WO1992000733A1

WO1992000733A1 - Collagen metabolism ameliorant and its use

Info

Publication number: WO1992000733A1
Application number: PCT/JP1991/000937
Authority: WO
Inventors: Masanori Nakata; Shintaro Inoue; Mikio Sotomura; Junsei Taira; Itaru Miyamoto
Original assignee: Kanebo, Ltd.
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-12
Publication date: 1992-01-23
Also published as: EP0506965B1; EP0506965A1; DE69110861T2; EP0506965A4; DE69110861D1

Description

明細書コラーゲン代謝改善剤及びその用途技術分野

本発明は、 N —メチルー Lーセリンを有効成分とするコラーゲン代謝改善剤に関し、さらに詳しくは、肝および肺線維症、ケロイド、肥厚性瘢痕、鞏皮症、頭皮の線維化等のコラーゲンの異常蓄積を伴う疾病、および老化に伴うコラーゲンの新陳代謝の低下に対するコラーゲン代謝改善剤に関する。

またさらに、このコラーゲン代謝改善剤よりなる育毛剤、皮膚老化防止剤に関する。

ここでいうコラーゲン代謝改善とは、コラーゲンの合成と分解のバランスが失われコラーゲンの合成が異常に進んだ状態を正常化すること、またはコラーゲンの新陳代謝の低下した状態を賦活化することをいう。また、コラーゲンの新陳代謝とはコラーゲンが合成と分解を受けながら一定の速さで入れ替わっている現象すなわち、代謝回転をいう。

背景技術

従来、コラーゲンの異常蓄積に伴う疾病（肝および肺線維症、ケロイド、肥厚性瘢痕、鞏皮症、頭皮の線維化等）では、コラ一ゲンの合成と分解のバランスが失われていることが示唆されている。（最新医学、 42巻、 ]0号、 2075〜2139頁、 1987年参照）例えば、肝硬変症に伴う肝線維化は、コラーゲン生合成増加 (Science 、 176 卷、 795 頁、 1972年参照）やコラーゲン分解能の低下（Biochemical Journal 、 118 巻、 229 頁、 1970年および Life Sciences, 30巻、 1379頁、 1982年参照）により生ずる。

また、男性型脱毛症の頭皮ではコラーゲンの合成と分解のバランスが失われ、コラーゲンの異常蓄積が生じ、頭皮の線維化が進行していることが知られている（Hair Research, 244 頁， 1981年： Ed. by Orfanos, Montagna, Stuttgen, Spr inger-Verlag Berlin Heidelberg 参照）。その結果、頭皮の緊張化、血流の低下、毛母細胞の活性低下等が生じて脱毛症を発生させることが考えられる。

コラーゲン分解能の低下は、各組織や皮膚線維芽細胞のコラゲナーゼ活性の低下によると考えられており（皮膚、 14巻、 217 頁、 1972年.、 Journl of Clinical Investigations 56巻、 1175 頁、 1975年および Life Sciences. 30巻、 23頁、 1982年参照）、コラゲナーゼ活性の増強が望まれている。このことは、例えば肝硬変症の治療において指摘されている（医学のあゆみ、 136 巻、 13号、 1027頁、 1986年参照）。一方、上記のような疾病のみならず、老化に伴い皮膚コラーゲンの新陳代謝が低下し、コラ一ゲンが体内に長く留まることにより化学修飾を受け、コラーゲンの架橋が進み、細胞の足場としての機能が損なわれ、その結果さらに新陳代謝の低下が起こるという悪循環が生じることが知られており、皮膚の老化を防ぐためにはコラ一ゲンの新陳代謝の低下を防ぎ、コラーゲンの架橋を少なくすればよいといわれている（現代化学、 12月号、 36頁、 1990年参照）。

このようなコラーゲンの新陳代謝の低下の悪循環を防止するためには、コラーゲンを体内に長く留まらせないことが必要である。そのためにコラゲナーゼ活性の増強が望まれている。

コラゲナーゼは、結合組織中の間質型コラーゲン（ I型、 II 型、および ΠΙ型コラーゲン）を分解する際の律速酵素であり、コラーゲンの代謝に重要な役割を果たしている。

コラゲナーゼは、前駆体であるプロコラゲナ一ゼとして細胞より分泌され、生体内でプラスミンやスト口ムライシン等の夕ンパク分解酵素によって限定分解を受け、コラゲナーゼになる

(Biochemical Journal 、 166 卷、 21頁、 1977年および

Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S.A.、 86巻、 2632頁、 1989年参照）と考えられている。

以上のことから、コラーゲンの異常蓄積を伴う疾病の治療、または老化に伴ぅコラーゲンの新陳代謝の低下に対するコラ一ゲン代謝改善のためには、プロコラゲナ一ゼの産生を促進する物質、すなわち、コラーゲン代謝改善剤が有効と考えられる。発明の開示

従って本発明の目的とするところは、コラーゲン代謝改善剤すなわち、肝および肺線維症、ケロイド、肥厚性瘢痕、鞏皮症、頭皮の線維化等コラーゲンの異常蓄積を伴う疾病、または老化に伴うコラーゲンの新陳代謝の低下に対するコラーゲン代謝改善剤を提供すること、さらには、有用なる育毛剤、皮膚老化防止剤を提供することにある。

本発明者等は、上述の目的を達成するために鋭意研究した結果、 N —メチルー Lーセリンにプロコラゲナーゼ産生促進作用のあることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は N —メチルー Lーセリンを有効成分とするコラーゲン代謝改善剤及びその用途に関する。

本発明のコラーゲン代謝改善剤は、その使用目的に応じて公知の成分に配合し、通常の方法にて調製することによって、経口投与の剤形や注射、経皮等の非経口の剤形に調製することが可能で、経口または注射、経皮等の非経口でヒ卜に投与される。経口投与の剤形としては、錠剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、硬カプセル剤等の固形製剤のほか、シロップ剤、エリキシル剤、軟カプセル剤等の液剤が含まれる。

