WO1988003163A1 - Process for multiplication of animal cells - Google Patents

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WO1988003163A1
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animal cells
cells
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Shinji Hosoi
Hiroyuki Mioh
Seiji Sato
Nobuo Fujiyoshi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions

Definitions

  • the present invention relates to a method for growing animal cells.
  • a high-density culture method has been developed as an efficient culture method for animal throats using a medium containing serum, serum, cell proliferating cells, etc., and various types of perfusion culture The method is known [Science, 164, 555 (1969), Develop. Biol. Standard, _55, 31 (1982)]. In this method, perfusion culture is performed using a medium containing serum and cell proliferation. Therefore, a large amount of serum / cell growth factor is required to replenish fresh medium.
  • a septum can be used for perfusion culture using animal cells.
  • a small amount of serum or cell growth factors can be obtained by culturing animal cells in a medium containing serum or cell growth factor on one side and adding a medium containing serum or cell growth factor in the other medium.
  • Cell growth factors allow animal cells to grow efficiently and in large quantities.
  • Animal cells used in the present invention include lymphocytes, lymphoblasts, hybridomas, epithelial cells, fibroblasts, bone marrow cells, and the like. Specifically, CTL-2 (ATCC TIB214) derived from mouse T cells (lymphocytes) and Namalva cells (ATCC GRL 1432) of human lymphoblasts are obtained.
  • a medium containing animal cells a medium comprising serum or cell growth factors and a basic medium (a medium containing amino acids, vitamins, inorganic salts, saccharides, nucleic acid-related substances, etc.) is used. »Basic medium is used as the medium in which the cells are placed.
  • Serum includes human, cow, and horse sera.
  • the offspring include protein or peptide cell growth factors such as epidermal growth factor, fibroblast growth factor, and interlokin 2 (hereinafter referred to as IL-2 and ⁇ ⁇ ). ), Platelet-derived growth factor, cancer cell-derived growth factor ⁇ and somatomedin.
  • protein or peptide cell growth factors such as epidermal growth factor, fibroblast growth factor, and interlokin 2 (hereinafter referred to as IL-2 and ⁇ ⁇ ).
  • IL-2 and ⁇ ⁇ interlokin 2
  • the amino acids contained in the basal medium include arginine, cystine, glutamine, histidine, isorocicin, lysine, lysine, methionine, phenylylalanine, threonine, Examples include trip phan, tyrosine, and ballin.
  • the vitamins include vitamin ⁇ , chamin, riboflavin, and nicotine.
  • Examples include amide, antenoic acid, pyridosar, votin, and colin.
  • Inorganic salts include sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate copper sulfate , Iron sulfate, zinc sulfate, sodium bicarbonate, etc.
  • Examples of the saccharide include glucose, fructose, galactose, and sucrose.
  • nucleic acid-related substances examples include 5'-inosinic acid, 5'-guanylic acid, and inosine.
  • basal medium examples include RPMI — 164 DMEMEMEm F — 10 um F — 12 DM — 160 and the like.
  • antibiotics streptmycin, penicillin, etc.
  • baking soda insulin, pyruvate, selenite, ethanolamine, etc.
  • a surfactant or the like may be added.
  • the partition wall used in the present invention does not pass through serum and cell growth factors of animal cells and high-molecular substances, and does not pass through amino acids, vitamins, inorganic salts, saccharides, and nucleic acid-related substances. If a low-molecular substance such as the above is allowed to pass through, a difference can be used. Examples include membranes, porous plates, microcapsules, and the like.
  • the membrane include a synthetic resin membrane having a molecular weight of 3,000 100,000, preferably 63,000 000, for example, Nylon 66, cellulose triacetate, Mixed cerylloester, regenerated cerylose, nitrocellulose, acrylonitrile, vinyl chloride, polypropylene, teflon, etc. The film is exposed.
  • a synthetic resin membrane having a molecular weight of 3,000 100,000, preferably 63,000 000, for example, Nylon 66, cellulose triacetate, Mixed cerylloester, regenerated cerylose, nitrocellulose, acrylonitrile, vinyl chloride, polypropylene, teflon, etc. The film is exposed.
