WO1992021764A1 - Procede pour produire de l'astaxanthine par fermentation - Google Patents

Procede pour produire de l'astaxanthine par fermentation Download PDF

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WO1992021764A1
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astaxanthin
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strain
medium
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Tetsuro Kuga
Makoto Inoue
Toshiaki Imura
Yoshihide Aoyama
Yoshiyuki Kuratsu
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing astaxanthin by a fermentation method.
  • Asbestos xanthine is a type of natural carotenide and is useful as a color improver for cultured fish.
  • a method for producing astaxanthin using a microorganism belonging to the genus Phafa includes, for example, a method using a microorganism belonging to the genus Phafa and having susceptibility to antimycin A [Applied and Environment].
  • ronmen tal Mi crob iol ogy, 55, 116 (1989)] a method using microbes belonging to the genus Phafi, and having ionicon resistance [Journal,, 2944 (1990)].
  • a method using Rhodochyma ATCC24202 Japanese Patent Publication No.
  • 63-61907 is a method in which a microorganism belonging to the genus Fafa is treated with ethyl methansulfonate, UV irradiation or N-methyl-N'-nitro-N-2-nitrosogosa.
  • Method using mutant strain treated with gin Japanese Patent Application Laid-open No.
  • Hei 2-504101 (W088 / 08025) Method using a microorganism belonging to the genus Phaffa and having resistance to geraniol] Gazette (EP 427405)], belonging to the genus Quality (antimycin, tunicamycin, varnish), cytochrome B inhibitor (antimycin, 2-n-heptyl-4-hydroxy-quinolin-N-oxide) or terdinoid synthesis pathway
  • a method using a microorganism having resistance to an inhibitor has been known (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-501053 (W090 / 01552)).
  • a microorganism which belongs to the genus Paffa, is resistant to at least one of citronellol, primaquine and hydroxydiphenyl, and has an ability to produce astaxanthin is cultured in a medium. By collecting astaxanthin from It can be manufactured economically and efficiently.
  • the present invention relates to a culture, cell or treated cell of a microorganism belonging to the genus Phaffa, which is resistant to at least one of citronellol, primaquine and hydroxydiphenyl, and has the ability to produce stastaxanthin. provide.
  • Examples of the treated bacterial cells in the present invention include mechanically milled bacterial cells, ultrasonically treated substances, solvent-treated substances, enzyme-treated substances, surfactant-treated substances, and dried substances.
  • resistance to citronellol, primaquine or hydroxydiphenyl means that it can grow on citronellol 220 i / m primaquine 3.9 g / l or hydroxydiphenyl.
  • Microorganisms used in the present invention belong to the genus Puffa, and include at least citronellol, primaquine, and hydroxyphenyl.
  • any type that is resistant to the species and has the ability to produce astaxanthin is used.
  • These strains can be used to mutate asphaxanthin-producing bacteria of the genus Phaffa by conventional mutagenesis methods (eg, irradiation with ultraviolet light, treatment with a mutagenic agent (N-methyl-N'-two-row N-nitrosogazine), etc.). After allowing the cells to grow, they can be obtained as bacteria growing on a medium containing citronellol, primaquine or hydroxydifunil. Examples of such microorganisms include Phaf fia
  • rhodozyma such as, for example, Huffy's mouth H-8264 (hereinafter referred to as strain H-8264), H-8434 (hereinafter referred to as strain H-8434), and H-8435 (hereinafter referred to as H -8435).
  • the mutant strains (H-8264, H-8434 and H-8435 strains) and the parent strain (ATCC24202 strain) were spread on a minimal medium agar plate containing the additives shown in Tables 1 to 3 at 22 ° C. Cultured. The results are shown in Tables 1-3.
  • the above three strains are based on the Butavest Treaty, the H-8264 strain is dated May 18, 1991, and the H-8434 and H-8435 strains are dated March 13, 1992. They have been deposited internationally with the Research Institute of Microbial Industry and Technology, and have been assigned FERM BP-3404, 3800 and 3801, respectively.
