DE3724027A1 - Verfahren zur nitrifikation, einen hierfuer geeigneten mikroorganismus sowie die im mikroorganismus enthaltene plasmid-dna - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Nitrifikation mittels nitrifizierender Bakterien.

Unter dem Begriff Nitrifikation versteht man die bio­ logische Umsetzung von Ammoniak über Nitrit zu Nitrat. Hierfür sind in der Natur grundsätzlich zwei Bakterien­ gruppen verantwortlich, die man unter dem Oberbegriff Nitrifikanten zusammenfaßt. Einerseits oxidieren Ammoniak­ oxidanten Ammonium zu Nitrit, während Nitritoxidanten Nitrit zu Nitrat oxidieren. Bei beiden Stoffwechseltypen dient nach herrschender Lehrmeinung die Oxidation des Ammoniums bzw. des Nitrits zur Energiegewinnung und somit zur Förderung des Wachstums.

Nitrifikanten kommen in der Natur nahezu überall vor. Ihr natürliches Biotop ist der Erdboden. Hier sind sie wesent­ licher Bestandteil der bakteriellen Bodenflora. Die einzelnen Arten dieser Gattungen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Nährstoffansprüche und Kulturbe­ dingungen erheblich. So wird das Wachstum dieser Or­ ganismen entscheidend durch die Temperatur, den Sauer­ stoffpartialdruck, den pH-Wert sowie das Nährstoffangebot beeinflußt. Einige Arten wachsen z. B. obligat chemolitho­ autotroph, während andere in Gegenwart organischer Substanzen die höchsten Zellerträge liefern. Für die Kultivierung dieser Bakterien ist es somit von grund­ legender Bedeutung, daß die einzelnen Wachstumsparameter gezielt auf einzelne Arten abgestellt werden.

Gemäß ihres natürlichen Stoffwechsels finden Nitrifikanten auch industriell große Bedeutung. Ihre Stoffwechsel­ leistung nutzt man z. B. in Kläranlagen, in denen sie in einzelnen Nitrifikationsstufen für die Umsetzung des Ammoniaks sorgen. Ein derartiges biologisches System ist aber naturgemäß anfällig gegenüber veränderten Umwelt­ bedingungen. So können beispielsweise die obenerwähnten Parameter Temperatur, Sauerstoffpartialdruck, pH-Wert und das Nährstoffangebot die Leistungsfähigkeit des gesamten Systems entscheidend beeinflussen, so daß es nicht selten im Verlauf des Nitrifikationsprozesses zu einer drasti­ schen Verringerung der Umsatzraten für Ammonium oder Nitrit kommt, die darauf zurückzuführen ist, daß die Stoffwechselaktivität der Mikroorganismen beeinträchtigt wird. Die Beeinträchtigung kann sogar so weit führen, daß die für die Nitrifikation verantwortlichen Bakterien absterben oder zumindest für längere Zeit inaktivieren.

Ein Zusammenbruch der Bakterienpopulation hat weit­ reichende Folgen, denn es ist nicht nur die Leistungs­ fähigkeit des Systems für den derzeitigen Augenblick zum Erliegen gekommen, vielmehr kann es bis zu mehreren Wochen dauern, bis sich eine wirksame Bakterienpopulation wieder aufgebaut hat. Das Verstreichen einer derart langen Zeit führt aber zu hohen wirtschaftlichen Verlusten.

Zu einer vergleichbaren Situation kommt es beim Start einer neuen Anlage bzw. bei einem nicht kontinuierlichen Nitrifikationsprozeß. Nitrifikanten sind zwar natürliche, fast überall vorkommende Bakterien, ihr zahlenmäßiges Auftreten in der Natur reicht aber nicht zur industriellen Anwendung. Für einen effizienten Nitrifikationsprozeß ist eine Anreicherung dieser Organismen zumindest um den Faktor 100 erforderlich. Eine solche Anreicherung ist naturgemäß aufwendig und abhängig vom verwendeten Aus­ gangsmaterial, in dem sich die Bakterien befinden. Für gängige Nitrifikationsverfahren wird im allgemeinen Abwasser verwendet, dessen Bakterienpopulation ebenfalls stark variiert und dessen Bestand an Nitrifikanten zahlen­ mäßig nicht untersucht wird. Die Effizienz eines Nitri­ fikationsprozesses ist somit bei Anwendung bisheriger Verfahren abhängig von der natürlich vorkommenden Bak­ terienpopulation.

Ammonium, Nitrit und insbesondere auch Nitrat stören nicht nur im Abwasser, sondern müssen z. B. auch aus Trinkwasser eliminiert werden. Insbesondere bei solchen, durch andere Stoffe wenig belasteten Systemen, stellt sich das Problem der Beimpfung und Anreicherung von Nitrifikanten. Einer­ seits ist eine zusätzliche Belastung mit weiteren Ver­ unreinigungen unerwünscht, andererseits ist das zum raschen Aufwuchs von Nitrifikanten erforderliche Inoculum möglichst groß zu wählen. Der Einsatz biologischer Systeme scheitert daher häufig an dieser Diskrepanz.

