WO1989007147A1 - Process for preparing optically active 2-hydroxy-4-phenylbutyric acids - Google Patents

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WO1989007147A1
WO1989007147A1 PCT/JP1989/000120 JP8900120W WO8907147A1 WO 1989007147 A1 WO1989007147 A1 WO 1989007147A1 JP 8900120 W JP8900120 W JP 8900120W WO 8907147 A1 WO8907147 A1 WO 8907147A1
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acid
hydroxy
lactobacillus
microorganism
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PCT/JP1989/000120
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Inventor
Akinobu Matsuyama
Teruyuki Nikaido
Yoshinori Kobayashi
Original Assignee
Daicel Chemical Industries, Ltd.
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing optically active 2-hydroxy-4-monouniluric acid. More specifically, the ability to asymmetrically reduce 2-oxo-14-phenylbutyric acid to (R) 1-2-hydroxy-14-phenylbutyric acid, or (S) _2-hydroxy-4-1-funyilbutyric acid. The resulting microorganism or its processed product is allowed to act on 2-oxo-14-butyric acid to produce (R) -2-hydroxy-4-butyric acid or (S) 12-hydroxy-4-butyric acid The present invention relates to a method for producing optically active 2-hydroxy-4-butyralbutyric acid.
  • Optically active 2-hydroxy-4-funyurbutyric acid is an important synthetic intermediate for various pharmaceuticals such as antihypertensives.
  • the present inventors focused on the asymmetric reduction method using microorganisms as a method for obtaining optically active 2- (hydroxy-4-furonic acid) having a high optical purity and a simple method, and searched for microorganisms suitable for this purpose.
  • microorganisms used in the present invention include genus Lactobacillus, genus Leuonostoc, genus Streptococcus, genus Sporolactoba-cillus, and genus Sporolactoba-cillus.
  • Genus Pediococcus sacchar ⁇ Saccharoraycopsis 3 ⁇ 4, genus Saccharomyces, genus Rhodotorla (Bhodotolura), genus Candida, genus Saccharomyces, Saccharomyces Genus Dioboras (Sp- oridiobolus), Genus Ambros iozyma, Genus Azores (Arthroascus), Genus Botryoascus, Genus Clavispora, Genus Debaryomyces, Lipomycos ), Genus Roderomyces, genus Metschnikowia, Geotricum genus Kum, genus Kluyverofflyces, genus Cryptococcus, genus Trigonopis, genus Wickerhamia, genus Wickerhamiel la , Genus Schizosaccharomyces, Rhodosporidiuro> genus Stephanoascus, Hansenula JR
  • Lactobacillus acidophilus (Lactobacillus acidophi lus) NRIC1027 and the microorganisms that can produce (R) —2—hidoxy-4-furnyl drunic acid from 2-oxo-4-phenylbutyric acid are IF03831, Lactobacillus casei (Lactobacillus casei) NRIC1044 and ATCC25598, Lactobacillus 'casei' subs-beasts ⁇ Ramnos (actobaci 1 lus casei subsp. Rhannosus) IF03425, Lactobacillus s.
  • Lactobacillus casei subsp.casei IF012004, Lactobacillus delbruecki AHU1056. Lactobacillus brevis NRIC1037 and ATCC 4006, Lactobacillus brevis bulgaricus) NBIC1041 and IAM1120, Lactobacillus. Lactobacillus fructosus IF03516, Lactobacillus lactis> NRIC1061 and ATCC12315, Lactobacillus xylosus NRIC107 and ATCC15577, Lactobacillus nicotinei lacinoicyl Lactobacillus viride-descens NRIC1073 and ATCC12706, Leuconostoc dextranicum AHU1080.
  • Dext-tranicun IF03349 Centeroides '' Sub Products Mesenteroides IF03426, Leuconostoc ci trovorun NRIC1089 ⁇ Streptococcus faecal isto IF01296 'Streptococcus faecium NBIC1145 and ATCC1943 Streptococcus. S.
  • Bodice (Ambrosiozyma platypodis) IF0147K Acres roascus j avanensis (Arthroascus j avanensis) IF01848, Botryoassus synnaedendrus IF01604, Clavispora lusitanias IF01019, Debaryomyces hanse-nii IF00083, Pomyces starkeyi IF01289, Roderomys esborés esborés esborés * serobus * Mechinikobia ⁇ Biksubidata (Metschnikowia bicuspidata) IF01408, Geotricum.
  • Candidum (Geotrichuw candidum) IF0460K Kluyverorayces lactis IF01903, Cryptococcus neoforinans (Cryptococcus neoforinans) IAM4788.
  • microorganisms that can produce (S) —2—hydroxy-4 fudylic acid from 2-oxo-14-phenyl drunic acid include Pediococcus pentosaceus (Pediococcus pentosaceus). ) IF0389U Lactobacillus plantarum IF03070, Streptococcus agalactiae NRIC1137 and ATCC13813, Streptococcus * Lactobacillus lactis (Streptococ) Brevibacterium ammoniagenes IAM164U Or, Corynebacterium daletamicum (CorynebacteriuDiglutamicuiii) ATCC13032 and the like can be mentioned.
  • any of these microorganisms can be suitably used as a wild-type strain, a mutant strain, or a recombinant strain derived by a genetic technique such as cell fusion or genetic engineering.
  • microorganisms with an IF0 number are described in List of Cultures, 8th edition, volume 1 (1988), published by Imperial Research Institute (IF0), and can be obtained from the IF0.
  • Microorganisms with AHU numbers are described in Catalog of Cultures, 4th edition (1987), published by the Japan Federation of Microbial Strains (JFGC), and are available from the Faculty of Agriculture, Hokkaido University.
  • Microorganisms with ATCC numbers are American Type
  • ATCC Culture Collection
  • NODAI No. 1 published by Tokyo University of Agriculture and can be obtained from Tokyo University of Agriculture.
  • Microorganisms with IAM numbers can be obtained from the Institute of Applied Microbiology, The University of Tokyo.
  • the medium for culturing the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as the microorganism can grow.
  • ⁇ as a carbon source, any of the above microorganisms can be used, and specifically, sugars such as glucose, fructose, sucrose, dextrin, sorbitol, ethanol, and glycerol Alcohols such as bitumen, organic acids such as fumaric acid, citric acid, acetic acid, propionic acid and the like Salts, hydrocarbons such as baraffin, and the like, and mixtures thereof can be used.
  • the nitrogen source examples include ammonium salts of inorganic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate, ammonium salts of organic acids such as ammonium ammonium fumarate and ammonium citrate, meat extract, yeast extract, and corn steep liquor.
  • inorganic organic nitrogen compounds such as casein hydrolyzate and urea, or a mixture thereof can be used.
  • nutrients used in ordinary culture such as inorganic salts, trace metal salts, and vitamins, can be appropriately mixed and used. If necessary, a factor that promotes the growth of the microorganism, a factor that enhances the ability to produce the target compound of the present invention, or a substance that is effective in maintaining the pH of the medium can be added.
  • the medium pH is 3.0 to 9.5, preferably 4 to 8
  • the culture temperature is 20 to 45, preferably 25 to 37
  • the microorganism is anaerobically or aerobically. Incubate for 5 to 120 hours, preferably 12 to 72 hours, under conditions suitable for the growth of the yeast.
  • the method of reduction reaction is to use the culture solution as it is, to separate the cells by centrifugation, etc., and to wash the cells as they are, or to wash them, and then resuspend them in buffer solution, water, etc.
  • a carbon source such as sucrose or sucrose as an energy source.
  • the cells may be living cells, or may be cells that have been subjected to treatments such as crushed cells, aceton treatment, and dried oak.
  • these cells or the treated cells are, for example, It can also be used by immobilizing it by a known method such as a clear gel method, a polysaccharide polysaccharide gel method (such as a carrageenan gel method), an alginate gel method, and an agar gel method. Further, an enzyme purified and obtained from a treated product of the cells by a combination of known methods can also be used.
  • a known method such as a clear gel method, a polysaccharide polysaccharide gel method (such as a carrageenan gel method), an alginate gel method, and an agar gel method.
  • an enzyme purified and obtained from a treated product of the cells by a combination of known methods can also be used.
