JPH03501081A

JPH03501081A - 硝化細菌による硝化および窒素除去方法

Info

Publication number: JPH03501081A
Application number: JP88506343A
Authority: JP
Inventors: ボック，エベルハルト
Original assignee: テトラ・ヴエルケ，ドクター・レル・ナト・ウルリツヒ・バエンシユ・ゲー・エム・ベー・ハー
Priority date: 1987-07-21
Filing date: 1988-07-19
Publication date: 1991-03-14
Also published as: EP0377595A1; WO1989000547A1; DE3724027C2; DK16090D0; AU2131988A; HUT52742A; DE3724027A1; DK16090A; NO900299D0; KR890701480A; NO900299L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ）単独で残された、微好気性条件下での培養において、少なくとも６か月の長期間生存する能力、ｄ）微好気性、従属栄養的増殖の後の、酸素飽和培地における耐酸素性、ｅ）微好気性増殖の後の、酸素供給後２−４日後に開始する硝化活性、ｆ）この発明による方法における良好な再活性化、ｇ）８０±３　ＭＤの分子量を有するプラスミド、で特徴付けられる微生物。

８、請求の範囲第７項に記載のＮ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ属の微生物からのプラスミドＤＮＡであって、０．５％アガロースゲルにおける電気泳動での移動による８０±３　ＭＤの分子量を有し、インビボにおいて共有結合的に閉環した環状ＤＮＡであることを特徴とするプラスミドＤＮＡ０９、好気的または微好気的、および無機栄養的、混合栄養的または従属栄養的細胞培養の下で、請求の範囲第７項に記載のＮｉ　ｔｒｏｂａｃｔｅｒ属の微生物中において、インビボで複製することによって達成することができる請求の範囲第８項に記載のプラスミドＤＮＡ０１０、プラスミドが選択圧をさらに加えることなしに全く同一に複製され、かつそれが娘細胞に移ることを特徴とする請求の範囲第８項および第９項に記載のプラスミドＤＮＡ。

明細書硝化細菌による硝化および窒素除去方法この発明は、硝化細菌による硝化および窒素除去方法に関する。

硝化は、亜硝酸塩を経て硝酸塩に至るアンモニアの生物学的な転換を意味する。

一般に、その原因である細菌の２つの群が現存し、その全てが硝化作用体（ｎｉｔｒＨｙｅｒｓ）である。

亜硝酸酸化細菌（ｎｉｔｒｉｔｅ　ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ）が亜硝酸塩を酸化して硝酸塩とするのに対して、アンモニア酸化細菌（ａｍｍｏｎｉａ　ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ）はアンモニアを酸化して亜硝酸にする。

それらの本来の代謝のために、硝化作用体は産業において非常に重要である。それらの代謝は、例えば、排水プラントにおいて使用されており、そこでは個々の硝化工程がアンモニアの転換の原因となっている。しかしながら、硝化が完了した後であっても現実の窒素の除去が完了していないという不利な点がある。窒素は、どちらかというと硝酸塩の形態をとる。次の硝酸塩転換は、脱窒素と呼ばれる窒素の除去を通して起こり、これは特別かつ複雑な方法である。しかしながら、この方法は、非常にコストがかかり、そのため少数の汚水プラントにおいて使用されるのみであろう。

この発明の目的は、硝化細菌により、単純かつ対費用効率の高い方法を通して硝化および窒素除去を達成することが可能になるように、上述の方法を改良することにある。

さらに、それは、初期水性懸濁液の硝化細菌を代謝的に活性な状態で支持部材に固定し、かつ高い安定性を達成するために細菌を乾燥することが可能でなければならない。必要であれば、支持部材は細菌と一緒に水溶液にさらされ、それによって水の除去によって短期間もしくは長期間不活性化された支持部材上の細菌を再活性化する。上記水溶液は、そこからアンモニア、亜硝酸塩、および／または硝酸塩が除去されるものである。細菌が依然として固定されており、または支持部材から分離された可動細胞である限り、それらの特異的な硝化酵素系を導入し、硝化を再び開始する。

