WO1990002761A1

WO1990002761A1 - Human monoclonal antibody and process for its preparation

Info

Publication number: WO1990002761A1
Application number: PCT/JP1989/000936
Authority: WO
Inventors: Noriaki Endo; Yasuhiko Masuho; Takeshi Hara
Original assignee: Teijin Limited
Priority date: 1988-09-14
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1990-03-22
Also published as: EP0407586A1; EP0407586A4

Description

明細発明の名称

ヒト ■ モノクローナル抗体とその製造法技術分野

本発明は、ヒト癌に選択的に反応するヒト · モノクロ

—ナスレ ίΛ体 (monoclonal antibody，以下 MCAとう ) とその製造法に鬨する。その目的とするところは、癌の診断および治療に役立つところの、ヒト癌およびヒト癌に鬨連する糖蛋白質抗原または糖脂質抗原に対して反応性を有するヒト MC Aを提供することにある。

背景技術

癌はその診断および治療法が確立されておらず、より優れた方法を開発すべく種々の試みがなされてきている , 中でも、抗体を用いた診断および治療の試みは、

Mil steinと Kohl erによって確立されたハイブリドーマ法によって、高純度の MC Aが作製できるようになって以来、多くの研究者によって行なわれてきた。

かかる診断および治療において重要な要件の一つは抗体の特異性である。すなわち、癌細胞および Zまたは癌組織に対する反応性を有し、かつ、正常細胞および Zまたは組織との反応性が皆無または軽微であるか、あるいは比較的限られた正常細胞および Zまたは組織とのみ反応するような抗体が、かかる診断，予防および治療には望まれる。さらに、抗体が多種の癌細胞およびまたは癌組織と反応することがその汎用性の観点から、望ましいことが多い。

ある種のガンダリオシド等の糖脂質あるいは糖蛋白質等の糖鎖に対する抗体はかかる要件を満たす可能性がある [例えば、 Hakomoriと Kaanagi,ジャーナル■ ォブ . ナショナル · キャンサー · インスティテュート（ <J. Natl. Cancer last. ) ，第 71卷，第 231-251 頁] 。

例ぇば1^0! 611-卩1^6(1611 1<；11抗原（以下 T F抗原という〉は末端糖鎖として、抗原決定基のガラク卜ース（ ;3 1→3〉 N—ァセチルガラクトサミン（以下 1 β 1→ 3 Gal N Ac という〉を有することを特徴とする糖蛋白質または糖脂質抗原であり、各種のヒト癌組織に外部に露呈した状態で存在する腫瘍関連抗原である [ G. F.

Springer, サイエンス（ Science) , 第 224 卷，第 1198- 1206頁， 1984年] 。従って、（Jal β 1→3 Gal N Ac を有する糖蛋白質または糖脂質と反応する M C Aは、癌の診断，治療の上で有用であると考えられる。

Rahmanと Loagenecker [シヤーナル - ォブ · ィミュノロジー〈 J. Imminol. ) , 第 129 卷，第 2021-2024 頁， 1982年] は、シァリダ一ゼ処理して末端糖鎖精造を Gal β l→ 3 Gal N A c とした糖蛋白質を有するヒト赤血球でマウスを免疫し、そのマウス脾細胞とマウス，ミエ口一マ細胞を融合することによって、 Gal β 1→ 3 « Gal N Ac 特異的 MCAを産生するハイプリドーマを作製したが、その後この MC Aはヒト癌細胞とは反応しないことが報告されている [Longenecker ら，インターナショナル ' ジャーナル ' ォブ ' キヤンサー（ Int. J. Cancer) 第 33卷，第 123-129 頁， 84年参照] 。

しかるにその後、彼らは、 Gal β 1→ 3 Gal N Ac と反応し、かつヒト癌細胞に対する反応性を有する MCA の取得を報告している [例えば、 Longenecker ら，ジャーナル · ォブ ' ナショナル■ キャンサー ■ インステイチユート（ J, Natl. Cancer Inst. ) , 第 78卷，第 489- 496 頁， 1987年] 。かかる MCAは癌の診断，治療における有用性が期待される。しかしながら、これらはマウス由来の MC Αであり、人体に投与したとき異物として認識され不都合な副作用を引き起こす可能性が強い。そこで、末端糖鎖構造として Gal yS 1→3 Gal N Ac を有する糖蛋白質あるいは糖脂質と反応し、かつヒ卜癌細胞と反応する、マウス由来ではなく、ヒト由来の MCAの創製が望まれる。 .

