WO1986006381A1 - Pharmacologically active peptides - Google Patents

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WO1986006381A1
WO1986006381A1 PCT/DE1986/000169 DE8600169W WO8606381A1 WO 1986006381 A1 WO1986006381 A1 WO 1986006381A1 DE 8600169 W DE8600169 W DE 8600169W WO 8606381 A1 WO8606381 A1 WO 8606381A1
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Victor Brantl
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Victor Brantl
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/80—Cytochromes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to pharmacologically active peptides, in particular having an opiate-like effect.
  • the object of the invention is to create new peptides which have not yet been described and which in particular have an opiate-like effect.
  • Tyr-Pro-Phe-Thr-ABCDET where Tyr is the amino acid tyrosine, Pro is the amino acid proline, Phe is the amino acid phenylalanine and Thr is the amino acid threorrin.
  • A, B, C, D and E know to be any amino acid of the D or L form.
  • T stands for OH, OR, NH 2 , NHR, NR 2 or NHNHR ', where R may have the following meaning: Substit.
  • R ' is hydrogen, linear or branched C 1-10 alkyl, cycloalkyl or C 6-8 aralkyl, linear, branched or cyclic allphthalate.
  • C 1-16 acyl optionally substituted by OH, NH 2 , C 1-4 alkoxy or halogen, aromatic acyl, optionally substituted by OH, NH 2 , halogen or C 1-4 alkoxy; represents linear, branched or cyclic C 3-11 aliphatic urethane and their pharmaceutically acceptable salts.
  • the phenylalanine is in the D-form in the 3rd amino acid position of the peptide (calculated from the left, N-terminal end of the peptide).
  • the same as above The peptides have a stabilizing effect when the threonine in the 4th amino acid position is in the D form.
  • amino acid L-threonine in the 4th amino acid position can be replaced by glutamine, glycine or aspartic acid according to a further development of the invention.
  • the peptides are characterized in that a) the N-terminal L-tyrosine of the general formula:
  • R 3 represents hydrogen or an alkyl group with 1 to 4 C ⁇
  • R 5 for hydrogen, an alkyl group with 1 to 4 C atoms or an R 6 CO group, R 6 for a saturated or unsaturated, straight-chain or branched alkyl radical with 1 to 17 C atoms, a phenyl radical or a phenylakyl radical with 7 to 12 carbon atoms, where the phenyl radicals can be substituted by 1 or 2 substituents from the series halogen, alkyl having 1 to 4 carbon atoms or alkoxy having 1 to 4 carbon atoms, the R 5 O group being in meta or para Position to
  • R 7 for hydrogen or alkyl having 1 to 4 carbon atoms
  • R 8 for hydrogen, fluorine, chlorine, bromine, nitro, alkyl
  • the amino acids proline and phenylalanine are present as dehydroamino acids.
  • the peptides according to the invention can exert effects on the central nervous system.
  • this can be an analgesic effect; all or part of the analgesic effect can be mediated via opioid receptors.
  • the peptides according to the invention can trigger endocrine effects, e.g. an increase in growth hormone levels.
  • the peptides according to the invention can be used as immunomodulators.
  • the administration of such peptides leads e.g. in a weakened organism to stimulate the body's immune system.
  • the substances can also be supplied to the mammalian organism to activate the cell metabolism system; this increases the oxygen uptake of the tissue cells, which can be particularly important in the case of age-related diseases.
  • the peptides according to the invention can be used as antigens to generate antibodies in the mammalian organism.
  • the peptide is coupled to the macromolecule in the usual way with carbodlimid and injected intracutaneously into the back and abdominal skin of rabbits.
  • the antibodies against the peptides according to the invention can be used to determine the same in body tissues and fluids. This can be used to determine both exogenously supplied and endogenously generated peptides (diagnostics).
  • the peptides according to the invention and / or their derivatives and / or their salts can be contained in human and veterinary medicinal products. These can be used in particular as antitussives, antidiarrheals, modulators of the immune system, analgesics, antipsychotics, tranquilizers, blood circulation promoters and to promote wound healing.
  • the synthetic method used uses benzylox ⁇ carbonyl-protected amino acids as mixed anhydrides (Lottsspeich et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1835-1839, 1980).
  • the ethyl acetate / peptide mixture is washed 3 times with NaCL / water, 3 times with water and evaporated.
