JPH10304877A - 新規プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】Gln-Gly 間のペプチド結合を加水分解する新規
プロテアーゼを提供する。 【解決手段】分子中に配列表の配列番号２に示されるア
ミノ酸配列のアミノ酸番号1 〜243のアミノ酸配列を含
むことから成り、基質ペプチド中のGln-Gly 間のペプチ
ド結合を加水分解するプロテアーゼ活性を有するタンパ
ク質、または、該アミノ酸配列の一つもしくは複数のア
ミノ酸残基が欠失、挿入もしくは置換されているアミノ
酸配列を含み、該プロテアーゼ活性を有するタンパク質
等に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、基質ペプチド中の
Gln-Gly 配列を切断する新規プロテアーゼ、該プロテア
ーゼをコードする遺伝子等に関する。本発明で得られた
遺伝子を宿主細胞等で発現させ、該切断配列を切断する
プロテアーゼとして用いることが可能になる。該遺伝子
と外来性の有用タンパク質遺伝子を該切断配列を介して
同じ読み枠で接続することにより、該有用タンパク質を
宿主細胞内にて直接生産することも可能である。

【０００２】

【従来の技術】従来、基質ペプチド中のGln-Gly 配列を
切断するプロテアーゼとしては、クローバーイエローベ
インウイルス（以下、「CYVV」という）の成熟化を行な
う核内封入体a （Nuclear Inclusion-a ：以下、「NIa
」という）が報告されており、これをコードするDNA
が単離され、さらにDNA を遺伝子操作法により発現する
ことによって、このような活性を有する遺伝子産物が得
られている（特開平8-80194 号参照）。

【０００３】さらに、同特開平8-80194 号においては、
上記プロテアーゼNIa をコードするDNA を所望のタンパ
ク質をコードするDNA と該切断配列をコードするDNA 配
列を介して接続し、これらを含む形質転換ベクターを用
いて宿主細胞を形質転換することにより、所望のタンパ
ク質が宿主細胞内で直接生産されることが報告されてい
る。また、別途に生産したNIa 遺伝子産物が試験管内で
該切断配列を持ったタンパク質を切断することも見出さ
れている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、該プロ
テアーゼNIa のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列を有
し、分子量が約50,000から約27,000まで低減した新規蛋
白質（以下、「NIa-C 」という）を得、該新規蛋白質が
該プロテアーゼNIa と同等の活性を有していることを見
出し本発明を完成した。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）分子中
に配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ
酸番号1 〜243 のアミノ酸配列を含むことから成り、基
質ペプチド中のGln-Gly 間のペプチド結合を加水分解す
るプロテアーゼ活性を有するタンパク質、または、該ア
ミノ酸配列の一つもしくは複数のアミノ酸残基が欠失、
挿入もしくは置換されているアミノ酸配列を含み、該プ
ロテアーゼ活性を有するタンパク質、（２）分子中に配
列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番
号1 〜243 のアミノ酸配列を含むことから成り、基質ペ
プチド中のGln-Gly 間のペプチド結合を加水分解するプ
ロテアーゼ活性を有するタンパク質、（３）配列番号２
に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1 〜243 のアミ
ノ酸配列と55% 以上のアミノ酸配列相同性を有するアミ
ノ酸配列を含むことから成り、基質ペプチド中のGln-Gl
y 間のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼ活性を
有するタンパク質、（４）（１）ないし（３）のいずれ
か一つに記載のタンパク質をコードするDNA、 （５）分子中に配列表の配列番号１に示されるヌクレオ
チド配列のヌクレオチド番号4 〜732 のヌクレオチド配
列を含む、（４）記載のDNA 、（６）配列表の配列番号
１に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド番号4 〜
732 のヌクレオチド配列と70% 以上のヌクレオチド配列
相同性を有する配列を含み、基質ペプチド中のGln-Gly
間のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼ活性を有
するタンパク質をコードするDNA 、（７）（５）記載の
DNA とハイブリダイズし、基質ペプチド中のGln-Gly 間
のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼ活性を有す
るタンパク質をコードするDNA 、（８）（５）記載のDN
A と、60〜70℃、6xSSC 条件下でハイブリダイズし、基
質ペプチド中のGln-Gly 間のペプチド結合を加水分解す
るプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDN
A 、（９）（４）ないし（８）のいずれか一つに記載の
DNA を含むことから成る組換えDNA ベクター、（１０）
（９）記載の組換えDNA ベクターにより形質転換された
宿主細胞、（１１）形質転換された宿主細胞が大腸菌で
ある（１０）記載の宿主細胞、（１２）形質転換大腸菌
株 pNIa-C SANK 72497 ( FERM BP-5938 ）、に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明のDNA は、プロテアーゼNI
a をコードするDNA を基に作成することが好ましい。NI
a をコードするDNA は、例えば特開平8-80194 号に記載
されるごとく、ポチウイルスグループウイルスよりゲノ
ムRNA を調製した後に、既知の方法により２本鎖cDNAに
変換することによって得るか、または同特開平8-80194
号に記載されるプラスミドpKSUN9を当業者周知の方法に
より調製することができる。