  • the medium used in the present invention may be a synthetic medium or a natural medium as long as the medium contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, a growth factor, and the like.
  • a carbon source glucose, fructose, sucrose, molasses, and the like are used.
  • nitrogen source ammonia, ammonium sulfate, peptone, yeast extract, corn stuplica and the like are used.
  • the inorganic salt there are used mono-potassium phosphate, di-calcium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like.
  • growth factors vitamins, amino acids, nucleic acid-related substances and the like are used.
  • the culture is performed by batch culture, continuous culture, etc., at a temperature of 15 to 35 ° C., preferably 20 to 25, at a pH of 3 to 8, preferably 4 to 6, and usually completed in 2 to 7 days.
  • the pH of the medium is adjusted with calcium carbonate, inorganic or organic acids, alkaline solutions, ammonia, pH buffers (eg, lithium hydrogen phthalate), and the like.
  • the cells are separated and This is dried and pulverized to obtain dried cells, or the cells are separated from the culture solution, crushed, and then astaxanthin is solvent-extracted from the crushed cells and processed by silica gel chromatography. .
  • the staxanthin obtained by the present invention, the culture of the microorganism, the cells, the treated cells, and the like are used for fish and crustaceans.
  • the H-8264 strain, the H-8434 strain, and the H-8435 strain were each inoculated into 8 ml of a seed medium having the following composition in a test tube, and then cultured at 22 ° C for 3 days.
  • Seed medium composition glucose lOg / l, yeast extract 3g // l, butane 5g / 1, meat extract 3gZl (adjusted at pH 5.0, K0H, pressurized steam sterilization at 120 ° C for 20 minutes)
  • 3 ml of the obtained three seed cultures were inoculated into 30 ml of a production medium having the following composition in a 250 ml Erlenmeyer flask and cultured at 22 ° C for 4 days.
  • Production medium composition glucose 30 g / 1, sulfate Anmoniumu 2 GZL, yeast extract 2g / l, KH 2 P0 4 lg / and, gS0 4 - 7H 2 0 0.5 g / l, CaC • 2H 2 0 0.1 g / 1, Hydrogen phthalate power room 20.4g Zl (adjusted at pH5.0, K0H, steam sterilization at 120 ° C for 20 minutes)
  • the amounts of xanthine produced in cultures of the strains H-8264, H-8434, and H-8435 were 5.8 mg / l, 5.5 ⁇ ⁇ , and TragZl, respectively.
  • the H-8264 strain was inoculated into 300 ml of the seed medium described in Example 1 in a 2-liter Erlenmeyer flask, and then cultured at 22 ° C for 3 days. From the production medium described in Example 1 in a 5-liter After inoculating 3 liters of medium excluding the hydrogen-powered rim, the cells were cultured at 22 ° C for 48 hours (rotational speed 600 rpm, aeration 3 liters Zmin). The pH during the culture was adjusted to 5 with ammonia water. As a result, the amount of astaxanthin produced in the culture solution was 17. lmgZl.
  • the H-8434 strain was inoculated into 300 ml of the seed medium described in Example 1 in a 2-liter Erlenmeyer flask and cultured at 22 ° C for 3 days. 80 ml of the resulting seed culture was inoculated into 720 ml of a culture medium obtained by removing hydrogen phthalate from the production medium described in Example 1 in a 2-liter culture tank, and cultured at 22 ° C for 48 hours (rotation). At several 900 rpm, the air flow rate was 0.8 liter / min). The pH during the culture was adjusted to 5 with aqueous ammonia. As a result, the amount of astaxanthin produced in the culture solution was 16.3 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • the cells were separated from this culture solution, the cells were dried with a spray dryer to obtain 37 g of dried cells containing 14 mg of astaxanthin.

