WO1989000547A1 - Process for nitrification and nitrogen removal by nitrifying bacteria - Google Patents

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WO1989000547A1
WO1989000547A1 PCT/EP1988/000651 EP8800651W WO8900547A1 WO 1989000547 A1 WO1989000547 A1 WO 1989000547A1 EP 8800651 W EP8800651 W EP 8800651W WO 8900547 A1 WO8900547 A1 WO 8900547A1
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Definitions

  • the invention relates to a method for nitrification and nitrogen elimination by means of nitrifying bacteria.
  • nitrification is understood as the bioi ⁇ gi- cal conversion of ammonia via nitrite to nitrate.
  • two groups of bacteria are responsible for this, which are summarized under the generic term nitrificants.
  • ammonia oxidants oxidize ammonium to nitrite
  • nitrite oxidants oxidize nitrite to nitrate.
  • nitrificants are of great industrial importance.
  • Your metabolic rate is used e.g. B. in sewage treatment plants, in which they ensure the implementation of ammonia in individual nitrification stages.
  • the disadvantage is that after nitrification has taken place, the actual nitrogen elimination has not yet been achieved. Rather, the nitrogen is in the form of nitrate. Using a separate and technically more complex process, denitrification, nitrate is then converted with the release of nitrogen. However, this process is very cost-intensive and is therefore only used in a few sewage treatment plants.
  • the object of the invention is to improve the above-mentioned method so that nitrification and nitrogen elimination is possible in a simple and inexpensive manner by means of nitrifying bacteria.
  • nitrificants it should be possible, starting from an aqueous suspension of nitrificants, to bind the bacteria in a metabolically physiologically active state to a carrier material, to dry the bacteria in a storable manner, so that, if necessary, the carrier material together with the bacteria is added to it from an aqueous solution exposing eliminating ammonium, nitrite, and / or nitrate, the bacteria inactivated for a short or longer period by water removal on the carrier material reactivating their nitrification-specific enzyme system and resume their nitrification performance as free immortalized or reproducing cells that are detached from the carrier material.
  • the object of the invention is to cultivate such a strain of nitrifying bacteria which is suitable on the one hand for producing high cell yields and on the other hand can subsequently be converted to mineral or medium contaminated with dissolved organic substances when grown under these conditions, without resulting in a long lag phase in order to resume the nitrification performance or without reactivating the bacteria at all.
  • the object is achieved by starting from a nitrate-containing aqueous solution by reducing the nitrate by nitrite oxidants, oxidizing the reaction products ammonium by ammonia oxidants and nitrite by nitrite oxidants in a continuous process to nitrate and thereby gaseous nitrogen compounds such as N2O or NO are released, as well as through the selection and use of the microorganism Nitrobacter nov. spec. T3.
  • nitrate is reduced by nitrite oxidants, in particular of the genus Nitrobacter. If these organisms are used exclusively, the small amounts of ammonium produced will not be oxidized again. For optimal nitrogen elimination, it is therefore advantageous to use not only nitrite oxidants but also ammonia oxidants, for example of the genera Nitroso onas r Nitrosovibrio or Nitrosospira. The ammonium which is noticeable or already present in the nitrate or nitrite reduction is then included in the reaction cycle.
  • the optimal nutrient medium for the strain in question is selected for growing the nitrificants and for producing high cell yields. The following media are available for this, but their composition can still be changed.
  • NaCl can be added to this medium in a concentration of 10-200 mM.
  • Lithoautotrophic media are used exclusively for the growth of ammonia oxidants, since heterotrophic growing ammonia oxidants have so far not been isolated.
  • the media for growing ammonia oxidants can differ significantly from one another in terms of their salinity.
  • the differentiation within this organism group between land, sea and brackish water strains is common. Accordingly, the respective synthetic medium is adapted to the natural conditions.
  • nitrite oxidants In contrast to ammonia oxidants, nitrite oxidants also grow in the presence of organic substrates. With mixotrophic or heterotrophic growth, some species even deliver significantly higher cell yields than under purely chemolithoautotrophic conditions. For example, the species Nitrobacter hamburgensis is characterized by this property (Arch. Microbiol. 136, 281-283). An ⁇ under mixotrophic growth conditions of the cell yield values between 'reaches 30 and 35 mg total cell protein / first The cell yield is therefore more than ten times higher than under purely chemolithoautotrophic conditions.
  • Nitrite oxidants that show their optimum growth under heterotrophic conditions are not yet known and will be further described for the first time by the new species Nitrobacter nov. spec. T3 described.
  • Nitrificants are therefore cultivated under optimal growth conditions and then concentrated to increase the cell density. The concentrate is then resuspended. Basically, are suitable for Resuspension so-called "washing solutions", which in their
  • compositions except for the substance representing the energy source correspond to the respective nutrient media.
  • the bacteria are preferably adjusted to a cell concentration of 10 11 to 10 12 cells / ml. Such suspensions can then be used to apply carrier materials or used directly for the process.
  • Open-pore porous materials are suitable as carrier materials for immobilizing the nitrifi edges. These include activated carbon with an internal surface area between 500 and 1500 m 2 / g, which is preferably used in granular form, and zeolites, which belong to the silicate minerals.
  • ion exchangers consisting of organic solids are also suitable as carrier materials. They generally have a hydrophilic gel structure with a large surface area and are particularly suitable as macroporous ion exchangers. Ceramics can also be used as the carrier material.
  • the carrier materials are incubated in the resuspension solutions with the cell concentrations of 10 11 to 10 12 cells / ml. Incubation takes place at a temperature in the range of 20-30 ° C. 1-5 ml of the bacterial suspension are added to carrier materials with a volume of 10 cm 3 until all of the liquid has been absorbed by the carrier material. If the absorption capacity is large, the amount of bacterial suspension used can be increased until the maximum absorption capacity of the carrier material is reached.
  • the carrier loaded with bacterial suspension is then dried arerially.
