を含有する； p H 7. 5 ) に溶解させた。これに本酵素を加えて、 2 5 °Cにて反応させた。酵素反応により遊離する反応液中の p—二ト口ァニリンの吸光度（410η m) を測定することにより、 1 m gの基質から 1 分間に遊離される ρ — 二トロア二リンの量（ n m o l ) を算出した。その結果を表 1 に示す。

(以下余白）

基質特異性基質 «度（最終〉 A 4 ?k丄 ] 0 nm / 5 o /tn ΐ n n 溶媒 X

Z-Phe-Leu-Glu-pNA 0.20 DMF 0.2 319.1

Boc-Ala-Ala-Glu-pNA 0.20 DMF 2.0 126.2

Boc-A 1 a-A 1 a-Asp-pNA 0.20 DMF 2.0 14.3

Bz -Tyr-pNA 0.02 DMF 2.0 0 80

Z -Trp-pNA 0.20 DMF 2.0 0

Bz -Arg-pNA 0.50 DMSO 1.0 o

Z -Gly-Ser-pNA 0.20 DMF 2.0 0 ¾

Suc-Ala-Ala-Ala-pNA 0.20 0 ¾

1 -Ala-Ala-Leu-pNA 0.125 DMF 5.0 0 ¾

条件； 50 mM Tris-HCI. 2 nM CaCl₂ pH 7.5 25。C

検出： AUO nm

DMF ； N. N-Diraetylformaraide DMSO ； Dimetyl sulfoxide

Z- ： Benzylox carbonyl- Boc- ； t-Butoxycarbonyl-

Bz - ; Benzoyl- Sue- ； Succinyl- NA ； p-Nitroani 1 ide 酵素濃度 4.2"g/ral 23。C 15 分で A410nn の発色を検出しない.

一 ②タンパク性基質として、酸化ィンシュリン B鎖を選択し、該基質に対する本酵素の作用を調べた。まず、酸化インシュリン B鎮を 5 0 mM Tr is-HCl pH7.5、に溶解させ、酵素/ 基質- 1 / 1 3 9 ( /W) となるように本酵素を加えて所定時間反応させた。反応混合物を Vydac Protein C4カラムを用いた HPLCにかけ、 0.1%TFA中 0 %から 5 0 %のァセトニトリルを用いる直線濃度勾配で 3 0分間溶出を行った。このようにして得られるフラグメントをアミノ酸配列分析した。その結果、 Glul3— AlaUとの間の結合のみが切断されていることが判つた。

上記①および②の結果から、本発明の S F a s e は、ぺブチドのグルタミン酸残基のカルボキシル基を含むぺプチド結合を切断する、グルタミン酸特異的ェンドぺプチダーゼであることが明らかである。

( 2 ) 至適 p Hおよび安定 p H範囲

基質として Z-Phe-Leu-Glu-pNAを用い、該基質を 10%DMFを含む 5 OmMのバッファー（酢酸バッファー（ p H 3. 2 6. 1 ) 、リン酸ファー（ p H 5 · 5 8. 1 ) Tr i s-HC 1 ファー（ p H 6. 1 9. 8 ) 、グリシネート 'ッファー（ p H 9. 1 〜： L 1. 1 ) ) に溶解させた。これに本発明の S F a s e を加え、 2 5 °C 1 0分間反応させた。酵素反応により遊離する反応液中の P トロアニリンを吸光度 4 1 0 n mで測定した。上記反応液の P Hを変化させて反応を行つたところ、反応の至適 p Hは約 8. 2 であることがわかった。次に、各種 p H条件下で、本発明の S F a s e を 3 7 にて、 1. 5 時間放置した後、活性測定法に準じて反応を行い、残存活性を測定した。その結果、安定 P H範囲は 6. 0〜 9. 0 であることが判った。

( 3 ) 阻害剤の影響

各種阻害剤が本発明の S F a s e に対して及ぼす影響を表 2 に示す。本発明の S F a s e は、ジイソプロピノレフノレォロホスフェート（ DFP) により完全に阻害されるが、メタルプロテアーゼの阻害剤であるエチレンジアミンテトラ酢酸（ EDTA) および 0 — フユナント口リン（ 0P) により阻害を受けない。このことから本発明の S F a s e はセリンプロテア一ゼに分類されることが判る。

さらに本発明の S F a s e は、トリプシンあるいはキモトリプシンの阻害剤である Tosyl-Lys -ク口口メチノレケトン（TL CK) 、 Tosy卜 Phe-クロロメチルケトン（ TPCK) では阻害を受けないが、 Boc-Phe-Leu-Glu-クロロメチルケトンにより完全に阻害される。このことから、基質特異性で検討した結果と同様に、本発明の S F a s e は、グルタミン酸特異的エンドぺプチダーゼであることが判る。