Vergleichbare Probleme stellen sich auch in der Aquaristik sowie in der Teichwirtschaft. Hier kommt es regelmäßig zu toxischen Ammoniak- bzw. Nitritkonzentrationen. Insbe­ sondere werden derartige Konzentrationen beim Überbesatz der Becken oder Teiche erreicht und führen dann sehr rasch zum Fischsterben. Um diese Gefahren zu beseitigen, ist eine regelmäßige Wasserkontrolle und ggf. ein Wasser­ austausch erforderlich. Diese Maßnahmen sind jedoch sehr zeit- und kostenintensiv. Sie lassen sich auch nicht durch chemische Verfahren ersetzen.

Zur Lösung dieser Probleme ist es vorstellbar, Rein- oder Mischkulturen von nitrifizierenden Bakterien einzusetzen. Häufig scheitern derartige Vorhaben aber daran, daß zum erforderlichen Zeitpunkt keine aktiven Kulturen vorhanden sind, die unmittelbar verwendet werden können und eine jeweilige Anzucht dieser Bakterien nur unter definierten Laborbedingungen möglich ist. Darüberhinaus wäre aufgrund der extrem langen Generationszeiten dieser Organismen von bis zu mehreren Tagen eine entsprechende Anzucht un­ mittelbar vor der Anwendung unmöglich.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mittels nitri­ fizierender Bakterien ein Verfahren zur Nitrifikation zu entwickeln, das es ermöglicht, ausgehend von einer wässrigen Suspension von Nitrifikanten, die Bakterien in stoffwechselphysiologisch aktivem Zustand an ein Träger­ material zu binden, dieses lagerfähig zu trocknen, um bei Bedarf das Trägermaterial zusammen mit den Bakterien dem aus einer wässrigen Lösung zu eliminierenden Ammonium, Nitrit, und/oder Nitrat auszusetzen, wobei die für einen kurzen oder längeren Zeitraum durch Wasserentzug am Trägermaterial inaktivierten Bakterien unter Induktion ihres nitrifikationsspezifischen Enzymsystems reaktiviert werden und ihre Nitrifikationsleistung als weiterhin immobilisierte oder sich vom Trägermaterial ablösende freie und sich vermehrende Zellen wieder aufnehmen.

Desweiteren besteht die Aufgabe der Erfindung darin, einen solchen Stamm nitrifizierender Bakterien zu kultivieren, der einerseits zur Erzeugung hoher Zellerträge geeignet ist, andererseits sich bei Anzucht unter diesen Be­ dingungen anschließend auf mineralisches oder mit gelösten organischen Substanzen belastetes Medium überführen läßt, ohne daß dadurch zur Wiederaufnahme der Nitrifikations­ leistung eine lange lag-Phase entsteht, bzw. die Bakterien überhaupt nicht reaktivieren.

Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der Aufgabe dadurch, daß zunächst zur Anzucht der Nitrifikanten und zur Er­ zeugung hoher Zellerträge das für den betreffenden Stamm optimale Nährmedium ausgewählt wird. Hierfür stehen folgende Medien zur Verfügung, die sich in ihrer Zusammen­ setzung aber noch erfindungsgemäß verändern lassen.

Medien zur Anzucht von Ammoniakoxidanten

Autotrophes Medium nach Krümmel und Harms (Arch. Microbiol. (1982) 133, 50-54).

10 mM NH₄Cl; 0,1 mM KH₂PO₄; 1 mM KCl; 0,2 mM MgSO₄; 1 mM CaCl₂; Kresolrot als Indikator; 0,2 IM MnSO₄; 0,5 IM H₃BO₃; 0,15 IM ZnSO₄; 0,03 IM (NH₄)₆MO₇O₂₄; 3,5 IM FeSO₄.

Diesem Medium kann je nach Bedarf NaCl in einer Konzen­ tration von 10-200 mM zugesetzt werden.

Medien zur Anzucht von Nitritoxidanten

1. Mineralisches Grundmedium
0,5 g NaCl; 0,05 g MgSO₄×7 H₂O; 0,15 g KH₂PO₄; 7,0 mg CaCO₃; 0,05 mg (NH₄)₆Mo₇O₂₄×4 H₂O; 0,15 mg FeSO₄×7 H₂O; ad 1000 ml aqua dest.

