WO1993002107A1 - Immunoglobulin-combining artificial protein - Google Patents

Description

明 細

免疫グロ ブ リ ン結合性人工蛋白

産業上の利用分野

本発明は、 免疫グロ ブリ ン結合性人工蛋白 に関するもので あっ て、 こ の人工蛋白は、 天然に存在する免疫グロ ブリ ン G 結合性蛋白の一つであるプロ テイ ン A に比 して格段に免疫グ ロ ブリ ン G (IgG) 吸着能がす ぐれてお り、 また、 すぐれた分 子量マ一力一にも利用でき、 バイオテク ノ ロ ジー関連の各種 分野において広範に利用する こ と ができる。

従来の技術及び問題点

プロテイ ン Aは、 黄色ブ ド ウ球菌（Staphylococcus aureus) の細胞壁に存在する蛋白質で、 通常、 Cowan I 株の培養液か ら単離さ れる こ と は既に知 られてい る （福井三郎ほか監修 Γバイオテ ク ノ ロ ジ一事典」㈱シーエム シ一、 P.958(1986- 10 -9) ) 。 本発明のよ う に、 プロテイ ン Aの IgG結合 ド メ イ ンの 1 つに着目 し、 遗伝子操作によってそれを複数個連結させた !1と しては、 Nilssonら (Protein Engineering 1 , 107- 113 , 1987) による人工的な変異体である ドメイ ン Z を く り返した もの と、 Saitoら (Protein Engineering 2 , 481-487, 1989) によ る ドメ イ ン Β を く リ返したものがすでに知られているが、 ある特定の IgG結合 ド メ イ ン の特に く り返し数に着目 してそ れ らの IgG結合能を詳細に比較 した例はない。

また、 従来よ り マーカー蛋白質はい く つか知られており 、 例えば SDS-ポリ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動用の分子量マー カー蛋白 と して既知のものは、 ミ オシン （ H鎖） 、 β — ガ ラ ク トシダーゼ、 ホスホ リ ラーゼ b 、 ゥシ血清アルブミ ン、 ォバルブミ ン、 カーボニッ ク ア ン ヒ ドラ一ゼ、 大豆 ト リ プシ ンイ ン ヒ ビタ ー、 リ ゾチームなどの適当な分子量の蛋白質を 混合したものである。 ゥエスタ ンブロ ッティ ングにおいては、 メ ンブレ ン上に転写されたマ一力一蛋白質は、 目的蛋白質の レーン と切 り放して、 ア ミ ドブラ ッ クなどの色素で染色する。 また、 これらのマーカ一蛋白質に適当な色素を結合させ、 電 気泳動中にも見えるよ う に したもの（有色マーカー）があ り、 これらはそのままメンブレン上にも転写される。 また、 ゥェ スタ ンプロ ッテイ ング用の分子量マ一カーと しては、 上記蛋 白質を ビォチン化して、 ア ビジン一西洋ヮサビペルォキシダ —ゼ（H RP )と反応後、 発色させるものがある（ビォチン標識マ 一力一） 。

しかし、 従来用い られてきたマ一カー蛋白質は、 種々の蛋 白質の混合物であるため、 それぞれのバン ドの染色性や、 安 定性にばらつきがあ り 、 特に保存中に薄く なつ てい く バン ド があっ た。 有色マーカ一は色素が結合する こ と によって移動 度が変化し、 正確な分子量の推定には適さず、 そのバン ドは 一般にブロードである。 ピオチン標識マーカ一は、 ア ビジン — H R Pを必要と し、 一般的ではない。

また、 従来用い られてきたマーカー蛋白質は、 分子量が一 定 しない場合が多く て正確性に欠ける こ と があるだけでな く 、 分子量を変えた り して 目的とするマーカー蛋白質を 自 由に効 率よ く設計する こ となどはできなかっ た。

問題点を解決す^ 本発明ではプロテイ ン Aの IgG結合 ド メ イ ンの内 ド メ イ ン A と B の部分を一単位と し、 PCR法（プライ マー利用逍伝子増 幅法） によ り これ らの遗伝子を 自 由に増幅する こ と に成功 し、 その結果、 これ ら を複数個つなげた蛋白質を 自 由 に製造する こ と には じめて成功 した。