(以下余白）

阻害阻害剤阻害剤濃度残存活性 00

]'ノト，* 100

Z-Phe-Leu-Gl u-CK 0. 5 mM 0

Boc-Al a-Ala-Al a-CK 0. 5 nM 102

TPC 0. 5 BM 101

TLC 0. 5 MM 112

DFP 2. 0 nM 7

DFP 0. 5 mM 20

DFP 0. 25πΜ 33

EDTA 10. 0 n 126

ELTA 1. 0 nM 113

EDTA 0. 1 mM 110

OP 10. 0 nM 104

OP 1. 0 nM 108

OP 0. 1 nM 106

Λ' フ T-: 50 mM Tris-HCl , 2. 0 mM CaClg p] フ'レキュへ' -シ 3ン: 37*C lhs 酵素： 1. 基質： 0. 2 n Z-Phe-Leu-Gl u-pNA 0. 2% DHF ( 4 ) 分子量

SDS-PAGE ( 1 5 %ゲル、 1. 0 m m ; 分子量マーカー： Am ershai^ RAINBOW¹ "Protein Molecular Weight Marker) により分子量の測定を行った結果、本酵素の分子量は、 19.000と算出された。後述する本酵素の遺伝子配列から明かとなったァミノ酸配列をもとにしてその分子量を計算すると 18, 702となり、 SDS-PAGEの値とよく一致した。

( 5 ) ァミノ酸組成

本発明の S F a s e を 4 Mメタンスルホン酸〔 0. 2 %の 3 — ( 2 — アミノエチル）インドールを含む〕を用いて 1 1 0 °Cで所定の時間（ 2 4、 4 8、および 7 2 時間）加水分解した。それぞれの加水分解産物を日立アミノ酸分析機（Mode 1 835 ) にかけてアミノ酸分析を行った。その結果を表 3 に示す。本酵素の D N A配列（後述）から明かとなったアミノ酸組成もあわせて示す。これらの結果はよく一致することが明らかである。

(以下余白）

表 3

ノ酸組成物

実験値 · cDNAから予想される値

Asp 19.4 18

Thr 21.5 21

Ser 22.9 23

Glu 5.9 5

Pro 2.9 3

Gly 33.5 31

Ala 20.5 19

Cys/2 4.4 4

Val 18.9 20

Met 1.1 1

He 6.1 7

Leu 5.9 5

Tyr 10.5 10

Phe 4.3 4

Lys 4.0 4

His 3.8 i

Arg 7.1 7

Tr 0.9 1

Res 一 187

Mol - 18702.4 ( 6 ) ァミノ酸部分配列

①ァミノ酸 N末端配列

アプライドバイオシステムズ社 4 7 7 A Protein Seque ncerを用いて N末端付近のァミノ酸配列分析を行った。分析にあたっては、予め DFPで阻害された本

酵素を用いた。 N末端から 3 1 残基までのアミノ酸配列を表 4 に示す（配列表の配列番号 1 の 1 位の Valから 3 1 位の Ala までのアミノ酸に相当する）。

(以下余白）

N末端配列アミノ酸 PBOl 工程アミノ酸 pool

1 Yal 2615.1 17 Ala 1048.6

2 Ala 1771.8 18 Phe 995.6

3 Gly 2175.8 19 Asn 670.1

4 Gly 2378.4 20 Val 1080.1

5 Asp 1097.2 21 Thr 660.4 g Ala 2195.4 22 Lys 410.8

7 lie 2180.3 23 Asn 455.1

8 Tyr 1341.4 24 Gly 979.0

9 Gly lOU.5 25 Val 1054.4

10 Gly 2154.5 26 Arg 647.2

11 Gly 2227. i 27 Tyr 464.9 t

12 Ser 430.6 2 & Phe 396.5

13 Arg 304.6 29 Leu. 514.0

14 X X 30 Thr 280.

15 Ser 443.0 31 Ala 580.5

16 Ala 1002.9

1 11 21 31

Y A G G D A I Y C G G S - S A A F N Y T N G Y R Y F L T A" ② C末端ァミノ酸配列

予め DFPで阻害した本酵素に、リジルェンドぺプチダーゼ（ Lysyl endopept i dase) を作用させた。反応は、 25raM Tris-H CI pH 7.5のノ、'ッファー中で、 S F a s e ：リシルエンドぺプチダーゼ = 4 0 : 1 の割合で、 2 4 °C、 6 時間行った。得られる各フラグメントを、 Yydac protein C4 ( 4.6x25 cm) を用いる HPLCにかけ、 0.1¾TFA中で、 2 0 — 6 0 %の CHsCNを用いる直線濃度勾配で、各種条件で分離する。フラグメントの分析の結果、ぺプチドの末端に塩基性ァミノ酸を持たないフラグメントを見いだし、このフラグメントを C末端のペプチドと同定した。この C末端のアミノ酸組成を表 5 に示す（配列表の配列番号 1 の 1 7 7 位の Gluから 1 8 7 位の Tyrまでのァミノ酸に相当する）。さらに S F a s e の内部に存在すると思われる配列も得た（表 6 ；配列表の配列番号 1 の 6 8位の Tyrから 7 5位の Argまでのアミノ酸に相当する）。