注射剤は、 N —メチル— L—セリンを生理食塩水あるいは脂質賦形剤、例えば、植物油、油性ェマルジヨン、グリコール等に溶解または乳化させ無菌的にァンプルあるいはバイャルに封入することによって製造される。

経皮剤には、軟膏剤、ローション剤、パップ剤、ゲル剤、クリーム剤、液剤、スプレー剤、入浴剤および貼付剤等が含まれる

本発明のコラーゲン代謝改善剤は、経口または非経口で投与される。それは、例えば、肝線維症、肺線維症等、臓器にコラ —ゲンが異常蓄積した疾病には経口または注射により、ケロイド、肥厚性瘢痕、頭皮の線維化等上皮にコラーゲンが異常蓄積した疾病には経皮または局所注射により、本発明のコラーゲン代謝改善剤は投与される。

また、老化に伴うコラーゲンの新陳代謝の低下には、経口あるいは経皮により本発明のコラーゲン代謝改善剤は投与される _c 投与量は、投与される人の年齢、体重、症状あるいは投与方法等により異なる力;'、成人に投与する場台、一般には 1回当たり N —メチルー L —セリンとして 0. 1 〜1 000mgの量を 1 日、 1 〜 3回投与する。

例えば、肝線維症、肺線維症等の臓器にコラーゲンが異常蓄積した疾病に対しては、経口投与または注射により 1 回当たり 30〜1000mgの投与量が適当であり、ケロイド、肥厚性瘢痕、頭皮の線維化等の上皮にコラーゲンが異常蓄積した疾病や老化に伴うコラーゲンの新陳代謝の低下した皮膚に対しては、経皮投与により 1回当たり 0. 1 〜50mgの投与量が適当である。

また、本発明のコラーゲン代謝改善剤は育毛剤、皮膚老化防止剤としての用途が可能である。

育毛剤は、公知の物質との配合及び常法によって、脱毛予防剤、養毛剤、さらには、シャンプ一、リンス、ヘアートニック、ヘア一ローション、ヘア一クリーム、ヘア一コンデショナ一、ヘア一ジヱル、ヘアーミスト、ヘアーフォ一ム等の養毛化粧料の剤型にすることが可能である。

この育毛剤における N —メチルー Lーセリンの配合量（総量基準）は 0. 001 〜10. 0重量％ (以下、 wt %と略記する）であり、好ましくは 0. 01〜5. 0 wt %である。

皮膚老化防止化粧料は、公知の物質との配合及び常法によつて、しわ防止剤、軟膏類、さらには、スキンローション、スキンミルク、スキンクリーム、パック類等の皮膚化粧料の剤型にすることが可能である。

この皮膚老化防止化粧料における N —メチルー L - セリンの配合量（総量基準）は 0. 001 〜10. 0重量％ (以下、 wt %と略記する）であり、好ましくは ϋ. (] J〜5. 0 wt %である。

また、本発明のコラーゲン代謝改善剤として、上述のごとく、

N —メチル— Lーセリンを記載している力《、薬理学的に許容される塩類であっても同様に利用することが可能である。

発明を実施するための最良の形態

以下、試験例、実施例及び比較例を記載して本発明を詳細に説明する。

まず、 N —メチル— Lーセリン等の薬理学的な試験例による評価を記載し、次いで、後記の実施例及び比較例に関する評価を記載した。

〔試験例一 1〕プロコラゲナーゼ産生促進作用

1 ) 略号

試験例中に用いる下記の略号は次の意味を有する。

II F培地：ハム F 12粉末培地 (日水製薬社製） 10. 6g を精製水に溶解して調製した培地。

II F— A V培地： H F培地 1 ^当たりに、粉末イーグルアミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製） 1. 76g 、炭酸ナトリゥム 1. 6 g 、硫酸ストレブトマイシン 50mgおよび硫酸カナマイシン 60mg を加えた後、炭酸ガスを吹き込んで pHを約 7 に調整した培地。

卜リス：トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン。

M E S緩衝液： 0. 5M NaC l 、 1 mM CaC l ₂、および 0. 05容量％ Bri j-35 (ポリオキシエチレンラウリルアルコールの商品名）を含む 50mM 2- (N-モルホリノ）エタンスルホン酸モノハイドレ - ト水溶液をトリス水溶液にて 4 °Cで pH6.5 に調整した緩衝液。

酢酸緩衝液： 0.5 NaCl 、 1 mM CaCl ₂および 0.05容量ヌ Bri j 35を含む 25mM酢酸水溶液をトリス水溶液にて 4 °Cで pll4.5 に調整した緩衝液。

ME S一 A緩衝液： ME S緩衝液をトリス水溶液にて 4 °Cで PH7に調整した緩衝液。

ME S一 B緩衝液： ME S緩衝液と、酢酸緩衝液とを混合し、 4 °Cで pH5.2 に調整した緩衝液。

測定用緩衝液： 0.2M NaCl 、 5 mM CaCl₂、 ϋ.05容量％ Bri j- 35を含有する 50mMトリス水溶液を塩酸にて室温で pH7.5 に調整した緩衝液。

2 ) 試験化合物

N—メチル一 Lーセリン（以下、 M S Eと略記する）。

3 ) 使用細胞

ヒト線維肉腫細胞 HT1080(ATCC CCL121) 由来で無血清無蛋白培地において生育可能な足場非依存性細胞（ヒト線維肉腫 HT - P11 と呼ぶ、鐘紡株式会社、生化学研究所保有）を用いて試験した。この細胞を、以下の通り前培養し、細胞懸濁液を調製して試験した。ヒト線維肉腫 11T- Pllを H F— A V培地に密度 1 x l0⁵cells/ml に懸濁し、この懸濁液をフラスコ（底面積それぞれ 75cni² ) に 20mlずつ加え、 95%空気一 5 %炭酸ガスの雰囲気下に 37°Cで 3 日間静置培養した。