しかも全く予期せざる こ と に、 このよ う に して得られた連 結蛋白質 （以下、 連結蛋白質と い う こ と もある） は、 天然型 のプロテイ ン Aに比して IgGとの特異的結合能においてす ぐ れている こ と を発見 し、 これ らの新知見を基礎と して更に研 究の結果、 本発明の完成に至っ たものである。

また、 分子量マ一カーについては、 プロ テイ ン Aの IgG結 合 ド メ イ ンの内 ド メ イ ン Aと B の部分を一単位と し、 PCR法 によ り これらの遺伝子を 自 由に増幅する こ と に成功 し、 その 結果、 これ ら を複数個つなげた蛋白質を 自 由に製造する こ と には じめて成功 した。

図面の簡単な説明

図 1 は、 プロテイ ン Aの 5 つの IgG結合 ド メ イ ン（E 、 D、

A、 B、 C ) のア ミ ノ酸配列を比較した図であ り 、 図中、 5 種の間で完全に一致しない部分について、 共通でないア ミ ノ 酸にアンダーライ ンを示した。

図 2 は、 本発明に係る発現プラ ス ミ ドの構築図である。

図 3 は、 PCR法でプロテイ ン Aの AB ド メ イ ンの遗伝子を増 幅するための 2種のプラ イマ一（PR0TS、 PR0TAS) および、 発 現べク タ 一に開始コ ドンと Acclサイ ト を導入するための 2種 のプライマー（ACCS、- ACCAS)の塩基配列である。 図 4 は、 PR0T-AB、 セ フ ァ ロ一ス カ ラム上における ゥサギ 抗ヒ ト CRP抗体のァフィ 二ティ ク ロマ トグラムである（O ： 蛋 白質、 Δ ： IgG) 。 - 図 5 は、 6種の組換え型プロテイ ン Aによる ゥサギ抗血清 由来 IgGの結合容量を示 したダラ フである。

図 6 は、 PROT-AB IV—セ フ ァ ロ一ス カ ラムによって精製 されたゥサギ IgGの SDS-PAGE パタ ーンであ る 。

( 1 : 分子量マーカ一、 2 : ゥサギ抗血清、 3 : 精製 IgG)。

図 7 は、 本発明に したがっ て作製された分子量マーカー蛋 白質を SDS-PAGEにかけ、 そのゲルを CBBRで染色 した図面であ る。

図 8 は、 本発明に したがっ て作製された分子量マーカー蛋 白質を SDS-PAGEにかけ、 そのゲルを PVDF膜にエレク 卜 ロブ口 ッ 卜 し 、 一次抗体と してゥサギの血清を、 二次抗体と して HRP結合ャギ抗ゥサギ抗体を結合させて、 4 -ク ロ ロー 1 - ナフ トールで発色させた図面である。 図 7及び図 8 において 各レーンはそれぞれ次のものを示す ： レーン BRL社分子量 マーカ— ； 1 , PR0T-ABI ； 2 ， PR0T-ABII ； 3， PR0T-ABII I ； 4 ， PR0T-ABIV ； 5 ， PR0T-ABV ； 6 ， PR0T-ABVI ; 7 , 8 , 9 ， 10, レーン 2〜 7 の混合物。 CBBR染色では PR0T-ABI, II は 1.0 g、 PR0T - ABIII-VIは 0.5 g, プロ ッティ ングした方 の レーン 1 — 7では PR0T-ABI, IIは 0.1 ;i g、 PROT-ABIII- VI は 0.05 ;i g、 レーン 8 ， 9 では PROT-ABI, IIは 0.5 /i _g、 PROT- ABIII- VIは 0 · 25 μ g、 レーン 10では PROT-ABI, IIは 1.0 g、 PR0T - ΑΒΙΠ - VIは 0·5 gを用レヽた。 本発明に係る連結蛋白質は、 後記する と こ ろからも明 ら 力、 なよ う に遺伝子組換え技術によっ て所望する分子量のものを 正確且つ 自由に作製する こ と ができ、 し かも画期的な こ と に、 IgG に特異的に結合する能力 に卓越 している。 したがっ て本 発明に係る連結蛋白質によれば、 Ig G含有試料中の I g Gのみを 選択的に結合する こ と ができ るので、 I gGの精製、 分離に利 用する こ と ができ、 あるいは逆に I gG含有試料から I gGのみ を選択的に除去するのに利用する こ とも可能である。 しかも、 本連結蛋白質は IgGに,対する結合能に優れ、 溶離液を作用さ せれば容易に IgGを溶離する こ と ができ る。