【０００７】本発明のDNA は、例えば上記のNIa をコー
ドするDNA を鋳型として、配列表の配列番号２に示され
るアミノ酸配列のアミノ末端配列に対応するセンススト
ランドとカルボキシル末端配列に対応するアンチセンス
ストランドのオリゴヌクレオチドを合成し、これらを組
み合わせてポリメラーゼ連鎖反応［ Polymerase Chain
Reaction，以下「PCR 」という。：Saiki,R.K. et al.
（1988） Science， 239: 487-491.参照］を行い、増幅
することができる。 このようにして得られたDNA を、
例えばpUC19 ［Yanish-Perron,C. et al.(1985). Gene
33:103-119. 参照］等のクローニングベクターに組み込
み、得られた組換えベクターを大腸菌等の宿主細胞に導
入して形質転換させ、当業者周知の方法により、目的の
DNA を保持する形質転換株を得ることができる。

【０００８】得られた形質転換株より目的のDNA を採取
する方法は、公知の方法に従い実施できる。例えば宿主
細胞よりベクターDNA に相当する画分を分離し、該ベク
ターDNA より目的DNA 領域を切り出すことにより行い得
る。

【０００９】このようにして得られるDNA の配列決定
は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法［Maxam,
A.M. and Gilbert,W. （1980）. in "Methods in Enzym
ology"65:499-560.参照］やM13 ファージを用いるジデ
オキシヌクレオチド鎖終結法［Messing,J. and Vieira,
J.（1982）. Gene 19:269-276.参照］等により行うこと
ができる。

【００１０】このようにして得られた本発明のタンパク
質をコードするDNA を発現ベクターに組み込みこれを導
入することにより、原核生物または真核生物の宿主細胞
を形質転換させることができる。更に、これらベクター
に適当なプロモーターおよび形質発現に関わる配列を導
入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子
を発現させることが可能である。

【００１１】原核生物の宿主としては、例えば大腸菌
（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis ）
等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で
形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリ
コン、即ち複製起点及びlac UV5 等のプロモーター配列
を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換
すれば良い。またベクターは、形質転換細胞に表現形質
（表現型）による選択性を付与することができる配列を
持つものが望ましい。

【００１２】例えば大腸菌としては、E. coli K12 株由
来のJM109 株等がよく用いられ、ベクターとしては、一
般にpBR322やpUC 系のプラスミドがよく用いられるが、
これらに限定されず、公知の各種の菌株及びベクターが
いずれも使用できる。プロモーターとしては、大腸菌に
おいてはラクトースプロモーター（lac ）やトリプトフ
ァン・ラクトースプロモーター（trc ）等が挙げられる
が、これらに限定されない。

【００１３】なお、本発明の形質転換大腸菌株 pNIa-C
SANK 72497は、平成９年（1997年）5月 7日にブタペス
ト条約に従って、通商産業省工業技術院生命工学研究所
に国際寄託され、寄託番号として、 FERM BP-5938 が付
されている。

【００１４】枯草菌としては、例えば207-25株が好まし
く、ベクターとしてはpTUB228 ［Ohmura,K. et al.
（1984）. J.Biochem. 95:87-93.参照］等が用いられる
が、これに限定されない。プロモーターとしては、枯草
菌α−アミラーゼ遺伝子の調節配列が良く用いられ、さ
らに必要に応じてα−アミラーゼのシグナルペプチド配
列をコードするDNA 配列を連結することにより、菌体外
への分泌も可能となる。

【００１５】真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆
虫、酵母、植物等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞として
は、たとえばサルの細胞であるCOS 細胞［Gluzman,Y.
（1981）. Cell 23:175-182.参照］等が用いられる。

【００１６】昆虫細胞としては、ヤガ科の毛虫（Spodop
tera frugiperda）由来細胞［Smith,G.E. et al.
（1983）. Mol.Cell.Biol. 3:2156-2165. 参照］等が用
いられる。酵母としては、パン酵母（Saccharomyces ce
revisiae）や分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe
）等が用いられる。植物細胞としてはタバコ（Nicotia
na tabacum ）やイネ（Oryza sativa）等が用いられ
る。ここに例示した細胞が一般に宿主細胞としてよく用
いられているが、これらに限定されない。