  • porous plate examples include a sintered metal plate and a ceramic plate.
  • Raw materials for microcapsulating a medium containing animal cells and serum or cell growth spores include agarose, sodium alginate, chito acid, kappa-carrageenan, and the like.
  • the concentration of animal cells to be put into the culture tank is in the range of 10 3 to 10 3 Z m, preferably in the range of 10 4 to 10 5 Z. Cultivation in the culture tank is carried out at 30 to 38 "C, 10 to 150 rptn, preferably 30 to 50 rpm.
  • the culture in the dialysis tank without animal cells is performed with agitation culture in the range of 30 to 38 :, 10 to 150 rpm, preferably 30 to 50 rpm. Run at a speed that matches the speed.
  • the exchange medium the above-described basal medium is used.
  • the medium exchange rate is generally increased from the culture amount day to the 2nd-5X culture amount Z days as the number of cells increases to 10 s cells / m. Duru. Furthermore, saccharides such as glucose, amino acids and the like may be added as appropriate, and oxygen aeration may be performed. Even if serum ⁇ cell growth factor is not added to the medium to be replaced, the serum concentration in the upper culture tank partitioned by the membrane does not change, and the blood decreases due to the adsorption of cells to the medium. It is good to add only the amount that is metabolized. When adding cell growth factors, add the amount consumed as the cell number increases. This one According to the method, it is possible to obtain about 10 times the number of cells by using the same amount as the amount of serum / cell growth factor added for batch culture that is usually performed. Next, the case where the partition is a microcapsule will be described.
  • the above-mentioned materials are used as the raw materials for microencapsulation.
  • agarose cells cultured at 2.5 to 10% agarose and 37 t 5 X After mixing 10 5 to 6 ⁇ 10 6 Z with 40: to obtain L 2 5 to 5% gel, drop it into a paraffin solution, and cool it with stirring. Is included in the source particles.
  • sodium alginate the final gel concentration will be 1 to 4%, and 5 x 10 5 to 6 x 10 6 cells Zm £ and sodium alginate will be mixed, and 50% calcium chloride solution will be added. Drop it into microcapsules.
  • microcapsule particles containing animal cells are used to improve permeability, such as polyethylenimin, polypropylenimin, polyvinylamin, and polylysine. It may also be used after washing with polycation.
  • microcapsule particles are aseptically filtered, washed with a basal medium, and then subjected to perfusion culture of the medium, whereby high-density cells can be grown in the gel.
  • Culture is performed as above at 30-38 t :, 10-150 rpm, preferably
  • FIG. 1 shows an example of a perfusion culture apparatus comprising a culture tank and a dialysis tank used in the perfusion culture method of the present invention.
  • dialysis perfusion culture of mouse T cell-derived CTLL-CATCC TIB214 was performed.
  • the dialysis perfusion culture device consists of a dialysis membrane with a molecular weight of 12,000 to 1 000 (spectral ⁇ 2: Ieda Trading), a culture tank above, and a dialysis tank and a niobium below. Was used.
  • the culture volume was 200 mi for the culture tank (500 mi) and 300 for the dialysis tank.
  • the culture Yori except fetal calf serum ⁇ Pi IL- 2, I Nsu Li down 3 g / ⁇ ⁇ 2, pyruvate 5 mM, selenite 1.25x 10- tau Micromax, Gala click A medium supplemented with 0.1% toose 1 mg / m ⁇ , Pole 88 (Toho Chiba Chemical Co., Ltd.) was used.
  • CT was performed in the culture tank, and -2 was seeded at 6 ⁇ 10 4 Z. The survival rate at this time was 93.8%.
  • the culture in the dialysis tank was not changed for two days, and the culture was stirred at 50 rpm and 371: 1, and then the culture was continued while performing the dialysis.
  • Day 3 500 m ⁇ / day, 4-5 days 75 0 m ⁇ / day, then 1 ⁇
  • Dialysis was performed at a flow rate of Z days.
  • CTLL- 2 has grown up to 1 x 10 7 cells m in 5 days.