この発明のさらなる目的は、高い細胞収量を達成することが可能であり、続いて、これらの条件の下で増殖させたときに無機培地または溶解した有機基質を含有する培地に移すことが可能であるような硝化細菌の株を育てることにあり、この株はさらに、硝化プロセスが開始されたときに遅滞期がなく、かつ細菌の完全な不活性化はない。

この発明によって、この問題は解決される。この解決においては、微生物Ｎｉ　ｔｒｏｂａｃｔｅｒ凹ｖ、　ｓＢｇ、、　Ｔ３の選択および使用によるものの他に、初期水溶液中に含有される硝酸塩が硝化細菌によって還元され、そのようにして得られた反応生成物、アンモニアおよび亜硝酸塩が酸化の連続プロセスにおいてアンモニアおよび亜硝酸酸化細菌によって硝酸塩に再変換され、Ｎ２０またはＮＯのような気体状窒素化合物が放出される。

硝酸塩の還元は、亜硝酸塩酸化細菌、特にＮ１ｔｒｏｂａｃｔ、ｅｒ属の細菌によって起こる。これらの微生物が独占的に使用されている場合には、そのようにして得られた少量のアンモニアが再び酸化されることはない。したがって、窒素除去を最大にするためには、亜硝酸酸化細菌だけではなく、例えば、Ｎｔｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ　５Ｎｉｔｒｏｓｏｖｉｂｒｉｏ、またはＮｆｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ属のアンモニア酸化細菌を使用することが有利である。次に、亜硝酸塩還元由来の他に硝酸塩からのアンモニア、または予備のアンモニアを反応プロセスに導入する。

まず、高い細胞収量を達成させるために、各株に最良の増殖培地を選択する。下記の培地は利用可能であり、その組成を変更することもできる。

アンモニア酸化細菌用増殖培地ＫｒｉｉｍｍｅｌおよびＨａｒｍｓ　（Ａｒｃｈ、ＭＩｃｒｏｂｌｏｌ、（１９８２）　１３３．５０−５４　）による無機栄養培地（ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｍｅｄｉｕｍ）ＮＨ４ＣＩ　ＩＯＩＯＭ　；　ＫＨ２ＰＯ４０，ＩＩｎＭ；　ＫＣｊ　１ｍＭ；ＭｇＳＯ４０，２ｃＭ　；ＣａＣ１２１１１Ｍ　；指示薬としてのクレゾールレッド；　ＭｎＳＯ４０，２ＪＩＭ；　Ｈ３ＢＯ３０，８ｇＭ；ＺｎＳＯ４０，１５１１Ｍ；　（ＮＨ４）５ＭＯ７０ａ４０．０３ｇλｌ；　ＦｅＳＯ４３，５ｇＭこの培地に、１０−１００ｍＭの濃度でＮａＣｊを添加することができる。

１、無機塩培地ＮａＣｊ　０．５ｇ　；　ＭｇＳＯ４４Ｈ２００，０５ｇ　；　ＫＨ２ＰＯ４０，１５ｇ　；ＣａＣＯ３７，Ｏｇ　；　（ＮＨ４）６ＭｏｑＯｓ４−　４Ｈａ０　０．０５　ｍｇ　；ＦｅＳＯ４４Ｈ２００，１５ｒＩｌｇ　；蒸留水を加えて１０００−２、無機栄養培地無機塩培地；　ＮａＮＯ２０，２−２，０ｇ　；殺菌後ｐＨ７，４−７，６３、混合栄養培地無機塩培地；　ＮａＮＯ２０，２−２，Ｏｇ　Ｈピルビン酸ナトリウム０．５５　ｇ　；酵母エキス１．５ｇ　；ペプトン１．５ｇ。