【００１７】脊椎動物細胞のベクターとしては、通常は
発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモータ
ー、RNA スプライシング部位、ポリアデニル化部位及び
転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに
必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの
例としては、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr
Subramani,S. et al.（1981）. Mol.Cell.Biol. 1:85
4-864. 参照］等を例示できるが、これに限定されな
い。

【００１８】また、昆虫細胞の発現系としては、ヤガ科
毛虫培養細胞が例示できる。発現ベクターとしては、例
えば発現しようとする遺伝子の上流にバキュロウイルス
（Baculovirus ）のポリヘドリン（Polyhedrin）プロモ
ーター、ポリアデニル化部位及び相同組換えを行うのに
必要なAcMNPV（Acutographa californica nuclear poly
hedrosis virus）ゲノムの一部を有するものを使用で
き、pBacPAK8［Matuura,Y. et al. （1987）. J.Gen.Vi
rol. 68:1233-1250.参照］が例示できるが、これに限定
されない。

【００１９】また真核微生物としては酵母がよく用いら
れており、パン酵母（S. cerevisiae ）が例示できる。
酵母の発現ベクターとしてはpYEUra3 ［Abe,I. and Pre
stwich,G.D. （1995）. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 92:9
274-9278. 参照］が例示できるが、これに限定されな
い。発現プロモーターとしては、例えばアルコール脱水
素酵素遺伝子のプロモーター［Bennetzen,J.L. and Hal
l,B.D.（1982）. J.Biol.Chem. 257:3018-3025. 参照］
や、GAL10 プロモーター［Ichikawa,K. et al.（199
3）. Biosci.Biotech.Biochem. 57:1686-1690. 参照］
等を利用できるが、これに限定されない。さらに必要に
よりカルボキシペプチダーゼＹのシグナルペプチド配列
をコードするDNA 配列を連結することにより、細胞外へ
の分泌も可能となるが、これに限定されない。

【００２０】植物の発現ベクターとしては、例えばカリ
フラワーモザイクウイルスの初期プロモーターである35
s プロモーターと根頭癌腫病菌（Agrobacterium tumefa
ciens ）のノパリン合成遺伝子ポリアデニル化配列を有
しさらに、根頭癌腫病菌による遺伝子導入配列を有した
pBI121［Jefferson,R.A. et al. （1987）. EMBO J.6:3
901-3907.参照］が使用できるがこれに限定されない。

【００２１】宿主細胞として、大腸菌を用いる場合を例
に挙げると、発現ベクターとしては、trc プロモーター
を有し、大腸菌K12 株由来菌株、例えばJM109 株等にお
いて自立増殖が可能であるpKK388-1（クローンテック社
製）を用いることができる。発現ベクターは、エレクト
ロポーレーション法［Dower,W.J. et al. （1988）.Nuc
l.Acids Res. 16:6127-6145. 参照］等ごく一般に用い
られている大腸菌の形質転換法に基づき、容易に大腸菌
に導入できる。かくして得られた菌株を、一般によく用
いられるLB培地等に接種し、一夜培養後、プロモーター
の誘導剤であるイソプロピル−β−チオガラクトピラノ
シド（以下、「IPTG」という）を添加しtrc プロモータ
ーを活性化する。その後一定時間培養の後、超音波破砕
機などで菌体を破砕することにより、発現タンパク質を
菌体から抽出できる。

【００２２】また、本発明のタンパク質は、NIa をコー
ドするDNA を、適当なプロモーターおよび形質発現に関
わる配列を導入した発現ベクターに組み込み、該発現ベ
クターによって形質転換した原核生物または真核生物の
宿主細胞において発現させ、菌体から抽出後に15〜40℃
においてジチオスレイトール等の還元剤の存在下にpH6
〜9 の緩衝液中で30分〜一夜自己消化を起こさせること
により生産することも可能である。

【００２３】上記により得られる本発明のNIa-C タンパ
ク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質等を利
用した各種公知の分離操作法により、分離精製すること
ができる。かかる方法としては具体的には、例えば通常
のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるい
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィー等の各種クロマトグラフィー、透析法、これらの組
み合せ等を例示できる。

【００２４】上記のようにして精製した該NIa-C タンパ
ク質のプロテアーゼ活性を測定する方法としては、精製
該NIa-C タンパク質を、該タンパク質の切断配列を含む
オリゴペプチド基質に作用させる方法を例示できる。即
ち、15〜40℃においてジチオスレイトール等の還元剤の
存在下にpH6 〜9 の緩衝液中で、Gln-Gly 配列を含むオ
リゴペプチド基質に対して該タンパク質を30〜60分反応
させる。反応終了液を例えば逆相ＨＰＬＣに供与し、溶
出される切断されたペプチドを解析することにより、該
プロテアーゼ活性を確認できる。