  • the material is stored for a period of, for example, 5 days at a temperature between 18 and 25 ° C., so that a gentle and uniform release of water takes place, the drying can also be accelerated by the fact that the loaded carrier material is under vacuum in corresponding vacuum vessels is dried. As a result, the drying process can be shortened to 24 hours.
  • the dried and bacterially loaded carrier material is to be kept in a dry place for further storage, if possible. Storage in evacuated and welded plastic bags is recommended, which can then be stored at room temperature or at 4 ° C.
  • the loaded carrier material can be used directly if required. It should be added to the aqueous solution at the optimal growth temperature in which the biological conversion processes are to take place. At a suboptimal temperature, the nitrification process slows down.
  • active precultures can also be generated using the dried material by inoculating fresh synthetic nutrient medium first and then adding this culture to the aqueous solution to be cleaned. In both cases, it is not necessary for the bacteria to remain immobilized on the carrier in order to absorb their nitrification performance. They can also detach and become metabolically physiologically active as freely moving cells.
  • the process according to the invention can be used to combine the previously multistage processes in wastewater purification and drinking water treatment which, in addition to a nitrification stage, have a denitrification stage which is spatially separate therefrom.
  • the total outlay for nitrogen removal can thereby be reduced considerably.
  • nitrifying agents can be induced to reduce nitrate or nitrite and to release gaseous nitrogen compounds such as N 2 O or NO.
  • a decisive factor here is a reduction in the oxygen partial pressure in the culture medium. Both processes, the nitrate or nitrite reduction and the nitrification run side by side, whereby zones of different, ie higher and lower, oxygen partial pressures result in cultures that are not or only slightly stirred. The nitrification then takes place in the zones of higher oxygen partial pressures, while the nitrite or nitrate reduction takes place in zones of lower oxygen partial pressures.
  • the nitrificants immobilized according to the invention can also be used for such a method for coupled nitrification / nitrite or nitrate reduction.
  • the particular advantage of immobilized cells results from the fact that the microorganisms can be directed to the locations of certain oxygen partial pressures and brought there to the corresponding metabolic rate. Nitrogen elimination can thus * be achieved in one step with relatively simple means without changing the milieu conditions.
  • the process for nitrification and nitrogen elimination is not only suitable for wastewater treatment and
  • Drinking water treatment can be used in practically all bodies of water in which the nitrogen pollution is too high. It is essential that in ammonium, A combined nitrification / nitrogen elimination is carried out in situ by adding the bacterial material to nitrite and / or nitrate contaminated natural or artificial waters.
  • the area of aquaculture is becoming increasingly interesting. Intensive fish farming regularly leads to toxic nitrite concentrations that cause fish to die. Using the nitrifying agents, the nitrite can now be broken down and nitrogen can be removed from the water at the same time.
  • all nitrifying agents are suitable for the method according to the invention.
  • relatively high cell concentrations have to be used for effective use. These, in turn, can only be produced from litho-autotrophic cultivations with considerable and economically unjustifiable effort. It is therefore advisable to cultivate nitrificants mixotrophically or heterotrophically.
  • the resulting cell yields which, in contrast to lithoautotrophic cultivation, are more than ten times higher, are sufficient to apply the carrier material.
  • Nitrobacter nov. spec. T3 behaves completely different. This organism was selected on mineral medium over a period of one year. It hardly differs from morphologically previous species, but shows clear physiological, biochemical and genetic peculiarities. Its main distinguishing feature is the growth behavior on a heterotrophic medium and in the presence of nitrite. Special features of this organism are
  • the plasmid DNA is in vivo in a covalently closed circular form and, based on the electrophoretic migration behavior, has a 0.5% strength
  • Agarose gel the molecular weight 80 + 3 MD. It can be obtained by in vivo replication in the microorganism of the genus Nitrobacter described above by aerobic or micro-aerophilic cultivation of the cells under lithoautotrophic, ixotrophic or heterotrophic culture conditions. The plasmids can be replicated identically without additional selection pressure and transferred to daughter cells.
  • 5 shows the schematic representation of an electrophoretic separation of the membrane proteins from N. nov. spec. T3 compared to N ⁇ hamburgensis X14 and
  • FIG. 6 shows the schematic representation of a gel-electrophoretic separation of the DNA from ⁇ nov. spec. T3 compared to Nitrobacter hamburgensis X14.
  • Fig. 1 the growth curve of Nitrobacter nov. spec. T3 shown after heterotrophic cultivation. This curve shows a typical lag phase at the beginning of the course, a subsequent logarithmic phase and finally a stationary phase with a plateau after 45 days.
  • the cell yield achieved with 50 mg total cell protein / 1 is about 60% higher than with N. hamburgensis, which showed the best growth of all strains of nitrifying bacteria.
  • FIG. 2 shows Another physiological peculiarity of the new species N. nov. spec. T3 in Figures 2 to 4. They show growth curves for this organism in the presence of different nitrite concentrations. In all cases, a decrease in the nitrite concentration is accompanied by an increase in protein, with the cell yield achieved after 45 days being lower compared to heterotrophic cultivation with increasing initial concentration of nitrite.
  • Fig. 2 shows the growth at an initial nitrite concentration of 0.5 g NaN0 2 / l. After 45 days, the cell yield reaches a comparative value of approximately 36 mg total cell protein / 1 and increases further to approximately 38 mg total cell protein / 1. The nitrite used is oxidized after 15 days.
  • the nitrite concentration used significantly inhibits growth.
  • the nitrite used is only used up after 29 days.
  • An extreme inhibition of growth is illustrated in FIG. 4.
  • the nitrite used is oxidized with approximately the same conversion rate as in the experiments shown in FIGS. 2 and 3, the protein content hardly increases here. Only after 39 days when the nitrite concentration had dropped to 0.5 g NaN0 2 / l was it possible to measure a slight increase in protein.
  • the comparison value after 45 days is approximately 13 mg of total cell protein / 1 and is therefore a factor of 4 lower than that of heterotrophic cultivation.