3 日間培養の後、遠心分離（600rpm、 10分間）により細胞を集めた。得られた細胞を H F— A V培地に懸濁し、密度 7 X 10⁴ eel Is/mlの細胞懸濁液を調製した。

) 試験方法

上記の細胞懸濁液を 2 mlずつ 6穴プレート（底面積 9.4cm²) に加え、 95%空気一 5 %炭酸ガスの雰囲気下に 37°Cで 1 日培養した。その後、 10mM濃度の試験化合物水溶液を H F - A V培地で 600 M濃度に希釈し、ポア一サイズが 0.2 m のニトロセルロース膜（ァドバンテツク東洋製、 DISMIC- 25 ) で濾過滅菌後、この溶液 0.4 mlずつを培養液に加え、 95%空気一 5 %炭酸ガスの雰囲気下、 13日間培養した。培養終了後、培養液に対し 1/200 容の 10容量％ Bri j- 35水溶液を加え、遠心分離（600rpm、 10分間）により細胞を除去し培養上清液を得た。

次に、培養上清液 0.5 mlに M E S— A緩衝液 0.5 mlを加え、 M E S一 A緩衝液で平衡化した亜鉛キレ一ティングセファロ一ス 6 B™ (フアルマシア製） 0.5 mlを充填したカラムに供した。カラムに ME S— B緩衝液の 1 mlずつを 4回流し、コラゲナ一 1 ϋ ゼ阻害物質をカラムより溶出し除去した。

次に、 M E S— C緩衝液の 1 ralずつを 2回流し、溶出液を集めプロコラゲナ一ゼ溶液 1 mlを得た。

プロコラゲナーゼ溶液に IN NaOH を加え溶液の pHを約 7に調整した後、 M E S— A緩衝液を加え 2. 5 mlとし、次いで測定用緩衝液にてプロコラゲナ一ゼが約 0. 1 〜0. 7 単位/ m〗の溶液を調製し、これを試験液とした。

次に、試験液 50〃 1 にトリプシン溶液（シグマ社製、 Type l 2 を測定用緩衝液にて濃度 1 mg/ml に調製） 20 1 を添加し、 35 °Cにて 5分間インキュベートした後、ダイズトリプシンインヒビター溶液（メルク社製 No. 24020を測定用緩衝液にて濃度 3 mg/ml に調製） 30〃 1 を添加してトリプシンを失活させ、コラゲナーゼ溶液を得た。

フルォレツセンイソチオシァネ一卜（以下、 F I TCと略記する）で標識された I型コラーゲン（濃度 1 mg/ml の F ITC - コラーゲン酢酸溶液、コスモバイオ社製）を基質溶液として用い、永井等の方法（炎症、 4巻、 2号、 123 頁、 1984年参照）に準じて上記コラゲナ一ゼの活性（単位ノ ml ) を測定した。そして、上記の卜リブシン処理によりプロコラゲナーゼから生じるコラゲナ一ゼが、 35°Cにて 1分間当り 1 z g の I型コラーゲン（FITC - コラーゲン）を分解する量をプロコラゲナーゼの 1単位とし、プロコラゲナ一ゼ産生量（単位. Z培養液 ml) を求めた（この値を Xとする）。一方、対照試験として試験化合物水溶液の代わりに精製水を加え、上記と同様の操作により試験化台物を添加しない場合のプロコラゲナーゼ産生量（単位 Z培養液 ml) を求めた（この値を Yとする）。次いで、これらの値から下式によりプロコラゲナーゼ産生促進率（）を算出した。

X— Y

プロコラゲナーゼ産生促進率（％) = X 1 0 0

Y

4 ) 試験結果結果を第 1表に示す < 第 1表 11

H 4

試験化合物プロコラゲナ—ゼ産生量産生促進率

(単位ノ培養液 ml) (%)

無添加（対照） 3.7 ±0.2 M S E 7.9 ±0.7 データは平均値土標準誤差（n = 3 ) を示す。

無添加（対照）に比べ Pく 0.01 にて

有意差あり（Duncan法）

第 1表より明らかなように N—メチル— L—セリンはプロコラゲナーゼ産生を促進させた。

〔試験例 - 2〕肝線維症に対する治療効果

肝線維症モデル動物を作製し試験した。

1 ) 試験化合物

M S E

) 試験方法

肝機能改善硬化の薬効スクリーニング法（小澤光監修、新薬開発のための薬効スクリーニング法、 75頁、丸善、 1984年発行）に準じ、四塩化炭素（以下 CC1₄と略記する）とォリーブ油との等量混合物を 1回につき 2 ml/kg 、週 2回（月曜、木曜）の割合でウィスター系雄性ラット（ 5週齢、体重 11 〜 134g、 1群 5匹）背部皮下に 10週間投与して肝線維症ラットを作製した。濃度 66.6mg/ml の試験化合物の水溶液を 1回当り 3 ml/kg の割合で、 CC1₄投与開始から 4週目より 1 日 1回 7週間（但し日曜日は除く）連続経口投与した。

その後腹部大動脈より全採血し、へパリン処理した試験管に採取した。これを遠心分離して血漿を得、後記の生化学検査を行うまで一 80Cに凍結保存した。

また、全採血後肝臓を摘出し、その重量を測定し、氷冷下にて 2分割した。そして半分を肝臓中ヒドロキシプロリン（以下、 II y pと略記する）の定量用として-- 80°Cに凍結し、残り半分を組織学的検査用として 10%ホルマリン液で固定した。

一方、無処置群として、肝線維症ラッ卜に試験化合物水溶液の代わりに精製水を 3 ml/kg 、同上スケジュールにて投与する群を、正常ラット群として、四塩化炭素および試験化合物水溶液を投与すること無く 10週間飼育した群を設けた。これら各群は、前記と同様に採血および肝臓摘出を行った。

