WO1993015214A1 - Process for producing n-acetylneuraminic acid - Google Patents

Process for producing n-acetylneuraminic acid Download PDF

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WO1993015214A1
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acetylneuraminic acid
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Yoji Tsukada
Yasuhiro Ohta
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Marukin Shoyu Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing N-acetylneuraminic acid.
  • N-Acetyl neuraminic acid is the most ubiquitous sialic acid substance, is widely distributed in tissues, fluids, secretions, etc. of living organisms, and is involved in hemagglutination, intercellular recognition, turnover of serum proteins, etc. This is an important substance known.
  • N-acetylneuraminic acid is conventionally produced by the hydrolysis of capsular polysaccharide of Escherichia coli, as well as the hydrolysis of natural products such as swallow's nest, chicken eggs and milk. It is also manufactured by
  • Kim et al. J. Am. Chem. Soc.], 110, 648 1-64 8 6 (198 8) is a method for reacting N-acetyl mannosamine with pyruvate in the presence of N-acetyl neuraminic acid lyase to obtain N-acetyl neuraminase.
  • a method for producing acid is reported.
  • this method lacks practicality because it uses N-acetylmannosamine, which is expensive and difficult to obtain in large quantities, as a raw material.
  • N-acetyl neuraminic acid Reaction of N-acetylglucosamine with pyruvate in the presence of N-acetylneuraminic acid lyase and epimerase A method for obtaining N-acetyl neuraminic acid has also been proposed [for example, Kiegl (Kieg 1) et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30_, 82] 7-8282 (1991)).
  • N-acetyl darcosamine is sequentially converted into N-acetylmannosamine by the action of epimerase, and then this N-acetylmannosamine is subjected to the action of N-acetylneuraminic acid lyase to give N-acetylethylnosamine. Converted to acetyl neuraminic acid.
  • epimerase that isomerizes N-acetyldarcosamine
  • the conversion rate of N-acetyltilcosamine to N-acetylneuraminic acid is 25%. Low, this method is not practical.
  • An object of the present invention is to provide a simple and practical method for producing N-acetylneuraminic acid.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to achieve the above object, and as a result, in order to avoid the inactivation of the enzyme in the past and to determine the optimal pH of N-acetylneuraminic acid lyase. 7.7) The alkalinity that was not used to deviate from N-acetylacetylglucosamine and pyruvate in the high pH region in the presence of N-acetylneuraminic acid lyase When reacted, the inactivation of the enzyme is suppressed by the protective effect of the substrates N-acetylglucosamine and pyruvate, and N-acetyl We found that dalcosamine was effectively converted to N-acetyl neuraminic acid.
  • the present invention provides a method for producing N-acetylneuraminic acid, which comprises reacting N-acetylneuraminic acid lyase in the presence of N-acetyldarcosamine and pyruvate under alkaline conditions. It provides a manufacturing method.
  • the term "hydrophilic conditions" means that the pH of the reaction solution is usually about 8 to 12, preferably about 9 to 12, more preferably about 10 to 12, and most preferably about 10 to 12. It is preferably about 10 to 11. If the pH of the reaction mixture is too low, little or no conversion of N-acetylglucosamine to N-acetylmannosamine occurs, so the reaction does not proceed and the pH of the reaction mixture becomes too high. And N-acetyl neuraminic acid lyase are inactivated, and the reaction yield is reduced.
  • the reaction temperature is about 10 to 80 ° C, preferably about 20 to 50 ° C, and the reaction time is about 30 minutes to 240 hours, preferably 20 hours to 12 hours. It is about 0 hours. The reaction is carried out in a stationary or stirred state.
  • the concentration of each component in the reaction solution is as follows. (1)
  • the amount of N-acetyldarcosamine used is not particularly limited, and it can be used at any concentration up to the saturation solubility, but is preferably about 1 to 20 WZV%, more preferably 10 to 10%. Used around 20 WZV%.
  • the amount of pyruvic acid used is not particularly limited and can be used at any concentration up to the saturation solubility, but is preferably about 1 to 20 WZV%, more preferably about 10 to 20 WZV%. Used once.
  • the amount of N-acetyl neuraminic acid lyase used is not particularly limited and can be selected from a wide range according to the amount of the substrate, but is preferably 0.01 U or more per 1 ml of the reaction solution, more preferably. 0.1 U or more: about LOOU, most preferably about 1 U to 50 U.