  • This growth behavior underlines the strong heterotrophic potency of this type, which, however, does not come at the expense of the lithoautotrophic growth.
  • This organism grows chemolithoautotrophically in comparison to other representatives of this genus.
  • N. nov. spec. T3 characterized by the fact that only relatively short adaptation times are required in order to nitrify in the case of changed oxygen partial pressures, in particular increases.
  • the disadvantage of a lack of adaptation performance in conventional species affects, as already shown, the method according to the invention. By using this new bacterium, the impairment due to "oxygen stress" in nitrite oxidants is overcome for the first time.
  • Nitrite oxidoreductase is the membrane-bound key enzyme of nitrite oxidation. According to previous knowledge, it can be induced both by nitrite and by nitrate. However, its activity can be
  • N. nov. spec. T3 is also a biochemical peculiarity, which is evident in a gel electrophoretic separation of the membrane proteins.
  • Figure 5 shows SDS polyacrylamide gel electrophoresis of these proteins.
  • the large subunit of nitrite oxidoreductase has a relative molecular weight of 115,000 in all strains examined to date.
  • the molecular weight deviates from this and is approximately 130,000.
  • other membrane proteins are also changed in their relative molecular weight.
  • the second subunit of the terminal oxidase, the cytochrome aa 3 has in N. nov. spec.
  • T3 has a relative molecular weight of around 27,000, which is about 1,000 less than in the other cases.
  • the membrane-bound cytochrome c after gel electrophoretic separation is somewhat above the comparison band from N ⁇ hamburgensis X14, which is also typical for all other species.
  • N. nov. spec. T3 further characterized by having a large plasmid.
  • Nitrobacter plasmids have so far only been detected in strains of the type N. hamburgen ⁇ sis.
  • all the strains of the species N ⁇ winogradskyi examined are plasmid-free. Over time, this fact has led to the interpretation of the possession of at least certain plasmids, for example in the case of N. hamburgensis, as a species characteristic.
  • T3 after cesium chloride-ethidium bromide density gradient centrifugation.
  • the molecular weight of 80 + 3 MD can be determined from this.
  • N. nov. spec. T3 Owning exactly one plasmid is necessary for N. nov. spec. T3 characteristic. It is striking that this plasmid pPB31 is stable even under different growing conditions. A plasmid loss could not be observed even without additional selection pressure. Even the use of mutagenic agents did not lead to the appearance of plasmid-free mutants. It can therefore be assumed that in the cultivation of N. nov. spec. T3 achieves expression of metabolically physiologically relevant plasmid genes under the specified conditions and thus a selection pressure for targeted plasmid replication arises. That N. nov. spec.
  • the plasmid function can be connected with the physiological performance of this bacterium.
  • a plasmid-free strain will therefore lack the essential metabolic benefits.
  • N. nov. spec. T3 not only offers advantages over previously known nitrite oxidants when using the method according to the invention, but is also characterized by long periods of metabolic physiological activity in resting cultures.
  • So z. B. cells cultured microaerophilically on a heterotrophic medium are still active after three months. After this and after a long time, they can be left lithotrophic in an oxygen-rich medium cultivate and begin nitrification there after a few days.
  • This special metabolic performance, the above-average growth under heterotrophic conditions and the subsequent lithotrophic nitrification without longer adaptation times characterize this organism as well as its oxygen tolerance after microaerophilic cultivation.

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Description

er a ren zur r a on un c s o e m nation mittels nitrifizierender Bakterien
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Nitrifikation und Stickstoffelimination mittels nitrifizierender Bakterien.
Unter dem Begriff Nitrifikation versteht man die bioiαgi- sehe Umsetzung von Ammoniak über Nitrit zu Nitrat. Hierfür sind in der Natur grundsätzlich zwei Bakteriengruppen verantwortlich, die man unter dem Oberbegriff Nitrifikan¬ ten zusammenfaßt. Einerseits oxidieren Ammoniakoxidanten Ammonium zu Nitrit, während Nitritoxidanten Nitrit zu Nitrat oxidieren.
Gemäß ihres natürlichen Stoffwechsels finden Nitrifikanten industriell große Bedeutung. Ihre Stoffwechselleistung nutzt man z. B. in Kläranlagen, in denen sie in einzelnen Nitrifikationsstufen für die Umsetzung des Ammoniaks sorgen. Von Nachteil ist jedoch, daß nach erfolgter Nitrifikation die eigentliche Stickstoffelimination noch nicht erreicht ist. Der Stickstoff liegt vielmehr in Form von Nitrat vor. über ein gesondertes und technisch aufwen- digeres Verfahren, die Denitrifikation, wird anschließend Nitrat unter Freisetzung von Stickstoff umgewandelt. Dieses Verfahren ist aber sehr kostenintensiv und wird daher nur in wenigen Kläranlagen eingesetzt.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin,das eingangs genannte Verfahren so zu verbessern, daß auf einfache und kostengünstige Weise mittels nitrifizierender Bakterien eine Nitrifikation und Stickstoffelimination möglich ist.
Darüber hinaus soll es möglich sein, ausgehend von einer wässrigen Suspension von Nitrifikanten, die Bakterien in stoffwechselphysiologisch aktivem Zustand an ein Trägerma¬ terial zu binden, die Bakterien lagerfähig zu trocknen, um bei Bedarf das Trägermaterial zusammen mit den Bakterien dem aus einer wässrigen Lösung zu eliminierenden Ammonium, Nitrit, und/oder Nitrat auszusetzen, wobei die für einen kurzen oder längeren Zeitraum durch Wasserentzug am Trägermaterial inaktivierten Bakterien unter Induktion ihres nitrifikationsspezifischen Enzymsystems reaktiviert werden und ihre Nitrifikationsleistung als weiterhin immobilisierte oder sich vom Trägermaterial ablösende freie und sich vermehrende Zellen wieder aufnehmen.