  • 2-Oxo 4-fluorofuric acid as it is, or dissolved in water, dissolved in an organic solvent that does not affect the reaction, or dispersed in a surfactant, etc., from the beginning of the reaction It may be added all at once or dividedly.
  • 2-oxo-4-phenylbutyric acid can be used as various salts such as an ammonium salt, a sodium salt, a calcium salt, and a potassium salt.
  • the reaction is carried out at a pH of 3 to 9, preferably at a pH of 5 to 8 and at a temperature of 10 to 60 (preferably, in a range of 20 to 40, 1 to: about 20 hours, under stirring or static.
  • concentration of the substrate used is not particularly limited, but is preferably about 0.1 to 10%.
  • optically active 2-hydroxy-4 monohydric acid produced by the reaction can be collected directly or from the reaction solution by extracting the cells, extracting with an organic solvent, and using ordinary purification methods such as column chromatography and recrystallization. Obtained easily.
  • the pair configuration and optical purity of the reaction product were determined by extracting the reaction product with ethyl acetate, and then converting the product to ethyl ester by a conventional method.
  • High-performance liquid chromatograph using a chemical separation ram columnumn: Chiral Cell 0B manufactured by Daicel Chemical Industries, 4.6 mIDx250 ⁇ , solvent: n-hexane: 2-propanol (19: 1 1 ⁇ ), flow rate: 0.5 min) , Detection: 254 nm).
  • the cells were separated by centrifugation and washed with physiological saline to obtain live cells.
  • Example 3 The method described in Example 1 is exactly the same except that calcium carbonate is removed from the medium and the pH of the medium is adjusted to 7, and the culture is performed by reciprocating shaking in a 500 mi Sakaro flask. Experiments were performed on the microorganisms listed in Table 3 by various methods.
  • Example 1 The medium used in Example 1 was inoculated with Leuconost's Munk, Centenroides, Subs. Seeds. Dextranicum I F03349 in a 5-pound jar fermenter containing 2 £, and stirred at 30 ° C. For 30 hours.
  • the cells were collected by centrifugation and washed with 1 £ of water. After this, the cells were suspended in 400 mi of water, placed in a 2-pound Erlenmeyer flask, and 10% aqueous solution of 2-oxo-14-funylbutyric acid (adjusted to pH 7 by using caustic) 50 ae, glucose 40 g, calcium carbonate 4 g was added and reacted at 30 • C with stirring for 72 hours.
  • 2-oxo-14-funylbutyric acid adjusted to pH 7 by using caustic
  • Example 3 5 £ jar fermenter containing 2 £ of medium used in Example 3 was inoculated with Wickella Mimella Domerky IF01857, and the mixture was cultured at 30 rpm with stirring at 400 rpra. Aeration rate I vvm for 30 hours.
  • the cells were collected by centrifugation and washed with 1 £ of water. After this, suspend the cells in 200 ml of water, place in a 1-p Erlenmeyer flask, and add a 10% aqueous solution of 2-oxo-4-phenyl nitric acid (adjusted to pH 7 with a scalpel). 20 g of recose was added, and the mixture was stirred at 24 hours for 24 hours.
  • Example 6 After completion of the reaction, the mixture was treated in the same manner as in Example 4 to obtain 1.5 g of crude crystals of the produced (B) -2-hydroxy-4-vinyl diacid. When this was reconstituted with toluene, 1.2 g of the desired crystal of (B) -2-hydroxy-4-phenyl-kilic acid (60% yield, optical purity 99% e.e.) was obtained.
  • Example 6
  • Flavobacterium suaveorens IF03752 was inoculated into a 5-pound jar fermenter containing 2 £ of the medium used in Example 3, and cultured at 30 • C with stirring at 400 rpm and an aeration rate of I vvm for 30 hours.
  • the cells were collected by centrifugation and washed with 1 £ of water. Thereafter, the cells were suspended in 400 ai of water, placed in a 2-pound Erlenmeyer flask, and 10% aqueous solution of 2-keto-4 monophenylenoic acid (adjusted to pH 7 with Kasakari) 50 ai and 40 g of glucose were added. The mixture was added and reacted at 30 ° C with stirring for 72 hours.
  • Streptococcus ⁇ agalactia IF01137 was inoculated in a 5-pound jar fermenter containing 2 £ of the medium used in Example 1, and the mixture was cultured at 30 rpm with a lOOrpra for 30 hours.