2. Autotrophes Medium
Mineralisches Grundmedium; 0,2-2,0 g NaNO₂; pH 7,4-7,6 nach erfolgter Sterilisation.

3. Mixotrophes Medium
Mineralisches Grundmedium; 0,2-2,0 g NaNO₂; 0,55 Natriumpyruvat; 1,5 g Hefeextrakt; 1,5 g Bacto-Pepton; pH 7,4.

4. Hererotrophes Medium
Mineralisches Grundmedium; 0,55 g Natriumpyruvat; 1,5 g Hefeextrakt; 1,5 g Bacto-Pepton; pH 7,4.

Zur Anzucht von Ammoniakoxidanten dienen ausnahmslos lithoautotrophe Medien, da heterotroph wachsende Ammoniak­ oxidanten bislang nicht isoliert wurden. Allerdings können sich die Medien zur Anzucht von Ammoniakoxidanten hin­ sichtlich ihrer Salinität deutlich von einander unter­ scheiden. Die Differenzierung innerhalb dieser Organismen­ gruppe zwischen Land-, See- und Brackwasserstämmen ist geläufig. Entsprechend ist das jeweilige synthetische Medium den natürlichen Gegebenheiten angepaßt.

Nitrifikanten kommen auch in anderen Biotopen vor, denen völlig andere Wachstumsbedingungen vorliegen. Beispiels­ weise sind auf Hochbauten solche Stämme anzutreffen, die gemäß ihrer Umgebung auf oder im Gestein derart hohe Salzgehalte vorfinden und diesen angepaßt sind, daß eine optimale Anzucht auf synthetischen Medien auch unter entsprechenden Bedingungen möglich ist. Ammonium, Nitrat-, Sulfat- und Chloridkonzentrationen können hierbei Werte von bis zu 10 g/l und mehr erreichen.

Im Gegensatz zu Ammoniakoxidanten wachsen Nitritoxidanten auch in Gegenwart organischer Substrate. Einige Arten liefern beim mixotrophen oder heterotrophen Wachstum sogar deutlich höhere Zellerträge als unter rein chemolithoautotrophen Bedingungen. So zeichnet sich beispielsweise die Art Nitrobacter hamburgensis durch diese Eigenschaft aus (Arch. Microbiol. 136, 281-283). Unter mixotrophen Anzuchtsbedingungen erreicht der Zell­ ertrag Werte zwischen 30 und 35 mg Gesamtzellprotein/l. Der Zellertrag liegt somit um mehr als das Zehnfache höher als unter rein chemolithoautotrophen Bedingungen.

Nitritoxidanten, die unter heterotrophen Bedingungen ihr Wachstumsoptimum zeigen, sind bislang nicht bekannt und werden im weiteren erstmals durch die neue Art Nitrobacter nov. spec. T3 beschrieben.

Zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind hohe Zellmengen nitrifizierender Bakterien erforderlich. Nitrifikanten werden daher unter optimalen Wachstums­ bedingungen kultiviert und anschließend zur Erhöhung der Zelldichte zentrifugiert. Das sich ergebende Sediment wird anschließend resuspendiert. Grundsätzlich eignen sich zur Resuspension sogenannte "Waschlösungen", die in ihren Zusammensetzungen bis auf die die Energiequelle dar­ stellende Substanz den jeweiligen Nährmedien entsprechen. Zusätzlich kann 1 ml Glycerin/l der Suspensionslösung zugefügt werden. Bei der Resuspension werden die Bakterien bevorzugt auf eine Zellkonzentration von 10¹¹ bis 10¹² Zellen /ml eingestellt. Derartige Suspensionen lassen sich dann zur Beaufschlagung der Trägermaterialien verwenden.

Als Trägermaterialien zur Immobilisierung der Nitrifi­ kanten eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren offenporige poröse Materialien. Hierzu zählen Aktivkohle mit einer inneren Oberfläche zwischen 500 und 1500 m²/g, die vorzugsweise in gekörnter Form verwendet wird, sowie Zeolithe, die zu den silikatischen Mineralien gehören. Letztere zeichnen sich insbesondere dadurch aus, daß sie das in ihren Gitterhohlräumen enthaltene Wasser mit steigender Temperatur abgeben und beim Abkühlen wieder aufnehmen. Darüberhinaus besitzen sie Ionenaustauscher­ eigenschaften bzgl. ihrer relativ frei beweglichen Alkali-, Erdalkali- und Ammoniumionen sowie die Fähigkeit zur Adsorption bestimmter organischer Verbindungen. Als Trägermaterial läßt sich auch Sinterglas verwenden. Dieses aus Glaskörpern oder Glaspulver hergestellte Material zeichnet sich durch seine mineralischen Bestandteile sowie seine Porösität aus. Letztlich sind auch aus organischen Festkörpern bestehende Ionenaustauscher als Träger­ materialien geeignet. Sie besitzen im allgemeinen eine hydrophile Gelstruktur mit großer Oberfläche und sind als makroporöse Ionenaustauscher besonders geeignet.