本発明に係る連結蛋白質を用いて IgGを精製する には、 不 均一系、 均一系のいずれの系も利用する こ と ができ、 いずれ の場合においても常法が適宜使用される。

例えば不均一系を利用する場合には、 常法に したがって容 器、 器壁や担体に本発明に係る連結蛋白質を固定化 し、 これ に I gG含有試料を接触させればよ く 、 バッチ式、 連続式のい ずれの方式も利用する こ と ができる。 固定化法と しては、 微 生物や酵素を固定化する方法が適宜利用され、 例えば共有結 合法、 イオン結合法、 物理的吸着法と いっ た各種の担体結合 法が好適に利用される。 また、 担体ない し器壁材料と して 、 利用する結合法に最適なもの を選択すればよ く 、 例えば、 合 成樹脂、 多糖類等合成又は天然の有機物 ； ガラス、 金属、 多 孔質粘土等無機物 ； 血球、 細胞、 微生物菌体等生物系物質等 が広範に適宜選択使用 される。

このよ う に して本発明に係る連結蛋白質を固定化 した担体 は、 例えばこれをカ ラムに充填した後、 IgG 含有試料を これ にアプライ して IgGのみを選択的に固定化担体に結合させ、 しかる後に溶離液を流下させる と IgGが溶離して、 連続的に 精製 IgG を得る こ とができる。 そ して更に精製度を高めるた めには、 この操作を く り返した り、 必要あれば新たに調製し た該プロテイ ン A固定化担体充填カラムで改めて処理 しても よい。 バッチ式で精製する場合も同様に IgGを担体に結合せ しめた後、 これを固液分離し、 次いで IgGを溶離すればよい， 実施例 1

(1) プラス ミ ド PTRP - PR0T - AB：〜 VIの構築

最も分子量の小さい基本蛋白質と して、 プロテイ ン Aの AB ドメイ ンを用いる こ と を計画し、 その遗伝子を市販のプロテ イ ン A融合蛋白質発現べク タ一 PRIT2Tを鐯型と して PCR法で 合成した （図 2 ) 。 その際、 遺伝子の両端に制限酵素 Acclの 認識配列を導入し、 この遗伝子が一定方向に連結されるよ う に した。 Acclの認識配列は ποη - palindromicであ り 、 両末端 にそのよ う な配列を持つ DMA断片は一定方向に しか連結され ない特徴がある。 この様な制限酵素と しては他に、 AiLIII、 Aval. Banl, Banll, HgiAIなどがある》

発現ベク ターと しては、 trpプロモータ と、 ク ローニング 部位と して Acclサイ ト を持ち、 大腸菌で髙発現させるために、 N末端ア ミ ノ酸の Metの次のア ミ ノ酸を Lysと し、 そのコ ドン を AAAと して、 いわゆる ATGベク タ ー （PTRPACC) を作製 した。 この癸 ¾ベク タ 一に上記プロテイ ン Aの ABドメ イ ンの遗伝子 を基本単位と して、 それら が 1 個から 6個連結されたもの を 揷入 した。 PCR反応は、 PRIT2Tを HincIIで切断したもの を鍀 型と し、 センスプライ マーと して、 5'-GGTAGACGCTGATAACAAT TTCAACAAA - 5' (図 3 、 PR0TS) を、 アンチセンスプライマーと して、 5, - GGTCTACTTTTGGTGCTTGAGCATCATTTA - 3, (図 3 、 PR0TS) を用い、 Tagポリ メ ラ一ゼ （2.5単位） を用いて、 94°C、 1 分、 50 °C , 1 分、 72°C、 5分を 30サイ クル行っ て、 目的の ABドメ イ ンの遗伝子を増幅した。 発現ベク タ ーも同様の PCR反応を 利用 して、 ク ロ一ニング部位を導入 した。 この場合に用いた センスプライマー（ACCS)及びアンチセンスプライマ一（ACCAS) は、 図 3 に示すと おりである。