Des weiteren besteht die Aufgabe der Erfindung darin, einen solchen Stamm nitrifizierender Bakterien zu kulti¬ vieren, der einerseits zur Erzeugung hoher Zellerträge geeignet ist, andererseits sich bei Anzucht unter diesen Bedingungen anschließend auf mineralisches oder mit gelösten organischen Substanzen belastetes Medium überfüh¬ ren läßt, ohne daß dadurch zur Wiederaufnahme der Nitrifi¬ kationsleistung eine lange lag-Phase entsteht, bzw. die Bakterien überhaupt nicht reaktivieren.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe dadurch, daß ausgehend von einer nitrathaltigen wässrigen Lösung das Nitrat durch Nitritoxidanten reduziert, die Reaktions¬ produkte Ammonium durch Ammoniakoxidanten und Nitrit durch Nitritoxidanten in einem kontinuierlichen Prozeß wieder zu Nitrat oxidiert und dabei gasförmige Stickstoff erbindun¬ gen wie N2O oder NO freigesetzt werden, sowie durch die Selektion und Verwendung des Mikroorganismus Nitrobacter nov. spec. T3.
Die Nitratreduktion erfolgt durch Nitritoxidanten insbe¬ sondere der Gattung Nitrobacter. Bei ausschließlicher Verwendung dieser Organismen wird das zum geringen Teil entstehende Ammonium nicht wieder oxidiert. Für eine möglichst optimale Stickstoffelimination ist es daher vorteilhaft, neben Nitritoxidanten auch Ammoniakoxidanten z.B. der Gattungen Nitroso onas r Nitrosovibrio oder Nitrosospira einzusetzen. Das bei der Nitrat- bzw. Nitrit¬ reduktion auffallende oder auch schon vorliegende Ammonium wird dann in den Reaktionskreislauf mit einbezogen. Zunächst wird zur Anzucht der Nitrifikanten und zur Erzeugung hoher Zellerträge das für den betreffenden Stamm optimale Nährmedium ausgewählt. Hierfür stehen folgende Medien zur Verfügung, die sich in ihrer Zusammensetzung aber noch verändern lassen.
Medien zur Anzucht von Ammoniakoxidanten:
Autotrophes Medium nach Krümmel und Harms (Arch. Micro- biol. (1982) 133, 50-54)
10 mM NH4C1; 0,1 mM KH2P04; 1 mM KCl; 0,2 mM MgS04; 1 mM CaCl ; Kresolrot als Indikator; 0,2/tM MnSθ4; 0,8 M.VL H3BO3; 0,15/uM ZnS04; 0,03 uM (NH4)6M07024; 3,5«M FeS04.
Diesem Medium kann je nach Bedarf NaCl in einer Konzen¬ tration von 10-200 mM zugesetzt werden.
Medien zur Anzucht von Nitritoxidanten;
1. Mineralisches Grundmedium
0,5 g NaCl; 0,05 g MgS04 • 7 H20; 0,15 g KH2P04; 7,0 g CaC03; 0,05 mg (NH4)gMθ7θ 4 • 4 H20; 0,15 mg FeS0 • 7 H20; ad 1000 ml aqua dest.
2. Autotrophes Medium
Mineralisches Grundmedium; 0,2-2,0 g NaN02; pH 7,4-7,6 nach erfolgter Sterilisation.
3. Mixotrophes Medium
Mineralisches Grundmedium; 0,2-2,0 g NaN02; 0,55 Natriumpy- ruvat; 1,5 g Hefeextrakt; 1,5 g Bacto-Pepton; pH 7,4. 4. Hererotrophes Medium
_
Mineralisches Grundmedium; 0,55 g Natriumpyruvat; 1,5 g Hefeextrakt; 1,5 g Bacto-Pepton; pH 7,4.
Zur Anzucht von Ammoniakoxidanten dienen ausnahmslos lithoautotrophe Medien, da heterotroph wachsende Ammo¬ niakoxidanten bislang nicht isoliert wurden. Allerdings können sich die Medien zur Anzucht von Ammoniakoxidanten hinsichtlich ihrer Salinität deutlich von einander unter¬ scheiden. Die Differenzierung innerhalb dieser Organismen¬ gruppe zwischen Land-, See- und Brackwasserstämmen ist geläufig. Entsprechend ist das jeweilige synthetische Medium den natürlichen Gegebenheiten angepaßt.
Im Gegensatz zu Ammoniakoxidanten wachsen Nitritoxidanten auch in Gegenwart organischer Substrate. Einige Arten liefern beim mixotrophen oder heterotrophen Wachstum sogar deutlich höhere Zellerträge als unter rein chemolithoauto- trophen Bedingungen. So zeichnet sich beispielsweise die Art Nitrobacter hamburgensis durch diese Eigenschaft aus (Arch. Microbiol. 136, 281-283) . Unter mixotrophen An¬ zuchtsbedingungen erreicht der Zellertrag Werte zwischen ' 30 und 35 mg Gesamtzellprotein/1. Der Zellertrag liegt somit um mehr als das Zehnfache höher als unter rein chemolithoautotrophen- Bedingungen.
Nitritoxidanten, die unter heterotrophen Bedingungen ihr Wachstumsoptimum zeigen, sind bislang nicht bekannt und werden im weiteren erstmals durch die neue-Art Nitrobacter nov. spec. T3 beschrieben.
Zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind hohe Zellmengen nitrifizierender Bakterien erforderlich. Nitrifikanten werden daher unter optimalen Wachstumsbedin¬ gungen kultiviert und anschließend zur Erhöhung-der Zelldichte aufkonzentriert. Das Konzentrat wird an¬ schließend resuspendiert. Grundsätzlich eignen sich zur Resuspension sogenannte "Waschlösungen", die in ihren
*
Zusammensetzungen bis auf die die Energiequelle darstel¬ lende Substanz den jeweiligen Nährmedien entsprechen. Bei der Resuspension werden die Bakterien bevorzugt auf eine Zellkonzentration von 1011 bis lθ12 Zellen/ml eingestellt. Derartige Suspensionen lassen sich dann zur Beaufschlagung von Trägermaterialien verwenden oder direkt für das Verfahren einsetzen.