  • the concentrations of the substrates N-acetylglucosamine and pyruvate are too low, the absolute amount of N-acetylneuraminic acid produced will decrease, and the concentrations of the substrates N-acetyldarcosamine and pyruvate will decrease. If it is too high, the ratio of N-acetyl neuraminic acid at the end of the reaction will decrease, making purification difficult.
  • sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide or the like may be used as a method for adjusting the pH of the reaction solution to alkalinity.
  • N-Acetylglucosamine can be used in any form of free base and salts such as hydrochloric acid and sulfuric acid.
  • Pyruvic acid can be used in any form of a free acid and a salt such as sodium and potassium.
  • N-Acetylneuraminic acid lyase can use enzymes derived from both animal and plant sources, and is not significantly affected by the purity of the enzyme.
  • N-Acetylneuraminic acid produced by the method of the present invention can be easily separated and purified from the reaction solution by known means. For example, after purification by ion exchange column chromatography, concentration can be performed to obtain a crystal in an organic solvent.
  • the reaction is carried out under alkaline conditions in which the enzyme is conventionally deactivated by the enzyme protecting action of the substrate. Therefore, the following excellent effects can be achieved.
  • N-acetyldarcosamine which is inexpensive and available in large quantities, the reaction can be performed at a high substrate concentration, enabling mass synthesis of N-acetylneuraminic acid.
  • N-acetylneuramin can be obtained in a high yield of 50% or more (mol ratio) to N-acetylacetylglucosamine. Acid can be produced.
  • reaction product was isolated by ion exchange chromatography using D0weX1 (registered trademark, manufactured by Dow Chemical Co., Ltd.), concentrated, and then 10 g of needle-like N-acetylneuraminic acid was obtained according to a conventional method. Obtained.