ライゲ一シヨ ン反応は、 T4DNAリ ガ一ゼ （350単位） を用い て、 14°C、 16時間行っ た。 この反応生成物を用いて、 大腸菌 JM109 (recAl , endAl , gyrA96, thi, hsdR17， supE44, relAl , λ -, Δ (lac-proAB) , [F'， traD36, proAB, laclq, lacZ Δ M15])の形質転換を行っ た後、 受容菌を寒天 0.7%およびア ン ピシ リ ンを 1 ml当た り 100 g含む寒天培地 （組成 ： 1 リ ッ ト ル当た リ ト リ プ トン 10 g 、 イース トエキス 5 _g 、 食塩 10 g： 、 PH7.4) と混合した後、 寒天 1 · 5 %およびアン ピシ リ ンを 1 ml 当た リ 100 μ g含む L寒天培地のプレー ト上に重層 して 37°Cに て一昼夜培養を行い'、 アルカ リ -SDS法によ り プラス ミ ド DNA を分離し、 ァガ口一スゲル電気泳動を行っ て、 目的の DNA断 片が揷入されたク ローン を選択 した。 また、 得られたプラ ス ミ ド DNAを Accl で部分消化する こ と によ り 、 何単位のプロテ イ ン Aの ABドメ イ ンの遣伝子が挿入されているかを調べ、 1 個から 6個連結されたものをそれぞれ、 PTRP-PROT-ABI力、ら pTRP-PROT-ABVIと名付けた。

PTRP— PR0T— ABIVによる形質 S # 大腸菌 t± Escherichia coli JM109/pTRP-PROT-AB 4の表示のも とに微生物工業技術研究所 に FERM BP- 3930と して寄託されている。

(2) 形質転換大腸菌 JM109/pTRP-PR0T- ABI〜VIの培養

プラスミ ド PTRP-PROT - ABI〜VIで形質転換した大腸菌 JM109 をアン ピシ リ ンを 1 ml当たリ 100 μ g含む LB培地中， 37°Cで 24 時間培養した。 このよ う に して得た菌体は一 20°Cで凍結保存 した。

(3) 菌の粉砕と各マーカー蛋白質の精製

凍結してあった菌体を室温で融解した後、 菌体の 3倍量の 0. ImM EDTA、 0.15M NaClを含む 50mM燐酸緩衝液（pH7 · 5) に懸 濁し、 ダイ ノ ミノレによ リ菌を破砕した。 これに 1/50容量の 10 % Lubrol PXを加え、 0°Cで 15分間撹拌した後、 15， 000rpmで 20分間 4 °Cで遠心し、 その遠心上清に硫安を加えて 30 %飽和 に し、 さ らにその遠心上清に硫安を加えて 60%飽和にして遠 心し， 30— 60 %飽和硫安沈澱画分を得た。 これを少量の緩衝 液 A (0.1DIM EDTAを含む 50mM燐酸緩衝液、 PH 7.5) に溶解し、 セ フ アデッ クス G-25カラムで脱塩後、 緩衝液 Aで平衡化した DEAE—セフ ァ ロースカラムにアプライ した。 目的蛋白質はこ の条件で DEAE-セフ ァ ロ一スに吸着する。 緩衝液 Aでカラム を十分洗浄後、 0— 1M NaClの直線濃度勾配で溶出した。 目的 蛋白質は、 HRP結合ャギ抗ゥサギ IgG抗体を用いた ELISAによ W検出した。 目的蛋白質画分を 0.15M NaCl、 0.05% Tween20 を含む 50mMト リ ス塩酸緩衝液 PH7.4で平衡化 した IgGセ フ ァ ロ ースカ ラムにアプライ し、 同緩衝液で十分カ ラムを洗浄後、 0.5M酢酸ア ンモニ ゥム緩衝液（pH 3.4)で溶出 した。 溶出画分 を 80%飽和硫安で沈澱させ、 少量の緩衝液 Aで溶解後、 0.2M NaClを含む 0.1M燐酸緩衝液、 pH 7.0で平衡化された TSKgel G3000SW力ラムによ る高速分子篩ク ロマ ト グラ フィ にかけた。 このよ う に して得られた画分は SDS-ポリ アク リルア ミ ドゲル 電気泳動で単一バン ドを示した。 下記の表 1 に各連結蛋白質 における ABド メ イ ンの連結数と その分子量についてま と めた。