Als Trägermaterialien zur Immobilisierung der Nitrifi¬ kanten eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren offenporige poröse Materialien. Hierzu zählen Aktivkohle mit einer inneren Oberfläche zwischen 500 und 1500 m2/g, die vorzugsweise in gekörnter Form verwendet wird, sowie Zeolithe, die zu den silikatischen Mineralien gehören.
Letztere zeichnen sich insbesondere dadurch aus, daß sie das in ihren Gitterhohlräumen enthaltene Wasser mit steigender Temperatur abgeben und beim Abkühlen wieder aufnehmen. Darüber hinaus besitzen sie Ionenaustauscher- eigenschaften bzgl. ihrer relativ frei beweglichen Alka¬ li-, Erdalkali- und Ammoniumionen sowie die Fähigkeit zur Adsorption bestimmter organischer Verbindungen. Letztlich sind auch aus organischen Festkörpern bestehende Ionenaus¬ tauscher als Trägermaterialien geeignet. Sie besitzen im allgemeinen eine hydrophile Gelstruktur mit großer Oberflä¬ che und sind als makroporöse Ionenaustauscher besonders geeignet. Als Trägermaterial lassen sich auch Keramiken verwenden.
Zur Beaufschlagung mit Bakterien werden die Trägermate¬ rialien in den Resuspensionslösungen mit den Zellkon¬ zentrationen von 1011 bis 1012 Zellen/ml inkubiert. Die Inkubation erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von 20-30° C. Auf Trägermaterialien mit einem Volumen von 10 cm3 werden hierzu 1-5 ml der Bakteriensuspension gegeben, bis die gesamte Flüssigkeit vom Trägermaterial aufgenommen ist. Bei großer Aufnahmekapazität kann die Menge der eingesetzten Bakteriensuspension soweit erhöht werden, bis die maximale Au nahmekapazität des Trägermaterials er¬ reicht ist.
Das mit Bakteriensuspension beaufschlagte Träger arerial wird anschließend getrocknet. Hierzu wird das Material über einen Zeitraum von beispielsweise 5 Tagen bei einer Temperatur zwischen 18 und 25° C gelagert, so daß eine schonende und gleichmäßige Wasserabgabe erfolgt, die Trocknung kann auch dadurch beschleunigt werden, daß das beaufschlagte Trägermaterial bei Unterdruck in entspre¬ chenden Unterdruckgefäßen getrocknet wird. Hierdurch kann der Trocknungsprozeß auf 24 h verkürzt werden.
Das getrocknete und mit Bakterien beaufschlagte Träger- material ist zur weiteren Lagerung möglichst unter Luftab¬ schluß und trocken aufzubewahren. Es empfiehlt sich eine Lagerung in evakuierten und verschweißten Kunststoffbeu¬ teln, die anschliessend bei Raumtemperatur oder bei 4°C gelagert werden können.
Das beladene Trägermaterial kann bei Bedarf direkt verwen¬ det werden. Es ist bei der möglichst optimalen Wachstums¬ temperatur der wässrigen Lösung zuzugeben, in der die biologischen Umsetzungsprozesse stattfinden sollen. Bei suboptimaler Temperatur verlangsamt sich der Nitrifika- tionsprozess. Es lassen sich aber auch unter Verwendung des getrockneten Materials aktive Vorkulturen erzeugen, indem zunächst frisches synthetisches Nährmedium beimpft wird und diese Kultur dann der zu reinigenden wässrigen Lösung zugegeben wird. In beiden Fällen ist es nicht erforderlich, daß die Bakterien zur Aufnahme ihrer Nitri- fikationsleistung am Träger immobilisiert bleiben. Sie können sich auch ablösen und als frei bewegliche Zellen stoffwechselphysiologisch aktiv werden. Vor allem aber lassen sich durch das erfindungsgemäße Verfahren die bisher mehrstufigen Prozesse bei der Ab¬ wasserreinigung und Trinkwasseraufbereitung, die neben einer Nitrifikationsstufe eine hiervon räumlich getrennte Denitrifikationsstufe aufweisen, vereinen. Der Gesamtauf¬ wand zur Stickstoffentfernung läßt sich hierdurch erheb¬ lich reduzieren.
Nitrifikanten können unter bestimmten Voraussetzungen dazu gebracht werden, Nitrat bzw. Nitrit zu reduzieren und gasförmige Stickstoffverbindungen wie N20 oder NO freizu¬ setzen. Entscheidend hierfür ist eine Verringerung des Sauerstof partialdruckes im Kulturmedium. Beide Prozesse, die Nitrat- bzw. Nitritreduktion und die Nitrifikation laufen nebeneinander her, wobei sich in wenig oder nicht gerührten Kulturen Zonen unterschiedlicher, d.h. höherer und niedrigerer Sauerstoffpartialdrucke ergeben. In den Zonen höherer Sauerstoffpartialdrucke findet dann die Nitrifikation statt, während in Zonen niedriger Sauer- stoffpartialdrucke die Nitrit- bzw. Nitratreduktion erfolgt.
Die erfindungsgemäß immobilisierten Nitrifikanten lassen sich auch für ein derartiges Verfahren zur gekoppelten Nitrifikation/Nitrit- bzw. Nitratreduktion verwenden. Der besondere Vorteil von immobilisierten Zellen ergibt sich dadurch, daß die Mikroorganismen gezielt an Orte bestimm¬ ter Sauerstoffpartialdrucke geführt und dort zu entspre¬ chenden StoffWechselleistungen gebracht werden können. Eine Stickstoffelimination läßt sich somit* einstufig mit relativ einfachen Mitteln ohne zu verändernde Milieuver¬ hältnisse erreichen.