(以下余白）

c末端配列工程ァミノ酸 pmol 工程ァミノ酸 pnol

1 &lu 760.5 7 Gly 839.0

2 Ala 1176.9 8 Val 1047.5

3 Leu 1318.5 9 Asn 603.4

4 Ser 353.0 10 Val 955.5

5 Ala 1126.6 11 Tyr 951.4

6 Tyr 934.0

1 11

E A L S A Y G V N V Y

表 6

SFaseの E列（未知領域〉工程ァミノ酸 pool 工程アミノ酸 pmol

1 Tyr 1843.5 6 Asn 1460.9

2 Thr 2375.8 7 Val 2003.5

3 Tfar 2266.2 S Asp 1896.5

4 Thr 2713.1 9 Gly 1047.4

5 Thr 2921.1 10 Arg 620.4

1 10

■Y T T T T N V D G

V. S F a s e をコードする D N A の配列の決定

以下に、本発明を説明するうえで用いられる用語を説明する。

「オリゴヌクレオチド」とは、短い一本鎖 D N A を意味する ( ォリゴヌクレオチドは、既知の方法により化学合成することができる。本発明に用いるオリゴヌクレオチドは、特に明示しない限り、化学合成され、セフアデックス G 5 0 を用いたゲルクロマトグラフィ一および逆相シリ力ゲル力ラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC) により精製して得られる。

「 P C R」とは、ポリメラーゼチェーンリアクション（Po lymerase chain reaction) の略であり、 MA上の一定の領域を酵素的に増幅させる方法を意味する（Saikiら、 Science、 239.487-497 ( 1988)) 。まず、増幅したい D N Aを熱変性させて一本鎮とし、一本鎖の鋅型 D N Aのそれぞれの 3 ' 末端領域に栢捕的なオリゴヌクレオチドプライマー（センス鎖およびアンチセンス鎖の 2種類）をアニーリングさせる。次に、 D N Aポ I；メラ一ゼの作用によってそれぞれのプライマ一から D N A鎖の伸長反応を行わせる。この一連の反応を繰り返すことにより、目的 D N Aを 1 0 万倍〜 1 0 0万倍に増幅することができる。

「サザン分析」とは、ある制限酵素によって切断して得た D N A断片に目的の遺伝子が含まれているかどうかを検定するための方法である。サザン分析を行うには、まず、二本鎖 D N A上の特異的な塩基配列を認識して D N Aを切断する制限酵素で D N Aを消化する。得られた消化物の 1 %ァガロースゲル電気泳動を行い、アル力リ処理により変性させて一本鎖とし、ナイロンフィルターに移す。一方、問題とする遺伝子の一部であるオリゴヌクレオチドもしくは D N A断片を準備し、標識を施してプローブとする。このプローブとナイ口ンフィルター上の一本鎖 DNAとのハイプリッド形成により分析がなされる。次に、本発明の S F a s e をコードする D N A配列の決定方法を、工程の順に説明する。この D N A配列は、ストレブトマイセスフラディ ATCC 14544株のゲノム D N Aを、 P

C R解析、サザン分析、直接シークェンス法などを組み合わせて分析することにより決定された。

( 1 ) ゲノム D N A内部配列の P C R解析

S F a s e をコードする配列は、例えば、ゲノム D N Aから得ることができる。それ.には、まずストレブトマイセスフラディ ATCC 145"株のゲノム D N Aを、該菌株の培養細胞から既知の方法（ J. Marmurら、 J. Mol. Biol. (1961) 3, 2 08-218) に従って調製する。このゲノム D N Aを P C R解析の鍀型 D N A として用いる。 P C R に用いるォリゴヌクレオチドプライマ一は、上記 I V項の（ 6 ) で得られる精製酵素の N末端付近のアミノ酸配列；および該組成物を部分分解して得られるペプチドのアミノ酸配列に基づいて、常法により合成することができる。例えば、 S F a s e のアミノ酸配列の N末端側第 1 位から第 8位に相当するアミノ酸配列 Val A la Gly Gly Asp Ala lie Tyrをコードするォリゴヌクレオチド（但し、 C末端の Tyrをコードするトリプレツ卜の 2 番目の塩基まで； 2 3 m e r ) を化学合成し、センスプライマー S F 1 とする。ここでストレプトマイセスフラディは、 G C リツチであることが知られているので、縮重を考慮せずに 1 種類のオリゴヌクレオチドのみからなるプライマー（配列表の配列番号 2 ) を設定した。これとは別に、上記精製酵素をリジルエンドぺプチダ一ゼで部分分解して得られたぺプチドを配列決定した中で、最も信頼度の高いぺプチドを選び、これをもとにオリゴヌクレオチドを合成する。後述の実施例 2 に述べられているように、 Tyr Thr Thr Thr Thr Asn Val Aspの配列が得られたので、このァミノ酸配列をコ一ドするォリゴヌクレオチドに相捕的な 2 4 m e r を化学合成し、アンチセンスプライマー S F 2 ( 配列表の配列番号 3 ) とする。