一方、正常人の血清中には主として IgM からなる自然抗体としての抗 TF抗体が存在することが知られており [Springer^? , ナツ一レヴィッセンシャフテン

( aturwissenschaften) , 第 69卷，第 346-348 頁， 1982 年] 、 Brayらが報告している如く（ J. I UHO 1.，第 126 卷，第 1 6-1969 頁， 1981年）、 TF抗原鬨連糖鎖などを用いた免疫吸着カラム等による、かかる抗 TF抗体のヒト血清中からの収集も可能と考えられる。しかしながら血清中での存在量は少く、かつ元来かかるヒト血液をその原料ソースとしている場合には、その安定な供耠に難がある。かかる点においても、ヒト由来で、 Gal 1 →3 Gal N Ac を含有する糖蛋白質または糖脂質と反応し、かつヒト癌細胞と反応する MC Aの作製が望まれるが、今までかかる MC Aの作製は成功していない。

また、 Kabat らの報告（ J. ImniMol.，第 128 卷，第 540-544 頁， 1982年〉によれば、偶発性モノクローナルァーグロプリン血症と肺癌を併発していた患者においてたまたま体内で産生されていたラクトー N—テトラオ一ス [ガラクト一ス（ 1→3 ) N—ァセチルダルコサミン（；3 1→3〉ガラクトース（ 1→4 ) グルコース (以下 Gal 1→3 Gic N Ac β 1→ 3 Gal β 1→4 Glc という） ] に対して特異的に反応するモノクローナル IgM 抗体のために、その患者の進行肺癌が治癒し、その後長期間癌の再発が見られなかったという例が知られている。従ってラクト一N—テトラオースあるいはその部分構造であるガラクト一ス（ 1—3 ) N—ァセチルダルコサミン（以下 Gal >S l→3 Glc NAc という）を末端糖鎖構造として有するオリゴ糖または糖蛋白質または糖脂質と反応する抗体は癌の治療に有用な可能性がある。ハイプリドーマ法等によるかかる反応性を有するヒト MCAの作製が望まれるが、今までそのような MCA の作製は成功していない。

一般にヒト由来の MC Aはマウス · ミエローマ細胞，ヒト ■ ミエローマ細胞あるいは他のリンパ系樹立細胞とヒト ' リンパ球とを細胞融合して得られるハイプリド一マから産生される。あるいはヒト · リンパ球を E Bウイルスによって形質転換させたリンパ芽球細胞からも産生される。 80年から現在まで、多くのヒト MCA作製の試みがなされてきたが、いずれの方法もそれぞれ固有の問題をかかえている。マウス · ミエローマとヒト . リンパ球との細胞融合で得られたハイブリド一マの MC A産生は不安定であるし、ヒト · ミエローマ細胞とヒト · リンパ球との細胞融合は極めて効率が悪い。また E Bウイルスによって得られるリンパ芽球細胞の MC A産生は量が少なく、かつ不安定である。その上、 E Bウィルスは腫瘍を引き起こす能力を有しており、安全性上問題がある。このように、 MC A産生細胞を樹立する技術において大きな障害があるが、さらにヒト癌に選択的に反応するヒト MCAを得るためにもいくつかの障害がある。そのうちの一つは、いかにしてヒト癌に選択的に反応するヒト MC Aを産生するハイプリドーマを選別取得するかという課題である。一般に癌細胞自身との反応性で選別した場合には、ヒト癌に選択的に反応するヒト MC Aを得る効率は非常に悪い。発明の開示