  • N-acetyldarcosamine and 200 g of pyruvate were dissolved in 100 mM phosphate buffer ( ⁇ ⁇ ⁇ .0), and N-acetylneuraminic acid lyase was obtained. U was added to make the total amount 1 liter, and the reaction was carried out at 35 ° C for 120 hours. The amount of N-acetylneuraminic acid in the reaction solution was 56 g, and the conversion to the N-acetylglucosamine used was about 40%.
  • the reaction was performed under the same conditions as in Example 2 except that the concentrations of N-acetylglucosamine and pyruvate, the concentration of N-acetylneuraminate lyase, the reaction time, and the pH of the phosphate buffer were changed. Went.
  • N-Acetylglucosamine and sodium pyruvate The stability of N-acetylneuraminic acid lyase was examined under the same conditions as in Example 24 except that 2 was not added. Comparative Examples 3 to 1 1
  • N-acetyl neuraminic acid lyase The stability of N-acetyl neuraminic acid lyase was examined under the same conditions as in Comparative Example 2 except that the concentration of N-acetyl neuraminic acid lyase and the pH of the phosphate buffer were changed.
  • N-Acetylneuraminate lyase concentration l UZmll II Example or PH substrate concentration (g / 100 ml) N-acetylbalamin S ratio ⁇ GlcNAc Pyr-Na lyase residual ratio (%) Actual 9 . 0 1 8 1 8 1 0 0 Example 35 9.5 8 1 8 1 0 0

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Description

明 細 書
N —ァセチルノ イラ ミ ン酸の製造法
産業上の利用分野
本発明は、 N —ァセチルノイラ ミ ン酸の製造法に関する。
発明の開示
N —ァセチルノ イラ ミ ン酸は、 シアル酸類で最も普遍的 な物質であり、 生体の組織、 体液、 分泌液等に広く分布し、 赤血球凝集、 細胞間認識、 血清蛋白質の代謝回転等に関与 するこ とが知られている重要な物質である。
この様な、 重要物質である N —ァセチルノイラ ミ ン酸は、 従来、 大腸菌の夾膜多糖の加水分解により製造されている 他、 ゥ ミ ツバメの巣、 鶏卵及び牛乳などの天然物の加水分 解によっても製造されている。
上記のような天然物を製造原料とする方法は、 製造原料 の絶対量が限られているため、 年々需要の増加している N ーァセチルノ イ ラ ミ ン酸を大量に供給するこ とが困難であ ること、 天然物の加水分解後の他の夾雑物からの N —ァセ チルノイラ ミ ン酸の分離精製が容易でないこ と及び製造コ ス トが高く つく こと等の問題点を有しており、 N —ァセチ ルノ イラ ミ ン酸の安価な大量生産技術は未開発の状況にあ o
上記の問題を解決するため、 酵素を用いる合成法が種々 検討されている。
例えば、 キム （K i m) ら [ジャーナル · ォプ · ァメ リ カン * ケ ミ カノレ ' ソサエティ 一 （ J . Am. C h e m. S o c . ) , 1 1 0 , 6 4 8 1〜 6 4 8 6 ( 1 9 8 8 ) ] は、 N—ァセチルマンノサミ ンとピルビン酸とを N—ァセ チルノ イラ ミ ン酸リ アーゼの存在下に反応させることによ り、 N—ァセチルノイラ ミ ン酸を製造する方法を報告して いる。 しかし、 この方法は、 高価で大量の入手が困難な N —ァセチルマンノサミ ンを原料と して使用している点で実 用性に欠ける。