Zur Beaufschlagung mit Bakterien werden die Träger­ materialien in den Resuspensionslösungen mit den Zell­ konzentrationen von 10¹¹ bis 10¹² Zellen/ml inkubiert. Die Inkubation erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von 20-30°C. Auf Trägermaterialien mit einem Volumen von 10 cm³ werden hierzu 1-5 ml der Bakteriensuspension gegeben, bis die gesamte Flüssigkeit vom Trägermaterial aufgenommen ist. Bei großer Aufnahmekapazität kann die Menge der eingesetzten Bakteriensuspension soweit erhöht werden, bis die maximale Aufnahmekapazität des Trägermaterials er­ reicht ist.

Das mit Bakteriensuspension beaufschlagte Trägermaterial wird anschließend getrocknet. Hierzu wird das Material über einen Zeitraum von beispielsweise 5 Tagen bei einer Temperatur zwischen 18 und 25°C gelagert, so daß eine schonende und gleichmäßige Wasserabgabe erfolgt. Die Trocknung kann auch dadurch beschleunigt werden, daß das beaufschlagte Trägermaterial bei Unterdruck in ent­ sprechenden Unterdruckgefäßen getrocknet wird. Hierdurch kann der Trocknungsprozeß auf 24 h verkürzt werden.

Das getrocknete und mit Bakterien beaufschlagte Träger­ material ist zur weiteren Lagerung möglichst unter Luft­ abschluß und trocken aufzubewahren. Es empfiehlt sich eine Lagerung in evakuierten und verschweißten Kunststoff­ beuteln, die anschliessend bei Raumtemperatur oder bei 4°C gelagert werden können.

Das beladene Trägermaterial kann bei Bedarf direkt ver­ wendet werden. Es ist bei der möglichst optimalen Wachs­ tumstemperatur der wässrigen Lösung zuzugeben, in der die biologischen Umsetzungsprozesse stattfinden sollen. Bei suboptimaler Temperatur verlangsamt sich der Nitrifika­ tionsprozess. Es lassen sich aber auch unter Verwendung des getrockneten Materials aktive Vorkulturen erzeugen, indem zunächst frisches synthetisches Nährmedium beimpft wird und diese Kultur dann der zu reinigenden wässrigen Lösung zugegeben wird. In beiden Fällen ist es nicht erforderlich, daß die Bakterien zur Aufnahme ihrer Nitri­ fikationsleistung am Träger immobilisiert bleiben. Sie können sich auch ablösen und als frei bewegliche Zellen stoffwechselphysiologisch aktiv werden.

Das bezeichnete Verfahren läßt sich auch zur Nitrifikation in Verbindung mit einer Nitratreduktion verwenden. Hierzu waren bisher mehrstufige biologische Prozesse notwendig, die z. B. bei der Abwasserreinigung neben einer Nitrifi­ kationsstufe eine hiervon räumlich getrennte Denitrifi­ kationsstufe vorsahen. Beide Prozesse, die Nitrifikation und die Denitrifikation wurden von stoffwechselphysio­ logisch völlig unterschiedlichen Organismengruppen be­ wirkt. Der Gesamtaufwand zur Stickstoffentfernung war daher entsprechend den andersartigen Kulturbedingungen für Nitrifikanten und Denitrifikanten erheblich.

Nitrifikanten sind unter bestimmten Voraussetzungen auch in der Lage, Nitrat bzw. Nitrit zu reduzieren und gas­ förmige Stickstoffverbindungen wie N₂O, NO oder NO₂ freizusetzen. Entscheidend hierfür ist eine Verringerung des Sauerstoffpartialdruckes im Kulturmedium. Beide Prozesse, die Nitrat- bzw. Nitritreduktion und die Ni­ trifikation laufen nebeneinander her, wobei sich in wenig oder nicht gerührten Kulturen Zonen unterschiedlicher, d.h. höherer und niedrigerer Sauerstoffpartialdrucke ergeben. In den Zonen höherer Sauerstoffpartialdrucke findet dann die Nitrifikation statt, während in Zonen niedriger Sauerstoffpartialdrucke die Nitrit- bzw. Ni­ tratreduktion erfolgt.

Die erfindungsgemäß immobilisierten Nitrifikanten lassen sich auch für ein derartiges Verfahren zur gekoppelten Nitrifikation/Nitrit- bzw. Nitratreduktion verwenden. Der besondere Vorteil von immobilisierten Zellen ergibt sich dadurch, daß die Mikroorganismen gezielt an Orte be­ stimmter Sauerstoffpartialdrucke geführt und dort zu entsprechenden Stoffwechselleistungen gebracht werden können. Eine Stickstoffelimination läßt sich somit ein­ stufig mit relativ einfachen Mitteln ohne zu verändernde Milieuverhältnisse erreichen.