  • Namalba cells (ATCC CR-1432), which are human lymphoblasts, were placed in RPMI-1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) in 10% fetal calf serum, 4 mM glutamin, 25 / g / m Leptisin, 25 g / m ⁇ -nicillin, 16 mM Hex buffer and 0.0 1% w / v using medium supplemented with baking soda, 37 t: The cells were cultured at 50 rpm for 2 weeks.
  • the cultured cells were dispersed in the above-mentioned medium containing 2% sodium alginate at a density of 6.0 ⁇ 10 5 cells / cell, placed in a syringe, and dropped into a physiological saline solution containing 2% calcium chloride. According to this procedure, the cells were encapsulated in a spherical capsule of sodium alginate (microcapsule) with a diameter of 600 um. At this time, the viable cell density in the capsule was 5.1 ⁇ 10 5 Z m ⁇ . Serum was simultaneously encapsulated in the capsule.
  • a serum-free medium 400 tn ⁇ of a serum-free medium (serum was removed from the above medium) was placed in a 500 tn inverted cone, high-density culture device (manufactured by Shibata Hario). Microencapsulated cells washed with 0.1% w / v poly-lysine (Sigma) with a capacity of 40 ml were inoculated. After inoculation 1, the cells were perfused in a serum-free medium at a rate of 400 ⁇ ⁇ ⁇ ZB. Four days later, when the flow rate was set to 800 ml / day and the cells were cultured until day 10, the number of cells after the culture reached 2.1 x 10 7 Z. The culture was performed at 37, the stirring speed was 50 rpm, and the aeration rate was "II, hr".
  • the human perfused normal lymphocytes were subjected to transfusion perfusion culture.
  • the same dialysis perfusion culture apparatus as in Example 1 was used.
  • the dialysis medium the above-mentioned medium containing neither plasma nor IL-2 was used.
  • Healthy human peripheral blood cells 1 ⁇ 10 7 cells were allowed to migrate into the above culture medium