【００２５】またNIa-C の活性は、該タンパク質を精製
することなく確認することもできる。即ち、上記のよう
にtrc プロモーター下流にNIa-C をコードするDNA と検
出可能な他のタンパク質をコードするDNA を該タンパク
質の切断配列をコードするDNA 配列を介してつなぎ、こ
れを発現ベクターに挿入する。得られた発現ベクター
を、好適な宿主細胞に導入し、融合タンパク質を発現す
る。発現した該他のタンパク質を該タンパク質に対する
抗体を用いたウェスタンブロッティング法等により検出
し、検出されるバンドの移動度の変化としてプロテアー
ゼ活性を検出できる。即ち、プロテアーゼ活性があった
場合には融合体より大きい移動度を示すバンドとして該
他のタンパク質を検出できる。

【００２６】この様にして切断が確認されたバンドを電
気泳動のゲルから回収し、常法によりアミノ末端配列の
解析をすることにより、切断されたペプチド結合を解析
できる。

【００２７】上記方法により、容易に高収率、高純度で
所望のNIa-C タンパク質を製造でき、この様にして得ら
れる本発明の組換えNIa-C タンパク質は、プロテアーゼ
として、遺伝子操作において、特に大腸菌等の微生物を
用いて所望のタンパク質を製造する際に好適に使用し得
る。

【００２８】配列表の配列番号２で示されるアミノ酸番
号1 〜243 から成るNIa-C タンパク質のアミノ酸配列中
の、一つ若しくは複数の部位において、一つ若しくは複
数のアミノ酸残基が欠失、挿入若しくは置換されている
タンパク質でもNIa-C タンパク質と同様のプロテアーゼ
活性を有することがある。これらのタンパク質も本発明
に包含される。

【００２９】例えば、インターロイキン2 （IL-2）遺伝
子のシステイン残基に相当するヌクレオチド配列をセリ
ン残基に相当するヌクレオチド配列に変換して選られた
タンパク質がIL-2活性を保持することも既に公知となっ
ている［Wang,A. et al.（1984）. Science 224:1431-1
433.参照］。それ故に、それ等天然に存在するかあるい
は人為的に合成されたタンパク質がNIa-C 活性を有する
限りそれ等のタンパク質及び該タンパク質をコードする
同効のヌクレオチド配列から成るDNA もすべて本発明に
含まれる。

【００３０】このような同効のヌクレオチド配列から成
るDNA として、（４）、（６）、（７）または（８）記
載のDNA が挙げられる。

【００３１】この様な本発明の各種のDNA は、上記NIa-
C タンパク質の情報に基づいて、例えばフォスファイト
・トリエステル法［Hunkapiller,M. et al. （1984）.
Nature 310:105-111. 参照］等の常法に従い、核酸の化
学合成法により製造することもできる［Grantham,R. et
al.（1981）. Nucleic Acids Res. 9:r43-r74. 参
照］。更に、これらヌクレオチド配列コドンの一部改変
は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌ
クレオチドから成るプライマーを利用した部位特異的変
異体合成法［（site specific mutagenesis ）, Mark,
D.F. et al.（1984）. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 81:56
62-5666. 参照］等により行うことができる。

【００３２】尚、所望アミノ酸に対するコドンは、それ
自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば使用す
る宿主生物のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定
できる。また、あるDNA が（５）記載のDNA とハイブリ
ダイズするか否かは、例えば、目的とするDNA をランダ
ムプライマー法［Feinberg,A.P. and Vogelstein,B.(19
83 ）. Anal.Biochem. 132:6-13. 参照］やニックトラ
ンスレーション法［Maniatis,T. et al.（1982）. in "
Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring
Harbor Laboratory, NY. 参照］等に従い、［α−³²P
］dCTP等で標識したプローブを用いてハイブリダイゼ
ーションを行い調べることができる。ハイブリダイゼー
ションに用いるDNA は、公知の方法、例えば、ニトロセ
ルロース膜やナイロン膜などに吸着させ、加熱あるいは
紫外線照射等により固相化させる。その後、6xSSC （90
0mM NaClを含む90mM クエン酸三ナトリウム pH7.0：以
下、この溶液を「6xSSC 」という。）と5%デンハート溶
液、0.1%SDS を含むプレハイブリダイゼーション溶液に
浸し、55℃で４時間以上保温する。その後先に作成した
プローブを同様のプレハイブリダイゼーション溶液に最
終比活性1x10⁶cpm/mlとなるように加え、60℃で一夜保
温する。その後、室温下で 6×SSC による5 分間の洗浄
を5 回繰り返し、その後57℃で20分間洗浄し、オートラ
ジオグラフィーを行うことにより、ハイブリダイズした
か否かを判定することができる。

【００３３】かくして得られたNIa-C タンパク質または
その同効物（以下、「NIa-C 類」という。）を用いて所
望とするタンパク質を製造する方法としては、細胞外切
断法と細胞内直接切断法が挙げられる。