Zu dem erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich im Grunde sämtliche Nitrifikanten. Es hat sich jedoch gezeigt, daß zur wirksamen Anwendung relativ hohe Zellkonzentrationen auf das Trägermaterial aufgebracht werden müssen. Diese widerum sind aus lithoautotrophen Anzuchten nur unter erheblichem und wirtschaftlich kaum zu vertretendem Aufwand herzustellen. Daher empfielt es sich, Nitri­ fikanten mixotroph oder heterotroph zu kultivieren. Die sich daraus ergebenden, im Gegensatz zur lithoautotrophen Anzucht um mehr als zehnfach höheren Zellerträge sind zur Beaufschlagung des Trägermaterials ausreichend.

Bei den meisten bisher isolierten Stämmen nitrifizierender Bakterien ist die Nitrifikationsleistung trotz hoher Zellmengen sehr gering. Dies ist als Folge des Milieu­ wechsels von Komplexmedium zu annähernd lithoautotrophen Bedingungen zu erklären. Auch der plötzliche z. B. bei der Anwendung in Aquarien auftretende relativ hohe Sauerstoff­ partialdruck, der einer Sauerstoffsättigung des Wassers annähernd gleichkommt, trägt zur Beeinträchtigung der Nitrifikationsleistung insbesondere bei den Nitrit­ oxidanten bei. Sämtliche bisher bekannte Arten von Nitrobacter zeigen dieses ungünstige Verhalten.

Die neue Art Nitrobacter nov. spec. T3 verhält sich dagegen völlig anders. Dieser Organismus unterscheidet sich zwar morphologisch kaum von bisherigen Arten, er zeigt aber deutliche physiologische, biochemische und genetische Besonderheiten. Sein wesentliches Unter­ scheidungsmerkmal ist das Wachstumsverhalten auf heterotrophem Medium sowie in Gegenwart von Nitrit. Diese und weitere Merkmale des neuen Mikroorganismus sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben und nachstehend anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 bis 4 Wachstumskurven der Art Nitrobacter nov. spec. T3 nach heterotropher Anzucht in Gegenwart unter­ schiedlicher Nitritkonzentrationen,

Fig. 5 die schematische Darstellung einer gelelektrophoretischen Trennung der Membran­ proteine aus N. nov. spec. T3 im Vergleich zu N. hamburgensis X14 und

Fig. 6 die schematische Darstellung einer gelelek­ trophoretischen Trennung der DNA aus N. nov. spec. T3 im Vergleich zu Nitrobacter hamburgensis X14.

In Fig. 1 ist die Wachstumskurve von Nitrobacter nov. spec. T3 nach heterotropher Anzucht dargestellt. Diese Kurve zeigt eine typische lag-Phase zu Beginn des Ver­ laufs, eine sich daran anschließende logarithmische Phase sowie schließlich eine stationäre Phase mit einem Plateau nach 45 Tagen. Der erreichte Zellertrag liegt mit 50 mg Gesamtzellprotein/l um ca. 60% höher als bei N. hamburgensis, der von allen Stämmen nitrifizierender Bakterien das bislang beste Wachstum zeigte.

Eine weitere physiologische Besonderheit der neuen Art N. nov. spec. T3 ist in den Fig. 2 bis 4 dargestellt. Sie zeigen Wachstumskurven für diesen Organismus in Gegenwart unterschiedlicher Nitritkonzentrationen. In allen Fällen geht mit einer Abnahme der Nitritkonzentration eine Proteinzunahme einher, wobei der nach 45 Tagen erreichte Zellertrag im Vergleich zur heterotrophen Anzucht mit zunehmender Ausgangskonzentration von Nitrit geringer wird. Fig. 2 zeigt das Wachstum bei einer anfänglichen Nitritkonzentration von 0,5 g NaNO₂/l. Der Zellertrag erreicht nach 45 Tagen einen Vergleichswert von etwa 36 mg Gesamtzellprotein/l und steigt im weiteren Verlauf bis auf etwa 38 mg Gesamtzellprotein/l an. Das eingesetzte Nitrit ist nach 15 Tagen oxidiert. Der Wachstumskurve nach Fig. 3 liegt ein Versuch mit einer Nitritkonzentration von 1,0 g NaNO₂/l zugrunde. Die Wachstumgskurve zeigt nunmehr keinen gewohnten Verlauf. Es existiert keine logarithmische Wachstumsphase. Der Proteingehalt steigt langsam und unregelmäßig an und erreicht nach 45 Tagen einen Wert von ca. 21 mg Gesamtzellprotein/l. Die eingesetzte Nitrit­ konzentration hemmt das Wachstum signifikant. Das ein­ gesetzte Nitrit ist erst nach 29 Tagen verbraucht. Eine extreme Wachstumshemmung verdeutlicht Fig. 4. Obgleich das eingesetzte Nitrit mit annähernd gleicher Umsatzrate wie bei den in Fig. 2 und 3 dargestellten Versuchen oxidiert wird, steigt der Proteingehalt hier kaum an. Erst nach 39 Tagen als die Nitritkonzentration auf 0,5 g NaNO₂/l abgefallen war, konnte eine geringe Proteinzunahme ge­ messen werden. Der Vergleichswert nach 45 Tagen beträgt ca. 13 mg Gesamtzellprotein/l und liegt damit im Vergleich zu heterotrophen Anzucht um den Faktor 4 niedriger. Dieses Wachstumsverhalten unterstreicht die starke heterotrophe Potenz dieser Art, was allerdings nicht zu Lasten des lithoautotrophen Wachstums geht. Chemolithoautotroph wächst dieser Organismus im Vergleich zu übrigen Ver­ tretern dieser Gattung ähnlich.