  • the cells were cultured at 50 rpm with a stirring rotation speed of 37 t while supplying 5% carbon dioxide gas and adjusting to PH68-7.2.
  • the exchange of the dialysis medium was started at 500 ⁇ ⁇ , and the culture was performed for 20 B while gradually increasing the temperature to 2,500 Z day.
  • IL-1 was added every 2 days to reach 20 UXmjg. As a result, after 16 days, the cells had increased to 1.97 ⁇ 10 7 cells / m ⁇ and could be maintained until day 30.

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Description

明 細 書
動 物 細 胞 の 増 殖 方 法
技 術 分 野_
本発明は動物細胞の増殖方法に関する。
動物細胞を増殖させることにょり、 医薬品などに有用な物質 （例ぇ ば、 ィ ンタ 一フ ヱ ロ ン） を大量に生産することができる。
背 景
従来、 動物細胞を培養する際には、 細胞の性質上、 血清、 細胞増殖 因子などを培地に添加することが必要でぁる。 しかし、 これらの成分 は高価でぁる為又はこれら成分の口 ッ ト差にょる細胞増殖のばらっき をな くす為に無血清培地の開発が行ゎれてぃる。
しかし、 現在、 全ての動物細咆 （例ぇば、 正常リ ンパ球、 正常骨髄 細胞など） を無血清培地で培養することはできなぃ。 ー方、 血清、 細 胞増殖囡子などを含む培地を用ぃる動物細咆の効率的な培養法と して 高密度培養法の開発が行ゎれてぉり、 種々の形式の灌流培養法が知ら れてぃる 〔Science，—164， 555 (1969)， Develop. Biol. Standard, _55 , 31 (1982)] 。 該方法では血清ゃ細胞増殖囡子を舍む培地を用ぃて灌流 培養が行ゎれてぃる。 したがって、 新鮮な培地を補給するために、 大 量の血清ゃ細胞増殖因子を必要とする。
少量の血清ゃ細胞増殖因子を培地に添加し、 動物細胞を大量に増殖す る方法の開発が望まれてぃる。
発 明 の 開 示
本発明方法にょると、 動物細胞を用ぃる灌流培養法にぉぃて、 隔壁 で隔てた一方にぉぃて、 血清又は細胞増殖因子を含む培地に動物細胞 を培養し、 他方に血清又は細胞増殖因子を舍まなぃ培地を入れて灌流 培養することにょり、 少量の血清又は細胞増殖因子で動物細胞を効率 ょぐ大量に増殖させることができる。
本発明に用ぃる動物細胞としては、 リ ンパ球、 リ ンパ芽球、 ハィブ リ ドーマ、 上皮細胞、 線維芽細胞、 骨髄細胞等がぁげられる。 具体的 には、 マゥ ス T細胞 （ リ ンパ球） 由来の CTLし- 2 ( ATCC T I B214 ) 、 ヒ ト リ ンパ芽球細胞のナマルバ細胞（ATCC GRL 1432) がぁげられる。
本発明に用ぃる培地と しては、 次のものがぁげられる。
動物細胞を含む方の培地としては血清又は細胞増殖因子及ぴ基礎培 地 （ァミノ酸、 ビタ ミ ン、 無機塩、 糖類、 核酸関連物質等を舍む培地） からなる培地が用ぃられる。 »物細胞を舍まなぃ方の培地としては、 基礎培地が甩ぃられる。
血清と しては人、 牛、 馬等の血清がぁげられる。
細胞増殖！ [子と しては、 タ ンパク性又はぺプチ ド性細胞増殖因子、 例ぇば、 上皮細胞成長因子、 線維芽細胞成長因子、 ィ ンター ロ ィ キ ン 2 (以下、 I L— 2 とぃぅ） 、 血小板由来成長因子、 癌細胞由来成長 因子 α及ぴ 、 ソマ トメ ジン等がぁげられる。