ABドメ イ ン 1個は 116ア ミ ノ酸からな り 、 その分子量は

13205.24である。 各連結蛋白質の N末端には Metし y s Vai A spの 4 ア ミ ノ酸がつ 、てお り 、 C末端 Iこ ThrGlyArgArgPheThrThr Serの 8 ア ミ ノ酸がついている。 また各 ABドメ イ ンは ValAsp の 2 ア ミ ノ酸で連結されている。

表 1

各マーカ一蛋白質における ABドメインの連結数とその分子量 マーカ一蛋白質 ABドメインの数 分 子 量

PR0T-ABI 14,586

PR0T-ABII 2 27,987

PR0T-ABIII 3 41,389

PR0T-ABIV 4 54,790

PR0T-ABV 5 68,192

PR0T-ABVI 6 81,593 マ一カー蛋白質の構造 NH2-MKVD-(ABドメイン） n-TGRRFTTS-COOH

n=ABドメインの連結数

実施例 2

(1) 固定化担体の作製

担体 （臭化シアン活性化セ フ ァ ロース 4Β : フ アルマシア社 製） 0.3 g をカラム中にて ImM HC1で 15分間膨潤 しゲル化させ た。 次いで lmM HC1を用いてこれを洗浄した（乾燥ゲル lgあた り 200ml) 。 更に、 カ ッ プリ ングノ、'ッ フ ァ ー 〔0.1M NaHC0₃ (P H8.3)-0.5M NaCl〕 で、 これを洗浄した（乾燥ゲル 1 gあた り 5 ml)。 一方、 カ ッ プリ ングバッ フ ァ 一に リ ガン ド蛋白質 （実 施例 1 で作製した連結蛋白質 ： ABドメイ ンの く り返し 1 〜 6

(すなわち、 PR0T ΑΒχ-β ) ； なお対照と して、 天然型プロテ イ ン Α (市販品） を溶解しておき、 これを上記ゲルに、 ゲル 1 ml: ノ ッ フ ァ ー 2 mlの割合で懸濁 し、 これを 4。Cで一昼夜 振と う混合した。 次いでブロ ッ キング試薬 〔0·2Μグリ シン

(ρΗδ.Ο) を加え、 室温に 2時間保持した後， カ ラムを、 力 ッ プリ ングバッ フ ァ ー、 0.1M 酢酸バッ フ ァ 一 （ρΗ4) -0.5Η NaCl、 次いでカ ップリ ングバッ フ ァ 一の傾序で洗浄 して、 各 種連結蛋白質を固定化した担体を充填したカ ラム をそれぞれ 作製した。 なお、 いずれのプロテイ ン Aも担体への結合率は 良く 、 例えば PR0T-AB₄の担体への結合率は約 95%であつ た。

(2) IgGの分離精製

ゥサギの血清 2mlにバッ フ ァー A C0.1H a-Pi(_PH 7.0)〕 mlを加えて希釈した後、 濾過、 滅菌処理し、 これを前項で 調製 した各カラムにそれぞれ添加した。 次いでバッ フ ァ ー A を各カ ラ ム に 10mlずつ流 した後、 溶離液と してバ ッ フ ァ ー B C0.3M KC1-HC1 (pH2.3)) を流 して溶離処理を行い、 1 mlず つ分画操作 してそれぞれ 280nmにおける吸光度（ A₂₈。） 及び ELISA法によ る 492nmにおける吸光度（ A ₄₃₂ ) で蛋白質及ぴ IgG量を測定した。 その結果よ リ カ ラム 1 mlに吸着 して溶離 してきた IgG量を求め結合容量と した。 なお、 PROT-AB IV の ァ フィ 二ティ ク ロマ ト グラ フィ の結果を図 4 に示 したが、 こ れからも明 らかなよ う に、 フ ラ ク ショ ンナンバー 20前後にお いて、 精製 IgGが溶離されている こ と がわかる。