本発明者らは、腫瘍に鬨連した抗原物質中の糖鎖構造と反応し、かつヒト癌細胞に反応するヒト M C Aを取得することを目的として鋭意研究を行なった結果、 in vitro でマイト一ジェン存在下に培養したヒ f ■ リンパ球と、マウス · ミエ口一マ細胞とを融合させ、末端糖鎖構造として Gal β l -→ 3 Gai N Ac を有する糖蛋白質または糖脂質に対する反応性で先ず選別し、ついでヒト癌細胞との反応性を検討するとともに、さらに種々の糖蛋白質，糖脂質，オリゴ糖などとの反応性を検索する方法によって、末端糖鏆構造として Gal β l→3 Gal N Ac および Zまたは Gal β l→ 3 Glc N A c を有するオリゴ糖または糖蛋白質または糖脂質と反応し、かつヒト癌細胞と反応するヒト M C Aを産生するハイプリドーマを得ることができた。そして、このハイプリドーマおよび Z またはそれに由来する細胞株を培養し、培養上清から該ヒト M C Aを取得することができた。本発明のヒト M C Aは、末端糖鎖楕造として Gal /3 1— 3 Gal N A c を有する糖蛋白質（例えばァシァログリコホリン Aおよびァシァロフツインなど〉または上記末端糖鎖構造を有する糖脂質（例えばガンダリオシド GM1，ガンダリオシド G Dlb など）、並びに末端糖鎖構造として Gai β 1— 3 Glc N Ac を有するオリゴ糖（例えばラクト一 N—テトラオースなど）または上記末端糖鎖構造を有する糖蛋白質（例えば Gal β l→3 Glc Ν Ac を結合したゥシ血清アルブミンなど）または上記末端糖鎖構造を有する糖脂質（例えばラクトテトラオシルセラミドなど）と反応しさらにはヒト癌細胞、例えばヒト結腸癌細胞およびヒト乳癌細胞などと反応する抗体である。

発明を実施するための最良の形態

ヒト ■ リンパ球は脾臓，リンパ節，末梢血，骨髄，扁桃，アデノィド等の中に含まれている。本発明の目的のためには、いかなるソースのリンパ球でも用いることができるが、脾臓，リンパ節または扁桃のリンパ球が特に適している。

マウスのミエローマ細胞としては、 8—ァザグァニン耐性株を用いるのが有利であり、公知のものでは、 BALB /cマウスの P3X 65Ag8株， P3-NSl/l-Ag4-l株， P3x63Ag ϋΐ株, SP2/0Agl4 株， P3x63Ag8.6.5.3 株， MPC11-45. 6. TGI.7 株， SP-1株等を用いることができる。

本発明においては、ヒトのリンパ球とマウスのミエ口 —マ細胞とを融合させるに先立って、望ましくはヒトのリンパ球を in vitroでマイト一ジェン存在下に培養する。マイト一ジェンとしては、リンパ球の分化及び増殖を促進させるものならば何でもよいが、例えば、ポ一ク - ウイ一ド . マイトジェン（ PWM〉， B細胞増殖因子（B cell growth factor, BCGF) ，プロテイン A，フイトへムァグルチニン（ P HA ) , コンカナバリン Aを用いることができる。特に好ましいのは 2 〜200 /mlの P WMあるいは 10り分の 1容から 3分の 1容の BCGFであるさらに、 Gal β 1→ 3 Gal N Ac および/または Gal β l→ 3 Glc N Ac を末端糖鎖構造として有する糖蛋白質または糖脂質、あるいはかかる糖蛋白質または糖脂質を細胞表面に有する細胞などを抗原ソースとして共存させて、リンパ球を培養してもよい。

リンパ球の培養の条件は特に限定されるものではないが、リンパ球の濃度は 1 X 10⁵ 〜1 X 10⁷ 個 mlが適当であり、培養温度は 35〜4G Cで培養時間は 4〜1G日、好ましくはら〜 8日である。培養液としてはヒト，ゥシ，ゥマ等の血清および Zまたはかかる血清成分を含むものが用いられる。

かくして得られたヒトの抗体産生細胞（リンパ球）とマウスのミエ口一マ細胞とは、次いで公知の方法に従つて細胞融合せしめられる。例えば、リンパ球とミエ口一マ細胞を 10 : 1〜1 ： 100 、好ましくは.1 ： 1〜1 ： 10 の比率で混合し、適当な細胞融合溶液、例えば約 35%ポリエチレンダリコール（分子量 1, 000 〜6, 000 程度〉および約 7. 5 %ジメチルスルホキシドを含む R P M I 1640 を加えて、室温〜 37°Cで 1〜数分間撹拌し、その後 10% ゥシ胎児血清加 R P M I 4Qで徐々に希釈し、洗浄の後 H A T (ヒポキサンチン一アミノプテリン一チミジン）選択培養液にて細胞濃度が 1〜5 X 10⁵ 個 Zmlとなるように調整する。これを 0.2 mlずつ、例えば穴プレートに分注し、 5%C02を含む空気中で 35〜38でで 3〜4週間培養する。 HAT培養液中ではハイプリドーマのみが生存し、 8—ァザグァニン耐性のミエローマ細胞及びミエロ一マ同士の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体産生細胞は数日で死滅する〉。