基礎培地に含まれるァ ミ ノ酸としては、 了ルギニン、 システィ ン、 グルタ ミ ン、 ヒスチジン、 ィ ソ ロ ィ シ ン、 ロ ィ シン、 リ ジン、 メ チォ ニン、 フェニリレァラニン、 ト レォニン、 ト リ プ ト フ ァ ン、 チロ シン、 バリ ン等がぁげられる。
ビタ ミ ンと しては、 ビタ ミ ン Α、 チァ ミ ン、 リ ボフ ラ ビン、 ニコ チ ンァ ミ ド、 ン ト テ ン酸、 ピ リ ドヰサール、 ビォチ ン、 コ リ ン等がぁ げられる。
無機塩と しては、 塩化ナ ト リ ゥ ム、 塩化カ リ ゥ ム、 塩化カルシゥ ム 塩化マグネ シゥ ム、 リ ン酸ニ水素ナ ト リ ゥ ム、 リ ン酸ニ水素カ リ ゥ ム 硫酸銅、 硫酸鉄、 硫酸亜鉛、 炭酸水素ナ ト リ ゥム等がぁげられる。 糖類と しては、 グルコ ース、 フ ラ ク ト ース、 ガラ ク ト ース、 シュ ー ク ロ ース等がぁげられる。
核酸関連物質と しては、 5 ' —ィ ノ シン酸、 5 ' —グァニル酸、 ィ ノ シン等がぁげられる。
基礎培地の例と しては、 R P M I — 1 6 4 0 D M E E M E 厶 F — 1 0 ヽ厶 F — 1 2 D M— 1 6 0等がぁげられる。
その他、 必要に応じて培地に抗生物質 （ス ト レプ ト マィ シ ン、 ぺニ シ リ ン等） 重曹、 ィ ンス リ ン、 ピルビン酸、 亜セ レ ン酸、 ェタ ノ ー ルァ ミ ン、 界面活性剤等を加ぇてもょぃ。
本発明に用ぃられる隔壁と しては、 動物細胞ゃ高分子物質でぁる血 清及び細胞増殖因子を通過させず、 ァ ミ ノ 酸、 ビタ ミ ン、 無機塩、 糖 類、 核酸関連物質等の低分子物質を通過させるものでぁればぃずれも 用ぃられる。 その例と しては、 膜、 多孔質板、 マィ ク ロカプセル等が ぁげられる。
具体的な膜と しては、 分子量 3, 000 100, 000 、 好ま し く は 6 000 30 000 の合成樹脂膜、 例ぇばナィ ロ ン 6 6 、 セルロ ース ト リ ァセ テ— ト 、 混合セリレロ ースェステル、 再生セ Jレロ 一ス、 ニ ト ロ セルロ ー ス、 ァ ク リ ルニ ト リ ル、 塩化ビニル、 ポ リ プロ ピレ ン、 テ フ ロ ン等の 膜がぁげられる。
多孔質板と しては、 金属焼結扳、 セラ ミ ック板等がぁげられる。
動物細胞及び血清又は細胞増殖 S子を舍む培地をマィ ク ロカプセル 化する為に甩ぃる原料としてはァガロース、 ァルギン酸ソーダ、 キ ト 酸、 カッパ一カラギ一ナン等が用ぃられる。
隔壁で隔てた一方が培養槽で他方が透析槽の場合の培養を以下に説 明する。
培養槽に入れる動物細胞の濃度としては、 103 〜103 個 Z m 好 ましく は 104 〜 105假 Z の範麗でぁる。 培養槽の培養は 3 0 ~ 3 8 "C、 1 0〜 1 5 0 rptn 、 好ましぐは 3 0〜 5 0 rpm の範丽で撹拌培 養を行ぅ。
動物細胞を入れなぃ透析槽の培養は 3 0〜 3 8 :、 1 0〜 1 5 0 rpm, 好ましく は 3 0〜 5 0 rpm の範囲で撹拌培養を行ぃ、 液交換は細胞数 ゃ代謝速度に合せた速度で行なぅ。 交換培地としては前記基礎培地が 用ぃられる。
培地交換速度は、 細胞数が 10 s個 / m £ となってから細砲数の増加 に合せ培養量 日から直鎳的に上昇させ、 2〜 5 X培養量 Z日とする のが一般的でぁる。 さらに、 適時、 グルコースなどの糖類、 ァミ ノ酸 類等を添加し、 酸素通気しても良ぃ。 交換する培地には、 血清ゃ細胞 増殖因子を添加しなく とも、 膜にょって仕切られた上部培養槽の血清 濃度は変化せず、 細胞に吸着されることにょって培地ょり減少する血 清量ぁるぃは代謝される量のみを添加すれば良ぃ。 細胞増殖因子を添 加する場合は細胞数の増加にょって消費される量を追加する。 この方 法にょって、 通常行なゎれてぃる回分培養に用ぃる血清ゃ細胞増殖因 子添加量と同じ量を用ぃ 1 0倍程度の細胞数を得ることができる。 次に隔壁がマィ ク ロカプセルの場合にっぃて說明する。