そして、上記の各肝臓および血漿を用いて、肝臓中および血中の H y pを定量した。尚、 H y pはコラーゲン量の指標である (Methods of Biochemical Analysis 、 15巻、 25頁、 1967年参照）。また、肝障害の指標となる、血漿の生化学的検査〔下記（b) 〜（h) 参照〕および肝臓の組織学的検査〔下記（i) 参照〕も行った。

それぞれの検査項目および検査方法は以下の通りである。

( a ) 肝臓中および血中の H y p量

( a- 1) 肝臓中の H y p量：約 lOOmg の肝臓を精密に秤量し、これに生理食塩水 25ϋ 1 を加えたのちにヒスコトロンホモジナイザー（日本医理科器械製作所製）にて激しく攪拌（2800ϋ rpm 、 30秒間）して粉砕した。

得られた懸濁液を遠心分離（ 15000rpm、 10分間）し、上清試料と沈澱試料に分けた。それぞれの試料に 6 N塩酸を加え 2 ml とし、 110 °Cで 24時間加水分解した。加水分解液を遠心濃縮によって塩酸を除去し、濃縮物を 0.01 N塩酸に溶解した。

この溶液を高速液体クロマトグラフィを用いたボストカラムアミノ酸分析 fe (Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A.、 72巻、二号、 619 頁、 1975年参照）にて定量することにより、上清試料と沈殿試料の H y p量をそれぞれ求めた。そして、上清試料と沈殿試料の H y pとを合計し、この値と肝臓重量から単位肝臓重量当りの H y p量（ zmol/g 肝）を求めた。

( a -2) 血中 H y p量：血漿 100 〃 1 に 5 w/v %スルホサリチル酸水溶液 100 1 を氷冷下で添加し、遠心分離（ 10000 rpm 、 3分間）して上清を得、上清中の H y pを前述のァミノ酸分析法にて定量した（ zniol/l)。

(b ) グルタミン酸ピルビン酸トランスァミナーゼ（以下、 G P Tと略記する）量： Karmen法（金井泉、臨床検査法提要、改訂第 29版、 514 頁、金原出版株式会社、 1983年参照）にて測定した（単位 /1) 。

( c ) グルタミン酸ォキザロ酢酸トランスアミナーゼ（以下、 G 0 Tと略記する）量： Karmen法（金井 ¾、臨床検査法提要、改訂第 29版、 514 頁、金原出版株式会社、 1983年参照）にて測定した（単位 /1) 。

( d ) γ—グルタミルトランスぺプチダ一ゼ（以下、ァー G Τ Ρと略記する）量： L— ァ一グルタミノレ一 ρ—ニトロァニリドを基質とする方法（金井泉、臨床検査法提要、改訂第 29版、 532 頁、金原出版株式会社、 1983年参照）にて測定した（単位 /1) 。

( e ) 総ビリルビン量： Malloy- Evelyn 法（金井泉、臨床検査法提要、改訂第 29版、 724 頁、金原出版株式会社、 1983年参照）にて測定した（mg/dl) 。

( f ) アル力リホスファタ一ゼ量： Bessey- Lowry法（金井泉、臨床検査法提要、改訂第 29版、 496 頁、金原出版株式会社、 1983年参照）にて測定した（単位 /1) 。

( ) チモール混濁検査値（以下、 T T Tと略記する）：消化器病学会肝機能研究班の標準操作法（金井泉、臨床検査法提要、改訂第 29版、 711 頁、金原出版株式会社、 1983年参照）にて測定した（U) 。

( h ) 硫酸亜鉛混濁試験値（以下、 Z T Tと略記する）：消化器病学会肝機能研究班の標準操作法（金井泉、臨床検査法提要、改訂第 29版、 710 頁、金原出版株式会社、 1983年参照）にて測定した（U) 。

( i ) 肝臓の組織学的検査：常法にて肝臓を薄切し、へマトキシンェォシン染色の後に、顕微鏡下に観察した。

3 ) 試験結果

肝臓中および血中の H y p量、並びに肝障害の指標となる血漿の生化学的検査値を第 2表に示す。

第 2表四塩化炭素誘発肝線維症ラット検査項目正常ラット群

無処置群 M S E投与群 a一 1 1.72±0.63 10.0±1· 5 6.79±0.82* a - 2 27.6±2.3 30.6±1.1 39.1±3.6 * b 45.2±3.8 948 ±92 537 ±182 ** c 85 ±6.8 2170±184 875 ±324 ** d 1.8 ±0.6 17.6±0.1 14.4±1.7 * e <0.10 0.36±0.02 0.26±0, 05* f 317 土 13 1270土 90 956 ±114 ** s 0.10±0· 03 0.26±0.06 0.18±0.13 h 0.28±0.08 0.78±0.11 0.26±ϋ· 07** データは平均値土標準誤差（ n = 5 ) を示す。

* 無処置群に比べ Pく 0.05にて有意差あり（Duncan法）無処置群に比べ Pく 0.01にて有意差あり（Duncan法）第 2表に示す様に無処置群に比べ、 M S E投与群の肝臓中 H y p量は有意に低く、血中 H y p量は有意に高かった。このことは、本発明のコラーゲン代謝改善剤がプロコラゲナ一ゼ産生を促進し、その結果、線維化した肝臓組織のコラーゲンの分解を促進して血中に H y pが遊離したことを示している。

また、 M S E投与群の血漿の生化学的検査値は、無処置群に比べ、 G P T、 G O T, y— G T P、総ビリルビン、アルカリホスファターゼおよび Z T Tで有意に低い。このことより、本発明のコラーゲン代謝改善剤が肝線維症に伴う肝障害を改善したといえる。

一方、肝臓の組織学的検査において、 M S E投与群では、無処置群に比べて肝障害に基づく、びまん性肝細胞空胞形成、細胆管増生および総胆管上皮細胞造成をそれぞれ軽減していることが観察された。このことも本発明のコラーゲン代謝改善剤が肝線維症に伴う肝障害に有効であることを示している。