上記鍀型の D N A、センスプライマー S F 1、アンチセンスプライマー S F 2 を用いて P C Rを行うことにより、ゲノム D N A中の目的 D N A鎮が伸長され、増幅される。得られた P C R産物をァガロースゲル電気泳動により解析すると、約 2 2 0 b p長の D N A断片が得られる。この D N A断片を適当なベクターに組み込み、サブクローニングを行った後、チェーンターミネーション法 ( Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA Vol. 74, 5463-5467 ( 1977) ) により D N A配列が決定される _c その結果 2 2 5 b pの D N A配列が決定され、上記アンチセンスプライマ一 S F 2 の作成の基本となったァミノ酸配列 Ty r Thr Thr Thr Thr Asn Val Aspは、 6 8 位〜 7 5位に位置するアミノ酸であることがわかる。

( 2 ) ゲノム D N Aのサザン分析

上記（ 1 ) 項で調製したストレブトマイセスフラディ A TCC 14544株由来のゲノム D N Aを、制限酵素 S a l I および P s t I で二重消ィ匕し、これをァガロースゲル電気泳動にかけて分離した後、該 D N A断片をナイロンメンブランフィルターにブロッテイングし、サザン分析を行う。ハイブリダィゼーション用プローブは、上記（ 1 ) 項の S F 1 — S F 2 の P C R産物を³² P — d C T P で常法により標識して用いる。このプローブとハイブリダィズした陽性 D N A断片は、 2 . O k b のバンドとして認められる。

( 3 ) S F a s e のゲノム D N A の塩基配列の決定

( 1 ) 項で得られたストレプトマイセスフラディ ATCC14 544株のゲノム D N Aを適当な制限酵素で切断し、これを適当なベクターに組み込んで、上記（ 1 ) 項で述べたチヱ一ンタ一ミネーション法で S F a s e の D N A塩基配列が決定され得る。

例えば、上記（ 1 ) 項で得られたストレプトマイセスフラディ ATCC 14544株のゲノム D N Aを S a 1 I および P s t I で消化して、（ 2 ) 項で確認された約 2 K b の D N A断片を、同制限酵素で処理した M l 3 m p 1 0 にサブクローニングし、プラークノ、イブリダィゼーシヨンを行う。この時、プローブとしては、上記（ 2 ) 項で用いたサザン分析のハイプ- リダイゼ一ション用プローブを用い得る。プラークハイブリダイゼーシヨンにより、陽性であると確認されたプラークからプラスミド D N Aを単離し、このプラスミドの揷入断片の D N A配列を決定する。この D N A配列決定の結果、配列表の配列番号 1 に示す 2 0 6 4 b p の D N A配列が決定され、 S F a s e は、翻訳開始コドン A T G力コ一ドするメテオ二ンを含む 1 7 ひ残基のァミノ酸からなるプレブ口べプチド、および 1 8 7残基のァミノ酸からなる成熟べプチドをコ一ドする D N A配列を有することが確認される。 5 ' 非翻訳領域に含まれる、 — 1 7 0 位の A T Gの 8塩基上流には、リボソ —ム結合領域の配列 A A G G A Gが存在する。さらにその上流にプロモータ一様配列を有する一 1 0 領域および一 3 5領域が観察される。メチォニンをコードする D N A配列の 3，側には、シグナルべプチド特有の塩基性ァミノ酸が存在し、続いて疎水性ァミノ酸が並び、シグナルぺプチド認識配列である Ala-X-Ala (Xは、任意のアミノ酸）も存在しており、典型的なシグナルべプチドを構成していることがわかる。

I. Svendsen,ら (刖出.) は、 St reptomy ces griseus由来の同種酵素のァミノ酸配列を報告している。この酵素と本発明の S F a s e とのアミノ酸配列とを比較すると、その相同性は、 81.3%であつた。第 1 図にこの 2 つの酵素の成熟ペプチドのァミノ酸配列を比較した図を示した。ここで用いられている記号は、通常のアミノ酸の一文字表記である。しかし、 I. Sve ndsenらは、遺伝子クローニングを行っていないため、その前駆体およびプロモータ一配列などは不明である。

本発明によれば、ポリペプチドのアミノ酸配列中のグルタミン酸残基の C末端を特異的に開裂する新規プロテアーゼ、および該プロテア一ゼをコ一ドする D N A配列が提供される。このプロテアーゼは、ストレプトマイセスフラディを培養することにより、あるいは、化学合成により調製され得る。このようなプロテアーゼは、タンパク質の分析、融合タンパク質の所望の部位でのぺプチド鑌の切断など、種々の目的に利用され得る。該プロテアーゼをコ一ドする D N A配列は、該プロテア一ゼの製造、検出に用い得る。