N—ァセチルマンノサミ ンは、 N—ァセチルグルコサミ ンを P H 1 2程度の強アル力 リ性条件下で異性化させて製 造すること もできる力 [サイモン （S i m o n) ら、 ジャ —ナル ， ォブ * アメ リカン · ケミ カル · ソサエティ 一 （J. Am. C e m. S o c . ) ， 1 1 0 , 7 1 5 9〜 7 1 6 3 ( 1 9 8 8 ) 参照] 、 この方法では平衡時の N—ァセチ ルグルコサミ ンと N—ァセチルマンノサミ ンの比率が、 N 一ァセチルグルコサミ ン ： N—ァセチルマンノサミ ン = 3 ： 1であり、 N—ァセチルマンノサミ ンの割合が小さいため その単離操作が容易でない。
N—ァセチルグルコサミ ンと ピルビン酸とを N—ァセチ ルノ イラ ミ ン酸リ ア一ゼ及びェピメ ラーゼの存在下に反応 させて N—ァセチルノ イラ ミ ン酸を得る方法も提案されて いる [例えば、 キーグル （ K i e g 1 ) ら， A n g e w . C h e m. I n t . E d. E n g l . ， 3 0_, 8 2 7〜 8 2 8 ( 1 9 9 1 ) 参照] 。 この方法では、 N—ァセチル ダルコサミ ンがェピメ ラーゼの作用により順次 N—ァセチ ルマンノサミ ンに変換され、 次いでこの N—ァセチルマン ノサミ ンが N—ァセチルノ イラ ミ ン酸リ アーゼの作用を受 けて N—ァセチルノイラ ミ ン酸に変換される。 しかしなが ら、 N—ァセチルダルコサミ ンを異性化するェピメ ラーゼ の入手が困難であり、 しかも N—ァセチルダルコサミ ンの N—ァセチルノ イラ ミ ン酸への変換率が 2 5 %と低く、 こ の方法も実用的であるとはいえない。
本発明は、 N—ァセチルノ イラ ミ ン酸の簡易かつ実用的 な製造法を提供するこ とを目的とする。
本発明者は、 上記課題を達成するために鋭意検討を重ね た結果、 従来は酵素が失活するこ とを避けるため、 および N—ァセチルノ イラ ミ ン酸リ ア一ゼの至適 p H ( 7. 7 ) から離れるために使用されていなかったアルカ リ性、 即ち、 高い p H領域で N—ァセチルグルコサミ ンと ピルビン酸と を N—ァセチルノイラ ミ ン酸リ ア一ゼの存在下に反応させ ると、 基質である N—ァセチルグルコサ ミ ン及びピルビン 酸の保護効果により酵素の失活が抑制され、 N—ァセチル ダルコサミ ンが効果的に N —ァセチルノイラ ミ ン酸に変換 されることを見出した。
即ち、 本発明は、 アル力 リ性条件下、 N —ァセチルダル コサミ ンおよびピルビン酸の存在下に N —ァセチルノイラ ミ ン酸リ アーゼを作用させるこ とを特徵とする N —ァセチ ルノイラ ミ ン酸の製造法を提供するものである。
本発明の製造法において、 アル力 リ性条件下とは、 反応 液の p Hが通常 8〜 1 2程度、 好ま しく は 9〜 1 2程度、 より好ま しく は 1 0〜 1 2程度、 最も好ま しく は 1 0〜 1 1程度である。 反応液の p Hが低く なり過ぎると N —ァ セチルグルコサ ミ ンから N —ァセチルマンノ サ ミ ンへの変 換がほとんど或いは全く起こ らないため反応は進行せず、 反応液の p Hが高く なり過ぎると N —ァセチルノイラ ミ ン 酸リァーゼが失活するため反応の収率が低下する。 反応温 度は、 1 0〜 8 0 °C程度、 好ま しく は 2 0〜 5 0 °C程度で あり、 反応時間は 3 0分〜 2 4 0時間程度、 好ま しく は 2 0時間〜 1 2 0時間程度である。 反応は、 静置または攪 拌状態で行う。
反応液中の各成分の濃度と しては、 以下の通りである。 ( 1 ) N —ァセチルダルコサミ ンの使用量は特に制限され ず、 飽和溶解度までのいずれの濃度でも使用できるが、 好 ま しく は 1〜 2 0 W Z V %程度、 より好ま しく は 1 0〜 2 0 WZV%程度使用される。
(2 ) ピルビン酸の使用量は特に制限されず、 飽和溶解度 までのいずれの濃度でも使用できるが、 好ま し く は 1〜 2 0WZV%程度、 より好ま し く は 1 0〜 2 0 WZV %程 度使用される。
(3) N—ァセチルノイラ ミ ン酸リ アーゼの使用量は特に 制限されず、 基質の量に応じて広い範囲から選択できるが、 好ま し く は反応液 l m l当たり 0. 0 1 U以上、 より好ま し く は 0. 1 U〜： L O O U程度、 最も好ま し く は 1 U〜 5 0 U程度である。