ｐＨ７，４４、従属栄養培地無機塩培地；ピルビン酸ナトリウム０．５５　ｇ　；酵母エキス１．５ｇ　；ペプトン１．５ｇ　；　ｐＨ７，４アンモニア酸化細菌の培養には無機力源生物用培地（Ｉｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｍｅｄｉａ）のみが使用される。これは、今までに有機力源アンモニア酸化細菌が単離されていないためである。しかしながら、アンモニア酸化細菌培養のための培地は塩濃度に関して異なっていても良い。この群の中では、陸性、海性、塩水様の間の区別は共通である。この区別に対応して、人工的な培地が自然の状態に適合される。

アンモニア酸化細菌とは対照的に、亜硝酸酸化細菌は有機基質の存在下において増殖する。混合栄養的もしくは従属栄養的に培養された場合には、いくつかの種が完全な無機栄養的条件下よりも高い細胞収量を示しさえする。それは、例えば、Ｎ１ｔｒｏｂａｅｔｅｒ　ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ種（Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３Ｂ、２８１−２８３　）で特徴付けられる。混合栄養的増殖条件下において、細胞収量は３０ないし３５ｍｇ全細胞タンパク質／ｇである。

したがって、細胞収量は完全な無機栄養的条件下よりも１０倍高い。

従属栄養的条件下においてそれらの最大増殖を示す亜硝酸酸化細菌は、今まで知られておらず、新種であるＮ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｎｏｖ、　」狙東Ｔ３によって最初に記述されるであろう。

この発明による方法の適用には、多細胞量の硝化細菌が必要である。したがって、硝化細菌を最良の増殖条件下で培養し、続いて濃縮して高い細胞密度を達成する。次いで、濃縮物を再懸濁する。一般に、特別の増殖培地に適合した組成を有するがエネルギー源として使用される基質を含まない、いわゆる「洗浄液」が再懸濁に使用される。再懸濁には、１０１１ないし１０１２細胞／ｄの細胞濃度が好ましい。そのような懸濁液は、支持部材の充填（ｌｏａｄ）に使用することができ、または直接プロセスに使用することもできる。

この発明による方法に使用される硝化細菌の固定のための支持部材として、開口多孔性材料が使用される。これらの材料は、５００ないし１５００ｒｒｆ／ｇの内部表面積を有し、かつ好ましくは粒状である活性炭、およびケイ酸塩であるゼオライトである。特に、ゼオライトは、温度が上昇したときにそれらの格子空間から水を放出し、冷却したときにそれを取り込むことを特徴とする。さらに、それらは遊離アルカリ、アルカリ土類、およびアンモニアイオンに関してイオン交換特性を有し、かつある有機化合物を吸着することができる。結局、有機的な固体本体からなるそのようなイオン交換体を支持部材として使用することができる。それらは一般に、マクロ細孔イオン交換体として使用するために、大きな表面を有する親水性ゲル構造を有する。セラミックスも支持部材として使用することができる。

支持部材に細菌を充填するために、それらを１０１１ないし１０１２細胞／−の細菌懸濁液中でインキュベートする。このインキュベーションは２０ないし３０ ℃の温度で行なう。１０３ｃｌｌ（の体積の支持部材に、１−５１の細菌懸濁液を、全ての懸濁液が支持部材に吸着されるまで供給する。取り込み能力が高い場合には、支持部材の最大取り込み能力に達するまで供給される細菌懸濁液の体積を増加することができる。

次に、細菌懸濁液を供給された支持部材を乾燥する。このため、水分蒸発が念入りかつ安定したものであるように、この部材を１８ないし２５℃の温度で、例えば５日間保存する。細菌を供給された支持部材が真空容器中において減圧下で乾燥される場合には、乾燥プロセスを促進することができる。これにより、乾燥プロセスに要する時間を２４時間に短縮することができる。可能であるならば、細菌を供給された乾燥支持部材は、乾燥しかつ空気がない状態で保存するべきである。