  • the cells were collected by centrifugation and washed with 1 £ of water. After this, suspend the cells in 200 mi of water, place in a 1-p Erlenmeyer flask, and add a 10% aqueous solution of 2-oxo-l-vinyl dulphonic acid (adjusted to pH 7 with a calyx) 25 m £, 20 g glucose Then, 2 g of calcium carbonate was added, and the mixture was reacted with stirring for 24 hours.
  • the method for producing optically active 2—hydroxy-4—phenyl drank acid by the asymmetric reduction method using the microorganism of the present invention can easily convert optically active 2—hydroxy 4-phenyl drank acid with high optical purity. It enables production, and is extremely advantageous as an industrial production method.
  • Lactobacillus brevis ⁇ 73 (Lactobacillus brevis) NRIC1037 Lactobacillus bulgaricus 100 (Lactobacillus xylosus) NRIC1074 Lactobacillus viridescensNRIC1074 Lactobacillus xylosus Table 1 continued
  • Saccharomycopsis fibrigera 22 100 (Saccharomycopsis f ibuligera) IF00103 Saccharomycopsis lipolytics 18 82 (Saccharomycopsis lipolytics) IF01550 Saccharomyces nojanus 13 53 15 46 (Saccharomyces Vietnamese) IF01894 Saccharomyces uvarum 12 34 (Saccharomyces uvarum) IF00565 Saccharomyces chevalieri) 10R 24 (Saccharomyces chevalieri) IF00222 Rhodtorla guz nis 19 100 100 (Candida humicola) IF00760 Candida parapsilosis 16 92 (Candida parapsilosis) IF01396 Candida rugosa 7 31 (Candida rugosa) IF00750 Torulaspora delbruekii 16 00 (Torulaspora delbruekii
  • Kluyverorayces lactis 11 100 (Kluyverorayces lactis) IF01903
  • Cryptococcus neoformance 30 100 (Cryptococcus neof ormans)
  • IAM4788 Trigonopsis variabilis 17 R 100 (Trigonopsis variabilis) IF00755 Table 2 continued
  • Serratia marcescens R 94 (Serratia raarcescens) IAM12143 Staphylococcus aureus 100 (Stapylococcus aureus) IF03060 Mycobacterium, smegmatis 100 (Mycobacterium smegmatis) IF03153 ⁇ Testaceum 100 (Aureobacterium testaceum) IF012675
  • Flavopacterium suaveolens 100 (Flavobacterium suaveolens) IF03752 Salmonella typhimurium R 100 (Salmonella typhimuriura) IF012529
  • Microorganisms (%) Agrobacterium radionecta 13 100 (flgrobacterium radiobacter) IF012664 Acetobacter bacteria Luba-1 19 ⁇ 100 (Protaminobacter ruber) IAM9081 Pseudomonas aureofaciens 11 100 (Pseudomonas aureofaciens) IF03522 Vibrio anguillarum 10 20 (Vibrio anguillarum) IF012710 Daltamicum 24 10 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032

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Description

明 細 書
光学活性 2 —ヒ ドロキシー 4一フエニル酩酸の製造法
(産業上の利用分野）
本発明は光学活性 2 —ヒ ドロキシー 4一フユニル酴酸の製造方 法に関する。 更に詳しく は、 2—ォキソ一 4一フエニル酪酸を（R) 一 2—ヒ ドロキシ一 4一フエニル酪酸、 或いは（S) _ 2—ヒ ドロ キシー 4一フユニル酪酸に不斉的に還元する能力を有する微生物、 或いはその処理物を 2—ォキソ一 4 ーフヱニル酪酸に作用させ、 生成する（R) — 2 —ヒ ドロキシ一 4 ーフヱニル酪酸、 或いは（S) 一 2 —ヒ ドロキシー 4一フヱニル酴酸を採取することを特徴とす る光学活性 2 —ヒ ドロキシ— 4一フユニル酪酸の製造方法に閼す る。
光学活性 2 —ヒ ドロキシー 4 —フユニル酪酸は種々の医薬品例 えば、 高血圧症治療薬等の重要合成中間体である。
(従来技術）
¾来、 光学活性 2—ヒ 'ドロキシー 4一フ ニル酪酸を製造する 方法としては、 ラセミの 2 —ヒ ドロキシ一 4 ーフヱ二ル酩酸を ί ーメ ン トールとのエステルをつく り光学分割する方法（D.Biquard, Ann. de.Chimie., vol.20, 146(1933))及びべンジルマグネシゥムク 口リ ドと光学活性ダリ シ ド酸より化学合成する方法 （特開昭 62— 212329) 等が知られているが、 光学分割法は 'ーメ ン トールが高 価であること、 化学合成法の場合は光学活性グリ シ ド酸の原料で ある光学活性なセリ ンが工業的 ^高価であること等の問題点を有 している。
2一ォキソカルボン酸を不斉還元し光学活性な 2 —ヒ ドロキシ カルボン酸を生成しうる微生物酵素に関する報告 （特開昭 60— 12975 号公報、 特公昭 61— 11591 号公報、 特開昭 62 - 100286号公 報、 特開昭 63— 32480 号公報、 特開昭 63— 32493 号公報） がある、 これらの中には 2—ォキソ一 4一フエニル酪酸から光学活性な 2 ーヒ ドロキシー 4一フユ二ル翳酸を得る方法は記載されていない。 また、 微生物を用い 2—ォキソ一 4一フユニル酪酸から光学活性 な 2—ヒ ドロキシー 4一フユ二ル酴酸を得る方法は知られていな い。
(本発明の開示）
本発明者らは簡便な方法で、 かつ光学純度の高い光学活性 2 — ヒ ドロキシー 4 ーフ 二ル酴酸を得る方法として微生物による不 斉還元方法に着目しこの目的に適した微生物を検索した結果、 ラ ク トノヾチルス（Lactobacillus)属、 ロイコノ ス ト ツ ク (Leuconos toe) 属、 ス ト レフ'トコ ッカス（Streptococcus) 属、 スポロラク トノヾチ ルス (Sporolactobacillus) ¾^ ぺテ ィォコ 'ンカス (Pediococcus) 属、 サッカロ ミコプシス（Saccharoraycopsis)属、 サッカ σ ミセス (Saccharorayces) 属、 ロ ド 卜ルラ（Rhodotolura) 属、 キャ ンディ ダ（Candida) 属、 トルラスボラ（Torulaspora) 属、 スボリディ ォ ポラス（Sporidiobolus) 属、 アムブロシォジマ（Arabrosiozyma)属、 ァルスロァスカス（Arthroascus) 属、 ボッリオァスカス（Botryo- ascus)属、 クラビスボラ（Clavispora)属、 デバリオマイセス（De- baryomyces) 属、 リ ポマイ セス（Li pomyces) 属、 ロデロマイ セス (Lodderomyces)属、 メ チニコビア（Metschnikowia) 属、 ジォ 卜 カム (Geotrichum)属、 クノレイ べロマイ セス (Kluyveromyces) 属、 ク リ プ トコ ッカス（Cryptococcus)属、 ト リ ゴノ プシス（Trigono- psis) 属、 ウ イケラ ミア（Wickerhamia) 属、 ウイケラ ミエラ（Wi- ckerhamiel la) 属、 シソ サ 'ンカロマイ セス (Schzosacc.haromyces) 属、 ロ ドスポリディ ウム（Bhodosporidium)属、 ステファ ノ ァスカΆ - (Stephanoascus) 属ヽ ノヽンセヌ ラ（Hansenula) 属、 ァ夕 α ΐノヾ クタ一（Achromobacter) 属、 バチルス（Baci 1 lus)属、 ェシェ リ シ 7 (Escherichia) 属、 ミ ク ロコ ッカス（Micrococcus) 属、 プロテ ウス（Proteus) 属、 セラチア（Serratia)属、 