Das Verfahren zur Nitrifikation und Stickstoffelimination eignet sich aber nicht nur zur Abwasserreinigung und
Trinkwasseraufbereitung, sondern ist in praktisch allen Gewässern anwendbar, in denen eine zu hohe Stickstoffbe- lastung vorliegt. Wesentlich ist, daß in mit Ammonium, Nitrit und/oder Nitrat belasteten natürlichen oder künst¬ lichen Gewässern eine kombinierte Nitrifikation/Stick- stoffelimination in situ durch Zugabe des Bakterienmate¬ rials durchgeführt wird. Zunehmendes Interesse findet hier der Bereich der Aquakultur. Durch Intensivfischzucht kommt es regelmäßig zu toxischen Nitritkonzentrationen, die ein Fischsterben hervorrufen. Unter Einsatz der Nitrifikanten kann nun das Nitrit abgebaut und gleichzeitig eine Stick- stoffentfernung aus dem Wasser vorgenommen werden.
Zu dem erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich im Grunde sämtliche Nitrifikanten. Es hat sich jedoch gezeigt, daß zur wirksamen Anwendung relativ hohe Zellkonzentrationen eingesetzt werden müssen. Diese widerum sind aus litho- autotrophen Anzuchten nur unter erheblichem und wirt¬ schaftlich kaum zu vertretendem Aufwand herzustellen. Daher empfielt es sich, Nitrifikanten mixotroph oder heterotroph zu kultivieren. Die sich daraus ergebenden, im Gegensatz zur lithoautotrophen Anzucht um mehr als zehn- fach höheren Zellerträge, sind zur Beaufschlagung des Trägermaterials ausreichend.
Bei den meisten bisher isolierten Stämmen nitrifizierender Bakterien ist die Nitrifikationsleistung trotz hoher Zellmengen sehr gering. Dies ist als Folge des Milieu¬ wechsels von Komplexmedium zu annähernd lithoautotrophen Bedingungen zu erklären. Auch der plötzliche z. B. bei der Anwendung in Aquarien auftretende relativ hohe Sauerstoff- partialdruck, der einer Sauerstoffsättigung des Wassers annähernd gleichkommt, trägt zur Beeinträchtigung der
Nitrifikationsleistung insbesondere bei den Nitritoxidan¬ ten bei. Sämtliche bisher bekannte Arten von Nitrobacter zeigen dieses ungünstige Verhalten.
Die neue Art Nitrobacter nov. spec. T3 verhält sich dagegen völlig anders. Dieser Organismus wurde über einen Zeitraum von einem Jahr auf mineralischem Medium selek¬ tiert. Er unterscheidet sich zwar morphologisch kaum von bisherigen Arten, zeigt aber deutliche physiologische, biochemische und genetische Besonderheiten. Sein wesent¬ liches Unterscheidungsmerkmal ist das Wachstumsverhalten auf heterotrophem Medium sowie in Gegenwart von Nitrit. Besondere Merkmale dieses Organismus sind
- schnelleres heterotrophes als mixotrophes und .lithoauto- trophes Wachstum,
- hohe Zellerträge von 50 mg Gesamtzellprotein/1 bei heterotropher Anzucht,
- die Fähigkeit in ruhenden Kulturen unter mikroaerophilen Bedingungen lange Zeiten von mindestens sechs Monaten überdauern zu können,
- die Sauerstofftoleranz bei Sauerstoffsättigung des Mediums nach mikroaerophiler, heterotropher Anzucht,
- die 2 - 4 Tage nach Sauerstoffzugabe einsetzende Nitri¬ fikationsleistung nach mikroaerophiler Anzucht,
- die leichte Reaktivierbarkeit bei Anwendung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens, - der Besitz eines Plasmids mit einem Molekulargewicht von 80 + 3 MD.
Die Plasmid-DNA liegt in vivo in kovalent-geschlossen circularer Form vor und besitzt, ausgehend von dem elektro- phoretischen Wanderungsverhalten in einem 0,5 %igen
Agarose-Gel, das Molekulargewicht 80 + 3 MD. Sie ist durch in vivo Replikation in dem oben beschriebenen Mikroorga¬ nismus der Gattung Nitrobacter durch aerobe oder ikro- aerophile Anzucht der Zellen unter lithoautotrophen, ixo- trophen oder heterotrophen Kulturbedingungen erhältlich. Die Plasmide können ohne zusätzlichen Selektionsdruck identisch repliziert und auf Tochterzellen übertragen werden. Diese und weitere Merkmale des neuen Mikroorganis¬ mus werden nachstehend anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 Wachstumskurven der Art Nitrobacter nov. spec. bis 4 T3 nach heterotropher Anzucht in Gegenwart un¬ terschiedlicher Nitritkonzentrationen, Fig. 5 die schematische Darstellung einer elelektro- phoretischen Trennung der Membranproteine aus N. nov. spec. T3 im Vergleich zu N^ hamburgensis X14 und
Fig. 6 die schematische Darstellung einer gelelektro- phoretischen Trennung der DNA aus ^ nov. spec. T3 im Vergleich zu Nitrobacter hamburgensis X14.
In Fig. 1 ist die Wachstumskurve von Nitrobacter nov. spec. T3 nach heterotropher Anzucht dargestellt. Diese Kurve zeigt eine typische lag-Phase zu Beginn des Ver¬ laufs, eine sich daran anschließende logarithmische Phase sowie schließlich eine stationäre Phase mit einem Plateau nach 45 Tagen. Der erreichte Zellertrag liegt mit 50 mg Gesamtzellprotein/1 um ca. 60 % höher als bei N. hamburgensis, der von allen Stämmen nitrifizierender Bakterien das bislang beste Wachstum zeigte.