培養後、培養液中の抗体価をチックし、目的とする抗体を産生しているハイプリドーマのみを選択し単離する（クローニング）。培養液中の抗体価のチェックは、例えばラジオィムノアツセィ法（ R I A ) ，酵素抗体法 ( E L I SA ) , 螢光抗体法などの方法で行なうことができる。抗原として Gal ^ l→3Gal NAc を末端糖鎖構造として有する糖蛋白質および糖脂質、例えばァシァログリコホリン A，ァシァ口フェツイン，ガングリオシド GM1， GDlb を用い、かかる抗原に対して反応する M C Aを産生するハイプリドーマを選択し、しかる後に、かかる検出法にて選択されたハイプリドーマの培養上清にっき、さらに種々の糖蛋白質，糖脂質，オリゴ糖などとの反応性、並びにヒト癌細胞およびヒト正常細胞との反応性を検討することにより、末端糖鎖構造として 1 β 1 -→ 3 Gal N A c および Zまたは Gal β 1 -→ 3 Glc N Ac を有するオリゴ糖糖蛋白質または糖脂質と反応し、かつヒト癌細胞と反応するヒト MC Aを産生するハイブリドーマを効率よく得ることができる。ヒト癌細胞との反応性は、例えば R I A法， E L I S A法，蛍光抗体法などの方法で行なうことができる。

クロ一ニングによって選択された、本発明の抗ヒト癌ヒト MC Aを産生するマウスーヒトハイプリドーマは、凍結して保存することができる。かかるハイプリドーマのセルライン（細胞株）およびノまたはそれに由来する細胞株を、例えば適当な方法で大量に培養すると、培養上清から本発明の目的とするヒト MC Aを得ることができる。

以上の如くして得られた本発明のヒト MC Aは、次のような特性を有する。本発明で得られたヒ卜 MC Aは、末端糖鎖構造として Gal β l→3Gal N Ac およびまたは Gal β l→3Glc N Ac を有する糖蛋白質、例えばァシァログリコホリン A, ァシァ口フェツイン， Gal β 1→3 Glc N Ac を結合せしめたゥシ血清アルブミンなどとは反応するが、 Gal β l→3Gal N Ac にシアル酸が結合した糖鎖構造を有するグリコホリン A, フツインおよび Gal β 1→ 3 Gal N Ac と Gal 1→3 Glc N Ac のいずれをも含有しない糖蛋白質、例えばゥシのチログロブリンあるいは酸処理によりシアル酸をはずしたヒトの《 i —酸性糖蛋白質などとは全く反応しないか、または軽微の反応性を示すのみである。さらには、ガングリ才シドとの反応性において、 Gal β 1→ 3 Gal N Ac を末端に有する GM1， GDlb とは反応するが、末端ガラクトースにシアル酸の結合した GTlb および Gal β 1→ 3 Gal N A c を含まない GM2， GM3などとは全く反応しない。また、オリゴ糖との反応性において、末端に Gal β 1→ 3 Glc N A c を有するもの、例えばラクト — N—テトラオース， Gal β 1→ 3 Gal N A c a 1 - O M e などが強い反応性を示す。一方、ヒト由来の細胞株に対する反応性では、癌細胞、例えば多くの結腸癌細胞乳癌細胞とは反応するが、正常細胞、例えば線維芽細胞: リンパ球とは反応しない。従って本発明にて得られたヒト M C Aは、末端糖鎖構造として Gal /3 1→ 3 Gal

N A c および/"または Gal β 1→ 3 Glc N A c を有するオリゴ糖または糖蛋白質または糖脂質と反応し、かつヒト癌細胞と反応する特性を有する抗体である。かかる特性を有する抗癌ヒト M C Aはこれまで全く作られたことはなく、本発明において初めて得られたものである。