スタフイ ロコ ッカス (Staphylococcus)属、 ミ コノヾクテリ ゥム（Mycobac ter i um) 属、 ブ レビバクテリ ゥム（Brevibacterium)属、 ォウ レォバクテリ ゥム (Aureobacterium)属、 フラボノヾクテリ ゥム（Flavobacterium)属、 サルモネラ（Salmonella)属、 エルピュア（Erwinia) 属、 ァグロバ クテリ ゥム（Agrobacterium) 属、 ァセ ト ノヾクタ一（Acetobacter) 属、 ノヾラ：3 ッカス（Paracoccus) 、 フ · α夕 ミノノヾク夕一 （Protami— nobacter) 属、 シユー ドモナス（Pseudomonas) 属、 或いはビブリ ォ（Vibrio)属に属する微生物が 2 —ォキソ一 4 一フヱニル酴酸を 不斉還元し（R) — 2 —ヒ ドロキシー 4 ーフ 二ル酴酸を生成する こと及びべディォコ ッカス（Pediococcus) 属、 ラク トバチルス (Lactobacillus) 属、 ス 卜 レプトコ 'ンカス（S trep tococcus) 属、 ブレビパクテリ ゥム（Brevibacterium)属、 或いはコ リ ネバクテリ ゥム (Corynebacterium) 属に属する微生物が 2 —ォキソ— 4ーフ ェニル酪酸を不斉還元し（S) — 2 —ヒ ドロキシ— 4 ーフヱニル酷 酸を生成することを見出だし、 本発明を完成したものである。
本発明に使用する微生物としては、 ラク トバチルス（Lactobacillus) 属、 ロイ コノ ス ト ック（Leueonostoc) 属、 ス トレブ トコ 'ン カス（Streptococcus) 属、 スポロラク 卜ノヾチルス（Sporolactoba - cillus) 属、 ぺディォコ 'ンカス (Pediococcus) 属、 サッカ σ ミ コ プシス (Saccharoraycopsis) ¾、 サッカロ ミセス (Saccharomyces) 属、 ロ ド トルラ（Bhodotolura》 属、 キャ ンディダ（Candida) 属、 サッカ σマイセス（Saccharomyces) 属、 スポリディオボラス（Sp- oridiobolus)属、 ア ムブロシォジマ（Ambros iozyma)属、 ァゾレス口 ァスカス（Arthroascus) 属、 ボッリオァスカス（Botryoascus) 属、 ク ラビスボラ（Clavispora)属、 デノヾリオマイセス（Debaryomyces) 属、 リポマイ セス（Lipomyces) 属、 ロデロマイ セス（Lodderomyces) 属、 メチニコビア（Metschnikowia) 属、 ジォ ト リカム（Geotrichum) 属、 クルイ べロマイ セス（Kluyverofflyces) 属、 ク リブ トコ ッカス (Cryptococcus)属、 ト 'J ゴノ プシス（Tr igonops is) 属、 ウ イケラ ミア（Wickerhamia) 属、 ウイケラ ミエラ（Wickerhamiel la)属、 シ ゾサッカロマイ セス（Schizosaccharomyces) 属、 ロ ドスボリディ ゥム (Rhodosporidiuro) > ステファノァスカス (Stephanoascus) 属、 ノヽンセヌラ（Hansenula) JR、 ァク αモ ノヾク夕一（Achromobact er) 属、 ノヾチノレス（Bacillus)属、 工シエ リ シァ（Escherichia) 属、 ミ ク ロコ ッカス（Micrococcus) 属、 プロテウス（Proteus) 属、 セ ラチア（Serratia)属、 スタフイ ロコ ッカス（Staphylococcus)属、 ミ コノ、'クテリ ゥム（Mycobacterium) 属、 ブレビバクテリ ウム（Br- evibacterium) 属、 ォウ レオノヾクテ リ ゥム（Aureobac ter i um)属、 フラボバクテリ ゥム（FlavobacteriuRi)属、 サルモネラ（Salmonella) 厲、 ェルビニァ（Erwinia)属、 ァグロノ ク テ リ ゥム（Agrobacterium) Jg、 ァセ 卜ノヾク夕一 （Acetobacter) J¾、 ノヽ ·ラコ 'ン カス（Paracoccus) 属、 プロタ ミノパクター（Protaminobacter) 属、 シユー ドモナス (Pseudomonas) 属、 或いはビブリオ（Vi brio)属に属する微生物で 2—ケ トー 4 ーフュニル酪酸を不斉還元し（R) — 2 —ヒ ドロキシ 一 一フユニル酩酸を生成しうる能力を有する微生物、 或いはべ ディォコ ッカス（Pediococcus)属、 ラク トノヾチルス（Lactobaci 1 lus) 属、 ス ト レプ トコ 'ンカス（Streptococcus) 属、 ブレビノ、,クテリ ウ ム（Brevibacterium)属、 或いはコ ワ ネノヾクテひ ゥム (Corynebac te- rium) 属に属する微生物で 2—ォキソ— 4 ーフヱ二ル酴酸を不斉 還元し（S) — 2—ヒ ドロキシー 4 ーフヱ二ル酩酸を生成しう る能 力を有する微生物であればいずれも使用可能である。
具体的には 2—ォキソ一 4 ーフヱニル酪酸から（R) — 2 —ヒ ド 口キシー 4 ーフュニル酩酸を生成しう る微生物としてはラク トノヽ' チノレス · ァシ ドフィルス (Lactobacillus acidophi lus) NRIC1027 及び IF03831 、 ラタ 卜 ノヽ *チ レス · カゼィ （Lactobacillus casei) NRIC1044及び ATCC25598 、 ラク トバチルス ' カゼィ ' サブスビー ンース ♦ ラムノ サス（ actobaci 1 lus casei subsp. rhannosus) IF03425 、 ラク トパチルス · カゼィ · サブスビーシーズ · カゼィ (Lactobacillus casei subsp.casei) IF012004、 ラク 卜 ノヾチ レス - デルブルエ 'ンキー（Lactobacillus delbruecki i) AHU1056. ラク ト ノヾチゾレス · ブレビス（Lactobacillus brevis) NRIC1037及び ATCC 4006、 ラク 卜ノヾチ レス · ブクレガ カス（Lactobacillus bulgaricus) NBIC1041及び IAM1120 、 ラク トバチルス 。 フラク トサス（Lactobacillus fructosus)IF03516、 ラク 卜ノヾチルス · ラクチス（Lactobacillus lactis〉NRIC1061及び ATCC12315 、 ラク トバチルス · キシ ロサス（Lactobacillus xylosus) NRIC107 及び ATCC15577 、 ラ ク 卜ノヾチルス - ライ ヒマンニー aactobacillus leichmanni i) AHU 1681、 ラク トバチルス · ビリデ 'ヌセンス（Lactobacillus viri- descens)NRIC1073及び ATCC12706 、 ロイ コノ ス ト ック * デキス ト ラニカム (Leuconostoc dextranicum) AHU1080. ロイ コノ ス 卜 'ンク - デキス 卜ラニカム（Leuconostoc dextranicum) ATCC17072 、 ロイ コノ ス ト ,ンク * メ センテロイテス (Leuconostoc mesenteroides) AHU1067 、 ロイ コノ ス ト ツク . メ センテ αイデス * サブスビーシ 一ズ * ァヤス 卜 フ ニカム (Leuconostoc mesenteroides subsp. dext- tranicun) IF03349、 ロイ コノ ス ト ツク 《 メ センテロイデス ' サブ 一ン一ス · メセンテロィァス (Leuconos toe mesnteroides subsp. mesenteroides) IF03426 、 ロイ コノ ス ト ツク 《 シ ト ロボラ ム (Leuconostoc ci trovorun) NRIC1089^ ス 卜 レブ 卜コ ッカス · 7 ェカ リ ス（Streptococcus faecal is) IF01296 ス ト レプ トコ 'ンカ ス - フエシゥム（Streptococcus f aecium) NBIC1145及び ATCC1943 ス 卜 レブ 卜コ ツカス 。 