【００３４】〔細胞外切断法〕NIa-C 類をコードするDN
A を、生産しようとする宿主細胞で好適に発現をもたら
すプロモーターとターミネーターを有するベクターに挿
入する。得られたベクターを、目的とする細胞に好適な
方法で導入し、形質転換体を得る。得られた形質転換体
で発現したNIa-C 類を、通常のタンパク質沈殿剤による
処理や各種クロマトグラフィーの組み合わせ等により分
離精製する。或はグルタチオン-S- トランスフェラーゼ
やマルトース結合タンパク質との融合体として発現さ
せ、グルタチオンカラムやマルトースカラムにて分離精
製し、その後エンテロキナーゼやファクターXa等で切断
後、NIa-C 類として精製し、使用することもできる。

【００３５】あるいはNIa タンパク質またはその同効物
（以下、「NIa 類」という。）をコードするDNA を、生
産しようとする宿主細胞で好適に発現をもたらすプロモ
ーターとターミネーターを有するベクターに挿入する。
得られたベクターを、目的とする細胞に好適な方法で導
入し、形質転換体を得る。得られた形質転換体で発現し
たNIa 類に、菌体内であるいは菌体から抽出後に好適な
緩衝液中で自己消化を起こさせることにより生じるNIa-
C 類を上記の方法により分離精製し、用いることもでき
る。

【００３６】一方切断を目的とするタンパク質は、その
アミノ酸配列内にNIa-C 類の切断配列を有するものであ
れば、そのタンパク質自体を基質として用いることも可
能であり、または、精製を容易にするためグルタチオン
-S- トランスフェラーゼやマルトース結合タンパク質等
と切断配列を介して融合体を作成し、これを基質として
用いることもできる。この基質タンパク質と精製したNI
a-C 類を好適な緩衝液中で反応させることにより、基質
タンパク質を試験管内で切断し、目的タンパク質を得る
ことができる。得られた目的タンパク質は、その物理的
性質や化学的性質等を利用した各種公知の分離操作法に
より、単離精製することができる。

【００３７】〔細胞内直接切断法〕NIa-C 類をコードす
るDNA を、切断配列をコードするDNA配列を介して、所
望のタンパク質をコードするDNA と同じ読み枠で接続す
る。得られた融合体タンパク質をコードするDNA を、生
産しようとする宿主細胞で好適に発現をもたらすプロモ
ーターとターミネーターを有するベクターに挿入する。
得られたベクターを、目的とする細胞に好適な方法で導
入し、形質転換体を得る。形質転換体で発現した融合タ
ンパク質はNIa-C 類のプロテアーゼ活性により自己切断
し、目的タンパク質を生じる。得られた目的タンパク質
は、その物理的性質や化学的性質等を利用した各種公知
の分離操作法により、単離精製することができる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれに限定されない。

【００３９】NIa-C 発現系の構築 NIa-C はNIa のカルボキシル末端断片であるので、NIa
をコードするDNA のNIa-C コード領域には開始コドンが
ない。この問題を解決するためにPCR 法により開始コド
ンを付加したNIa-C をコードするDNA を得た。