以下、実施例により本発明を詳述する。実施例 1

(1) ヒ卜 . リンパ球の培養

ヒトの扁桃リンパ球を培養液 A ( RPMI 1640 + 10%胎児ゥシ血清 + 2 mMグルタミン + 1 mM ピルビン酸ナトリウム + 0.02iuZmlセリン + 80 g Zmlゲンタマイシン）に浮遊させた。細胞漶度は 12X 10⁵ 個ロであった。この細胞浮遊液を l inlずつ、培養プレート（ 24穴）の 5穴に入れた。各穴には最終濃度が 20 x g Zmlとなるように P WMを添加し、この培養プレートを 37 ， 5%C02含有空気中で 6日間培養した。

(2) マウス ' ミエローマ細胞 P 3 x Ag8 U 1株

( P 3 U 1と略記する〉との細胞融合

前もって P 3 U 1を培養液 B ( G I T培地 +80t g / mlゲンタマイシン）中で培養しておいた。使用時の細胞濟 ί¾は 6 X10⁵ 個 Zmlであった。上記 {1} の培養リンパ球（ 5穴を一緒にした〉と P 3 U 1を、それぞれ別々に無血清 R P M I 1640で 2回洗浄した。こうして得たリンパ球と 2 X 10⁷ 個の P 3 U 1 とを試験管の中で一緒にし、 1500 rpm で 5分間遠心し、上清を捨てた。細胞ペレツトを、試験管をたたくことによって、よく分散させた。これに 0.5 mlのポリエチレングリコール液（ R P M I 1640 5, 75ml +ポリエチレングリコール 1000 3.5 ml十ジメチルスルホキサイド 0.75ml〉（以下、 P E G液という〉を加えて'、細胞をゆるやかに浮遊させた。 1分後に 0.5 ml R P M 1 1640を加え、さらに 1分後に 1 ml R P M I、さらに 2分後に 4 mlの H AT培養液（ G I T培地 +8( g Zmlゲンタマイシン + 95 Mヒポキサンチン + 0.4 JUL M アミノアテリン +1.6 Mチミジン）、さらに 2分後には 4 mlの H A T培養液を加えた。最後に、 HAT培養液で 100 ml細胞浮遊液とした。これを培養プレート（ 96穴） 5枚に蒔いて、 VTC、 5%C02含有空気中で培養した。 1週間毎に半量の培養液を新しい HT培養液（ HATからアミノアテリンを除去したもの）で交換していきハイプリド一マを得た。

(3) 抗体活性の測定

E L I S Aによって測定した。抗原として 1 Mホウ酸バッファ一（pH 8.6) に溶解したァシァ口フエツイン (シグマ社より購入〉 10 g Zmlを、 100 j ^ Z穴ずつそれぞれファルコン · ミクロテスト ] Πの 96穴ァレートに固定して用いた。このプレ一卜にハイブリド一マ培養上清 50 ϋ を加えて、室温で 1時間放置した。 1 %ゥシ血清アルブミン（以下 B S Αという）を含有するハンクス塩類緩衝液（以下、 H B S S— Bという）で 3回洗浄の後、ャギ抗ヒト IgM 抗体一アル力リホスファタ一ゼ複合体（ 2000倍希釈液〉を 50 ϋ 加えて、室温で 1時間反応させた。さらに H B S S— Βで 3回洗浄したのち、 Ρ — ニトロフエニルホスフェートを 1 Μジエタノールアミン + l mM gCl₂ の pH9.8 溶液に 0.6mg Zmlの割合で溶かした溶液 100 を加えた。 30分から 60分後に 405nm の吸光度を測定し、抗体活性陽性のハイプリドーマを選別した。

(4) ハイブリドーマのクローニング

クローニングは限定希釈法を用いた。抗ァシァロフエツイン抗体陽性の穴より細胞を取り出し、細胞数を数え、培養液 Bを用いて 2個. Z穴あるいは 10個 Z穴で細胞を蒔いた。 2週間後に細胞が十分増殖した時点で、その上清の抗ァシァロフエツイン抗体価を E L I S Aによって測定し、 MC A産生ハイプリドーマを選別した。

こうして、ハイプリドーマ 11-50 が樹立された。このハイプリド一マは安定に IgM 型の MCAを産生し続けている。ハイプリドーマ 11-50 は、工業技術院微生物工業技術研究所に昭和 6 3年 9月 2 9日に微ェ研菌寄第 10303 号（FERM P-10303) として寄託された。実施例 2