マィ ク ロカプセル化する為の原料と しては前記のものが用ぃられる, ァガロースの場合は、 2. 5〜 1 0 %ァガ口 ースと 3 7 tで培養され てぃた細胞 5 X 105 〜 6 X 106 個 Z とを 4 0 :で混合し、 L 2 5 ~ 5 %ゲルを得た後、 パラ フ ィ ン溶液内に滴下し、 撹拌しながら冷却 すると、 細胞は、 球状のァガ口 ース粒子内に包括される。 ァルギン酸 ソーダの場合は最終ゲル濃度が 1〜 4 %となるょぅ に、 細胞 5 X 105 〜 6 X 106 個 Z m £ とァルギン酸ソーダとを混合し 5 0 の塩化カル シゥ 厶液内に滴下してマィ ク ロカプセル化する。
カ ッパーカ ラギーナンの場合は、 最終ゲル濃度が 1〜 4 %となるょ ぅに細胞 5 X 105 〜 6 X 106 個 Z m とカ ッパーカ ラギーナ ンとを混 合し、 2 %塩化カ リ ゥ ム中に滴下してマィ ク ロカプセル化する。
前記の如く 勖物細胞を包括したマィ ク ロカプセル粒子は、 透過性を 改善するためにポ リ ェチレ ンィ ミ ン、 ポ リ プロ ピレ ンィ ミ ン、 ポ リ ビ ニルァ ミ ン、 ポ リ リ ジンなどのポ リ カチォ ンで洗浄して用ぃること も ぁる。
マィ ク ロカプセル粒子は無菌的に濾過し、 基礎培地で洗浄後、 該培 地を用ぃ灌流培養することで、 ゲル内に高密度の細胞を増殖させるこ とができる。
培養は前記と同様、 3 0〜 3 8 t：、 1 0 ~150 rpm 、 好ま し く は
3 0〜 7 0 rpm の範囲で撹拌培養を行ぃ、 液交換は細胞数ゃ代謝速度 に合せた速度で行なぅ。
図面 の 簡単 な 說 明
第 1図は本発明の灌流培養方法に用ぃる培養槽と透析槽から成る透 析灌流培養装置のー例を示す。
1…通気ラィ ン （入ロ） 、 2…通気ラ ィ ン （出ロ） 、 3…無菌フィ ルタ ー、 4…接種ロ、 5…撹拌子、 6…培養槽、 ？ …膜、 8…透析槽. 9…撹拌子、 1 0 ··'透析培地入ロ、 1 1 …透析培地出ロ、 1 2 …スタ ―ラ 一、 1 3 "·セ ンサー、 1 4…サ ンプ リ ングラ ィ ン。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1
第 1図に示した透析灌流培養装置を用ぃて、 マゥス T細胞由来の CTLL- CATCC TIB214) の透析灌流培養を行った。 透析灌流培養装置は. 分子量12, 000〜1 000の透析膜 （スぺク ト ラ < ボ了 2 ： 家田貿易） を 境に上に培養槽、 下に透析槽とニっの槽からなるものを用ぃた。 培養 液量は、 培養槽 （ 5 0 0 mi ) は 200 mi 透析槽は 3 0 0 とし
RPMI-1640 培地 （B水製薬社製） に 1 0 %v/v 牛胎児血清、 4 mMグ ルタ ミ ン、 2 5 g/ m ス ト レプ ト マィ シン、 2 5 U Z m ^ぺニシ リ ン、 1 0 mMへぺス緩衝液、 0. 1 9 %w/v 重曹を加ぇ、 I L - 2を、 1 2 5 0 U/ を添加し、 塔養液とした。 透析液として、 前記培養 液ょり、 牛胎児血清及ぴ I L— 2を除き、 ィ ンス リ ン 3 g/ πΐ·2、 ピ ルビン酸 5 mM、 亜セレン酸 1.25x 10— τΜ、 ガラ ク ト ース 1 mg/ m Ά、 ぺポール 8 8 (東邦千葉化学ェ業㈱） 0. 1 %を添加した培地を用ぃた, 培養槽に CTしし -2を 6 X 104 個 Z となるょぅに播種した。 この時 の生存率は 9 3. 8 %でぁった。
培養開始後、 2 日間は透析槽培地の交換をせず、 回転数 5 0 rpm 、 3 7 1：で撹拌培養を行ぃ、 その後、 透析を行ぃながら培養を継続した。 3 日目ょり 5 0 0 m^ /日、 4〜 5 日は 7 5 0 m^ /日、 その後 1 ^
Z日の流速で透析した。
通気は、 3 日目まで 5 % CO 2 、 その後 PHの低下のため 4 日目まで 1 %C02 、 5 日目以後は 0. 5 %C02 と した。 CTLL- 2は、 5 日で 1 x 107 個 m にまで生育した。
実施例 2