(実施例）

以下に本発明を実施例につき説明する。

〔実施例 1 〕

( S F a s e の採取）

ストレプトマイセスフラディ ATCC 14544株を、 3 %ポテトスターチ、 ι %ソィビーンミール、 0. ₅ % コーンスティ一プリカ一、 0. 5 % グリセロール、 0. 3 % N a C 1、 0. 3 5 % C a C 0₃，および 0. 1 %酵母エキスを含む p H 7. 0 の培地で 2 8 °Cにて 3 日から 5 日間培養した（ K. Morihara ら（Biochim. Biophys. Acta. , 139 ( 1967 ) 382 -397) ₀ 培養液を遠心分離し（ 8000 rpin、 3 0 分）、菌体を除いて上清液を得た。得られた上清液に、 6 0 %飽和硫酸アンモニゥムを添加し、タンパク質を沈殺させた。この沈殺物を遠心分離して ( 8000 rpm、 30 m in) 回収し、 2mM CaCl2を含む 10 mM Tri s-H Cl、 pH 7. 5 に溶解した後、この溶液を同緩衝液を外液としてに透析する。次いで、この透析内液を凍結乾燥し、粗酵素粉末を作成した。この粗酵素粉末 104. 4 gを、 1. 2 Lの 5 mM T ris-HCK pH 7.5に懸濁し、再度同緩衝液 20 Lを外液として、 2 0 時間透析する。透析内液を遠心分離して（ 8000 rpm 20 min) 、 1.3 L の液を得る。この液に S —セファロース 1.0 L (5 m Tris-HCl H 7.5で平衡化）を加え、 4 でに T5時間、穏やかに攪拌する。上清を捨て、酵素を吸着した S —セファロースをガラスカラムに充旗し（11.2 X 10 cm) 、約 3 Lの 5 iM Tris-HCl pH 7.5 で洗浄後、 5 M Tris-HCl ひ.3 M NaCl pH 7.5で溶出した。

カラムより溶出した SFase活性分画を集め（2.3 L) 、これを 5 mM Tris-HCl pH 7.5 に対して 2昼夜透析した（20 Lの外液を 3 回交換）。透析内物約 2.5Lをカラム（ 5 X 2 5 c m ) に充塡した約 500 mlの S —セファロース（ 5 mM Tris-HCl p H 7.5 で平衡化）に吸着させた。次いで、このカラムを上記平衡化に用いた約 2.5Lの緩衝液で洗浄後、 0〜0.1 M NaClを含む緩衝液 5 Lで直線濃度勾 Eにより溶出した。 SFase活性を持つ画分を集め（約 0.05 M NaCl 濃度で溶出、約 1000 ml) 、 5 mMTris-HCl pH 7.5 に一晚透析した。次いで、この透析内物をァフィ -ティ -クロマトグラフィーにかけた。上記ァフィ二ティークロマトグラフィ一において、担体としては、 CHセファロ一ス 4B-Phe-Leu-D-GIu-0Me約 70mlを用レヽ、これを 2.5 x 14cmのカラムに充旗して、 5 mMTris-HCl、 pH 7.5で平衡化したものを用いた。上記透析内物をカラムに吸着させた後、平衡化に使用したものと同様の緩衝液約 500 mlで洗浄し、 Na C1を 0〜0.3Mの割合で含む同緩衝液 1.0 Lによる直線濃度勾配により溶出を行った。

採取した各画分の SFase活性を、前出の活性測定法に従つて測定した。 SFase活性は、 NaCl濃度が 0.25 M 付近で溶出された画分中に見いだされた。このようにして得られた SFase 活性分画を集め（0.2 L) 、 5 mM Tris-HCl pH 7. 5を外液として、 2 4 時間透析をぉこなった（ 20 し 2) 。 3. 2 X 40cmの力ラムに充塡した約 320 mlの S — セファロースを 5 mM Tri s-HCl pH 7.5で平衡化して、このカラムに上記の透析内物を吸着させた。次いで、このカラムを約 1. 5 Lの平衡化したのと同様の緩衝液で洗浄後、 NaCiを 0 〜 0. 1 Mの割合で含む緩衝液 4 で直線濃度勾配により溶出した。

採取した各画分の SFase活性を前述の活性測定法に準じて測定した。さらに、各画分の 280nmにおける吸光度を測定して、タンパク濃度の目安とした。その結果をあわせて第 2 図に示す。第 2 図から明らかなように、 SFase活性は、約 0.05M NaC 1濃度で溶出した画分中に存在した（ 200 ml) 。得られた画.分を 5mM Tris-HCl pH 7. 5を外液として、 4 0 時間（ 20 Lずつ、 3回交換）透析し、保存溶液とする。このようにして得られた SFaseは、 SDS-PAGEで単一なバンドを示した。粗酵素粉末 104 . 4gより、約 3.0 mg ( Bio Rad Protein assay ki tで定量）が得られた。

〔実施例 2 〕

( SFa seをコ一ドする D N A の配列決定）

( 1 ) ゲノム D N A の内部配列の P C R解析

ストレブトマイセスフラディ ATCC 14544株の培養細胞から、 J. Marmur (前出）の方法に従ってゲノム D N Aを調製し. 該 D N A を P C R解析の鍀型 D N A とした。 P C R に用いるオリゴヌクレオチドプライマ一は、ストレプトマイセスフラディ ATCC 14544株が生産する SFaseの決定されている部分のアミノ酸 E列に基づいて作成した。まず、 SFaseのアミノ酸 E列の N末端から第 1 位から第 8位に相当するァミノ酸配列 Val Ala Gl Gly Asp Ala lie Tyrをコードするオリゴヌクレオチド（但し、 C末端の Tyrをコードするトリプレツトの 2 番目の塩基まで； 2 3 m e r ) を化学合成し、センスブライマー S F 1 とした。ここでストレプトマイセスフラディのゲノムは、 ―般的に G C リツチであることが知られているので、縮重を考慮せずに 1種類のオリゴヌクレオチドのみからなるブラィマーを設定した（配列表の配列番号 2 ) 。