(1) ハイプリドーマ 11-50 産生 MC Aの各種糖蛋白との反応性

ァシァログリコホリン，ァシァ口フェツイン，ゥシ - チログロブリン（以上シグマ社より購入）およびヒ卜 a i —酸性糖蛋白（シグマ社より購入）を 0· 1 N HC1 にて 80で， 1時間処理して作製したァシァ口 α i —酸性糖蛋白の 4種の糖蛋白を抗原として E L I SAを行なつた。これら抗原蛋白は 100， 10, 1, .0. i I /ml ( 0.1 M ホウ酸バッファー， PH 8.6)に調製し、 100 Ζ穴ずつそれぞれファルコン ' ミクロテスト IIの穴プレートに固定して用いた。その後の手順は、実施例 1一（3) に記載した方法に準じて行なった。その結果を第 1表に示した。

ハイプリドーマ 11-50 産生 MCAは Gal 1→ 3 Gal N Ac を末端に有するァシァログリコホリン，ァシァ口フェツインと強く反応したが、 Gal a 1→4 Gal を多量に有するゥシ ' チログロブリンおよび Ga! β 1→4 Gic N Ac を多量に有するァシァ口" i 一酸性糖蛋白とは全く反応しないか、軽微の反応を示すのみであった。また Gal β 1→ 3 Gal N Ac または Gal β 1→3 Glc N A c を B S Aに結合した糖蛋白と共に強く反応した。

1

*1 値は、 405nm の吸収を示す。

*2 Gal β 1→3 Gal N Ac を結合した B SA (ピアス社より購入）

*3 Gal β 1→ 3 Glc N Ac を結合した B SA (ピアス社より購入〉

(2) ハイプリドーマ 11-50 産生 MC Aの各種糖脂質との反応

第 2表に記載した糖脂質を、クロ口ホルム一メタノール（ 1 ： 2 〉混液に 0.625 mg/ml , 1.25mg/ml , 2.5 mg /ml , 5mg/' mlになるように溶解した溶液を、 50 α Ζ 穴ずっフアルコン · ミクロテスト ΙΠプレートに入れ、風乾後抗原プレートとして用いた。その後は実施例 1 一 (3) に準じて行なった。その結果を第 2表に示した。ハイプリド一マ 11-50 産生 M C Aは Gal β 1→ 3 Gal N A c を末端に有するガンダリオシド GM1， GDlb と強く反応した。 ^

*1 値は、 405nm の吸収を示す実施例 3

各種ヒト細胞との反応

(1) 培養ヒト細胞株との反応

各種ヒト培養細胞株に、ハイプリドーマ産生ヒト MCAを反応させた。さらにフルォレツセンイソチォシァネイト ( f luoresceinisot io-cyanate, F I T C ) 標識抗ヒト IS 抗体を反応させ、蛍光顕微鏡下で観察した。その結果、該 MCAは LS174T, HT29などの結腸癌細胞、 KNS-62などの肺癌細胞および T47Dなどの乳癌細胞の細胞膜と強く反応することが確認された。

(2) シァリダーゼ処理ヒ卜 · リンパ球との反応

シァリダーゼ（シグマ社より購入， TypeV ) l UZml にて 37で， 45分間処理したヒト脾細胞と未処理の脾細胞に対するハイプリドーマ 11-50 産生 MC Aの反応性を、実施例 3—（1) に記載した間接蛍光抗体法により調べた, その結果、該 MCAは、シァリダーゼ処理した脾細胞とのみ強く反応することが確認された。実施例 4

(1) 各種糖蛋白による、ハイプリドーマ 11-50 産生 MC Aのヒ卜結腸癌細胞株 SW48G に対する反応性の阻害ハイプリドーマ 11-50 培養上清を H B S S— Bにて 30 倍に希釈した溶液と H B S S— Bにて段階希釈した各種糖蛋白（第 3表に記載した）溶液 5θ χ を予め混合した後その 50 を、ヒト結腸癌細胞株〈大日本製薬より購入〉をグルタールアルデヒドを用いて付着後固定した 96穴ァレートに加えて、室温で 1時間放置した。その後の手順は、実施例 1一（3) に記載した方法に準じて行なった。その結果を第 3表に示した。

Gal β 1→3 Glc N Ac を結合した B S Aが最も強い阻害活性を示し、次いでァシァログリコホリン， Gal β l→3 Gal N Ac を結合した B S Aが強い阻害活性を示し、次いでァシァロフヱツインに阻害活性が見られた。これに対して、ゥシ · チログロブリンおよびァシァ口！一酸性糖蛋白および末端のガラクトース残基にシァル酸の結合したグリコホリンおよびフェツインには全く阻害活性が認められなかった。