基質である N—ァセチルグルコサミ ンおよびピルビン酸 の濃度が低すぎると生産される N—ァセチルノイラ ミ ン酸 の絶対量が少な く なり、 基質である N—ァセチルダルコサ ミ ンおよびピルビン酸の濃度が高すぎると反応終了時の N ーァセチルノ イラ ミ ン酸の割合が低下するため精製が困難 となる。
N—ァセチルノイラ ミ ン酸リ アーゼの使用量が少なすぎ ると反応に長時間を要するこ とになり、 N—ァセチルノィ ラ ミ ン酸リ アーゼの使用量が多すぎても反応時間、 収率は 変わらず不経済である。
反応液の p Hをアルカ リ性に調整する方法と しては、 水 酸化ナ ト リ ウム、 水酸化カ リ ウム、 水酸化リ チウム等のァ ルカ リ金属水酸化物、 水酸化カルシウム、 水酸化マグネシ ゥム等のアル力 リ土類金属水酸化物、 炭酸ナ ト リ ウム、 炭 酸カ リ ウム、 炭酸水素ナ ト リ ウム、 炭酸水素力 リ ウム等の アルカ リ金属炭酸塩または炭酸水素塩、 ア ンモニアなどの アルカ リ性の物質を目的とする p Hの調整に必要な量だけ 添加するか、 またはリ ン酸緩衝液、 ト リ スー塩酸緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 ベロナール塩酸緩衝液、 グッ ド緩衝液、 ジ エタノ ールア ミ ン塩酸緩衝液などのアル力 リ性の緩衝液の 使用により行う ことができる。
N —ァセチルグルコサミ ンは、 遊離塩基及び塩酸、 硫酸 等の塩のいずれの形態でも使用することができる。
ピルビン酸は、 遊離の酸及びナ ト リ ウム、 カ リ ウム等の 塩のいずれの形態でも使用することができる。
N —ァセチルノイラ ミ ン酸リ アーゼは、 動物起源及び植 物起源のいずれの由来の酵素も用いることができ、 酵素の 純度にも余り影響されない。
本発明の方法により生成する N —ァセチルノイラ ミ ン酸 は、 公知の手段により容易に反応液から分離精製できる。 例えば、 イオン交換カラムクロマ トグラフィ ーにより精製 後、 濃縮し、 有機溶媒中で結晶体を得ることができる。
本発明の方法によれば、 基質の酵素保護作用により従来 では酵素が失活するとされているアル力 リ性条件下で反応 を行う こ とができるため、 以下のような優れた効果が達成 される。
( 1 ) 安価で大量入手が可能な N—ァセチルダルコサミ ン を原料と し、 高い基質濃度で反応が行えるため、 N—ァセ チルノ イラ ミ ン酸の大量合成が可能となった。
( 2 ) 1段階で反応が進行するので、 製造工程の簡略化が 図れるようになった。
( 3 ) N—ァセチルダルコサミ ンがアルカ リ性条件下で N 一ァセチルマンノサミ ンに異性化するため、 ェピメ ラーゼ を使用する必要がない。
( 4 ) 反応液の p H、 酵素量、 基質濃度等の条件を適切に 選択すると、 対 N—ァセチルグルコサミ ン 5 0 %以上 （モ ル比率） という高収率で N—ァセチルノ イラ ミ ン酸を製造 するこ とができる。
実 施 例
以下、 実施例および比較例を用いて本発明をより詳細に 説明するが、 本発明はこれら実施例に限定される ものでは ない。
実施例 1
* N—ァセチルノイラ ミ ン酸の製造
水に N—ァセチルグルコサミ ン 1 8 gおよびピルビン酸 1 8 gを溶解し、 この溶液を 1 N—水酸化ナ ト リ ウム水溶 液を用いて ρ Η Ι Ο . 5に調整後、 これに N—ァセチルノ イラ ミ ン酸リ アーゼ 2 0 0 0 Uを加えて全量を 1 0 O m l とし、 3 0 °Cで 4 8時間反応させた。 H P L Cによる定量 によれば、 反応液中の N—ァセチルノイラ ミ ン酸量は 1 3 gであり、 使用した N—ァセチルダルコサミ ンに対す る変換率は約 5 1 %であった。
D 0 w e X 1 (登録商標、 ダウケミ カル株式会社製） によるィォン交換ク ロマ トグラフィ 一により反応生成物を 単離し、 濃縮後、 常法に従い N—ァセチルノイラ ミ ン酸の 針状結晶を 1 0 g得た。
実施例 2
1 0 0 mMリ ン酸緩衝液 （ρ Η Ι Ο. 0 ) に N—ァセチ ルダルコサミ ン 1 0 0 gおよびピルビン酸 2 0 0 gを溶解 し、 N—ァセチルノイラ ミ ン酸リアーゼ 1 5 0 0 0 Uを加 えて全量を 1 リ ッ トルと し、 3 5 °Cで 1 2 0時間反応させ た。 反応液中の N—ァセチルノイラ ミ ン酸の量は 5 6 gで あり、 使用した N—ァセチルグルコサミ ンに対する変換率 は約 4 0 %であった。