次に、実施例 1 で得られた精製 SFase (DEP処理済）にリジルェンドぺプチダーゼ（和光純薬）を 3 7。Cで 5 時間作用させた o 酵素消化物を、 Vydac protein C4.300A ( 4.6X25cm) のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィ一で分解精製した。得られた消化断片のアミノ酸配列を、アプライドバイオシステムズ社製 4 7 7型プロティンシークェンサ一で調べた。そのうちの 1種は、 Tyr Thr Thr Thr Thr Asn Val Aspである ( このァミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドに栢補的な 2 4 m e r を化学合成し、アンチセンスプライマー S F 2 (配列表の配列番号 3 ) とした。

上記铸型の D N A、センスプライマ一 S F 1、およびアンチセンスプライマー S F 2 を用いて P C R法〔Saikiら、 Sci ence 239 , 487- 91 (1989)] により D N Aを増幅させた。得られた P C R産物の一部を 1 %ァガロースゲル電気泳動で分析したところ、約 2 2 0 b p の D N A断片が確認された。この D N A断片を単離し、クレノー断片で処理することにより平滑末端とした後、 Smalで処理した Ml 3rap 10にサブク口一二ングし、チェーンターミネーシヨン法（サンガーら、前出）により D N A配列を決定した。その結果、 2 2 5 b p の D N A 配列が決定され、アンチセンスプライマー S F 2 に相当するアミノ酸配列は、 6 8 位〜 7 5位に位置することがわかった。

( 2 ) ゲノム D N Aのサザン分析

上記（ 1 ) 項で調製したストレブトマイセスフラディ A TCC 14544株由来のゲノム D N Aを、制限酵素 S a 1 I および P s t I で二重消化し、これを 1 %ァガロースゲル電気泳動にかけて分離した後、該 D N A断片をナイロンメンブランフィルターにブロッテイングし、サザン分析を行った。ノ、イブリダィゼーシヨン用プローブとしては、（ 1 ) 項で得られた S F 1 — S F 2 の P C R産物のうち、 3 3 5 6 の 3 8位から 4 5 位のアミノ酸配列に相当する塩基配列（配列表の配列番号 4 ; プローブ S F 3 ) を³² P — d C T Pで常法により標識して用いた。このプローブとハイプリダイズした陽性 D N A断片は、 2. 0 k b のバンドとして認められた。

( 3 ) S F a s e のゲノム D N Aの塩基配列の決定

( 1 ) 項で得られたストレブトマイセスフラディ ATCC14 544株のゲノム D N Aを S a 1 I および P s t I で消化して得られる約 2 k b の D N A断片を、同制限酵素で処理した後に脱リン酸化された M l 3 m 1 0 に連結した。この連結反応は、市販のキット（宝酒造）を用いて行った。

次に、プラークハイブリダィゼーシヨンを行った。この時、プローブとしては、上言己（ 2 ) 項で用いたプローブ S F 3 を用いた 0 プラーク八イブリダィゼーションにより、陽性であると確認されたプラークから常法によりプラスミド D N Aを単離し、このブラスミドの挿入断片の D N A配列を前述のチエーンターミネーション法により決定した。この D N A配列決定の結果、 2 0 6 4 b p の D N A配列が決定された。これを配列表の配列番号 1 に示す。

このようにして決定された S F a s e の D N A配列を検討すると、翻訳開始コドン A T Gがコードするメチォニンを含む 1 7 0 残基のァミノ酸からなるプレブロぺプチド、および 1 8 7 残基のァミノ酸からなる成熟べプチドをコ一ドする D N A配列を有することが確認された。さらに、 5 ' 非翻訳領域に含まれる、一 1 7 0 位のメチォニンをコードする塩基 A T Gの 8 塩基上流には、リボソ一ム結合領域の配列 A A G G A Gが存在し、その上流にプロモータ一様配列を有する ― 1 0 領域および— 3 5領域が観察された。メチォニンをコードする D N A配列の 3 ，側には、シグナルぺプチド特有の塩基性アミノ酸が存在し、続いて疎水性アミノ酸が並び、シグナルぺプチド認識配列である A l a-X-A i a ( Xは、任意のァミノ酸 ) も存在しており、典型的なシグナルペプチドを構成していることがわかつた。 (E列表） · 配列番号： 1

配列の長さ： 2 0 6 4

配列の型：核酸

鎖の数：ニ本鎮

トポロジー：直鎮状

@2列の種類： Genomic DNA

起源

生物名：ストレプトマイセスフラディ（Streptonyces fradiae)