【００４０】NIa-C をコードするDNA の5'末端に開始コ
ドンのATG とクローニングのための制限酵素ClaI切断配
列を付加し、また3'末端に制限酵素KpnI切断配列を付加
するために以下のPCR プライマーを作製した。作製した
プライマーの配列は、5' ATTATCGATA AGGAGGTTTA AACCA
TGAGT CTAAATCGCA TAAGTGGTTT GCGCGAC 3'（以下、「NI
AC5'」という。：配列表の配列番号3 ）および5'CCCGGT
ACCT TATTGGAATG AACAATTCAA ATCACT 3'（以下、「NIAC
3'」という。：配列表の配列番号4 ）である。NIa をコ
ードするDNA を含むプラスミドpKSun9（特開平8-80194
号参照）DNA 2μg に対して、合成したこれらのプライ
マーを各80pmol、dNTP混合溶液（25mM dATP 、25mM dCT
P 、25mM dGTP 、25mM dTTP ）を40μl 、10xPfu緩衝液
（ Pfu DNAポリメラーゼに添付された緩衝液、STRATAGE
NE社製）を40μl それぞれ加え、再蒸留水で400 μl と
した後にPfu DNA ポリメラーゼ10単位を加え、PCR を行
なった。PCR プログラムは、94℃ 2分間の後に、i)94℃
1分間、ii)55 ℃ 1分間、iii)72℃ 2分間の3 段階から
なるサイクルを30回繰り返し、さらに72℃ 10 分間の反
応を行なった。PCR 後の産物に400 μl のフェノール：
クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1 ）を加
え、激しく撹拌した後に10,000xg、3 分間の遠心分離を
行い、水相を回収した（以下、この操作を「フェノール
抽出」という）。この水相に400 μl のクロロホルム：
イソアミルアルコール（24:1）を加え、激しく撹拌した
後に10,000xg、3 分間の遠心分離を行い、水相を回収し
た（以下、この操作を「クロロホルム抽出」という）。
この水相に100 μl 当りに10μl の3M酢酸ナトリウム
（pH5.2 ）および275 μl のエタノールを順次加え、ド
ライアイス−エタノール浴中に10分間放置した後に10,0
00xg、5 分間の遠心分離で核酸画分を沈殿として回収し
た（以下、この操作を「エタノール沈殿」という）。得
られた画分をTBE （100mM トリス、100mM ほう酸、5mM
エチレンジアミン四酢酸：以下、この溶液を「TBE 」と
いう）存在下に5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
与し、増幅されたDNA バンドをゲルと共に切り出した。
予めセントリコン−10（アミコン社製）を装着したセン
トリリューター（アミコン社製）を用い、切り出したゲ
ルをTBE 中で100V、2 時間の電気溶出に供与した。溶出
後セントリコン−10を4 ℃において7,500xg 、1 時間の
遠心分離にかけ、溶出DNA を濃縮回収した。得られたDN
A 濃縮液に対してフェノール抽出、クロロホルム抽出を
行なった。得られた水相に等量（100 μl ）のイソアミ
ルアルコールを加え、激しく撹拌した後に10,000xg、3
分間の遠心分離を行い、イソアミルアルコール相を除去
した。得られた水相に対してエタノール沈殿を行なっ
た。得られたDNA 断片を制限酵素KpnIおよびClaI（宝酒
造（株）製）で切断し、フェノール抽出、クロロホルム
抽出、エタノール沈殿により精製した。得られたDNA 断
片のうち1/5量を発現プラスミド構築に用いた。即ちこ
のものを、予め制限酵素KpnIおよびClaIで切断し、アル
カリンフォスファターゼ・カーフインテスティン（Alka
line Phosphatase Calf intestine ：宝酒造（株）製）
を用いて脱リン酸化したプラスミドpKK388-1（クローン
テック社）200ng にライゲーションキットver.2 （宝酒
造（株）製）を用いて連結した。ライゲーション後の液
からDNA をフェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノ
ール沈殿により精製した。かくして得られたDNAを、ジ
ーンパルサー（BIO-RAD 社製）を用い1.80kVの電圧でエ
レクトロポーレーション法により、アンピシリン感受性
大腸菌JM109 株（宝酒造（株）製）に形質導入した。形
質導入された菌を当業者周知の方法でクローニングし、
NIa-C 発現プラスミドpKNIa-C を得た（図１）。

【００４１】NIa-C の菌体内での生産 NIa-C の菌体内での誘導発現を行なった。即ち、プラス
ミドpKNIa-C を保持する大腸菌（以下「pNIa-C株」とい
う）一白金耳を50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培
地（10g バクトトリプトン、5g バクトイーストエキス
トラクト、5g 塩化ナトリウム、蒸留水で1lとする）2m
l で37℃一夜振盪培養した（以下、「培養液A 」とい
う）。ついで新しいLB液体培地（50μg/mlのアンピシリ
ンを含む）3ml に30μl の培養液A を加え、37℃でOD60
0nm が1.0 になるまで振盪培養した。OD600nmが1.0 に
達した培養液にIPTGを最終濃度1mM になるように添加
し、28℃で6 時間振盪培養した。この培養液を以下、
「培養液B 」という。

【００４２】生産物の活性の確認 発現されたNIa-C の活性を、合成ペプチド基質分解活性
により確認した。即ち培養液B 1ml を4 ℃下、3,000xg
、5 分間遠心分離し菌体を回収し、400 μl の1mM ジ
チオスレイトールを含む10mM トリス塩酸緩衝液（pH8.
0 ）に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕機（ハンディ
ーソニックUR-20P：トミー精工（株）製）を用いレンジ
8 で2 分間処理し、菌体を破砕した。破砕液を4 ℃下、
10,000xgで5分間遠心分離し、上清を得た。この上清画
分20μl に90μl の10mM 塩化カリウム、10mM 二塩化
マグネシウム、0.5mM ジチオスレイトールを含む20mM N
-2- ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン
酸- 水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.3 ）および1 μl の
10mM 基質ペプチド水溶液（Lys-Glu-Phe-Lys-Phe-Gln-
Gly-Lys-Ser-Gln ：配列表の配列番号5 ）を加え、28℃
で30分間反応させ、反応液に12μl の1%トリフルオロ酢
酸（以下「TFA 」という。）水溶液を加え反応を停止さ
せた。反応終了液に3,000xg 、5 分間の遠心分離を行
い、上清60μl をYMC AM301 カラム（ワイエムシイ
（株）製）およびL-6320型HPLCシステム（日立製作所
（株）製）を用いた逆相HPLCに供与した。溶出液は0.1%
TFA水溶液（溶出液A ）および0.1% TFAアセトニトリル
溶液（溶出液B ）を用いた。溶出は溶出液A：B の割合
を15分間に100 ：0 から70：30まで直線的に変化させる
事によって行なった。流速は1.0ml/分とした。この条件
で溶出される基質（溶出時間10.0分）および生成物（Gl
y-Lys-Ser-Gln ：配列表の配列番号６、溶出時間1.5 分
およびLys-Glu-Phe-Lys-Phe-Gln ：配列表の配列番号
７、溶出時間11.2分）を220nm の吸光度で検出すること
により、NIa-C が活性を持つことを確認した。