スビーシース '（Streptococcus sp.) IF03427. ス 卜 レブ 卜コ ッカス * スビーシーズ（Streptococcus sp.) IF03535- ス 卜 レプ 卜コ 'ンカス 《 ラクチス (Streptococcus lactis) AHU1089 - ス ト レブ トコ ッカス · ウベリ ス (Streptococcus uberis) NRIC1153 及び ATCC19436、 スポロラク トバチルス · ィ ヌ リ ヌス（Sporolacto- bacillus inul inus) NBIC1133及び ATCC15538 、 ぺディォコ ツカス ァシディ ラクチシ（Pediococcus acidi lactici) NRIC1102及び ATCC 8081、 サッカロ ミ コプシス · フイ ブリゲラ (Saccharomycopsis f ibuligera) IF00103、 サッカロ ミ コプシス · リ ボリ ティ カ（Saccharomycopsis lipolytics) IF01550、 サッカ σ ミセス · ノ ャヌス (Saccharomyces bayanus) IF00262、 サ ッカ ロ ミセス♦ ククレイ ベリ (Saccharomyces kluyveri) IF01894 、 サ ッ カ ロ ミ セ ス · ウ ノヾノレム (Saccharomyces uvarun) IF00565 、 サッカ ロ ミセス ♦ チェノヾ リ エ ひ (Saccharomyces chevalieri) IF00222 、 ロ ド 卜ルラ · グルチ二 ス（Rhodotolura glutinis) AHU3942 、 キャ ンディダ . フ ミ コーラ humicola) IF00760 、 キャ ンディダ · ノヽ ·ラブシ口シス (Candida paraps i los is) IF01396、 キャ ンディダ · ノレゴサ (Candida rugosa) IFO0750、 ト レラス； ラ · デゾレブクレツキー（Torulaspo- ra delbruekii) IF00955 、 スポリ ディオボラス · ジョ ンソニー (Sporidiobolus johnaonii) IF06903. アムブロ シォジマ - シカ 卜 コサ（Ambrosiozyiaa cicatricosa) IF01846 、 アムブロ シォジマ ' プラチ 'ボディ ス （Ambrosiozyma platypodis) IF0147K ア クレス ロ ァ スカス · ジヤ ノヾネンシス（Arthroascus j avanensis) IF01848 、 ポ チォァスカス · シンナェデン ト'ラス (Botryoassus synnaedendrus) IF01604 、 ク ラビスボラ · /レシタニアス （Clavispora lusitanias) IF01019 、 デノヾリ才マイ セス · ノヽンセニー（Debaryomyces hanse- nii) IF00083 、 ポマイ セス · スターケィー（Upomycesstarkeyi) IF01289 、 ロデロマイ セス * ェロ ンギスボラス (Lodderomyces elongisporus) IF01676. メチニコビア 《 ビクスビデータ（Metsch- nikowia bicuspidata) IF01408 、 ジォ ト リ カム 。 キャ ンディダム (Geotrichuw candidum) IF0460K ク レイ べロマイ セス · ラクチス (Kluyverorayces lactis) IF01903 、 ク リ プ トコ ッカス - ネオフ ォ 一マンス（Cryptococcus neoforinans) IAM4788. ト リ ゴノ プシス * パリ アビひ ス (Trigonopsis variabilis) IF00755 、 ウ イケラ ミア ' フルォレ ツセンス（Wickerhamia f luorescens) IF01116 ウ イケラ ミエラ · ドメ スレクイ一（«ickerharaiella domercqui i) IF01857、 シ ゾサ 'ン カロマィセス · ォク 卜スポラス (SchizosaccharoBiyces octosporus) IF00353、 π トース JJ5リ ディ ウム · ディ； ノ ッム (Bho- dosporidium diobovatum) IF01829 ステファノ ァスカス ♦ シフエ V― (Stephanoascus cif errii) IF01854 、 ノヽンセヌラ ♦ フア ビィ ァ―― (Hansenula fabianii) IF01253 、 ァク αモノ クター 《 ぺス チファー（Achromobacter pes ti f er) ATCC23584 、 ノヾチクレス - ひケ ニフォルミス（Bacillus 1 ichenif orais) IF012200、 ェシエ リ シァ • コ V (Escherichia coli) IF03544 、 ミ ク ロコ ッカス 。 ルテウス (Micrococcus luteus) IF012992、 プ αテウス - ブルガワ ス（Proteus vulgaris) IF03167 、 セラチア * マルセ 'ンセンス (Serratia marcesceas) IAM12143 、 スタフ イ ロコ 'ンカス * ァウ レウス (Sta- phylococcus aureus) IF03060、 ミ コノヾクテリ ゥム · スメ グマチス (Mycobacterium smegmatis) IF03153、 ブレビノ クテひ ゥム · ィ才 ディ ナム（Brevibacterium iodinura) IF03558 、 ォウ レォバクテリ ゥム · テスタセゥム ureobacterium testaceum) IF012675. フラ ボノヾクテひ ゥム · スゥアベ才レンス (Flavobacterium suaveolens) IF03752 、 サルモネラ ' ティ フィ ム リ ウム（Salmonella typhiniu- rium) IF012529 、 エル^:ニァ · カロ トボラ（Erwinia carotovora) IF03830 、 ァグロバタテリ ゥム * ラディ ォバクター（Agro-bacterium radiobacter) IF012664 、 ァセ 卜 ノヾクタ一 · ノヽ ·ステゥ ひ ァヌ ス（Acetobacter pas teuri anus) ATCC10245 、 ノヾラコ 'ンカス · デニ ト リ フイ カ ンス（Paracoecus den i trifi cans) IF012442^ プロタ ミ ノ ノ クタ一 · レノ、一（Protawinobacter ruber) IAM908U シ ュ ー ト' モナス · オーレオファ シエンス (Pseudofflonas aureof aciens) IFO 3522、 或いはビブリオ * アングイ ラルム（Vibrio angui 1 larum) IFO 12710 等を挙げることができる。
また、 2—ォキソ一 4一フエニル酩酸から（S) — 2 —ヒ ドロキ シー 4一フユ二ル酸酸を生成しう る微生物としては、 ぺディ ォコ 'ンカス · ペン 卜サセウス（Pediococcus pentosaceus) IF0389U ラ ク 卜ノヽ'チゾレ · フ*ラ ンタラム (Lactobacillus plantarum) IF03070、 ス ト レプ トコ ッカス · ァガラクアイ ァ (Streptococcus agalactiae) NRIC1137及び ATCC13813 、 ス ト レブ トコ ッカス * ラクチス（Streptococcus lactis)NRIC1149 及び ATCC19435 、 ブレビノ クテワ ウ ム ♦ アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes) IAM164U 或いはコ リ ネノ クテリ ゥム · ダ レタ ミ カム（CorynebacteriuDi glu- tamicuiii)ATCC13032 等を挙げることができる。
これらの微生物は、 野生株、 変異株、 または、 細胞融合もしく は遺伝子操作法などの遺伝的手法により誘導される組み替え株等、 いずれの株でも好適に用いることができる。
尚、 IF0 番号の付ざれた微生物は、 勅醱酵研究所（IF0) 発行の List of Cultures. 第 8版、 第 1卷（1988)に記載されており、 該 IF0 から入手することができる。 AHU 番号の付された微生物は、 日本微生物株保存連盟（JFGC)発行の Catalogue of Cultures 、 第 4-版 (1987)に記載されており、 北海道大学農学部から入手するこ とができる。 ATCC番号の付された微生物は、 American Type
Culture Collection(ATCC)発行の Catalogue of Bacteria Phages rDNA Vectors. 第 16版（1985)に記載されており該 ATCCから入手す ることができる。 番号の付された微生物は、 東京農業大学発 行の Culture Collection of NODAI No.1 (1985)に記載されており 東京農業大学から入手することができる。 IAM 番号の付された微 生物は、 東京大学応用微生物学研究所から入手することができる。
本発明に用いる微生物を培養する為の培地はその微生物が増殖 し得るものであれば特に制限はない。 例えば、 炭素源として ^：、 上記微生物の利用可能であればいずれも使用でき、 具体的には、 グルコース、 フルク トース、 シュクロース、 デキス ト リ ン等の糖 類、 ソルビ トール、 エタノール、 グリ セ一口ル等のアルコール類、 フマール酸、 ク ェ ン酸、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸類及びそ の塩類、 バラフィ ン等の炭化水素類等或いはこれらの混合物を使 用することができる。 窒素源としては例えば、 塩化アンモユウム、 硫酸アンモユウム、 リ ン酸アンモニゥム等の無機酸のアンモユウ ム塩、 フマル酸アンモユウム、 クェン酸アンモユウム等の有機酸 のアンモニゥム塩、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスティープリ カー、 カゼイ ン加水分解物、 尿素等の無機有機舍窒素化合物、 あ るいはこれらの混合物を使用することができる。 他に無機塩、 微 量金属塩、 ビタ ミ ン類等、 通常の培養に用いられる栄養源を適宜、 混合して用いることができる。 また必要に応じて微生物の増殖を 促進する因子、 本発明の目的化合物の生成能力を高める因子、 あ るいは培地の pH保持に有効な物質も添加できる。
培養方法としては培地 pHは 3. 0 〜9. 5 、 好まし く は、 4〜 8、 培養温度は 20〜45て、 好ましく は 25〜37てで、 嫌気的或いは好気 的に、 その微生物の生育に適した条件下 5〜120 時間、 好ま し く は 12〜72時間程度培養する。