〔試験例 - 3〕皮膚粘弾性試験

1 ) 試験化合物

局方記載の吸水軟膏に、後記実施例または比較例の配合物質を記載含有量（重量％、以下 wt %と略記する）になるよう配台し、試験クリームを作製した。（尚、無配合のものをコントロ —ルとして用いた。）

2 ) 試験方法

ゥィスタ一系雄性ヘアレスラット（ 6週齢、体重 1 10g〜： 130 g 、 1群 5匹）の背部を毛刈りし、右肩の 2 x 2 cmの部位に連日試験化合物を 0. lg塗布した。試験開始後 45日目に、特開昭 59- 120130 号公報記載の振動式の皮膚粘弾性測定器を用いて皮膚粘弾性値を測定した。

試験化合物配合クリーム塗布群の粘弾性の平均値を（S ) 、試験化合物無配合クリーム塗布群の皮膚粘弾性の平均値（ C ) を求め、（S ) / ( C ) を算出して皮膚粘弾性を評価した。

尚、同測定器により表示される皮膚粘弾性値（任意単位）は、皮膚が柔らかいほど高い値を示す。

3 ) 試験結果 '

結果を第 3表〜第 6表に示す。

表より明らかなように実施例の試料はいずれも高い粘弾性を示した。

〔試験例一 4〕ヒト頭毛の成長促進効果試験

1 ) 試験化合物

後記実施例または比較例の試料を用いた。 2 ) 試験方法

男性型脱毛症患者である被験者 10名の耳の上 5 cmの位置の頭毛を、左右 2 ケ所に直径 1 cmの円形状に剃毛した被験部位に、試験化合物を左側に毎日朝夕 2回約 3 ml塗布し、無処置の右側と比較した。効果判定は試験開始 28日目に、左右の被験部位の頭毛各々 20本ずつを剃毛し、左側（実施例または比較例を塗布）の長さの平均値（B ) および右側（無処置）のそれの平均値 ( A ) を求め、被験者 10名の（B ) / ( Λ ) の平均値で示した。 3 ) 試験結果

結果を第 3表〜第 4表に示す。

表より明らかなように実施例の試料はいずれも成長促進効果を示した。

〔試験例一 5〕皮膚血流量試験

1 ) 試験化合物

後記実施例または比較例の試料を用いた。

2 ) 試験方法

ニュージーランドホワイト系雌家兎 3羽の腹部を刈毛し、 18 時間絶食後、ペン卜バルビタールナトリゥム塩を 35mg/kg の割台で静脈注射し麻酔処理する。家兎の背部を固定し、腹部 3 X 2 cm² の部分 2 ケ所にそれぞれ試験化合物および無配合試料を 0. lg均一に塗布し、その上にプレートタイプトランスジユーザ —をセ口ファンテープでとめ、交叉熱電対式皮膚血流計（シンエイ社製シンコーダ一、 201 型）を甩いて試料塗布後、 0.1 1.0 2.0 時間目の血流量を（/ V ) を測定した。

試験化合物を塗布した場合の血流量を（A) 、無配合試料の場合の血流量を（B) とし、（A) / (B) を算出する。 1羽について各時間毎の値を平均し、さらに 3羽の平均を求め、皮膚血流量増加率とした。

3 ) 試験結果

結果を第 5表〜第 6表に示す。

表より明らかなように実施例の試料は血流量促進効果を示し o

第 3表試料配合物質含有量皮膚粘弾性ヒト頭毛

(wt%) 改善効果成長促進実施例 1 M S E 0.1 1.11 1.18 実施例 2 M S E 0.5 1.30 1.25 実施例 3 M S E 4.0 1.42 1.3 比較例 1 トウガラシチンキ 0.1 0.95 1.01 比較例 2 センブリエキス 5.0 1.02 1.02 比較例 3 ニコチン酸ェチル 0.1 1.01 1.00 第 4表試料配合物質含有量皮膚粘弾性ヒト頭毛

( wt % ) 改善効果成長促進実施例 4 M S E 0. 2 1. 15 1. 15 実施例 5 M S E 3. 0 1. 36 1. 38 比較例 4 トウガラシチンキ 0. 1 1. 00 1. 01 比較例 5 ピオチン 0. 1 1. 02 1. 00 比較例 6 ノ、。ンテノール 2. 0 0. 98 1. 02 5表試料配合物質含有量皮膚粘弾性血流量

(wt % ) 改善効果促進効果実施例 6 M S E 0. 1 1. 12 1. 20 実施例 7 M S E 1. 0 1. 32 1. 23 実施例 8 M S E 4. 0 1. 43 1. 50 比較例 7 ァーオリザノール 5. 0 1. 01 1. 05 比較例 8 ニコチン酸ェチル 0. 1 1. 02 1. 01 第 6表試料配合物質含有量皮膚粘弾性血流量

(wt % ) 改善効果促進効果実施例 9 M S E 0. 2 1. 16 1. 27 実施例 10 M S E 4. 0 1. 35 1. 37 比較例 9 ノ、。ンテノール 5. 0 0. 99 1. 03 比較例 10 ピオチン 0. 1 1. 01 1. 05

〔試験例— 6〕皮膚コラーゲンへの作用

ヘアレスラッ卜の加齢に伴う皮膚のコラーゲン硬化モデルに対し試験した。

1 ) 試験化合物

実施例 11 (以下、 M S E軟膏と略記する）および比較例 11の軟膏（以下、コン卜ロール軟膏と略記する）を用いた。

) 試験方法

ウイスタ一系雄性ヘアレスラット（ 6週齢、体重 110g〜； I 30g) 15匹を 5匹ずつ 3群に分け、その内 1群はコントロール軟膏を、他の 1群は M S E軟膏を、背部右肩に 0. lgずつ 1 日 1回 60日問連日塗布した。 60日後に皮膚を採取し、皮下脂肪を除去したものをそれぞれ、 15週齢ラッ卜コントロール軟膏塗布群の皮膚 (加齢した皮膚）、および 15週齢ラット M S E軟膏塗布群とした。