各連結蛋白質及び市販の天然型プロテイ ン Aについて、 Ig G の結合容量の測定結果を図 5 に示す。 この結果から明 ら 力、 なよ う に、 連結蛋白賓は IgG結合 ドメ イ ンの連結数の増加に 伴っ て IgG結合容量が増 し、 例えば PROT-AB IV は対照の約 35 %も結合容量が高く 、 精製純度が非常に高 く なる こ と が実証 された。 また、 PROT-AB IV—セ フ ァ ロースカ ラムによっ て精 製されたゥサギ IgGを 4 gの割合で SDS-PAGEにァプライ し、 得られたパタ ーン を図 6 に示 した。 図中 1 は分子量マーカ一、 2 はゥサギの抗ヒ ト CRP血清 ( 8 μ g) . 3 は精製 IgG ( 4 _g) を示すが、 図 6 から明 らかなよ う に 目的とする IgGが集中 し て分離されたこ と、 つま り きわめて髙度に精製されたこ と が、 これによつてもはっ き リ と実証された。

実施例 3

実施例 1 と同様に して、 プロテイ ン Aの D ドメ イ ン を用い て各種の連結蛋白質を調製 した。 その結果を下記の表 2 に示 す。 表 2 は、 D ド メ イ ン を単位と した場合の連結数と各連結 蛋白質の分子量についてま とめたものである。

表 2

Dドメインを単位とした場合の各マーカー蛋白質の分子量 マ一力一蛋白質 Dドメインの数 分 子 量

PROT-Dx 1 8 , 220 P腹- D_z 2 15, 256

PR0T-D₄ 4 29, 327 PR0T-D_s 5 36, 362 マーカ一蛋白質の構造：

NH_Z-MKVD-(Dドメイン） n-TGRRFTTS-C00H

n= Dドメインの連結数

これ らの各連結蛋白質も、 ABドメインに係る実施例 2 の場 合と同様に、 すぐれた IgG精製能を有していた。 上記結果から明らかなよ う に、 本発明によれば各種分子量 を有する連結蛋白質を 目的に応じて自由に調製する こ とがで きる。 またプロテイ ン Aの IgG結合 ド メ イ ン には上記 した A 、

B 、 Dのほか、 E 、 Cがあるので （これのア ミ ノ酸配列は図 1 に示した） 、 上記したと同様の手法によって、 E 、 Cの ド メイ ンについても、 目的とする連結蛋白質を同種又は異種の ドメイ ンの間で自由に調製する こ とができ、 を髙度に精 製する こ とができる。 実施例 4 /3

実施例 1 で調製 した 6種類のマ一カー蛋白質を SDS-ポ リ ァ ク リルア ミ ドゲル電気泳動にかけ、 そのゲルを CBBRで染色 し たと こ ろ、 図 7 の結果を得た。 図中、 レ ー ン Mは BRL社の分 子量マ一カー、 レーン 1 〜 6 は本発明に係る1^0 81〜 1、 レ ー ン 7 は レー ン 1 〜 6 の混合物である が、 レ ー ン 1 〜 7 は 目的とする所定の分子量を有 している こ と が明瞭に認め られ る。

実施例 5

同様に して上記のよ う に各マーカ一蛋白質を SDS-ポリ アク リルア ミ ドゲル電気泳動にかけた後、 PVDF膜にエ レ ク 卜 ロ ブ ロ ッ ト し、 一次抗体と して ゥサギの血清を、 二次抗体と して 西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ（HRP) 結合ャギ抗ゥサギ抗体を 結合させ、 発色剤 4 一 ク ロ ロ ー 1 一ナフ トールで発色させ、 図 8 の結果を得た。 各レ ーンは図 7 と同 じものを指すが、 図 8 からも明 らかなよ う に、 本発明に係る分子量マーカ一蛋白 質 （ レーン 1 〜 6 ) は分子量マーカ一と して充分に機能する こ と が実証された。 なお、 レ ーン 7、 8 、 9 、 10は レ ー ン 1 〜 6 の混合物であ り 、 レ ーン 9 、 10はア ミ ドブラ ッ クで染色 したものである。