配列の特徴

特徴を表す記号： -35 signal

存在位置： 359..364

特徴を決定した方法： E

特徴を表す記号： -10 signal

存在位置： 378..383

特徵を決定した方法： E

特徴を表す記号： CDS

存在位置： 435..1505

特徵を決定した方法： E

特徴を表す記号： sig peptide

存在位置： 435..944

特徴を決定した方法： E

配列

GTCGACCGGC GCCGTGGTCG GCCAGCAGCC TTCGGCGGCG GCCGCGTCCG GCACCAACGA 60 CAAGGCCGGC GCCCCGCAGA ACCTGATGCG CTGGACGCTG ACCCGCGCCA TCAAGGAGAC 120 GCTGGTCCCG CCGACCGGGT ACGGCTACCC GCACATGCTG ACGCCCGTGC AGCTGACGCC 180 CGCCCCGGCC CGTACGCACG GGCCGGCGGG CCGACGCCCC GCCCCGCCGC ACCGCGGCCG 240 GGCTGCGGCC CGCGAGGCCG CCCCCTGACG CCGCCCCCTT CCGGCCCCCA CGCCGGGAGG 300 GGGCGGTCTC CATGTCCGGG TCGTCGCGCC GGAGGCCGGG CGCGGCGGAA ACGCGCCCTT 360 GCGGTCAGTG AAGCGTTGAT GTCAAGTTGC TCCGTCGGTA CGTGCCCACC CGTCACCGAC* 420 AAGGAGACCC CGGC ATG AGA CGC ACC ACC CGC GCG CGC ACC GGT CTG TCC 470

Met Arg Arg Thr Thr Arg Ala Arg Thr Gly Leu Ser

-170 -165 -160

GCC CTG CTC CTC GCC GCC TCC CTC GGC CTC GGC GCC GCC CCG GCC GGA 518 Ala Leu Leu Leu Ala Ala Ser Leu Gly Leu Gly Ala Ala Pro Ala Gly

-155 -150 -145

GCC GAC GCC CCC CAG AGG CCC GCC CCC ACC CGG GCC TCC GAC TCC GCC 566 Ala Asp Ala Pro Gin Arg Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ser Ala

-140 -135 -130

GCC GCC CTC CAC GCC CTC GAC GCC GCC GTC GAG CGG ACC CTC GGC GAC 6H Ala Ala Leu His Ala Leu Asp Ala Ala Val Glu Arg Thr Leu Gly Asp

-125 -120 -115

GAC AGC GCC GGC ACC TAC GTG GAC GCC GGC ACC GGC GAA CTC GTC GTC 662 Asp Ser Ala Gly Thr Tyr Val Asp Ala Gly Thr Gly Glu Leu Val Val

-110 -105 -100 -95

ACC GTC ACC ACC GAG GCC GCC GCC GCC AAG GTC CGC GCG GCG GGC GCC 710 Thr Val Thr Thr Glu Ala Ala Ala Ala Lys Val Arg Ala Ala Gly Ala

-90 -85 -80

ACG CCC CGG CGG GTC CAG CGC G&C GCC GCC GAG CTC GAC GCG GCC ATG 758 Thr Pro Arg Arg Val Gin Arg Gly Ala Ala Glu Leu Asp Ala Ala Met

-75 -70 -65

GCC GCC CTG GAG GCA CGG GCC AAff ATC CCG GGC ACC TCG TG& GGG CTG 806 Ala Ala Leu Glu Ala Arg Ala Lys lie Pro Gly Thr Ser Trp Gly Leu

-60 -55 -50

GAC CCG CGC ACC AAC CGG ATC GCC GTG GAG GCC GAC TCC TCC GTC TCC 854 Asp Pro Arg Thr Asn Arg lie Ala Val Glu Ala Asp Ser Ser Val Ser

. 一

-45 -40 -35

GCC CGC GAC CTG SCC CGG CTC CGC AAG GTC GCC "GCC TCC CTC GAC GGC 902 Ala Arg Asp Leu Ala Arg Leu Arg Lys Val Ala Ala Ser Leu Asp Gly

-30 -25 -20 -15

GCC GTC AGC GTC ACC CGC GTC CCC GGC GTG TTC CAG CGC GAG GTG GCC 950

Ala Val Ser Val Thr Arg Val Pro Gly Val Phe Gin Arg Glu Val Ala

-10 -5 1

GGC GGC GAC GCC ATC TAC GGC GGC GGC TCG CGC TGC TCG GCG GCC TTC 998

Gly Gly Asp Ala He Tyr Gly Gly Gly Ser Arg Cys Ser Ala Ala Phe

5 10 15

AAC GTC ACC AAG AAC GGC GTT CGG TAC TTC CTG ACC GCC GGG CAC TGC 1046

Asn Val Thr Lys Asn Gly Val Arg Tyr Phe Leu Thr Ala Gly His Cys

20 25 30

ACC AAC CTC TCG TCC ACC TGG TCG TCC ACC TCC GGC GGC ACG TCC ATC 1094

Thr Asn Leu Ser Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ser 1 le

35 40 45 50

GGC GTC CGC GAG GGC ACC AGC TTC CCG ACC AAC GAC TAC GGC ATC GTC 1142

Gly Val Arg Glu Gly Thr Ser Phe Pro Thr Asn Asp Tyr Gly lie Val

55 60 65

CGC TAC ACG ACC ACG ACC AAC GTG GAC GGC CGG GTC AAC CTG TAC AAC 1190

Arg Tyr Thr Thr Thr Thr Asn Val Asp Gly Arg Val Asn Leu T r Asn

70 75 80

GGC GGC TAC CAG GAC ATC GCC TCC GCG GCC GAC GCC GTC GTG GGC CAG 1238 Gly Gly Tyr Gin Asp I le Ala Ser Ala A 1 a Asp Ala Val Val Gly Gin