空であり、かつ気密性のプラスチックバッグに保存することが勧められる。このバッグは、次に、室温もしくは４℃で保存することができる。

必要であるならば、充填された支持部材を直ちに使用することができる。生物学的な代謝プロセスのために、それを最適増殖温度の水溶液に供給するべきである。次善の温度では、硝化プロセスはより遅いものになる。新鮮な増殖培地が接種されている場合には、乾燥部材から活性の前培養物を生成することもできる。これは、次に、処理しようとする水溶液に供給される。両方の場合において、硝化プロセスの開始には、細菌が支持体上に固定されて留まる必要はない。それらは、離れても良く、可動細胞として代謝的に活性になることもできる。

まず第一に、硝化工程および分離された脱窒素工程を有する、廃水処理および飲料水精製の複数工程プロセスを合わせることが可能である。結果として、窒素除去に対する総費用は減少する。

ある条件下では、硝化細菌は硝酸および亜硝酸をそれぞれ減少させ、かつＮ２０またはＮＯである気体状窒素化合物を除去する。しかし、培養培地中の酸素分圧を減少することが必要である。亜硝酸還元および硝酸還元と硝化作用との両者は平行なプロセスである。撹拌されていないかまたは穏やかに撹拌された培養物は、高酸素分圧および低酸素分圧の異なる領域を示す。亜硝酸および硝酸還元が低酸素分圧の領域において起こるのに対して、硝化作用は高酸素分圧の領域において起こる。この発明によると、固定された硝化細菌は、合体された硝化作用および亜硝酸もしくは硝酸還元を用いたプロセスにも用いることができる。固定した細胞の特別な利点は、微生物を、それらの代謝プロセスを開始することができる特別な酸素分圧に適用することにある。したがって、環境を変えることなく、比較的簡単な方法によって、一工程で、窒素の除去が可能である。

しかしながら、硝化作用および窒素除去プロセスは、廃水処理および飲料水の精製にしか使用できないわけではない。

それは、高窒素汚染の水のほとんどに適用し得る。アンモニア、亜硝酸塩および／または硝酸塩で汚染された天然もしくは人工水において、その場で細菌を供給することにより、合体した硝化作用／窒素除去を行なうことができる。水産養殖に対する関心は大きくなっている。集約的な魚の養殖は、一様に、魚を殺す毒性窒素の濃縮に帰着する。硝化細菌を用いた場合には、水から結合した窒素を除去する条件下において、亜硝酸を転換することができる。

一般に、全ての硝化細菌をこの発明によるプロセスに使用することができる。しかしながら、効率的な適用のためには、比較的高い細胞濃度が必要である。無機栄養培養がらは、これらは多大な、かつ不経済な努力をすることでのみ達成することができる。したがって、混合栄養的または従属栄養的に硝化細菌を増殖させることが勧められる。無機栄養的な増殖と比較して１０倍高い細胞収量は、支持部材の充填に充分である。

今までに単離された硝化細菌の多くの株は、高細胞濃度においてさえも硝化率が低い。これは、従属栄養培地がらほとんど無機栄養的な条件への変化のためである。しがしながら、例えば水槽内において、細菌が直ちにさらされ、かつ水のおおよその酸素の飽和を生じる比較的高い酸素分圧も硝化プロセス、特に硝化細菌の硝化プロセスに影響を与える。これは、Ｎ１ｔｒｏｂａｃｔｃｒの公知の全ての種について真実である。

新種Ｎ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ匹ｖ、　並±Ｔ３は完全に異なる。この生物は、無機塩培地上で１年かけて選択した。今までに知られている種との形態学的な相違はないにもかかわらず、重要な生理学的、生化学的および遺伝学的特性がある。

主な特徴は、亜硝酸塩の存在下の他に従属栄養培地で増殖することである。

この生物の特徴は以下の通りである。

−混合栄養的および無機栄養的な増殖よりも従属栄養的に増殖する、一従属栄養的に増殖させた場合の、５０＋ｎｇ全細胞タンパク／Ωの高細胞収量、一徹好気性条件下の培養物中に、単独で、少なくとも６か月の長期間にわたって生存する能力、 −微好気性従属栄養的に増殖させた後の、酸素飽和培地における耐酸素性、一酸素供給後２−４日後に開始される微好気性増殖後の硝化作用、ｍ：の発明によるプロセスにおける良好な再活性化、−８０±３　ＭＤの分子量を有するプラスミド。