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Description

明 細 書
発酵法によるァスタキサンチンの製造法
技 術 分 野
本発明は発酵法によるァスタキサンチンの製造法に関する。 ァス夕 キサンチンは天然カロチノ ィ ドの一種であり、 養殖魚類の色調改善剤 として有用である。
従来 の 技術
従来、 フ ァ フィ ァ属微生物を用いるァスタキサンチンの製法と して は、 例えば、 フ ァ フィ ァ属に属し、 ア ンチマイ シン A感受性を有する 微生物を用レヽる方法 [ App l i ed and Env i ronmen ta l Mi crob i o l ogy, 55, 116(1989) 〕 、 フ ァ フィ ァ属に属し、 —ィオノ ン耐性を有する微生 物を用いる方法 〔同誌， ， 2944 (1990) ) 、 フ ァ フ ィ ァ ' ロ ドチーマ ATCC24202 を用いる方法 （特公昭 63- 61907号公報） 、 フ ァ フ ィ ァ属微 生物をェチルメタ ンスルホネー ト、 UV照射または N—メチル— N ' — ニ トロ一 N—二 トロ ソグァ二ジンで変異処理した変異株を用いる方法 〔特表平 2-504101号公報（W0 88/08025) フ ァ フィ ァ属に属し、 ゲラニ オールに耐性を有する微生物を用いる方法 〔特開平 3-206880号公報 (EP 427405) 〕 、 フ ァ フ ィ ァ属に属し、 抗生物質 （ア ンチマイ シン、 ッニカマイシン、 ニス夕チン） 、 チ ト クローム B阻害剤 （ア ンチマイ シン、 2— n —へプチルー 4 —ヒ ドロキシ一キノ リ ンー N—ォキシ ド） またはテルぺノィ ド合成経路阻害剤 （メノ 口 ン酸ラ ク ト ン） 耐性を有 する微生物を用いる方法 〔特表平 4-501053号公報（W0 90/01552) 〕 等 が知られている。
発 明 の 開 示
本発明によると、 フ ァ フィ ァ属に属し、 シ トロネロール、 プリマキ ンおよびヒ ドロキシディ フヱニールの少な く とも一種に耐性を有し、 かつァスタキサンチン生産能を有する微生物を培地に培養し、 培養物 からァスタキサンチンを採取するこ とにより、 ァスタキサンチンをェ 業的に安価に効率よく製造することができる。
また、 本発明はファフィァ属に属し、 シトロネロール、 プリマキン およびヒ ドロキシディ フヱニールの少なく とも一種に耐性を有し、 力、 っァスタキサンチン生産能を有する微生物の培養物、 菌体または菌体 処理物を提供する。
本発明における菌体処理物としては、 菌体の機械的摩碎処理物、 超 音波処理物、 溶媒処理物、 酵素処理物、 界面活性剤処理物、 乾燥処理 物等があげられる。
本明細書において、 シトロネロール、 プリマキンまたはヒ ドロキシ ディ フヱニールに耐性とは、 シトロネロール 220 i /m プリマキン 3. 9 g / l またはヒ ドロキシディ フヱニール に生育できるこ とを意味する。
本発明に用いられる微生物としては、 フ ァフィァ属に属し、 シトロ ネロール、 プリマキンおよびヒ ドロキシディ フヱニールの少なく とも
—種に耐性を有し、 かつァスタキサンチン生産能を有するものであれ ばいずれも用いられる。 それらの菌株はファフィァ属のァスタキサン チン生産菌を通常の変異手段 〔例えば、 紫外線照射、 変異誘導起剤処 理 （N —メチルー N ' —二トロー N —二トロソグァ二ジン等） 等〕 に より変異させた後、 シトロネロール、 プリマキンまたはヒ ドロキシデ ィ フユニールを含有する培地上で生育する菌として得ることができる。 その微生物の例としては、 ファフィァ · 口 ドチ一マ（ Phaf f i a
rhodozyma ) に属する微生物、 例えば、 フ ァフィァ ' 口 ドチ一マ H-8264 (以下、 H-8264株という） 、 同 H-8434 (以下、 H- 8434株という） 、 同 H- 8435 (以下、 H-8435株という） 等があげられる。