Eine wesentliche Eigenschaft zeichnet N. nov. spec. T3 dadurch aus, daß nur relativ kurze Anpassungszeiten erforderlich sind, um bei veränderten Sauerstoffpartial­ drücken, insbesondere Erhöhungen, zu nitrifizieren. Der Nachteil einer mangelnden Adaptationsleistung bei her­ kömmlichen Arten beeinträchtigt, wie bereits dargestellt, das erfindungsgemäße Verfahren. Durch die Verwendung dieses neuen Bakteriums wird erstmalig die Beeinträch­ tigung durch "Sauerstoffstreß" bei Nitritoxidanten über­ wunden.

Auch die Induktion der Nitritoxidoreduktaseaktivität läßt sich messen. Nitritoxidoreduktase ist das membrangebundene Schlüsselenzym der Nitritoxidation. Es ist nach bisherigen Kenntnissen induzierbar sowohl durch Nitrit als auch durch Nitrat. Seine Aktivität läßt sich dagegen durch die Erhöhung des Sauerstoffpartialdrucks steigern. Mikrokal­ orimetrische Versuche haben ergeben, daß für N. nov. spec. T3 8 bis 10 Stunden ausreichen, um nach Erhöhung des Sauerstoffpartialdrucks bis zur Sauerstoffsättigung eine Induktion der Nitritoxidoreduktaseaktivität zu erreichen, die aufgrund einer meßbaren Wärmeentwicklung bei der Nitritoxidation erkennbar ist.

Gegenüber allen anderen Stämmen der Gattung Nitrobacter zeigt N. nov. spec. T3 auch eine biochemische Besonder­ heit, die in einer gelelektrophoretischen Trennung der Membranproteine deutlich wird. Fig. 5 zeigt eine SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese dieser Proteine. Die große Untereinheit der Nitritoxidoreduktase hat bei allen bislang untersuchten Stämmen ein relatives Molekular­ gewicht von 115 000. Bei N. nov. spec. T3 weicht das Molekulargewicht hiervon ab und liegt bei ca. 130 000. Aber auch andere Membranproteine sind in ihrem relativen Molekulargewicht verändert. So besitzt die 2. Untereinheit der terminalen Oxidase, das Cytochrom aa₃, bei N. nov. spec. T3 ein mit 27 000 um ca. 1000 geringes relatives Molekulargewicht als in den übrigen Fällen. Das membran­ gebundene Cytochrom c liegt hingegen nach gelelektro­ phoretischer Trennung etwas oberhalb der auch für alle anderen Arten typischen Vergleichsbande aus N. hamburgensis X14.

Genetisch wird N. nov. spec. T3 ferner durch den Besitz eines großen Plasmides charakterisiert. Plasmide sind bei Nitrobacter bislang nur bei Stämmen der Art N. hamburgensis nachgewiesen worden. Sämtliche unter­ suchten Stämme der Art N. winogradskyi sind dagegen plasmidfrei. Diese Tatsache hat im Laufe der Zeit dazu geführt, den Besitz zumindest bestimmter Plasmide wie beispielsweise im Falle von N. hamburgensis als Art­ charakteristikum zu deuten. Beide bislang bekannten Stämme dieser Art zeigen ein identisches Plasmidmuster aus drei verschieden großen Plasmiden pPB11, pPB12, pPB13 bzw. pPB21, pPB22 und pPB23 mit Molekulargewichten von 76, 124 bzw. 182 MD (Pohl, Dissertation, Universität Hamburg, N. nov. spec. T3 weist dieses Plasmidmuster nicht auf, sondern besitzt nur ein Plasmid. Gelelektrophoretische Molekulargewichtsbestimmungen ergeben für dieses Plasmid ein relatives Molekulargewicht von 80 ±3 MD. Fig. 6 zeigt, schematisch dargestellt, eine gelelektrophoretische Trennung der Plasmide aus N. hamburgensis und N. nov. spec. T3 nach Cäsiumchlorid Ethidiumbromid- -Dichtegradientenzentrifugation. Das Plasmid aus N. nov. spec. T3 genannt pPB31, zeigt dabei eine relative Mobili­ tät die zwischen der der Referenzplasmide pPB11 und pPB12 liegt. Hieraus läßt sich das Molekulargewicht von 80 ±3 MD ermitteln.