還元反応の方法としては培養液をそのまま用いる方法、 遠心分 離等により、 菌体を分離し、 これをそのまま、 或いは、 洗浄した 後、 緩街液、 水等に再懸濁したものに、 2 —ォキソ一 4 —フユ二 ル酴酸を添加し反応させる方法等がある。 この反応の際、 ダルコ ース、 シュクロース等の炭素源をエネルギー源として添加したほ うが良い場合もある。 また、 菌体は生菌体のままでも良いし、 菌 体破砕物、 ァセ ト ン処理、 澳結乾燥等の処理をほどこ したもので も良い。 また、 これらの菌体或いは、 菌体処理物を、 例えば、 ボ リァク リアミ ドゲル法、 舍硫多糖ゲル法 （カラギーナンゲル法等） 、 アルギン酸ゲル法、 寒天ゲル法等の公知の方法で固定化して用い ることもできる。 更に、 菌体処理物から、 公知の方法を組み合わ せて精製取得した酵素も使-用できる。
2 —ォキソー 4一フ 二ル酴酸はそのまま、 或いは、 水に溶解 し、 または反応に影響を与えないような有機溶媒に溶解したり、 界面活性剤等に分散させたり して、 反応始めから一括に或いは分 割して添加しても良い。 なお、 2—ォキソ一 4ーフヱニル酪酸は アンモユウム塩、 ナ トリ ウム塩、 カルシウム塩、 カリ ウム塩等の 各種の塩として用いることもできる。
反応は pH 3〜 9、 好ましく は pH 5〜 8の範囲で温度は 10〜60 · (：、 好ましく は、 20〜40ての範囲で、 1〜： ^20 時間程度、 撹拌下ある いは静置下で行う。 基質の使用濃度は特に制限されないが、 0. 1 〜10 %程度が好ましい。
反応によって生成した光学活性 2 —ヒ ドロキシー 4一フユニル 酴酸の採取は反応液から直 或いは菌体分離後、 有機溶媒で抽出 し、 カラムクロマ トグラフィー、 再結晶等の通常の精製方法を用 いれば容易に得られる。
(実施例）
以下、 本発明を具体的に実施例にて説明するが、 本発明はこれ らの実施例のみに限定されるものではない。
実施例における、 反応生成物の铯対配置及び光学純度は反応生 成物を酢酸ェチルで抽出した後常法によりェチルエステル化し光 学分割力ラムを用いた高速液体ク 口マ トグラフィ ー （カラム ： ダ ィセル化学工業製キラルセル 0B、 4.6 mIDx250麵、 溶媒 ： n —へ キサン ： 2 —プロパノール （19： 1νΖν)、 流速 ： 0.5 ノ分、 検 出 ： 254nm)により求めた。 また反応収率は逆相系のカラム （ヌク レオシル 10C18 、 4.0 咖 IDx250am) を用いた高速液体クロマ トグ ラフ ィ一 （溶媒 ： 40mMリ ン酸バッファー、 PH3.0 ァセ トニ ト リ ル = 4 ： 1、 流速 ： 1 mlノ分、 検出 ： 254nm)により求めた。
実施例 1
グルコース 2 %、 酵母エキス 0.5 %、 ペプ ト ン 0.5 %、 肉ェキ ス 0.5 %、 リ ン酸ニ力 リ ウム 0.2 %、 炭酸カルシゥム 1 %より成 る組成の培地 100 miを 500 mi容三角フラスコに入れ、 滅菌後、 表 1 に示す菌株を夫々植菌し 30'Cで 30時間面転振盪培養を行った。 培養終了後、 遠心分離により菌体を分離、 生理食塩水で 1回洗 浄し生菌体を得た。
100 mf容三角フラスコに蒸留水 7.5 n を入れ、 これに上記生菌 体を懸濁し、 グルコース 1,2 gを添加した。 30'Cで 10分間回転振 盪させた後、 4 % 2'—ォキソ一 4 ーフヱニル酪酸水溶液 （力セィ カ リ にて pH 7 に調整） 2.5 m と炭酸カルシウム 0.3 gを添加し 30 で 40時閽回転振盪反応させた。
反応終了後、 硫酸を加え PHを 1以下とした後、 生成した光学活 性 2—ヒ ドロキシー 4 ーフヱニル酪酸を齚酸ェチル 20m で抽出し た。 反応収率はこの酢酸ェチル層の一定量を減圧下脱溶剤し、 前 記の溶離液に溶解後、 逆相系力ラムを用いる高速液体ク ロマ トグ ラフィーにかけ生成した 2—ヒ ドロキシー 4 一フエ二ル酪酸を定 量して求めた。
また同様にこの醉酸ヱチル層の一定量を滅圧下脱溶剤した後、 常法によりェチルエステル化し、 光学分割力ラムを用いる高速液 体クロマ トグラフィーにかけ、 生成した 2 —ヒ ドロキシ一 4ーフ ユ ル酴酸の H対配置及び光学純度を求めた。
得られた結果を表 1 に示す。
実施例 2
ΪΜ培地 （酵母エキス 0。3 %、 麦芽エキス 0. 3 %、 ペプ ト ン 0.5 %、 グルコース 2 %、 pH6。0) 100 m£を 500 容坂ロフラスコに入 れ、 滅菌後、 表 2に示す菌株を夫々植菌し、 30てで 48時間振盪培 養をおこなった。
培養終了後、 遠心分離により菌体を分離、 生理食塩水で 1画洗 浄し、 生菌体を得た。
100 容三角フラスコに蒸留水 7。5 mi入れ、 これに上記生菌体 を懸濁し、 シユーク ロース 1.2 gを添加した。 30てで 10分間往復 振盪させた後、 4 % 2 —ォキソ一 4 一フユニル酪酸水溶液 （カセ ィ力リにて ρΗ Ίί に調整） 2. 5 «Iを添加し、 30 'Cで 20時間画転振盪 反応させた。
反応終了後、 実施例 1 と同様に処理し反応収率と铯対配置及び 光学純度を求めた。
得られた結果を表 2 に示す。
実施例 3 実施例 1 で述べた方法の内、 培地から炭酸カルシウムを除き培 地の pHを 7に調整したものを使用すること、 および、 培養を 500 mi容坂ロフラスコにて往復振盪で行う他は全く 同様な方法により 表 3に記載した微生物について実験を行った。
得られた結果を表 3に示す。
実施例 4
実施例 1 で用いた培地 2 £を舍む 5 £容ジャーファーメ ンター にロイ コノ ス ト 'ンク · メ センテロイデス · サブスビーシーズ . デ キス ト ラニカム I F03349 を植菌し、 30 'Cで撹拌 lOOrpmにて 30時間 培養した。
培養終了後、 遠心分離にて菌体を集め水 1 £にて洗浄した。 し かる後この菌体を水 400 miに懸濁し、 2 £容三角フラスコに入れ 10 % 2—ォキソ一 4 ーフュニル酪酸水溶液 （カセイ カ リ にて pH 7 に調整） 50ae、 グルコース 40 g、 炭酸カルシゥム 4 gを添加し 30 •Cで撹拌下 72時間反応させた。
• 反応終了後、 濃硫酸にて pHl . 5 にした後、 生成した（R) - 2 - ヒ ドロキシ一 4—フヱニル酴酸を 200 miの酢酸ェチルで 2回抽出 した。 酢酸ェチル層を無水芒硝で脱水した後、 滅圧下脱溶剤し、 粗結晶 4. 5 gを得た。 これを トルエンで再結すると、 目的の（R) 一 2 —ヒ ドロキシー 4 ーフ ニル酴酸の結晶 3. 6 g (収率 72 %、 光学純度 99 % e . e . ) が得られた。
実滷例 5
実施例 3で用いた培地 2 £を舍む 5 £容ジャーファーメ ンター にウイ ッケラ ミヱラ · ドメルキー IF01857 を植菌し、 30てで撹拌 400rpra. 通気量 I vvm にて 30時間培養した。
培養終了後、 遠心分離にて菌体を集め水 1 £にて洗浄した。 し かる後、 この菌体を水 200 に懸濁し、 1 £容三角フラスコに入 れ 10% 2 —ォキソ一 4ーフ ニル酴酸水溶液 （カセイ カ リにて pH 7に調整） 20W、 グ/レコース 20gを添加し 30てで撹拌下 24時閭反 応させた。
反応終了後、 実施例 4 と同様に処理し、 生成した（B) — 2 —ヒ ドロキシー 4ーフヱニル酴酸の粗結晶 1.5 gを得た。 これを トル ェンで再結すると、 目的の（B) — 2—ヒ ドロキシー 4一フエニル 黯酸の結晶 1.2 g (収率 60%、 光学純度 99%e.e.) が得られた。 実施例 6
実施例 3で用いた培地 2 £を舍む 5 £容ジャーファーメ ンター にフラボパクテリ ゥム · スゥアベオレンス IF03752 を植菌し、 30 •Cで撹拌 400rpm、 通気量 I vvm にて 30時間培養した。
培養終了後、 遠心分難にて菌体を集め、 水 1 £にて洗浄した。 しかる後この菌体を水 400 aiに懸灞し、 2 £容三角フラスコに入 れ 10% 2—ケ トー 4一フエ二ル酴酸水溶液 （カセイカリにて pH 7 に調整） 50ai、 グルコース 40gを添加し 30ΐで撹拌下 72時間反応 させた。
反応終了後、 実施例 4 と同様に処理し、 生成した（R) — 2 —ヒ ドロキシ一 4ーフヱニル酴酸の粗結晶 2.3 gを得た。 これを トル ェンで再結すると、 目的の（U) — 2 —ヒ ドロキシー 4一フエニル 酪酸の結晶 1.8 g (収率 36%、 光学純度 99%e.e.) が得られた。 実施例 7
実施例 1 で用いた培地 2 £を舍む 5 £容ジャーファーメ ンター にス ト レプ トコ ッカス ♦ ァガラクティ ァ IF01137 を植菌し、 30て で撹拌 lOOrpraにて 30時間培養した。
培養終了後、 遠心分離にて菌体を集め水 1 £にて洗浄した。 し かる後この菌体を水 200 miに懸濁し、 1 £容三角フラスコに入れ 10% 2 ォキソ一 4 ーフヱ二ル酩酸水溶液 （カセイ カ リにて pH 7 に調整） 25m£、 グルコース 20 g、 炭酸カルシウム 2 gを添加し 30 てで撹拌下 24時間反応させた。
反応終了後、 実施例 4 と同様に処理し、 生成した（S) — 2—ヒ ドロキシー 4一フ ニル酹酸の粗結晶 1.4 gを得た。 これを トル ェンで再結すると、 目的の（S) — 2—ヒ ドロキシー 4 —フエニル 酩酸の結晶 1.1 g (収率 44%、 光学純度 98%e.e.) が得られた。
本発明の微生物を用いた不斉還元法による光学活性な 2 —ヒ ド 口キシー 4 —フ ニル酩酸の製造方法は光学純度の高い光学活性 2 —ヒ ドロキシー 4 ーフヱ二ル酩酸を簡便に製造できることを可 能にさせるものであり、 工業的製造方法として極めて有利である。