第 3 表

*1 値は％阻害を示す。

%阻害は以下の式より算出した阻害剤存在下の A₄₀₅

%阻害二 ( 1 ■ ) X 100 阻害剤非存在下の A₄₀₅

(2) 各種ォリゴ糖による、ハイプリドーマ 11-50 産生 M C Aのヒト結腸癌細胞株 SW48G に対する反応性の阻

H B S S— Bにて段階希釈した各種オリゴ糖（第 4表に記載した〉を用い、実施例 4一（1) に記載した方法準じて行なった。その結果を第 4表に示した。第 4 表

*1 M C Aの癌細胞への結合を 50%阻害するオリゴ糖の濃度

*2 BioCar 社より購入ラクトー N—テトラオースが最も強い阻害効果を示し次いで Gal β 1→ 3 Gal N A c « 1 - O M e が強い阻害効果を示した。かかる二種のォリゴ糖が有意の阻害効果を示す濃度範囲において、他のオリゴ糖は全くあるいはほとんど阻害効果を示さなかった。

以上（1) ， (2) の結果より、ハイプリドーマ 11- 50が産生する M C Aは末端糖鎖構造の Gal β 1→ 3 Gl c N A c および Gal β 1→3 Gal N Ac に反応性を有していることが示された。実施例 5

ハイブリドーマ 11-50 産生 MC Aのアイソタイアの同定

ヒト MCAのアイソタイアの同定は以下の如く行なつた。すなわち、抗原としてァシァ口フェツインを用い、 2次抗体に、アルカリホスファターゼで標識したャギ抗ヒト IgM ないしはヒト IgG 、ないしはヒト鎖ないしはヒトス鎖を用いた E L I S Aを行なった。その結果、該ハイプリドーマのアイソタイプは IgM , λと同定された産業上の利用可能性

本発明のヒ卜 · モノクローナル抗体はヒ卜癌に選択的に反応するので、癌の診断、治療などの分野で有用であると思われる。

Claims

請求の範囲

1. 末端糖鎖構造として、ガラクト一ス（ /3 1→3 〉 N --ァセチルガラクトサミンおよび Zまたはガラクトース（；3 1→3〉 N —ァセチルダルコサミン—を有するォリゴ糖または糖蛋白質または糖脂質と反応し、かつヒト癌細胞と反応するヒト · モノクローナル抗体。

2. I gM 型の請求の範囲第 1項記載のヒト ■ モノクロ一ナル抗体。

3. 工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研菌寄第

10303 号（ PERM P- 1 0303 ) として寄託されたハイプリドーマ 1 1 - 50 によって産生される請求の範囲第 2項記載のヒト ■ モノクローナル抗体。

4. ヒト . リンパ球とマウス ■ ミエ口一マ細胞とを細胞融合させ、得られたハイプリド一マの中から、末端糖鎖構造としてガラクト一ス（ 5 1→3 〉 N —ァセチルガラクトサミンおよびノまたはガラクト一ス（ 1→ 3 ) N—ァセチルダルコサミンを有するオリゴ糖または糖蛋白質または糖脂質と反応し、かつヒト癌細胞と反応するヒト . モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別し、次いでかかるハイプリドーマおよび Zまたはそれに由来する細胞株を培養し、培養上清からヒト ■ モノクローナル抗体を採取することを特徴とするヒト · モノクローナル抗体の製造法

5. ハイプリドーマが工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研菌寄第 10303 号（FERM P-10303) として寄託されたハイプリドーマ 11-50 である、請求の範囲第 4 項記載のヒト · モノクロ一ナル抗体の製造法。

6. 末端糖鎖構造としてガラクトース（ 3 1→3〉 N— ァセチルガラクトサミンおよびノまたはガラクトース

{ β 1→3 ) Ν—ァセチルダルコサミンを有するオリゴ糖または糖蛋白質または糖脂質と反応し、かつヒト癌細胞と反応するヒト ■ モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。

7. 工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研菌寄第

10303 号（FEilM P-10303) として寄託された請求の範囲第 6項記載のハイプリドーマ（ハイプリド一マ

50} 。