残りの 1群は、試験開始と同時に背部より皮膚を採取し、 6 週齢ラット無処置群の皮膚（若い皮膚）とした。

採取した皮膚約 200mg に生理食塩水 l m l加え、ホモジナイザ一（ニチオン社製）で 28000rpm、 30秒、 2回ホモジナイズした。ホモジナイザーの刃先を生理食塩水 1 m lで洗浄し前者の検体と合わせて更に生理食塩水を加え、皮膚 l OOmg 当たり 2. 4m l の懸濁液とした。

得られた懸濁液を、 4 °C、 24時間、 120rpmで振盪た後、 2000 g 、 10分間遠心して、 4 °Cで可溶化する画分を得た。

残った沈殿にリンゲル液 10m lを加え均一にし、 65°C、 45分間、 120rpmで振盪した後、 2000g 、 10分間遠心して、 65°Cで可溶化する画分を得た。

残った沈殿に精製水 5 mlを加え均一にし、 125 °C、 60分間ォ一トクレーブ後、 3000rpm 、 10分間遠心して、 125 °Cで可溶化する画分を得た。

これらの画分の体積を量り、それぞれの検体 1 m lに 12 N塩酸を l m l加え 110 °C、 24時間、完全加水分解後、遠心濃縮で塩酸を除去し l OmM塩酸 1 mlで再溶解した。再溶解した検体は、試験例 2に示したァミノ酸分析系により、 H y pを定量し、その値をコラーゲン量の代表値とした。

3 ) 試験結果

結果を第 7表に示す。

第 7表コラーゲン（； mol H y pZg皮膚） 1 ) 処置

(可溶化温度）

4 °C 65 °C 120 °C

6週齢ラット

•無処置 42± 2 81± 6 11± 1

15週齢ラット

• コントロール

軟膏塗布 24± 5 157 ± 6 30± 2

• MS E軟膏塗布 44± 2 114 ± 3 26± 1

1 ) 平均値土標準誤差（n = 5 ) 表より MS E軟膏は、加齢に伴う難抽出性コラーゲン（架橋の多いコラーゲン）の組成比の増加を抑制し、 6週齢でのコラ ―ゲン組成比を維持する方向に作用することが明らかになった。〔試験例一 7〕急性毒性

急性毒性試験を以下のようにして調べた。

1 ) 試験化合物

M S E

2 ) 試験方法

I C R系雄性マウス（ 5週齢、体重 24〜28g ) 5匹に、精製水に溶解した 25g/ml試験化合物水溶液を、 0.2 ml/k 体重（試験化合物として 5g/kg 体重）で 1回経口投与した。

その後、 7日間マウスを観察したが、試験化合物の投与による死亡例は全く認められなかった。

〔試験例 - 8〕皮膚刺激性試験

皮膚刺激性試験を、日本在来種雄性家兎（体重約 3 kg) を用い、ドレイズ法（APPRAISAL OF THE SAFETY OF CHEMICALS IN FOODS 、 DRUGS AND COSMETICS 、 46頁、 1959年、 Edited and Published by THE EDITORIAL COMMITTEE, ASSOCIATION OF FOOD & DRUG OFFICIALS OF U.S.A.) に準じて試験した。

1 ) 試験化合物

MS E 2 ) 試験方法

毛を刈り取った家兎背部に擦傷部位（損傷部位）を作製し、損傷皮膚と正常皮膚のそれぞれに、精製水に溶解した 1重量％試験化合物水溶液 0. lml をパッチテスト用絆創膏（1.2 X 1.6 cmリボンエイド ^TM、リバ一テープ製薬株式会社製）に浸潤させて貼付した。 24時間後、絆創膏を剥離し、皮膚の紅斑および浮腫状態を観察し、さらに絆創膏剝離の 48時間後も同様に観察した。そして第 8表の評価基準にてそれぞれ紅斑スコアおよび浮腫スコアを付けた。

5^ 82¾ 平価基準紅斑スコア浮腫スコァ紅斑または浮腫なし 0 0

軽度の紅斑または浮腫 1 1

軽度の紅斑たは浮腫 2 2

中程度の紅斑または浮腫 3 3

強度の紅斑または浮腫 4 4 このスコアと下式に基づき、 1次刺激スコアを計算した。 1次刺激スコア = (A₂₄+A₄₈)/2 + (B₂₄+B₄₈)/2

X₂₄+X₄₈)/2 Y₂₄+Y₄₈)/2 ここで各記号は以下の意味を有する。

A M ：正常皮膚に絆創膏貼付 24時間後の紅斑スコア

A ₄₈：正常皮膚から絆創膏剝離 48時間後の紅斑スコア B ₂₄ ：損傷皮膚に絆創膏貼付 24時間後の紅斑スコア

B 4₈：損傷皮膚から絆創膏剝離 48時間後の紅斑スコア X ₂4 ：正常皮膚に絆創膏貼付 24時間後の浮腫スコア

X 48 ：正常皮膚から絆創膏剥離 48時間後の浮腫スコア Y ₂4 ：損傷皮膚に絆創膏貼付 24時間後の浮腫スコア

Υ ₄₈：損傷皮膚から絆創膏剝離 48時間後の浮腫スコア次に、 1次刺激スコアと第 9表の基準に基づき、試験化合物の刺激度を判定した。

第 9表

1次刺激スコア判

0〜 2未満軽度刺激

〜 5未満中程度刺激

5以上強度刺激

3 ) 試験結果

皮膚刺激性試験の結果、 1次刺激スコアは 0となり、軽度刺激と判定された。

〔試験例一 9〕育毛実用試験

1 ) 試験化合物

試験例一 4 と同じ（後記実施例または比較例の試料を用いた）

2 ) 試験方法

男性型脱毛症患者である被験者 20名の頭部に試験化合物を毎日朝夕 2回、連続 6 ·ヶ月間塗布した後の効果を評価した。育毛効果、脱毛予防効果、ふけ防止効果の各項に対して「生毛が剛毛化した或いは生毛が増加した」、「脱毛が少なくなつた」、「ふけが少なくなつた」と回答した人数で示した。