¾^¾»2—ヒドロ 率.キシ一 4—フエニゾレ 微 生 物 ( )
曜己置 »w
(%e.e.) ラクトバチルス 'ァシドフィルス R 30 (Lactobacil lus acidophi lus) NBIC1027 ラクトバチルス ·カゼィ β 81 (Lactobacillus casei)NRIC10 4 ラクトバチルス ·カゼィ サブスビーシーズ ·ラムノサス 45 (Lactobacillus casei subsp.rhamnosus) IF03 25 ラクトバチルス ·カゼィ ·サブスビーシ一ズ -カゼィ 100 (Lactobacillus casei subsp. casei) IF012004 ラクトンヾチルス ·デルブルエツキ一 R 56 (Lactobaci 1 lus delbruecki i) AHU1056
3.2433211 11191w 6 o o 431144911 A : :ί (
ラクトバチルス ·ブレビス β 73 (Lactobacillus brevis)NRIC1037 ラクトバチルス ·ブルガリカス 100 (Lactobaci 1 lus bulgaricus) NRIC1041 ラクトバチルス ·フラクトサス R 100 (Lactobacillus f ructosus) IF03516 ラクトバチルス ·ラクチス 56 (Lactobacillus lactis)NRIC1061 ラクトノチノレス ·キシロサス 70 (Lactobacillus xylosus)NRIC1074 ラクトバチルス ·ライヒマンニ一 100 (Lactobaci 1 lus leichmannii) AHU1681 ラクトノチルス ·ビリデッセンス 84 (Lactobacillus viridescens) NRIC1073 ロイコノストツク 'デキストラニカム 45 (Leuconostoc dextranicura) AHU1080 表 1 つ づ き
*¾¾2—ヒドロ 収率 一フエ二/レ 微 生 物 (%)
Figure imgf000021_0001
(%e.e.) ロイコノストック 'デキストラニカム 40 β 100 (Leuconostoc dextranicum) ATCC17072 ロイコノストツク ·メセンテロイデス 91 100 (Leuconos toe mesen tero i des) AHU1067 ロイコノストック ·メセンテロイデス · 95 100 サブスビーシース' 'デキストラニカム
(Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum) IF03349 ロイコノストック ·メセンテロイデス♦ 43 36 サブスビーシース' ·メセンテロィデス
(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides) IF03426 ロイコノスト 'ンク♦シトロボラム 65 (Leuconos toe c i trovorura) I C1089 ストレプトコッカス ·フエカリス 63 43 (Streptococcus faecal is) IF012964 ストレプトコッカス ·フエシゥム 11 49 (Streptococcus f aecium RIC1145 ストレプトコッカス ·スビーシーズ 39 71 (Streptococcus sp.) IF03427 ストレプトコッカス♦スビーシ一ズ 54 83 (Streptococcus sp.) IF03535 ストレプトコッカス ·ラクチス 47 21 (Streptococcus lactis)AHU1089 ストレプトコ'ンカス ·ウベリス 17 34 (Streptococcus uberis)腿 C1153 スポロラクトパ'チルス ·ィヌリヌス 17 91 (Sporolactobaci 1 lus inul inus) N IC1133 表 1 つ づ き
^ίδ¾2—ヒドロ 収率 キシー 4一フエニゾレ 微 生 物 (%)
Figure imgf000022_0001
(%e.e.) ぺディォコッカス ·ァシディラクチシ 17 73 (Pediococcus acidilactic細 IC1102 ぺディォコッカス ·ペントサセウス 13 70 (Pediococcus pentosaceus) IF03891 ラクトバチルス ·プランタラム 71 52 (Lactobacillus plantarum) IF03070 ストレプトコ yカス ·ァガラクティア 42 100 (Streptococcus agalactiae) KIC1137 ストレフ'トコッカス ·ラクチス 13 41 (Streptococcus lactis)NRIC1149
表 2
¾^S¾2—ヒドロ 収率 レ 微 生 物 (%)
Figure imgf000023_0001
(%e.e„) サッカロミコプシス ·フイブリゲラ 22 100 (Saccharomycopsis f ibuligera) IF00103 サッカロミコフ 'シス ·リポリティ力 18 82 (Saccharomycopsis lipolytics) IF01550 サ'ンカロミセス ·ノヾャヌス 13 53 (Saccharomyces bayanus) IF00262 サ'ンカロミセス ·クルイベリ 15 46 (Saccharomyces kluyveri) IF01894 サッカロミセス ·ウノヾノレム 12 34 (Saccharomyces uvarum) IF00565 サッカロミセス ·チェバ，)ェリ 10 R 24 (Saccharomyces chevalieri) IF00222 ロドトルラ ·グス ニス 19 100 (Rhodotolura glutinis)AHU3942 キャンディダ'フミコーラ 39 100 (Candida humicola) IF00760 キャンディダ ·パラプシ口シス 16 92 (Candida parapsilosis) IF01396 キャンディダ'ルゴサ 7 31 (Candida rugosa) IF00750 トルラスボラ ·デルブルツキ一 16 100 (Torulaspora delbruekii) IF00955 スポリディオボラス ·ジョンソニー 35 100 (Sporidiobolus j ohnsonii) IF06903 アムブロシォジマ ·シカトリコサ 15 100 (Ambrosiozyma cicatricosa) IF01846 表 2 つ づ き
»¾¾2—ヒドロ 収率 キシ一 4一フエ二レ 微 生 物 (%)
Figure imgf000024_0001
(%e.e.) アムブ口シォジマ ·プラチポデイス 13 100 (Arafarosiozyma platypodis) IF01471 ァレスロアスカス ·ジャパネンシス 14 100 (Arthroascus j avanensis) IF01848 ボチオアスカス ·シンナェデンドラス 16 R 100 (Botryoascus synnaedendrus) IF01604 クラビスボラ ·ルシタニアス 15 100 (Clavispora lusitanias) IF01019 デバ'リオマイセス ·ハンセニー 13 R 100 (Debaryomyces hanseni i) IF00083 リボマイセス ·スターケィー 30 100 (Lipomyces starkeyi) IF01289 ロデロマイセス *ェロンギスポラス 29 100 (Lodderomyces elongisporus) IF01676 メチニコビア ·ビクスビテ *ータ 17 100 (Metschnikowia bicuspidata) IF01408 ジォトリカム.ギヤンディダム 21 100 (Geotrichum candidum) IFO4601
クゾレイべロマイセス ·ラクチス 11 100 (Kluyverorayces lactis) IF01903 クリプトコッカス ·ネオフォーマンス 30 100 (Cryptococcus neof ormans) IAM4788 トリゴノプシス ·バリアビリス 17 R 100 (Trigonopsis variabilis) IF00755 ウイケラミア♦フル才レツセンス 16 100 ( ickerharaia fluorescens) IF01116 表 2 つ づ き
»»2—ヒドロ 収率 一フエ二ノレ 微 生 物 (%)
Figure imgf000025_0001
(%e.e.) ウイケラミエラ · ドメノレクイ一 51 100 (Wickerhamiel la domercquii) IF01857 シゾサッカロマイセス ·ォクトスポラス 15 100 (Schizosaccharomyces octosporus) IF00353 口ドスボリディゥム ·ディオボバツム 37 100 (Rhodosporidium diobovatum; IF01829 ステファノァスカス♦シフェリー 13 100 (Stephanoascus ciferrii) IF01854 ハンセヌラ ·フアビィァ — 13 100 (Hansenula fabianii) IF01253
表 3
»¾¾2—ヒドロ 収率 —フエ二ノレ 微 物 (%)
Figure imgf000026_0001
(%e.e.) ァクロモバクタ ；スチファ— 6 100
(Achroraobacter pestifer)ATCC23584 ノヾチルス ·リケニフォルミス 100 (Bacillus licheniforrais) IF012200 ェシエリシァ 'コリ 100 (Escherichia coli) IF03544 ミクロコッカス *ルテウス 100 (Micrococcus luteus) IF012992 プロテウス 'ブルガリス 89 (Proteus vulgaris) IF03167