85 90 95

GCC ATC AAG AAG AGC GGC TCC ACG ACC AAG GTC ACC AGC GGC ACC GTC 1286 Ala lie Lys Lys Ser Gly Ser Thr Thr Lys Val Thr Ser Gly Thr Val

100 , 105 110

AGC GCC GTC AAC GTC ACC GTC AAC TAC AGC GAC GGC CCC GTC TAC GGC 1334 Ser Ala Val Asn Val Thr Val Asn Tyr Ser Asp Gly Pro Val Tyr Gly

115 120 125 130 V10 1V03D3V300 90D0000010

urn

^篛 n： π ^ 镲本一：翳 mm■ ourn ε z '^^ oW

^902 0V0{)10003 1303303V39 0333303001 3303330003 0039013000 001001100 V SOOZ 0513V99V59 V30V0003D1 VD90010013 59D0V03000 {)30V19039V D01V090005 S 6T 丄 3133 Ϋ000139903 303109V131 0D130O033D 3030 VDO 310 0303131303

S88I 33003 UOVO OVIBOOODDO V90103I03V 93Y5913300 30301V9193 D030V0033I SZ8T 30S05VOODO 0300303 V39 ODOOOVlDOi) SDIDOOODVD 0130V10903 130D30V000 S9LT £)0€33ΰ900€ OVOOlflfllSO ilOOOODiVOl 3GI033V039 0V0303D130 1V39039303 SOLT 90303V99V9 0090V13303 V001309000 OOI30000V0 9V3i)i)丄 V39V300V91 s aovsooovvo OHOODO OD VOOIOOIOOO oooooivsoi ooooiooiao θΰΰοονοοοι

98ST 03V00V100V OVO00030V1 VOOIOIOOIV ΰ丄 DVSlVlSi) 33i331∑)V3Vi) 03I3V99003

S8T 08T ifil l¾A usv I^A 19 ュェ ^EIV -t8S nsq

SZST 9030033093 0000030V31 3 VI 310 OVV 91D 093 IVl 030 09V 010

SiT Oil S9T

BTV ηΐ9 2iv ΙΒΛ oij «ΐΰ SIH sil εχν ias ^ΐθ ^sy 1¾ iqi s 3

8i l 309 OVO 030 010 500 OVO 0V3 OIV 030 33丄 333 OVV OOV 333 33V 091

09T SSI OST

13 JSS is S 19 ュ ,9,S SIH 9H ΐ{) naq ¾iv ^ΐΰ ¾TV ^Άά STH

OS^ Οΰΰ 001 ODV ODD 33丄 01 V 000 3丄 3 009 3丄 ί) 301 139 009 Oil 3V0

S 0" 951

BIV Ϊ3 ズ Ϊ3 J9S dsv 13 ΐ3 s 3 Bjy Jqj,. iqi 8jy ΐ^Α 3«

Z88T * 009 339 303 30V 3V9 003 03€ 000 001 0D1 033 OOV 90V 030 3丄 3 3XV S00/£6df/I3d 0£S£Z/£6 OM se列番号： 3 -

E列の長さ： 2 4

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎮状

E列の種類：他の核酸合成]) NA

E列

GTCCACGTTG GTGGTGGTGG TGTA

配列番号： 4

配列の長さ： 2 4

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸台成 DNA

配列

TCGTCCACCT GGTCGTCCAC CTCC

Claims

請求の範囲

1. ぺプチドのグルタミン酸残基のカルボキシル基を含むペプチド結合を切断し、次の性質を有するプロテアーゼ：

( 1 ) 至適 p H：約 8. 2、および

( 2 ) 安定 p H範囲： 3 7 °Cにおいて 6. 0〜 9 * 0。

2. ストレプトマイセスフラディ（ Strep tomyces fradi ae) 由来である、請求項 1 に記載のプロテアーゼ。

3. ストレブトマイセスフラディ ATCC 14544株由来である、請求項 1 に記載のプロテア一ゼ。

4. 配列表の配列番号 1 の 1位の Va 1から 1 8 7位の Ty rまでのアミノ酸配列を含む、請求項 1 に記載のプロテア一ゼ。

5. 請求項 1〜 5 のいづれかに記載のプロテア一ゼをコ一ドする D N A配列。

6. 配列表の配列番号 1 の 9 4 5 位の Gから 1 5 0 5 位の Cまでの塩基配列を有する、請求項 5 に記載の D N A配列。

7. 配列表の配列番号 1 の— 1 7 0位の Metから 1 & 7位の Tyrまでのァミノ酸配列を含むプロテア一ゼをコ一ドする、請求項 5 に記載の D N A配列。

8. 配列表の配列番号 1 の 4 3 5 位の Aから 1 5 0 5 位の Cまでの塩基配列を有する、請求項 7 に記載の D N A配列。