3 ) 試験結果

結果を第 10表及び第 1 1表に示した。

第 1ϋ表

試料配合物質含有量実用試験 (入）

(wt%) 育毛脱毛ふけ予防防止

実施例 1 M S Ε 0.1 15 15 10

2

実施例 2 M S Ε 9 0.5 16 17 12 実施例 3 M S Ε 4.0 18 17 14 比較例 1 トゥガラシチンキ 0.1 5 7 4 比較例 2 センブリェキス 5.0 4 6 6 比較例 3 ニコチン酸ェチル 0.1 5 6 5

第 11表配合物質含有量実用試験 (人）

(wt ) 育毛脱毛ふけ予防防止実施例 4 M S E 0.2 16 15 11 実施例 5 M S E 3.0 18 18 13 比較例 4 トゥガラシチンキ 0.1 4 7 4 比較例 5 ノンテノール 2.0 5 5 6 比較例 6 ビォチン 0.1 4 5 5 表より実用試験においても明らかに効果が認められた。

〔試験例一 10〕皮膚実用試験

1 ) 試験化合物

試験例一 5と同じ（後記実施例または比較例の試料を用いた）

2 ) 試験方法

荒れ肌、小皺、乾燥肌等を訴える女子被験者（35〜55才） 20 名に試験化合物を毎日朝夕 2回、連続 3 ヶ月間使用させた後、皮膚の柔軟性、弾力性、皺の改善について評価させた。各項について「皮膚の柔軟性が向上した」、「皮膚の弾力性が向上した」、「皮膚の皺が改善した」と回答した人数で示した,

) 試験結果

結果を第 12表および第 13表に示した。

第 12表试料配合物質ムぉ

B Ή m 実用試験 (人）

( t%) 柔軟性弾力性皺改善実施例 6 M S E 0.1 14 16 13 実施例 7 M S E 1.0 17 18 14 実施例 8 M S E 4.0 16 18 15 比較例 Ί ァ—オリザノール 5.0 6 8 8 比較例 8 ニコチン酸ェチル 0.1 7 9 7

第 13表不斗配合物質 3 ¾里実用試験 (人）ノ柔軟性弾力性皺改 ^ 実施例 9 M S E 0.2 14 16 12 実施例 10 M S E 4.0 19 19 15 比較例 9 パンテノール 5.0 7 6 7 比較例 10 ピオチン 0.1 6 8 7 表より実用試験においても明らかに効果が認められた。

以下に本発明の実施例及び比較例を示す。

〔実施例 1〕〜〔実施例 3〕

M S Eを下記親水性成分に 0.1 wt% (実施例 1 ) 、 0.5 VI ί%

(実施例 2 ) 、 4.0 wt% (実施例 3 ) になるよう添加し、溶解後、下記記載の親油性成分と混合攪拌分散して、オイリーヘア —トニックを調製した。原料成分含有率（ % )

(親水性成分）

グリセリン 5. 0 香料 0. 1 精製水総量を】 00. 0

3

3 とする残量

(親油性成分）ォリ一ブ油 5. 0 イソプロピルミリステ卜 2. 0 イソプロピルメチルフノール 0. 05 ポリオキシエチレン

ノニルフェニルエーテル（20E. 0. ) 0. 5 パラォキシ安息香酸メチル 0. 1 エタノール 60. 0

〔比較例 1〕〜〔比較例 3〕実施例 I の M S Eをトウガラシチンキ ϋ. hvt % (比較例 1 ) センブリエキス 5. 0 wt % (比較例 2 ) 、ニコチン酸エキス 0. 1 vvtタ ό (比較例 3 ) にした以外は同じ方法でォイリ一ヘアートニックを調製した。

〔実施例 4〕〜〔実施例 5〕

MS Εを下記親水性成分に 0.2 (実施例 4 ) 、 3.0 wt%

(実施例 5 ) になるよう添加し、溶解後、 80°Cで下記記載の親油性成分と混合する。攪拌しながら冷却して 50°Cになったところで香料成分を加え、更に 30°Cになるまで攪拌を続けてヘア一クリームを調製した。

原料成分含有率 ( wl °

(親水性成分）

パラォキシ安息香酸メチル 0. 2 グリセリン 5. ϋ 精製水総量を 100. 0

3 とする残量

(親油性成分）

流動バラフィン 30. 0 ステアリン酸 5. 0 セタノール 5. 0 ソルビタンモノォレート 3. 0 ポリオキシエチレン

ソルビタンモノォレ一ト（20Ε. 0. 3. 0 ィソプロピルメチルフヱノール 0. 1

(香料成分）

香料 0. 2 〔比較例 4〕〜〔比較例 G〕

実施例 4の M S Eをトウガラシチンキ 0.1 wl% (比較例 ) 、ピオチン 0.】 wt% (比較例 5 ) ノ、。ンテノール 2.0 wt% (比較例 6 ) にした以外は同じ方法でヘア一クリ一厶を調製した。

〔実施例 6〕〜〔実施例 8〕

M S Eを下記親水性成分に 0.1 wl% (実施例 G ) 、 1.0 wt% (実施例 7 ) 、 4.0 wt% (実施例 8 ) になるよう添加し、溶解後、 75 °Cで 5分間加熱攪拌して均一に溶解した下記記載の親油性成分と均一に混合攪拌分散する。次いで、攪拌しながら 30^PC まで冷却し、スキンミルクを調製した。