【００４３】

【発明の効果】本発明の組換えNIa-C タンパク質は、プ
ロテアーゼとして、遺伝子操作において、特に大腸菌等
の微生物を用いて所望のタンパク質を製造する際に好適
に使用し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpKNIa-C の構築図

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源 生物名： 組織の種類： セルライン： 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..732 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：4..732 特徴を決定した方法：E 配列 ATG AGT CTA AAT CGC ATA AGT GGT TTG CGC GAC TAT AAT CCC ATT TCA 48 Met Ser Leu Asn Arg Ile Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser -1 1 5 10 15 CAA AAT GTT TGC TTG CTA ACA AAT GAG TCA GAA GGC CAT AGA GAG AAG 96 Gln Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu Lys 20 25 30 ATG TTT GGA ATT GGA TAT GGT TCA GTG ATC ATT ACA AAT CAA CAT CTG 144 Met Phe Gly Ile Gly Tyr Gly Ser Val Ile Ile Thr Asn Gln His Leu 35 40 45 TTC AGA AGG AAT AAT GGG GAG TTA TCA ATT CAA TCC AAG CAT GGC TAC 192 Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser Ile Gln Ser Lys His Gly Tyr 50 55 60 TTC AGA TGC CGC AAC ACC ACA AGC TTG AAG ATG CTG CCT TTG GAG GGA 240 Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu Gly 65 70 75 CAT GAC ATT TTG TTG ATT CAG TTA CCA AGG GAC TTT CCA GTG TTT CCA 288 His Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Pro Arg Asp Phe Pro Val Phe Pro 80 85 90 95 CAA AAG ATT CGC TTT AGG GAG CCA AGA GTG GAT GAC AAA ATT GTT TTG 336 Gln Lys Ile Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys Ile Val Leu 100 105 110 GTC AGC ACA AAT TTC CAG GAA AAG AGT TCC TCG AGC ACG GTC TCA GAG 384 Val Ser Thr Asn Phe Gln Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser Glu 115 120 125 TCC AGT AAC ATT TCA AGA GTG CAG TCA GCC AAT TTC TAC AAG CAT TGG 432 Ser Ser Asn Ile Ser Arg Val Gln Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His Trp 130 135 140 ATC TCA ACA GTA GCA GGA CAC TGT GGA AAC CCT ATG GTT TCG ACT AAA 480 Ile Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr Lys 145 150 155 GAT GGA TTT ATT GTA GGT ATC CAC AGT CTT GCT TCA TTG ACA GGC GAC 528 Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly Asp 160 165 170 175 GTT AAC ATC TTC ACA AGC TTT CCG CCG CAG TTT GAG AAC AAA TAT CTA 576 Val Asn Ile Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Tyr Leu 180 185 190 CAG AAG CTC AGT GAA CAC ACA TGG TGT AGT GGA TGG AAA CTA AAT CTT 624 Gln Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn Leu 195 200 205 GGA AAG ATT AGT TGG GGT GGA ATC AAC ATT GTG GAG GAT GCA CCT GAA 672 Gly Lys Ile Ser Trp Gly Gly Ile Asn Ile Val Glu Asp Ala Pro Glu 210 215 220 GAG CCC TTT ATA ACA TCC AAG ATG GCA AGC CTT CTT AGT GAT TTG AAT 720 Glu Pro Phe Ile Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu Asn 225 230 235 TGT TCA TTC CAA TAA 735 Cys Ser Phe Gln 240 配列番号：２ 配列の長さ：２４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Ser Leu Asn Arg Ile Ser Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser -1 1 5 10 15 Gln Asn Val Cys Leu Leu Thr Asn Glu Ser Glu Gly His Arg Glu Lys 20 25 30 Met Phe Gly Ile Gly Tyr Gly Ser Val Ile Ile Thr Asn Gln His Leu 35 40 45 Phe Arg Arg Asn Asn Gly Glu Leu Ser Ile Gln Ser Lys His Gly Tyr 50 55 60 Phe Arg Cys Arg Asn Thr Thr Ser Leu Lys Met Leu Pro Leu Glu Gly 65 70 75 His Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Pro Arg Asp Phe Pro Val Phe Pro 80 85 90 95 Gln Lys Ile Arg Phe Arg Glu Pro Arg Val Asp Asp Lys Ile Val Leu 100 105 110 Val Ser Thr Asn Phe Gln Glu Lys Ser Ser Ser Ser Thr Val Ser Glu 115 120 125 Ser Ser Asn Ile Ser Arg Val Gln Ser Ala Asn Phe Tyr Lys His Trp 130 135 140 Ile Ser Thr Val Ala Gly His Cys Gly Asn Pro Met Val Ser Thr Lys 145 150 155 Asp Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Leu Ala Ser Leu Thr Gly Asp 160 165 170 175 Val Asn Ile Phe Thr Ser Phe Pro Pro Gln Phe Glu Asn Lys Tyr Leu 180 185 190 Gln Lys Leu Ser Glu His Thr Trp Cys Ser Gly Trp Lys Leu Asn Leu 195 200 205 Gly Lys Ile Ser Trp Gly Gly Ile Asn Ile Val Glu Asp Ala Pro Glu 210 215 220 Glu Pro Phe Ile Thr Ser Lys Met Ala Ser Leu Leu Ser Asp Leu Asn 225 230 235 Cys Ser Phe Gln 240 配列番号：３ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Noアンチセンス :No 配列 ATTATCGATA AGGAGGTTTA AACCATGAGT CTAAATCGCA TAAGTGGTTT GCGCGAC 57 配列番号：４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 CCCGGTACCT TATTGGAATG AACAATTCAA ATCACT 36 配列番号：５ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Glu Phe Lys Phe Gln Gly Lys Ser Gln 1 5 10 配列番号：６ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Lys Ser Gln 1 配列番号：７ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｎ １ ５