インビボにおけるプラスミドＤＮＡは、０．５％アガロースゲル中の電気泳動での移動による８０±３　ＭＤの分子量を有する、共有結合的に閉環した環状ＤＮＡである。それは、好気性または微好気性の無機栄養的、混合栄養的まｔ：は従属栄養的細胞培養条件下で、前述のＮｉ　ｔｒｏｂａｃｔｅｒ属の微生物におけるインビボでの複製によって達成することができる。プラスミドは、さらに選択圧を加えることなく全く同一に複製され、娘細胞に移る。新規微生物のこれらの特徴および他の特徴は、図面に従って以下に説明されるであろう。それらは、以下のものを示す。

第１図ないし第４図：異なる亜硝酸塩濃度における従属栄養的な増殖の後のＮ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｎｏｖ、翌±Ｔ３種の増殖曲線、第５図：　Ｎ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈａｌＩｌｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　Ｘ１４と比較したＮよｎｏｖ、　１２匹、Ｔ３に由来する膜タンパク質のゲル電気泳動による分離の模式図、および、第６図：　Ｎ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　Ｘ１４と比較したＮよｎｏｖ、　５ｐｅｃ、　Ｔ３に由来するＤＮＡのゲル電気泳動分離による分離の模式図。

、Ｔ３の増殖曲線を示している。この曲線は最初に典型的な遅滞期を示し、次いで対数増殖期、および最後に４５日後にプラトーを有する安定期を示す。達成された細胞収量は、５０ｍｇ全の全ての硝化細菌の中で最も増殖するものである。

新種Ｎ、　ｎｏｖ、　５ｐｅｃ、　Ｔ３のさらなる生理学的特徴を第２図ないし第４図に示した。それらは、異なる濃度の亜硝酸塩の存在下におけるこの生物の増殖曲線を示す。タンパク質の増加は常に亜硝酸塩の減少と相互に関係する。そのため、４５日後に達成された細胞収量は従属栄養的な増殖に比較して少なく、０．５ｇＮａＮ０□／ｆｌの初期亜硝酸塩濃度の増加に従って減少する。細胞収量は、４５日後に約３６＋ｎｇ全細胞タンパク／ρの比較値に達し、さらに３８ｍｇ全細胞タンパク／ρに増加する。

第３図の増殖曲線は、亜硝酸塩濃度１．０ｇＮａＮＯ２／Ωである実験からのものである。増殖曲線は、異例のものである。それは、対数増殖期を示さない。タンパク質量は徐々に、かつ不規則に増加し、４５日後に約２１ｍｇ全細胞タンパク／ｆｌの値に達する。初期亜硝酸塩濃度は、増殖を著しく阻害する。初期の亜硝酸塩は、２９日目以前には消費されない。著しい増殖阻害を第４図に示す。亜硝酸塩の転換率が第２および第３図に示される実験におけるものとほぼ同じであるにもかかわらず、増加したタンパク質量はわずかである。ついには、３９日後、亜硝酸塩濃度がわずか０．５ｇＮａＮＯ２／Ωとなったとき、タンパク質の低増加を測定することができた。４５日後の比較値は、わずか約１３ｍｇ全細胞タンパク／Ωである。従って、従属栄養的な増殖と比較してｌ／４である。この増殖特性は、この種の従属栄養的な性質を示している。しかし、それは無機栄養的な増殖に影響を与えるものではない。この生物の無機栄養的な増殖は、同属の他の株に似ている。

Ｎ、　ｎＯＶ、Σｐｅｃ、Ｔ３の重要な特徴は、酸素分圧を変化させた後の、特に増加させた後の硝化作用に必要な適合時間が短いことである。前述のように、通常の種に知られている適合性の乏しさの不利益はこの発明によるプロセスに影響を与える。