原料成分含有率

(親水性成分）

N —ラウロイルグルクミン酸

ナトリウム 2. ϋ パラォキシ安息香酸メチル 0. 2 精製水総量を】 ϋϋ. 0

とする残量

(親油性成分）

流動パラフィン 20. 0 ステアリルアルコール 5. 0 ィソプロピルミリステー 1. 5

〔比較例 7〕〜〔比較例 8〕

実施例 Gの M S Εをァーオリザノール「). 0 (比較例了）ニコチン酸ェチル ϋ. 1 wt °o (比較例 8 ) にした以外は同じ方法でスキンミルクを調製した _c

〔実施例 9 J 〜〔実施例 10J

M S Eを 80°Cに加熱溶解した下記親水性成分に 0. 2 wt °o (実施例 9 ) 、 4. 0 wt % (実施例 10) になるよう添加し、溶解後、 80 Cに加熱溶解した下記記載の親油性成分と均一 Iこ混台攪拌分散する。次いで、攪拌しながら 30°Cまで冷却し、スキンクリ一ムを調製した。原料成分含有率

(親水性成分)

グリセリン 5. ϋ パラォキシ安息香酸メチル 0. 1 精製水総量を 100. 0

とする残量

(親油性成分）

スクヮラン 10. 0 ォリーブ油 10. 0 固形バラフィン 5. 0 セ夕ノ一ノレ 4. 0 ソルビ夕ンモノステアレ一ト 2. 0 ポリオキシエチレンソルビタン

モノステアレ一ト（20Ε. 0. ) 2. 0 〔比較例 ί) ) 〜〔比較例 1 ()〕

実施例 9の M S Εをパンテノール 5. Uwt ⁽'o (比較例 10) 、ビォチン ϋ. 1 wt % (比較例 1 ϋ) にした以外は同じ方法でスキンクリ一ムを調製した。

〔実施例 11〕

下記記載の親油性成分を 80°Cに加熱、溶解し、その中へ 80°C に加熱、溶解した下記記載の親水性成分を添加し、攪 j -、混台した。次いで、攪拌しながら室温までゆっくりと冷却し、吸水軟膏を調製した。

原料成分含有率（_wt % )

(親水性成分）

M S E 5. ϋ パラォキシ安息香酸ェチル 0. 1 精製水 31. 3

(親油性成分）

白色ワセリン 40. 0 セタノ一ノレ 18. 0 セスキォレイル酸ソルビタン 5. 0 ラウロマクロゴ一ノレ 0. 1 ブチノレパラベン 1. 5

〔比較例 11〕

実施例 11の M S Εを精製水にした以外は同じ方法で吸水軟膏を調製した。

〔実施例 12〕

M S E 50 g に下記記載量の乳糖、トウモロコシデンプン、結晶セルロースの混合物に、ヒドロキシプロピルセルロースを 30 gの精製水に溶解して加え、十分練合した。この練合物を 20 メッシュの篩に通して顆粒状に造粒し乾燥した後、得られた颗粒にステアリン酸マグネシウムを混合し、 1 錠 200mgに打錠し . 1錠中に有効成分を 10t)mg含有する錠剤を得た。

(成分）配台量（ g ) 乳糖 10

トウモロコシデンプン 30

結晶セルロース 8

ヒドロキシプロピルセル口一ス 1

ステアリン酸マグネシウム 1

〔実施例 13〕

M S E 100g に下記記載量の乳糖、トウモロコシデンプン、結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウムを充分混合し、混合物の 30ϋ mgずつを 2号カプセルに充塡して、 1錠中に有効成分を l OOmg 含有するカプセル剤を得た。 (成分）配合量（ g) 乳糖 100

トウモロコシデンプン 50

結晶セルロース 47

ステアリン酸マグネシウム 3

〔実施例 14〕

M S E 100g に下記記載量の乳糖、トウモロコシデンプンを充分混合し、ヒドロキシプロピルセルロースを 1000 gの精製水に溶解して加え、充分練合した。この混合物 20メッシュの篩に通して造粒し、乾燥後整粒して、 1 g中に有効成分として M S E lOOm を含有する顆粒剤を得た。

(成分）配合量（ g) 乳糖 470 トウモロコシデンプン 400 ヒドロキシプ口ピノレセノレロース 30 産業上の利用可能性

本発明の N—メチルー L—セリンはヒト線維肉腫細胞の培養系に添加すると、プロコラゲナーゼの産生量が促進される（試験例一 1 ) 。

動物を用いた試験においても、コラーゲンの異常蓄積を伴う疾病、例えば肝線維症の治療に有効であることが確かめられた (試験例 _ 2 ) 。また、加齢によって硬化する皮膚コラーゲン組成を若い皮膚コラ一ゲン組成に保つことが確かめられた（試験例一 6 ) 。

本発明の N—メチルー L —セリンは毒性も皮膚刺激性もなく安全な化合物である（試験例一 7および 8 ) 。

更に、育毛剤及び皮膚老化防止剤としての実用試験において、効果が認められた（試験例— 9および 10) 。

以上のことは、本発明の N—メチル一 L —セリンはコラーゲンの異常蓄積を伴う疾病、および老化に伴うコラーゲンの新陳代謝の低下に対しコラーゲン代謝改善剤として、また、育毛剤、皮膚老化防止化剤として有用であることが明らかに認められる。

Claims

請求の範囲 N—メチルー Lーセリンを有効成分とするコラーゲン代謝改善剤。肝および肺線維症、ケロイド、肥厚性瘢痕、鞏皮症、頭皮の線維化等のコラーゲンの異常蓄積を伴う疾病に対する請求項 1 のコラーゲン代謝改善剤。老化に伴うコラーゲン新陳代謝の低下に対する請求項 1 のコラーゲン代謝改善剤。 N—メチルー Lーセリンを有効成分とする育毛剤及び皮膚老化防止剤。育毛剤が養毛化粧料であり、皮膚老化防止剤が皮膚化粧料である請求項 4の育毛剤及び皮膚老化防止剤。