Der Besitz genau eines Plasmides ist für N. nov. spec. T3 charakteristisch. Es fällt auf, daß dieses Plasmid pPB31 auch bei unterschiedlichen Anzuchtsbedingungen stabil ist. Ein Plasmidverlust konnte auch ohne zusätzlichen Selek­ tionsdruck nicht beobachtet werden. Selbst der Einsatz mutagener Agenzien führte nicht zu einem Auftreten plas­ midfreier Mutanten. Es ist daher anzunehmen, daß bei der Kultivierung von N. nov. spec. T3 unter den angegebenen Bedingungen eine Expression stoffwechselphysiologisch relevanter Plasmidgene erreicht und somit ein Selektions­ druck zur gezielten Plasmidreplikation entsteht. Daß sich N. nov. spec. T3 aber genotypisch von allen bisher bekann­ ten Nitritoxidanten durch den Besitz dieses Plasmides unterscheidet, läßt die Plasmidfunktion naheliegend mit den physiologischen Leistungen dieses Bakteriums in Verbindung treten. Einem plasmidfreien Stamm wird es somit an den wesentlichen Stoffwechselleistungen fehlen.

N. nov. spec. T3 bietet nicht nur bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens Vorteile gegenüber bisher bekannten Nitritoxidanten, sondern zeichnet sich auch durch lange Zeiten stoffwechselphysiologischer Aktivität in ruhenden Kulturen aus. So sind z. B. mikroaerophil auf heterotrophem Medium kultivierte Zellen noch nach drei Monaten aktiv. Sie lassen sich nach dieser und noch nach längerer Zeit lithotroph in sauerstoffreichem Medium kultivieren und beginnen dort nach wenigen Tagen mit der Nitrifikation. Diese besondere Stoffwechselleistung, das überdurchschnittlich gute Wachstum unter heterotrophen Bedingungen sowie die sich daran anschließende lithotrophe Nitrifikation ohne längere Adaptationszeiten zeichnen diesen Organismus ebenso aus wie seine Sauerstofftoleranz nach mikroaerophiler Anzucht.

Claims (22)

1. Verfahren zur Nitrifikation mittels immobilisierter nitrifizierender Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von einer wässrigen Suspension de­ finierter Nitrifikanten die Bakterien in stoffwech­ selphysiologisch aktivem Zustand an einem offenporigen porösen Trägermaterial wie Aktivkohle, Zeolith, Keramik, Sinterglas oder Ionenaustauschern fixiert werden und das Trägermaterial anschließend mit den beaufschlagten Bakterien getrocknet wird und bei Bedarf die Bakterien zusammen mit dem Trägermaterial dem aus einer wässrigen Lösung zu eliminierenden Ammonium, Nitrit oder Nitrat ausgesetzt werden, wobei die für einen kurzen oder längeren Zeitraum durch Wasserentzug am Trägermaterial inaktivierten Bakterien unter Induktion ihres nitrifikationsspezifischen Enzymsystems reaktiviert werden und ihre Nitrifi­ kationsleistung als weiterhin immobilisierte oder sich vom Trägermaterial ablösende freie und sich ver­ mehrende Zellen wieder aufnehmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beaufschlagung des Trägermaterials Reinkulturen chemolithoautotroph, mixotroph oder heterotroph kultivierter Nitrifikanten aus der logarithmischen Wachstumsphase verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beaufschlagung des Trägermaterials Reinkulturen chemolithoautotroph, mixotroph oder heterotroph kultivierter Nitrifikanten aus der stationären Wachs­ tumsphase verwendet werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 unter Verwendung eines Bakterienkonzentrats mittels Zentrifugation der Flüssigkultur und anschließender Resuspension der Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beaufschlagung des Trägermaterials die Zellen in einer mineralischen Grundlösung oder sterilisiertem Leitungswasser re­ suspendiert werden und eine Zellkonzentration von 10¹¹ bis 10¹² Zellen/ml eingestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der mineralischen Grundlösung oder dem sterilisierten Leitungswasser Glycerin in einer Konzentration von 1 ml/l zugesetzt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Trägermaterial mit einer Sus­ pension nitrifizierender Bakterien vollständig ge­ tränkt und anschließend zur Trocknung bei 20°C für mehrere Tage gelagert wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Trägermaterial mit einer Sus­ pension nitrifizierender Bakterien vollständig ge­ tränkt und anschließend bei Atmosphärenunterdruck in Unterdruckgefäßen bei 20°C getrocknet wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das getränkte, mit Nitrifikanten beaufschlagte Trägermaterial zur weiteren Lagerung bei einer Temperatur im Bereich von 4°C bis 20°C unter Luftabschluß gehalten wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das getrocknete, mit Nitrifikanten beaufschlagte Trägermaterial zur weiteren Lagerung in Kunst­ stoffolien eingeschweißt wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß Reinkulturen ammoniakoxidierender und/oder nitritoxidierender Bakterien verwendet werden, die an hohe Sulfat-, Chlorid-, Ammonium-, Nitrit- und/oder Nitratkonzentrationen von bis zu 50 g/l angepaßt sind.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß heterotroph wachsende und unter diesen Bedingungen hohe Zellerträge erzielende Ni­ trifikanten verwendet werden, die sowohl nach aerober als auch mikroaerophiler Anzucht gegenüber höheren Sauerstoffpartialdrücken unempfindlich sind und ihre Nitrifikationsleistung unter diesen Bedingungen erbringen.