実施例 6

実施例 3で得た D ドメ イ ン を単位と した場合の各マーカ一 蛋白質を分子量マーカーとする。

本発明によれば各種分子量を有するマーカ—蛋白質を 目 的 に応じて自 由に調製する こ と ができ る。 またプロテイ ン Aの IgG結合 ドメ イ ンには上記 した A、 B、 Dのほか、 E、 Cが 屮

あるので、 （これのア ミ ノ酸配列は図 1 に示した） 、 上記 し たと同様の手法によっ て、 E、 Cの ドメイ ンについても、 目 的とするマーカー蛋白質を同種又は異種の ドメ イ ンの間で自 由に調製する こ と ができる。

発明の効果

本発明は、 遺伝子工学の手法を利用する こ と によっ て I gG 精製能にすぐれた免疫グロブリ ン結合性人工蛋白を製造する ものであっ て、 各ドメイ ンを選択、 結合する こ と によっ て 目 的とする正確な分子量を有する連結蛋白質を 自由に工業的に 製造する こ と ができ、 これらは、 いずれも、 天然型のプロテ イ ン Aに比して卓越した Ig G分離精製能を示すものである。

したがって本発明によれば、 バイオテク ノ ロ ジ一の各分野 において重要な役割を果している IgGを効率よ く分離精製す る こ と ができ、 精製された髙純度の IgGを効率的に製造する こ と ができる。 また、 本発明によれば、 試料から IgGのみを 選択的に分離除去する こ と ができる し、 更にまた本発明は、 試料中の IgGの正確且つ簡便なバイオア ツセィ にも利用する こ と ができる。

また、 本発明は、 遺伝子工学の手法を利用する こ と によつ てマーカー蛋白質を製造するものであって、 各 ドメイ ンを選 択、 結合する こ と によっ て 目的とする正確な分子量を有する マーカー蛋白質を 自由に製造する こ とができ る。

したがって、 本発明によって得られたウェスタ ンブロ ッテ イ ング用分子量マーカーは、 イ ミ ュ ノブロ ッテイ ング法のみ か Aず S DS -ポリ アク リノレア ミ ドゲル電気泳動法における一 般的な分子量マ一力一と しても広く 使用でき る

規則第 1 3绿則の 2の寄託された微生物への言及 Escherichia coli JM109/pTRP-PR0T-AB 4

ィ 当該微生物を寄託した寄託機関の名称及びあて名 名称 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名 〒305 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 口 ィの寄託機関に寄託した日付

平成 4年 7月 1 5日

ハ ィの寄託機関が寄託について付した受託番号

FERM BP-3930

Claims

請 求 の 範 囲

1 . プロテイ ン Aの IgG結合 ドメ イ ンのいずれか、 も し く は その内のい く つかを単位と して、 それを複数個連結させて なる こ と を特徴とする免疫グロ ブリ ン結合性人工蛋白。

2 . プロテイ ン Aの IgG結合 ドメ イ ンが E 、 D 、 A 、 B及び

/又は Cである こ と を特徴とする請求 1 の免疫グロ ブ リ ン 結合性人工蛋白。

3 . プロテイ ン Aの IgG結合 ドメイ ン ABを単位と し、 この AB ドメ イ ンを 1 〜複数個連結 してなる こ と を特徴とする免疫 グロ ブリ ン結合性人工蛋白。

4 . ABドメ イ ンの連結数が 4個である こ と を特徴とする請求 . 3 の免疫グロ ブリ ン結合性人工蛋白。

5 . 請求 1 〜 4 の免疫グロ ブリ ン結合性人工蛋白からなる IgG精製用免疫グロ ブ リ ン結合性人工蛋白。

6 . 請求 1 〜 4 の免疫グロ ブリ ン結合性人工蛋白からなる分 子量マ一カー。