以下に前記変異株の具体的取得方法について示す。
親株としてファ フィァ ' 口 ドチーマ ATCC24202(以下、 ATCC24202 株 という） を用い、 該菌株をメタンスルホン酸ェチル 0. 02ml mlで 22で、 0分間処理した後、 親株が生育阻害を示す濃度（220/igZnil) のシトロ ネロールを含む最小培地寒天平板 （グルコース 20 1 、 ディ フコ社 製 yeast Nitrogen Base 7g/l 、 寒天 20 gノ 1)上に塗布した。 22°C で、 7〜10日間培養後、 生育してく る変異株のうち、 250ml容三角フ ラスコでの液体培養試験で親株よりァスタキサンチンの生産能が優れ ている菌株を選んだ。 そのうち特に優れている株として H-8264株を得 た。
また、 シトロネロールの代わりにプリマキン（3.9gZl)およびヒ ド ロキシディ フユニール （33itgZml) を用いる以外は前記の方法と同様 に行って得られた菌株のうち、 特にァスタキサンチンの生産性の優れ た菌株として、 それぞれ H-8434株および H-8435株を得た。
これら変異株の耐性の確認は次の様にして行った。
変異株 （H-8264株、 H-8434株および H-8435株） と親株（ATCC24202株） を第 1〜 3表に示す濃度の添加物を含む最小培地寒天平板に塗布し、 22°Cで培養した。 その結果を第 1 〜 3表に示す。
第 1 表 シ ト ロネロール 囷 株
(ig/ ml) ATCC24202 H-8264 無 添 加 + +
2 0 0 + +
2 2 0 +
プ リ マ キ ン 菌 株
(g/l) ATCC24202 H-8434 無 添 加 + + 3 表 tト 'nキシディフエニール 囷 株
( /ig /ml ) ATCC24202 H - 8435
± +
無 添 加 + +
3 0 土 +
3 3 + 注） 生育する
わずかに生育する
生育しない
前記 3株はブタべス ト条約に基づき、 H- 8264株は平成 3年 5月 1 8日 付で、 H-8434株と H- 8435株は平成 4年 3月 1 3日付で、 それぞれ工業技 術院微生物工業技術研究所に国際寄託され、 それぞれ FERM BP-3404, 3800および 3801の寄託番号が付与されている。
本発明に用いる培地としては、 炭素源、 窒素源、 無機塩、 生育因子 等を程よく含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも よい。
炭素源としては、 グルコース、 フラク トース、 シュクロース、 糖蜜 等が用いられる。 窒素源としては、 アンモニア、 硫酸アンモニゥム、 ペプトン、 酵母エキス、 コーンスティプリカ一等が用いられる。 無機 塩としては、 リ ン酸一カ リウム、 リ ン酸二カ リ ウム、 リ ン酸マグネシ ゥ厶、 硫酸マグネシウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 塩化カルシゥ ム等が用いられる。 生育因子としては、 ビタ ミ ン、 アミ ノ酸、 核酸関 連物質等が用いられる。
培養はバッチ培養、 連続培養等が用いられ、 温度 15〜35 °C好ましく は 20〜25で、 pHは 3〜8 、 好ましく は 4〜6 で行われ、 通常 2〜7 日 間で終了する。 培地の pHは炭酸カルシウム、 無機または有機の酸、 ァ ルカ リ溶液、 アンモニア、 pH緩衝液 （例えば、 フタル酸水素力 リ ウム） などによつて調整される。
培養終了後、 培養液から菌体 （ァスタキサンチン含有） またはァス タキサンチンを得るには、 例えば、 培養終了後、 菌体を分離して、 そ れを乾燥粉砕し乾燥菌体を得るか、 培養液から菌体を分離し、 破砕し た後、 該破砕菌体からァスタキサンチンを溶媒抽出し、 シリカゲルク 口マ トグラフィ一で処理して得る。
本発明によって得られた了スタキサンチン、 前記微生物の培養物、 菌体、 菌体処理物等は魚類、 甲殻類の餌料に用いられる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を示す。