Eine weitere physiologische Besonderheit der neuen Art N. nov. spec. T3 ist in den Figuren 2 bis 4 dargestellt. Sie zeigen Wachstumskurven für diesen Organismus in Gegenwart unterschiedlicher Nitritkonzentrationen. In allen Fällen geht mit einer Abnahme der Nitritkonzentration eine Proteinzunahme einher, wobei der nach 45 Tagen erreichte Zellertrag im Vergleich zur heterotrophen Anzucht mit zunehmender Ausgangskonzentration von Nitrit geringer wird. Fig. 2 zeigt das Wachstum bei einer anfänglichen Nitritkonzentration von 0,5 g NaN02/l. Der Zeilertrag erreicht nach 45 Tagen einen Vergleichswert von etwa 36 mg Gesamtzellprotein/1 und steigt im weiteren Verlauf bis auf etwa 38 mg Gesamtzellprotein/1 an. Das eingesetzte Nitrit ist nach 15 Tagen oxidiert. Der Wachstumskurve nach Fig. 3 liegt ein Versuch mit einer Nitritkonzentration von 1,0 g NaN02/l zugrunde. Die Wachstumgskurve zeigt nunmehr keinen gewohnten Verlauf. Es existiert keine logarithmische Wachstumsphase. Der Proteingehalt steigt langsam und unregelmäßig an und erreicht nach 45 Tagen einen Wert von
* ca. 21 mg Gesamtzellprotein/1. Die eingesetzte Nitritkon¬ zentration hemmt das Wachstum signifikant. Das eingesetzte Nitrit ist erst nach 29 Tagen verbraucht. Eine extreme Wachstumshemmung verdeutlicht Fig. 4. Obgleich das einge¬ setzte Nitrit mit annähernd gleicher Umsatzrate wie bei den in Fig. 2 und 3 dargestellten Versuchen oxidiert wird, steigt der Proteingehalt hier kaum an. Erst nach 39 Tagen als die Nitritkonzentration auf 0,5 g NaN02/l abgefallen war, konnte eine geringe Proteinzunahme gemessen werden.
Der Vergleichswert nach 45 Tagen beträgt ca. 13 mg Gesamt- zellprotein/1 und liegt damit im Vergleich zu heterotro¬ phen Anzucht um den Faktor 4 niedriger. Dieses Wachstums¬ verhalten unterstreicht die starke heterotrophe Potenz dieser Art, was allerdings nicht zu Lasten des lithoauto¬ trophen Wachstums geht. Chemolithoautotroph wächst dieser Organismus im Vergleich zu übrigen Vertretern dieser Gattung ähnlich.
Eine wesentliche Eigenschaft zeichnet N. nov. spec. T3 dadurch aus, daß nur relativ kurze AnpassungsZeiten erforderlich sind, um bei veränderten Sauerstoffpartial- drucken, insbesondere Erhöhungen, zu nitrifizieren. Der Nachteil einer mangelnden Adaptationsleistung bei her- kömmlichen Arten beeinträchtigt, wie bereits dargestellt, das erfindungsgemäße Verfahren. Durch die Verwendung dieses neuen Bakteriums wird erstmalig die Beeinträchti¬ gung durch "Sauerstoffstreß" bei Nitritoxidanten über¬ wunden.
Auch die Induktion der Nitritoxidoreduktaseaktivität läßt sich messen. Nitritoxidoreduktase ist das membrangebundene Schlüsselenzym der Nitritoxidation. Es ist nach bisherigen Kenntnissen induzierbar sowohl durch Nitrit als auch durch Nitrat. Seine Aktivität läßt sich dagegen durch die
Erhöhung des Sauerstoffpartialdrucks steigern. Mikrokalo¬ rimetrische Versuche haben ergeben, daß für N. nov. spec. T3 8 bis 10 Stunden ausreichen, um nach Erhöhung des Sauerstoffpartialdrucks bis zur Sauerstoffsättigung eine Induktion der Nitritoxidoreduktaseaktivität zu erreichen, die aufgrund einer meßbaren Wärmeentwicklung bei der Nitritoxidation erkennbar ist.
Gegenüber allen anderen Stämmen der Gattung Nitrobacter zeigt N. nov. spec. T3 auch eine biochemische Besonder¬ heit, die in einer gelelektrophoretischen Trennung der Membranproteine deutlich wird. Fig. 5 zeigt eine SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese dieser Proteine. Die große Untereinheit der Nitritoxidoreduktase hat bei allen bislang untersuchten Stämmen ein relatives Molekularge¬ wicht von 115.000. Bei. N. nov. spec. T3 weicht das Moleku¬ largewicht hiervon ab und liegt bei ca. 130.000. Aber auch andere Membranproteine sind in ihrem relativen Molekular¬ gewicht verändert. So besitzt die 2. Untereinheit der terminalen Oxidase, das Cytochrom aa3, bei N. nov. spec. T3 ein mit 27.000 um ca. 1000 geringes relatives Moleku¬ largewicht als in den übrigen Fällen. Das membrangebundene Cytochrom c liegt hingegen nach gelelektrophoretischer Trennung etwas oberhalb der auch für alle anderen Arten typischen Vergleichsbande aus N^ hamburgensis X14.
Genetisch wird N. nov. spec. T3 ferner durch den Besitz eines großen Plasmides charakterisiert. Plasmide sind bei Nitrobacter bislang nur bei Stämmen der Art N. hamburgen¬ sis nachgewiesen worden. Sämtliche untersuchten Stämme der Art N^ winogradskyi sind dagegen plasmidfrei. Diese Tatsache hat im Laufe der Zeit dazu geführt, den Besitz zumindest bestimmter Plasmide wie beispielsweise im Falle von N. hamburgensis als Artcharakteristikum zu deuten. Beide bislang bekannten Stämme dieser Art zeigen ein identisches Plasmidmuster aus drei verschieden großen Plasmiden pPBll, pPB12, pPB13 bzw. pPB21, pPB22 und pPB23 mit Molekulargewichten von 76, 124 bzw. 182 MD (Pohl, Dissertation, Universität Hamburg, 1986) . N. nov. spec. T3 weist dieses Plasmidmuster nicht auf, sondern besitzt nur ein Plasmid. Gelelektrophoretische Molekulargewichtsbestimmungen ergeben für dieses Plasmid ein relatives Molekulargewicht von 80 + 3 MD. Fig. 6 zeigt, schematisch dargestellt, eine gelelektrophoretische Trennung der Plasmide aus N. hamburensis und N. nov. spec. T3 nach Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradientenzen- trifugation. Das Plasmid aus N. nov. spec. T3, genannt pPB31, zeigt dabei eine relative Mobilität die zwischen der der Referenzplasmide pPBll und pPB12 liegt. Hieraus läßt sich das Molekulargewicht von 80 + 3 MD ermitteln.