12. Verfahren zur Nitrifikation nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von einer nitrathaltigen wässrigen Lösung das Nitrat durch Nitrifikanten reduziert, die Reaktionsprodukte Ammonium und Nitrit in einem kontinuierlichen Prozess wieder zu Nitrat oxidiert und dabei gasförmige Stick­ stoffverbindungen wie N₂O, NO oder NO₂ freigesetzt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion des Nitrits bzw. des Nitrats durch Nitrifikanten bei vermindertem Sauerstoffpartialdruck durchgeführt wird.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13 zur Abwasser- und/oder Trinkwasserreinigung, dadurch gekennzeichnet, daß eine Stickstoffelimination aus Gewässern unter Verwendung von Nitrifikanten durchgeführt wird.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in mit Ammonium, Nitrit und/oder Nitrat belasteten natürlichen oder künstlichen Gewässern eine Nitrifikation in situ durch Zugabe des Bakterien­ materials durchgeführt wird.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in mit Ammonium, Nitrit und/oder Nitrat belasteten natürlichen oder künstlichen Gewässern eine Stickstoffelimination in situ durch Zugabe des Bak­ terienmaterials durchgeführt wird.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Trägermaterialien nach erfolgter Ni­ trifikation in ein anderes System überführt und dort zur erneuten Nitrifikation bzw. Nitratreduktion verwendet werden.

18. Mikroorganismus der Gattung Nitrobacter zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 17, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mi­ kroorganismen, D-3400 Göttingen, Eingangsnummer DSM 4153, isoliert aus einer Bodenprobe unter selektiven Bedingungen, heterotroph wachsend bei einer Temperatur im Bereich von 20-30°C in stehenden, nicht ge­ rührten und nicht geschüttelten Kulturen, gekenn­ zeichnet durch

• a) schnelleres heterotrophes als mixotrophes und lithoautotrophes Wachstum,
• b) hohe Zellerträge von 50 mg Gesamtzellprotein/l bei heterotropher Anzucht
• c) die Fähigkeit in ruhenden Kulturen unter mi­ kroaerophilen Bedingungen lange Zeiten von min­ destens sechs Monaten überdauern zu können,
• d) die Sauerstofftoleranz bei Sauerstoffsättigung des Mediums nach mikroaerophiler, heterotropher Anzucht,
• e) die 2-4 Tage nach Sauerstoffzugabe einsetzende Nitrifikationsleistung nach mikroaerophiler Anzucht,
• f) die leichte Reaktivierbarkeit bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens,
• g) den Besitz eines Plasmids mit einem Molekulargewicht von 80 ±3 MD.

19. Plasmid-DNA aus dem Mikroorganismus der Gattung Nitrobacter nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmid-DNA in vivo in kovalent-geschlossen- circulärer Form vorliegt, und, ausgehend von dem elektrophoretischen Wanderungsverhalten in einem 0,5 %igen Agarose-Gel, größer ist als das 76- und kleiner als das 124-MD-Referenzplasmid aus N. hamburgensis X14.

20. Plasmid-DNA nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht 80 ±3 MD beträgt.

21. Plasmid-DNA nach den Ansprüchen 19 und 20, erhältlich durch in vivo Replikation in dem Mikroorganismus der Gattung Nitrobacter nach Anspruch 17 durch aerobe oder mikroaerophile Anzucht der Zellen unter lithoautotrophen, mixotrophen oder heterotrophen Kulturbedingungen.

22. Plasmid-DNA nach den Ansprüchen 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmide ohne zusätzlichen Selektionsdruck identisch repliziert und auf Tochter­ zellen übertragen werden können.