実施例 1
H- 8264株、 H- 8434株および H-8435株をそれぞれ試験管中の下記組成 からなる種培地 8 mlに植菌した後、 22°Cで 3 日間培養した。
種培地組成 ： グルコース lOg/l 、 酵母エキス 3g//l 、 ぺブト ン 5 g/1 、 肉エキス 3gZl (pH 5.0 、 K0H で調整、 120°Cで 20分 間加圧蒸気殺菌）
得られた 3つの種培養液 3 mlをそれぞれ 250ml容三角フラスコ中の 下記組成からなる生産培地 30mlに植菌し、 22°Cで 4 日間培養した。
生産培地組成 ： グルコース 30 g/1 、 硫酸ァンモニゥム 2 gZl 、 酵母エキス 2g/l 、 KH2P04 lg/し、 gS04 - 7H20 0.5 g/l 、 CaC • 2H20 0.1 g /1 、 フタル酸水素力 リ ゥム 20.4g Zl (pH5.0、 K0H で 調整、 120°Cで 20分間加圧蒸気殺菌）
その結果、 H- 8264株、 H- 8434株および H- 8435株の培養液中のァス夕 キサンチン生成量はそれぞれ 5.8mg/l 、 5.5π^ および TragZl であった。
—方、 対照として、 親株 ATCC24202 株を用い、 前記と同様に培養し た結果、 培養液中のァスタキサンチン生成量は S ingZl であった。 実施例 2
H - 8264株を 2 リ ッ トル容三角フラスコの実施例 1 に示した種培地 300 mlに植菌した後、 22°Cで 3 日間培養した。 得られた種培養液 300 mlを 5 リ ッ トル容培養槽中の実施例 1 に示した生産培地からフタル酸 水素力 リゥムを除いた培地 3 リ ッ トルに植菌した後、 22°Cで 48時間培 養 （回転数 600rpm、 通気量 3 リ ッ トル Zmin)した。 培養中の pHは、 ァ ンモニァ水で 5に調整した。 その結果、 培養液中のァスタキサンチン 生成量は 17. lmgZ l であった。
この培養液から菌体を分離した後、 ホモゲナイザーにて菌体を破砕 した。 該破碎菌体からァスタキサンチンをァセ トンにて抽出し、 減圧 濃縮後、 シリカゲルクロマ トグラフィー （溶出液 ； アセ トン ： 石油ェ 一テル （： 1 ： 19v/v 〕 →ァセ トン ： 石油エーテル 〔 1 ： 4 v/v 〕 の濃 度勾配） によりァスタキサンチン 32mgを得た。
実施例 3
H-8434株を 2 リ ッ トル容三角フラスコ中の実施例 1 に示した種培地 300 mlに植菌し、 22°Cで 3 日間培養した。 得られた種培養液 80mlを 2 リ ッ トル容培養槽中の実施例 1 に示した生産培地からフタル酸水素力 リウムを除いた培地 720mlに植菌し、 22°Cで 48時間培養（ 回転数 900 rpm 、 通気量 0. 8 リ ッ トル/ min)した。 培養中の pHは、 アンモニア水 で 5に調整した。 その結果、 培養液中のァスタキサンチン生成量は 16. 3π¾ であった。
この培養液から菌体を分離した後、 スプレー式乾燥機で乾燥するこ とにより、 14mgのァスタキサンチンを含む 37 gの乾燥菌体を得た。

Claims

請 求 の 範 囲
(1) フ ァ フィァ属に属し、 シ トロネロール、 プリマキンおよびヒ ドロ キシディ フヱニールの少なく とも一種に'耐性を有し、 かつァス夕キサ ンチン生産能を有する微生物を培地に培養し、 培養物中にァスタキサ ンチンを生成蓄積させ、 該培養物よりァスタキサンチンを採取するこ とを特徵とする発酵法によるァスタキサン'チンの製造法。
(2) ファフィァ属に属し、 シトロネロール、 プリマキンおよびヒ ドロ キシディ フエニールの少なく とも一種に耐性を有し、 かつアスクキサ ンチ ン生産能を有する微生物の培養物、 菌体または菌体処理物。
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