D 0 w e X 1 (登録商標、 ダウケミ カル株式会社製） によるィォン交換ク口マ トグラフィ 一により反応生成物を 単離し、 濃縮後、 常法に従い N—ァセチルノイラ ミ ン酸の 針状結晶を約 4 2 g得た。 実施例 3 2 3及び比較例 1
N —ァセチルグルコサ ミ ンおよびピルビン酸の濃度、 N —ァセチルノ イ ラ ミ ン酸リ アーゼの濃度、 反応時間並びに リ ン酸緩衝液の P Hを各々変更した以外は実施例 2 と同様 な条件下で反応を行つ た。
糸口：^ ヽ 以下の第 1表および第 2表に示す。
1
"T* ァセチルノ イ ラ ミ ン酸リソ アノ ゼ濃 ， 1 0 U / m 室漏 A A ©濃度
1 0 0 m 1 \
ノ ill J¾ / m 1 )
Gl cNAc Pyr - 1 BSK後 5日反応後
3 8 . 0 1 8 1 ϋ s 0 1
4 9 . 0 1 8 1 8 1 3
5 9 . 5 1 8 1 8 2 7
6 1 0 . 0 1 8 1 8 1 9 5 0
7 1 0 . 5 1 8 1 8 5 5 1 3 0
8 1 1 . 0 1 8 1 8 3 0 6 0
9 9 . 0 4 . 5 4 . 5 0 1
10 9 . 5 4 . 5 4 . 5 1 2
11 1 0 . 0 4 . 5 4 . 5 4 1 1
12 1 0 . 5 4 . 5 4 . 5 9 2 0
13 1 1 . 0 4 . 5 4 . 5 2 3 謹 1 7. 5 1 8 1 8 0 0
2 ¾
* N ァセチルノ イ ラ ミ ン酸リ ア ゼ濃度 ： 1 U/m 1
一
実施例 度 A N Aの濃度
V 6 / 丄 U O m l ) (m g /m 1 )
\J · Λ Pyr-Na 1日反応後 5日反応後
14 q n u 1
丄 O Q 1 8 0 1
15 Q u 1丄 R o 1 8 1 3
16 1 n n 上 o 18 2 1 5
17 1 o . 5 18 1 8 7 2 6
18 1 1. 0 1 8 1 8 2 6
19 9. 0 4 · 5 4. 5 0 1
20 9. 5 4. 5 4. 5 1 2
21 1 0. 0 4. 5 4. 5 3 9
22 1 0. 5 4. 5 4 · 5 6 1 3
23 1 1. 0 4 · 5 4. 5 1 1
なお、 第 1表および第 2表中の略号の意味は、 以下の通 りである。 * N A N A : N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸
* G 1 c N A c ： N—ァセチルグルコサ ミ ン
* P y r - a ： ピルビン酸ナ ト リ ウム 上記第 1表および第 2表の結果から、 本発明の方法によ れば、 N—ァセチルグルコサミ ンから 1段階で N—ァセチ ルノイラ ミ ン酸に高い割合で変換できることが明らかとな つた。
実施例 2 4
ネ N—ァセチルノイラ ミ リ "^一ゼの安定性
l O O mMリ ン酸緩衝液 （ρ Η Ι Ο . 0 ) に N—ァセチ ルノイ ラ ミ ン酸リ アーゼ 1 0 0 U、 N—ァセチルダルコサ ミ ン 1. 8 gおよびピルビン酸ナ ト リ ウム 1. 8 gを加え て全量を 1 0 m l と し、 3 5 °Cで 1 6時間反応させた。 反 応後の N—ァセチルノイラ ミ ン酸リ アーゼの残存率を、 反 応液を 1 0 0倍量の 5 0 mMリ ン酸緩衝液 （p H 7. 5 ) に透析後、 基質 （N—ァセチルノイラ ミ ン酸） と反応し、 生成する N—ァセチルマンノサ ミ ンを比色定量することに より求めたところ 1 0 0 %であった。
実施例 2 5〜 4 3
N—ァセチルダルコサミ ンおよびピルビン酸の濃度、 N ーァセチルノ イラ ミ ン酸リ ァーゼの濃度並びにリ ン酸緩衝 液の p Hを各々変更した以外は実施例 2 4と同様な条件下 で N—ァセチルノイラ ミ ン酸リ ァーゼの安定性を調べた。 比較例 2
N—ァセチルグルコサ ミ ンおよびピルビン酸ナ ト リ ゥム 2 を添加しないことを除いては実施例 2 4 と同様の条件で、 N —ァセチルノイラ ミ ン酸リ ァーゼの安定性を調べた。 比較例 3〜 1 1
N —ァセチルノイラ ミ ン酸リ ァーゼの濃度およびリ ン酸 緩衝液の p Hを各々変更した以外は比較例 2 と同様な条件 下で N —ァセチルノイラ ミ ン酸リァーゼの安定性を調べた。
結果を、 以下の第 3表および第 4表に示す。
第 3 表