Der Besitz genau eines Plasmids ist für N. nov. spec. T3 charakteristisch. Es fällt auf, daß dieses Plasmid pPB31 auch bei unterschiedlichen Anzuchtsbedingungen stabil ist. Ein Plasmidverlust konnte auch ohne zusätzlichen Selek¬ tionsdruck nicht beobachtet werden. Selbst der Einsatz mutagener Agenzien führte nicht zu einem Auftreten plas- midfreier Mutanten. Es ist daher anzunehmen, daß bei der Kultivierung von N. nov. spec. T3 unter den angegebenen Bedingungen eine Expression stoffwechselphysiologisch relevanter Plasmidgene erreicht und somit ein Selektions¬ druck zur gezielten Plasmidreplikation entsteht. Daß sich N. nov. spec. T3 aber genotypisch von allen bisher bekann- ten Nitritoxidanten durch den Besitz dieses Plasmides unterscheidet, läßt die Plasmidfunktion naheliegend mit den physiologischen Leistungen dieses Bakteriu s in Verbindung treten. Einem plasmidfreien Stamm wird es somit an den wesentlichen Stoff echselleistungen fehlen.
N. nov. spec. T3 bietet nicht nur bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens Vorteile gegenüber bisher bekannten Nitritoxidanten, sondern zeichnet sich auch durch lange Zeiten stoffwechselphysiologischer Aktivität in ruhenden Kulturen aus. So sind z. B. mikroaerophil auf heterotrophem Medium kultivierte Zellen noch nach drei Monaten aktiv. Sie lassen sich nach dieser und noch nach längerer Zeit lithotroph in sauerstoffreichem Medium kultivieren und beginnen dort nach wenigen Tagen mit der Nitrifikation. Diese besondere Stoff echselleistung, das überdurchschnittlich gute Wachstum unter heterotrophen Bedingungen sowie die sich daran anschließende lithotrophe Nitrifikation ohne längere Adaptationszeiten zeichnen diesen Organismus ebenso aus wie seine Sauerstofftoleranz nach mikroaerophiler Anzucht.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur Nitrifikation und Stickstoffelimination mittels nitrifizierender Bakterien, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß ausgehend von einer nitrathaltigen wässrigen Lösung das Nitrat durch Nitrifikanten reduziert, die Reaktionsprodukte Ammonium und Nitrit in einem kontinuierlichen Prozess wieder zu Nitrat oxidiert und dabei gasförmige Stickstoffverbindungen wie N 0 oder NO freigesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion des Nitrats bzw. des Nitrits durch Ni¬ tritoxidanten bei vermindertem Sauerstoffpartialdruck durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeich¬ net, daß in mit Ammonium, Nitrit und/oder Nitrat be¬ lasteten natürlichen oder künstlichen Gewässern eine kombinierte Nitrifikation/Stickstoffelimination in situ durch Zugabe des Bakterienmaterials durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterienmaterial aus Nitrifikanten besteht, die an einem offenporigen porösen Trägermaterial wie Aktivkohle, Zeolith, Keramik oder Ionenaustauschern fixiert und anschließend getrocknet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Nitrifikanten Nitritoxidanten z. B. der Gattung Nitrobacter eingesetzt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Nitrifikanten gleichzeitig Nitritoxidanten und Ammoniakoxidanten eingesetzt werden.
7. Mikroorganismus der Gattung Nitrobacter, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, D-3400 Göttingen, Eingangsnummer DSM 4153, isoliert aus einer Bodenprobe unter selektiven Bedingungen, heterotroph wachsend bei einer Temperatur im Bereich von 20 - 20°C in stehenden, nicht gerührten und nicht geschüttelten Kulturen, gekennzeichnet durch
a) schnelleres heterotrophes als mixotrophes und lithoautotrophes Wachstum,
b) hohe Zellerträge von 50 mg Gesamtzellprotein/1 bei heterotropher Anzucht,
c) die Fähigkeit in ruhenden Kulturen unter mikro- aerophilen Bedingungen lange Zeiten von mindestens sechs Monaten überdauern zu können,
d) die Sauerstofftoleranz bei Sauerstoffsättigung des Mediums nach mikroaerophiler, heterotropher Anzucht,
e) die 2 - 4 Tage nach Sauerstoffzugabe einsetzende Nitrifikationsleistung nach mikroaerophiler An¬ zucht,
f) die leichte Reaktivierbarkeit bei Anwendung des erfindungsgemäßen Ver ahrens,
g) den Besitz eines Plasmids mit einem Molekularge- wicht von 80 + 3 MD.
8. Plasmid-DNA aus dem Mikroorganismus der Gattung
Nitrobacter nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmid-DNA in vivo in kovalent-geschlossen circularer Form vorliegt, und, ausgehend von dem elek- trophoretischen Wanderungsverhalten in einem 0,5 %igen Agarose-Gel, das Molekulargewicht 80 + 3 MD besitzt.
9. Plasmid-DNA nach Anspruch 8, erhältlich durch in vivo Replikation in dem Mikroorganismus der Gattung Nitro¬ bacter nach Anspruch 7 durch aerobe oder mikroaero- phile Anzucht der Zellen unter lithoautotrophen, mixotrophen oder heterotrophen Kulturbedingungen.
10. Plasmid-DNA nach Anspruch 8 und 9, dadurch gekenn- . zeichnet, daß die Plasmide ohne zusätzlichen Selek¬ tionsdruck identisch repliziert und auf Tochterzellen übertragen werden können.
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