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 高橋 亘 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 芹澤 伸記 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分子中に配列表の配列番号２に示されるア
   ミノ酸配列のアミノ酸番号1 〜243のアミノ酸配列を含
   むことから成り、基質ペプチド中のGln-Gly 間のペプチ
   ド結合を加水分解するプロテアーゼ活性を有するタンパ
   ク質、または、該アミノ酸配列の一つもしくは複数のア
   ミノ酸残基が欠失、挿入もしくは置換されているアミノ
   酸配列を含み、該プロテアーゼ活性を有するタンパク
   質。
2. 【請求項２】分子中に配列表の配列番号２に示されるア
   ミノ酸配列のアミノ酸番号1 〜243のアミノ酸配列を含
   むことから成り、基質ペプチド中のGln-Gly 間のペプチ
   ド結合を加水分解するプロテアーゼ活性を有するタンパ
   ク質。
3. 【請求項３】配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミ
   ノ酸番号1 〜243 のアミノ酸配列と55% 以上のアミノ酸
   配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことから成り、
   基質ペプチド中のGln-Gly 間のペプチド結合を加水分解
   するプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
4. 【請求項４】請求項１乃至請求項３のいずれか一つに記
   載のタンパク質をコードするDNA 。
5. 【請求項５】分子中に配列表の配列番号１に示されるヌ
   クレオチド配列のヌクレオチド番号4 〜732 のヌクレオ
   チド配列を含む、請求項４記載のDNA 。
6. 【請求項６】配列表の配列番号１に示されるヌクレオチ
   ド配列のヌクレオチド番号4 〜732のヌクレオチド配列
   と70% 以上のヌクレオチド配列相同性を有する配列を含
   み、基質ペプチド中のGln-Gly 間のペプチド結合を加水
   分解するプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコード
   するDNA 。
7. 【請求項７】請求項５記載のDNA とハイブリダイズし、
   基質ペプチド中のGln-Gly 間のペプチド結合を加水分解
   するプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする
   DNA。
8. 【請求項８】請求項５記載のDNA と、60〜70℃、6xSSC
   条件下でハイブリダイズし、基質ペプチド中のGln-Gly
   間のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼ活性を有
   するタンパク質をコードするDNA 。
9. 【請求項９】請求項４乃至請求項８のいずれか一つに記
   載のDNA を含むことから成る組換えDNA ベクター。
10. 【請求項１０】請求項９記載の組換えDNA ベクターによ
    り形質転換された宿主細胞。
11. 【請求項１１】形質転換された宿主細胞が大腸菌である
    請求項１０記載の宿主細胞。
12. 【請求項１２】形質転換大腸菌株 pNIa-C SANK 72497
    ( FERM BP-5938 ）。