硝化細菌に対する「酸素圧」の問題が新規細菌によって解決されたのはこれが初めてである。

亜硝酸酸化還元酵素活性の導入を測定することも可能である。亜硝酸酸化還元酵素は、亜硝酸塩酸化の膜結合鍵酵素である。今までに知られているように、それは、硝酸塩の他に亜硝酸塩によって導入されている。しかしながら、その活性の増加は、酸素分圧が増加するときにのみ可能であった。亜硝酸塩を酸化する間の測定可能な発熱によって決定された、Ｎ、　ｎｏｖ、　５ｐｅｃ、Ｔ３を用いた微小熱量測定（ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｌＣ）実験は、酸素分圧が酸素飽和状態まで増加された後、亜硝酸酸化還元酵素の導入には８ないし１０時間で充分であるこる生化学的特徴を表わす。第５図は、これらのタンパク質を用いた５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。亜硝酸酸化還元酵素の大きなサブユニットは、１１５，０００の相対分子量を有１．２でいる。これは、今までに研究された全ての株と同じである。これと比較して、Ｎ、　ｎｏｖ、　５ｐｅｃ、　Ｔ３においては分子量は１３０，０００である。そして、他の膜タンパク質も異なる相対分子量を有している。、例えば、末端酸化酵素チトクロムａａ３の２．サブユニットは、Ｎ、　ｎｏｖ、　５ｐｅｃ、　Ｔ３においては２７．０００の相対分子量を有しており、これは他と比較して約１．．０００低いものである。一方、ゲル電気泳動におけるドの多少上に位置する。これは、他の全ての種に典型的なら特徴付けると説明された。この種の両方の株は同一のプラスミドパターンを示す。このプラスミドパターンはそれぞれ３種類の異なるプラスミドｐＰＢ１１、ｐＰＢ１２、ｐＰＢ１３およびｐＰＢ２１、ｐＰＢ２２、ｐＰＢ２３からなる。これらは、７６．１２４、および１８２　ＭＤの分子量を有する（Ｐｏ旧、ＴｈｅｓｆｓＳＬｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｒＨａｍｂｕｒｇ　、　１９６８）。

このプラスミドパターンの代わりに、Σｎｏｖ、　ｚユニ３は唯１つのプラスミドを有する。このプラスミドは、ゲル電気泳動によって決定された８０±３　ＨＤの相対分子量を有する。

第６図は、セシウムクロライド・エチジュウムブロマイド密度勾配遠心の後のＮ、ｈａｍｂυｒｇｅｎｓ　ｉ　ｓおよびＬ凹しΣ幕匹。

Ｔ３のプラスミドのゲル電気泳動による分離を模式的に示す。

参照プラスミドｐＰＢｌｌおよびｐＰＢ１２の間にある、ｐＰＢ３１と命名されたＮ、　ｎｏｖ、Σｐｅａ工Ｔ３からのプラスミドは比較的可動性を有する。これから、８０±３　ＭＤの分子量が計算された。

厳密に、１つのプラスミドがＮ、　ｎｏｖ、　５ｐｅｃ、　Ｔ３を特徴付けている。このプラスミドは、異なる培養条件の下でさえも非常に安定である。さらに選択圧を加えることのない状態では、プラスミドの損失も検出されなかった。突然変異誘発物質でさえ、プラスミドのない突然変異体を作り出すことはない。プラスミドの複製によって選択圧が達成されるように、Ｎ、　ｎｏｖ、　５ｐｅｃ、　Ｔ３が上述の条件下で培養された場合に、代謝の面で重要なプラスミド遺伝子の発現が考えられる。この細菌の生理学的な特性は明らかにプラスミドの機能に依存している。これは、Ｎ、　ｎｏｖ、　５ｐｅｃ、　Ｔ３が今までに知られている他の全ての亜硝酸塩酸化細菌と遺伝学的に異なるためである。したがって、プラスミドのない株には本質的な代謝機能は存在しない。