43332111111 1209244033009 3
セラチア .マルセッセンス R 94 (Serratia raarcescens) IAM12143 スタフィロコッカス ·ァゥレウス 100 (Stapylococcus aureus) IF03060 ミコバクテリゥム、スメグマチス 100 (Mycobacterium smegmatis) IF03153 ブレビパクテリゥム ·ィオデイナム R 49 (Brevibacteriura iodi麵) IF03558 ォゥレオパクテリゥム ·テスタセゥム 100 (Aureobacterium testaceum) IF012675
フラボパクテリゥム ·スゥアベオレンス 100 (Flavobacterium suaveolens) IF03752 サルモネラ ·ティフィムリウム R 100 (Salmonella typhimuriura) IF012529
エルビニァ ·カロトボラ 19 R 100 (Erwinia carotovora) IF03830 表 3 つ づ き 収率
微 生 物 (%)
Figure imgf000027_0001
ァグロバクテリウム ·ラディオノ クタ一 13 100 (flgrobacterium radiobacter) IF012664 ァセトバクタ一 ·パステゥリアヌス 12 R 100 (Acetobacter pasteurianus)ATCC10245 バラコッカス ·デニトリフイカンス 21 R 100 (Paracoccus deni tri f icans) IF012442 プロタミノバクター ·ルバ一 19 β 100 (Protaminobacter ruber) IAM9081 シユードモナス♦オーレオファシエンス 11 100 (Pseudomonas aureofaciens) IF03522 ビブリオ ·アングイラルム 10 20 (Vibrio anguillarum) IF012710 ブレビパ'クテリウム ·アンモニアゲネス 23 49 (Brevibacterium ammoniagenes) IAM1641 コリネバクテリゥム ·ダルタミカム 24 10 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032

Claims

請 求 の 範 囲
(1) 2—ォキソ一 4一フエニル酪酸を（B) — 2—ヒ ドロキシ一 4 —フヱ二ル酷酸、 或いは（S) — 2 —ヒ ドロキシー 4一フエニル II酸に不斉的に還元する能力を有する微生物、 或いはその処理 物を 2—ォキソ一 4—フ ニル酪酸に作用させ、 生成する（8) — 2—ヒ ドロキシ一 4一フエニル酴酸、 或いは（S) — 2—ヒ ド 口キシ一 4一フ ニル酪酸を採取することを特徴とする光学活 性 2—ヒ ドロキシ 4 ーフュニル酴酸の製造法。
(2) (R) 一 2 —ヒ ドロキシ一 4一フ 二ル酴酸を生成する能力を 有する微生物が、 ラク トパチルス（Lactobacillus) 属、 ロイ コ ノ ス. ト ツク (Leuconostoc) 属、 ス ト レブ トコ ッカス (Streptococcus) 属、 スポロラク トノ、、チルス（Sporolactobacillus)属、 ぺディォコ ッカス（Pediococcus) 属、 サッカロ ミ コプシス（Sa- ccharomycops is) ¾、 サッカロ ミセス (Saccharomyces) 厲、 口 ド トルラ（Bhodotolura) 属、 キャ ンディダ（Candida) 属、 トル ラズボラ（Torulaspora) 属、 スポリディオボラス（Sporidiobo- lus)属、 アムブロシォジマ Umbrosiozyma)属、 ァルスロァスカ ス（Arthroascus) 属、 ボッ オアスカス（Bo tryoascus) 属、 ク ラビスボラ（Clavispora)属、 デノヾリ オマイ セス (Debaryorayces) 属、 リボマイ セス（Lipomyces) 属、 ロデロマイ セス（Lodderomy- ces)属、 メ チニコビア（Metschnikowia) 属、 ジォ ト リ カム（Ge- otrichum) 属、 クノレイ べ αマイ セス (Kluyveromyces) fe、 ク フに卜 コ 'ンカス (Cryptococcus) 卜 ひ ゴノ プシス (Trigonopsis) 属、 ウ イ ケ ラ ミ ア（Wickerhamia) 属、 ウ イ ケ ラ ミ エ ラ （Wicker- hamiel la) fe、 シソ サ 'ン カ ロマイ セス (Schizosaccharomyces) 属、 ロ ドスボリディ ウム（Rhodosporidium)属、 ステフ ァ ノ ァス カス（Stephanoascus) 属、 ノヽ ンセヌ ラ （Hansenula) 属、 ァク ロ モ ノヾクター（Achromobacter) 属、 ノヾチノレス（Baci 1 lus)属、 工シ エ リ シァ (Escherichia) fe、 ミ ク ロ コ ッカス (Micrococcus) ¾、 プロテウス（Proteus) 属、 セ ラチア（Serratia)属、 スタ フ イ ロ コ ッ カス（Staphylococcus)属、 ミ コノヾク テ リ ゥム (Mycobacterium) 属、 ブレビバク テ リ ウム（Brevibacterium)属、 ォウ レォバ ク テ リ ゥム（Aureobacterium)属、 フ ラボバク テ リ ゥム（Flavoba- cteriun 属、 サゾレモネラ（Salmonella)属、 エノレビ ァ（Erwinia) 属、 ァグロバタ テ リ ゥム（Agrobacterium) 属、 ァセ トバク タ一 (Acetobacter) 属、 パラ コ ッ カ ス（Paracoccus)厲、 プロタ ミ ノ パクター (Protaminobacter) ¾、 シュー ドモナス (Pseudomonas) 属、 或いはビブリォ（Vibrio)属に属する微生物群から選ばれた 微生物である請求項 1項記載の製造法。
(3) (S) 一 2 —ヒ ドロキシー 4 一フヱニル酩酸を生成する能力を 有する微生物がぺディォコ ッカス（Pediococcus) 属、 ラク トバ チノレス（Lactobacillus) 属、 ス 卜 レフ · 卜 コ ッ カス（Streptococcus)属、 ブレビノヾクテリ ゥム（Brevibacterium)属、 或 、 1ま：7 リ ネリバクテリ ゥム（Corynebacterium) 属に属する微生物群から
" 選ばれた微生物である請求項 1項記載の製造法。
(4) ラ ク トノ、'チノレス（Lactobacillus) 、 ロ イ コ ノ ス ト ッ ク （Leuco- nostoc) 、 ス ト レフ' トコ 'クカス (Streptococcus) 、 サ ッ-カ口 ミ コフ ·シス (Saccharomycopsis 、 ロ ド ト レラ (Bhodotolura) 、 キ ヤ ンディダ（Candida) 、 サッカロマイ セス（Saccharomyces) 、 スポリディオボラス（Sporidiobolus) 属に属する微生物群から えらばれた微生物又はその処理物である請求項 1項記載の製造 法。
(5). スポロラク トノ、'チノレス（Spororactobacillus)属、 ァク ロモバ クタ一（Achromobacter) 属、 ノヾチクレス （Baci llus)属、 ェシエリ ンァ (Escherichia; ¾、 ミク ロコ ッカス (Micrococcus) 腾、 ブ 口テウス（Proteus) 属、 セラチア（Serratia)属、 スタフイ ロコ 'ンカス（Staphlococcus) 属、 ミコノヾクテ 1 J ゥム (Micobacterium) 属、 ク ロモ ノ クテリ ゥム（Chromobacterium) 属、 才ゥ レオパク テ ゥム（Aureobacterium)属、 フラボノヾクテリ ゥム (Flavobac- terium) 属、 サルモネラ（Salmonel la)属、 エルビニァ（Erwinia) 属、 ァグロ ノ クテリ ゥム（Agrobacterium) 属、 ァセ トノヾクタ一 (Acetobacter)ー属、 ノヾラコ ッカス (Paracoccus)属、 プロタ ミノ ノヾクタ一（Protaminobacter) 属、 シユー ドモナス（Pseudomonas) 属、 アムブ口シォジマ（Ambrosiozyma)属、 ァルスロァスカス (Arthroascus) 属、 ボチオアスカス（Botyoascus)属、 クラビス ポラ（Clavispora)属、 デノヾ ！Jォマイ セス（Debaryomyces)属、 リ ポマイ セス (Lipomyces) 属、 ロデロマイ セス (Lodderomyces)属、 メチニコビア（Metschnikowia) 属、 ゲオ ト カム（Geotrichum) 属、 クルイ べロマイ セス（Kluyveromyces) 属、 ク リ ブ トコ ッカ ス（Cryptococcus)属、 ト リ ゴノ ブシス（Trigonops is) 属、 ウ イ ケラ ミ ア（Wickerhamia) 属、 ウ イケラ ミ エラ（Wickerhamiel la) 属、 シゾサッカロマイ セス（Schzosaccharomyces)属、 ロ ドスポ リディ ウム（Rhodosporidium)属、 ステファノ ァスカス（Stepha- noascus) Mx またはノヽンセヌラ（Hansenula) 属に属し、 2 —ケ トー 4 一フエ二ル酪酸を（B) — 2 —ヒ ドロキシ一 4 一フエニル 酪酸に不斉的に還元する能力を有する微生物群から選ばれた微 生物又はその処理物である請求項 1項記載の製造法。
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