* N —ァセチルノイラ ミ ン酸リ アーゼ濃度 ： 1 0 U Z m 1 実腹は P H 基質濃度（g/100ml) N -ァセチルノイラミン液 比较 ¾ GlcNAc Pyr-Na リア-ゼの残存率（ ) 誦 24 9 . 0 1 8 1 8 1 0 0 実關 25 9 . 5 1 8 1 8 1 0 0 実 26 1 0 . 0 1 8 1 8 1 0 0 実顧 7 1 0 . 5 1 8 1 8 8 0 実 28 1 1 . 0 1 8 1 8 2 2 実關 29 9 . 0 4 . 5 4 . 5 1 0 0 謹 30 9 . 5 4 . 5 4 . 5 1 0 0 実關 31 1 0 . 0 4 . 5 4 . 5 1 0 0 実關 32 1 0 . 5 4 . 5 4 . 5 8 0 議 3 1 1 . 0 4 . 5 4 . 5 1 0 比较例 2 9 . 0 0 0 1 0 0 3 顯 3 9. 5 0 0 1 0 0 比较例 4 1 0. 0 0 0 2 0
1 0. 5 0 0 0 1 1. 0 0 0 0 第 4 表
* N— ァセチルノ イ ラ ミ ン酸 リ ア ーゼ濃度 ： l UZm l II施例又は P H 基質濃度（g/100ml) N-ァセチルバラミン S 比较 GlcNAc Pyr-Na リア-ゼの残存率（％) 実 9. 0 1 8 1 8 1 0 0 実施例 35 9. 5 8 1 8 1 0 0
0. 0 8 1 8 9 7 実議 7 0. 5 1 8 8 7 0
1. 0 8 1 8 3 0 実施例 39 9. 0 4. 5 4 · 5 0 0
9. 5 4 5 4 5 0 0 1 0. 0 4 5 4 5 9 8 1 0. 5 4 5 4 5 6 0 1 1. 0 4 5 4 5 8 比較例 7 9. 0 0 0 0 0 比较例 8 9. 5 0 0 9 8
1 0. 0 0 0 1 5 4 比議 1 0. 5 0 0 0 誦 11 1 1. 0 0 0 0 上記第 3表および第 4表の結果から、 基質である N—ァ セチルダルコサミ ンおよびピルビン酸の存在により、 より 広い p H範囲で不安定な N—ァセチルノイラ ミ ン酸リ ア一 ゼの安定化が図れることが明らかとなつた。

Claims

5 請求の範囲
アルカ リ性条件下、 N —ァセチルグルコサ ミ ンおよび ピルビン酸の存在下に N —ァセチルノイラ ミ ン酸リ ア一 ゼを作用させることを特徴とする N —ァセチルノイラ ミ ン酸の製造法。
アルカ リ性条件が、 p H 8〜 1 2である請求項 1 に記 載の製造法。
アルカ リ性条件が、 p H 9〜 1 2である請求項 2に記 載の製造法。
アルカ リ性条件が、 p H 1 0〜 1 2である請求項 3 に 記載の製造法。
アルカ リ性条件が、 p H l 0〜 1 1である請求項 4に 記載の製造法。
アルカ リ性条件の調節を、 アルカ リ金属水酸化物、 ァ ルカ リ土類金属水酸化物、 アルカ リ金属炭酸塩、 アル力 リ金属炭酸水素塩およびアル力 リ性の物質からなる群か ら選ばれた少なく と も 1種を p Hの調整に必要な量だけ 添加して行う請求項 1〜 5のいずれかに記載の製造法。
アルカ リ性条件の調節を、 水酸化ナ ト リ ウム、 水酸化 カ リ ウム、 水酸化リ チゥム水酸化カルシゥム、 水酸化マ グネシゥム、 炭酸ナ ト リ ウム、 炭酸力 リ ゥム、 炭酸水素 ナ ト リ ウム、 炭酸水素力 リ ゥム及びア ンモニアからなる 群から選ばれたの少なく とも.1種を p Hの調整に必要な 量だけ添加して行う請求項 1〜 5のいずれかに記載の製 造法。
8 アルカ リ性条件の調節を、 アルカ リ性の緩衝液を用い て行う請求項 1〜 5のいずれかに記載の製造法。
9 アルカ リ性の緩衝液がリ ン酸緩衝液、 ト リ スー塩酸緩 衝液、 ホウ酸緩衝液、 ベロナール塩酸緩衝液、 グッ ド緩 衝液またはジエタノ ールアミ ン塩酸緩衝液からなる群か ら選ばれたいずれか 1種である請求項 1〜 5のいずれか に記載の製造法。
10 N—ァセチルグルコサ ミ ンの濃度が 1〜 2 0 W Y % である請求項 1〜 9のいずれかに記載の製造法。
11 ピルビン酸の濃度が 1〜 2 0 WZV%である請求項 1 〜 9のいずれかに記載の製造法。
12 N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸リ アーゼの使用量が反応液 l m l当たり 0. 1〜 1 0 0 Uである請求項 1〜 9のい ずれかに記載の製造法。
13 N—ァセチルグルコサミ ンの濃度が 1〜2 0WZV%、 ピルビン酸の濃度が 1〜 2 0 WZV 、 N—ァセチルノ イ ラ ミ ン酸リ アーゼの使用量が反応液 1 m 1当たり
0. 1〜 1 0 0 Uである請求項 1〜 5のいずれかに記載 の製造法。
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