Ｎ、　ｎｏｖ、　５ｐｅｃ、　Ｔ３は、この発明による方法に使用された場合に公知の亜硝酸酸化細菌と比較して利点を有するだけではなく、撹拌されていない培養物中で長期間代謝的に活性である。例えば、従属栄養培地で増殖した微好気性細胞は、３か列後でも依然として活性である。その時点もしくはその後以降、それらは酸素に富む培地で無機栄養的に培養され、そこ養的な条件下での優れた成長、および続く長期の適合を必要としない無機栄養的な硝化作用は、ちょうど微好気性増殖の後の耐酸素性と同様に特有の特色である。

ＦＩＧ、　６ａ：　Ｎ　ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　Ｘｌｌ；国際調査報告ｌＡ＃Ｈ１ＰＣＴＩＥＰ８８１００６５１国際調査報告ＥＰ　８８００６５１

Claims

【特許請求の範囲】

１．硝化細菌による硝化および窒素除去方法であって、初期水溶液中に含有される硝酸塩を硝化細菌によって還元し、それにより得られた反応生成物、アンモニア、および亜硝酸塩を酸化の連続工程によって硝酸塩に再転換し、Ｎ２ＯまたはＮＯのような気体状窒素化合物を放出することを特徴とする方法。
２．硝酸塩および亜硝酸塩の還元を、それぞれ、低酸素分圧で硝化細菌によって行なうことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
３．合体した硝化作用／窒素除去を、アンモニア、亜硝酸塩および／または硝酸で汚染された天然または人工水中で、細菌をその場で供給することにより行なうことを特徴とする請求の範囲第１項および第２項に記載の方法。
４．細菌が、活性炭、ゼオライト、セラミックス、またはイオン交換体のような開口、多孔性支持体に固定化され、かつ乾燥された硝化細菌であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の方法。
５．適用される硝化細菌が、例えば、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属の亜硝酸酸化細菌であることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。
６．適用される硝化細菌が、アンモニア酸化細菌と一緒の亜硝酸酸化細菌である請求の範囲第４項に記載の方法。
７．選択条件の下で土壌資料から単離され、ドイツ微生物寄託機関（ＤＳＭ）、Ｄ−３４００ゲッチンゲンに寄託された寄託番号ＤＳＭ４１５３のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属の微生物であって、撹拌もしくは振とうされていない培養物中において全く単独で残されて２０ないし３０℃の温度で従属栄養的に増殖し、ａ）混合栄養的および無機栄養的増殖以上の従属栄養的増殖、ｂ）混合栄養的に増殖した場合に、５０ｍｇ全細胞タンパク／ｌの高細胞収量、ｃ）単独で残された、微好気性条件下での培養において、少なくとも６か月の長期間生存する能力、ｄ）微好気性、従属栄養的増殖の後の、酸素飽和培地における耐酸素性、ｅ）微好気性増殖の後の、酸素供給後２−４日後に開始する硝化活性、ｆ）この発明による方法における良好な再活性化、ｇ）８０±３ＭＤの分子量を有するプラスミド、で特徴付けられる微生物。
８．請求の範囲第７項に記載のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属の微生物からのプラスミドＤＮＡであって、０．５％アガロースゲルにおける電気泳動での移動による８０±３ＭＤの分子量を有し、インビボにおいて共有結合的に閉環した環状ＤＮＡであることを特徴とするプラスミドＤＮＡ。
９．好気的または微好気的、および無機栄養的、混合栄養的または従属栄養的細胞培養の下で、請求の範囲第７項に記載のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属の微生物中において、インビボで複製することによって達成することができる請求の範囲第８項に記載のプラスミドＤＮＡ。
１０．プラスミドが選択圧をさらに加えることなしに全く同一に複製され、かつそれが娘細胞に移ることを特徴とする請求の範囲第８項および第９項に記載のプラスミドＤＮＡ。