ヒ ト リ ンパ芽球細胞でぁるナマルバ細胞（ATCC CRし 1432)を RPMI- 1640 培地 （日氷製薬社製） に 10%牛胎児血清、 4 mMグルタ ミ ン、 25 / g/m ス ト レプ ト マィ シ ン、 2 5 g/ m ·β ぺニ シ リ ン、 1 6 mMへぺス緩衝液 ぉょび 0. 0 1 %w/v 重曹を加ぇた培地を用ぃ、 3 7 t：、 5 0 rpm で 2 曰間培養した。
前記培養細胞を 6. 0 X 105 個 / となるょぅに 2 %ァルギン酸ソ —ダを含む前記培地に分散し注射筒に入れて 2 %塩化カルシゥムを含 む生理食塩水中に滴下した。 この操作にょり細胞は 6 0 0 u m の径を 持ったァルギン酸ソ ーダの球状カプセル （マイ ク ロ カ プセル） 内に包 括された。 この時のカプセル内の生存細胞密度は、 5. 1 X 105 個 Z m ^でぁった。 カプセル内には、 血清も同時に封入された。
5 0 0 tn の逆円錐型、 高密度培養装置 （柴田ハ リ ォ社製） に 400 tn^の無血清培地 （前記培地から血清を除ぃたもの） を入れ、 これに カプセル内容量 4 0 m£の 0. 1 %w/v ポ リ 一し一リ ジン （シグマ社製) で洗浄したマィ クロカプセル化した細胞を接種した。 接種 1 曰後ょり 無血清培地にょり 4 0 0 πΐ·β ZBの速度で灌流した。 4 日後、 流速を 8 0 0 m£ /日とし 1 0 日まで培養すると培養後の細胞は 2. 1 x 107 個 Z に達した。 なぉ、 培養は 3 7 で、 撹拌速度は 5 0 rpm 、 通気 量は "I ί ,hrとした。
実施例 3
第 1図に示した透析灌流塔養装置を用ぃて、 ヒ ト正常リ ンパ球の透 析灌流培養を行った。 透析灌流培養装置は実施例 1 と同じものを用ぃ た。 培養用培地として、 11 %ヒ ト血漿、 4 mMグルタ ミ ン、 10^Ζπι ゲンタ ミ シン、 0. 2 %重曹及び 2 UZm I L - 2 (武田製薬製) を加ぇた R P M I - 1 6 4 0培地を用ぃた。 透析用培地としては、 血 漿と I L— 2を含まなぃ上記培地を甩ぃた。
健常人末梢血細胞 1 X107 個 m を上記培養用培地に淳遊させ、
5 %炭酸ガスを供給し PH6 8 ー 7. 2に調節しながら、 5 0 rpm の撹拌 回転数、 3 7 tで培養した。 透析槽培地の交換は、 5 0 0 πι Ζ曰で 開始、 2, 5 0 0 Z日まで徐々に上げながら 2 0 B間培養した。
I L一 2 は、 2 日ごとに 2 0 UXmjg となるょぅに添加した。 その結 果 1 6 日後には、 該細胞は 1. 9 7 X 107 個 /m^まで増加し、 3 0 日 目まで維持することができた。

Claims

請 求 の 範 囲
(1) 動物細胞を用ぃる灌流培養法にぉぃて、 隔壁で隔てたー方にぉぃ て、 血清又は細胞増殖因子を含む培地に動物細胞を培養し、 他方に 血清又は細胞増殖因子を舍まなぃ培地を入れて灌流培養することを 特徵とする動物細胞の増殖方法。
(2) 隔壁が膜、 多孔質板又はマィ ク ロカプセルでぁる特許請求の範囲 第 1 項記載の方法。
(3) 膜が分子量 3, 0 0 0 〜 1 0 0, 0 0 0 の合成樹脂からなる膜でぁる 特許請求の範囲第 2項記載の方法。
(4) 多孔質板が金属焼結板又はセラ ミ ッ ク板でぁる特許請求の範画第 2項記載の方法。
(5) マィ ク ロカプセルがァルギン酸ソーダ、 了ガロ 一ス又はカ ッパ一 カ ラギ—ナンからなるものでぁる特許請求の範囲第 2項記載の方法 c
(6) 細胞増殖因子がタ ンパク性又はぺプチ ド性細胞増殖因子でぁる特 許請求の範囲第 1項記載の方法。
(7) タ ンパク性又はぺプチ ド性細胞増殖因子が上皮細咆成長因子、 線 維芽細胞成長因子、 ィ ンター ロ ィ キン 2、 血小板由来成長因子、 癌 細胞由来成長因子"、 癌細胞由来成長因子 /9又はソマ ト メ ジンでぁ る特許請求の範囲第 5項記载の方法。
(8) 動物細胞がリ ンパ球、 リ ンパ芽球、 ハィ ブリ ド—マ、 上皮細胞、 線維芽細胞又は骨髄細胞でぁる特許請求の範囲第 1項記載の方法。
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