  • the peptide thus obtained, which still bears the protective group Z, is then hydrogenated in methanol.
  • 100-500 mg Pd / activated carbon are added as catalyst per mmol peptide.
  • the elimination of CO 2 is controlled with Ba (OH) 2 solution.
  • the catalyst is then filtered off (paper filter), washed extensively with water and the filtrate on a Rotary evaporator evaporated.
  • the desired deblocked peptide is contained in the residue.
  • stage 2 reaction of the mixed anhydride of stage I / 1a with the amino component of stage I / lb.
  • the 50% excess of mixed anhydride is destroyed.
  • the pH of the reaction product is adjusted to pH 8 with aqueous, saturated KHCO 3 solution and stirred at 0 ° C for 30 minutes.
  • the peptide is then extracted with 50-100 ml of ethyl acetate (EtAc); the EtAc / peptide mixture is washed with saturated, aqueous NaCl solution. After a further final wash with water, the EtAc phase is evaporated. I / stage 3) splitting off the protective group by hydrogenation.
  • the peptide is dissolved in 30 ml of methanol and 100 mg
  • Air is displaced by nitrogen and hydrogen is introduced into the reaction vessel.
  • the hydrogenation will performed at 25 ° -30 ° C.
  • the hydrogenation is complete when no more CO 2 is released, ie when no more precipitate is formed after control in aqueous Ba (OH) 2 solution.
  • the solution is filtered, washed with water and evaporated on a rotary evaporator.
  • the permanent product Pro-Phe-Thr-OMet (I) is later used as an amino component.
  • stage II / Stage 3b Preparation of the amino component.
  • the dipeptide obtained in stage II / 2 is dissolved in 20 ml of DMF with the addition of 170 ⁇ l (1.5 mmol) of N-methylmorpholine.
  • II / stage 4 implementation of the mixed anhydride of stage II / 3a) with the amino component of stage II / 3b
  • Anhydride is converted with the Thr-Ile-OMet in 40 ml DMF at -15 ° C for 4 hours to the Z-Pro-Phe-Thr-Ile-OMet. Further processing is carried out analogously to that already described under I / 2 and I / 3.
  • the obtained tetrapeptide Pro-Phe-Thr-Ile-OMet (II) is later used as an amino component.
  • stage Ill / lb The respective reaction products of stage Ill / lb are worked up as described under 1/2 and I / 3.
  • Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-OMet are then either purified directly via column chromatography (Biogel P 2) (or after one in the usual way Acidic hydrolysis) and subsequently analyzed, as described by Lottsspeich et al. (HoppeSeyler's Z. Physiol. Chem., 361, 1835-1839, 1980).
  • Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-OH was then examined for pharmacological effects.
  • the other peptides according to the invention were prepared in the same manner as described above, with other Z-amino acid derivatives being used according to the desired sequence, e.g. instead of Z-L-threonine, Z-D-threonine; instead of Z-ProPhe, Z-Prq-D-Phe; or other amino acid methyl esters e.g.
  • Threonine methyl ester or serine methyl ester can be used.
  • the other peptides according to the invention are also synthesized analogously to the synthesis methods such as
  • the two substances show specific opiate-like effects on the electrically stimulated plexus myentericus / longitudinal muscle preparation of the guinea pig ileum (GPI), method according to Schulz and Goldstein, J. Pharmacol. Exptl. Ther. 183, 400, 1972.
  • GPI guinea pig ileum
  • the numbers indicate the concentration ( ⁇ M) which is necessary to inhibit the electrically induced contraction of the guinea pig intestine preparation (GPI) by 50% (IC 50 value).
  • the numbers are averages from 4-5 determinations; the standard deviation from the mean values is less than 13%.
  • the inhibitions of the GPI can be removed with the specific opioid antagonist naloxone or blocked with pretreatment.
  • the corresponding D-Ala 2 compounds show even stronger opiate-like effects on the GPI preparation.
  • Opiate-like effects can also be observed in rats after intracerebroventrticular injection.
  • the procedure is as described by Brantl et al., Life Sciences, 28, 1903-1909, 1981.
  • An effective analgesic dose was found to be 400 to 800 ⁇ g of the above.
  • Peptides; the analgesic effect can be reversed with naloxone 10 mg per kg body weight (intraperitoneally) or blocked with pretreatment with naloxone.

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Description

PHAEMAKOLOGISCH AKTIVE PEPTIDE
Die Erfindung betrifft pharmakologisch aktive Peptide, insbesondere opiatartig wirkend.
Aufgabe der Erfindung ist es, neue, bisher noch nicht beschriebene Peptide zu schaffen, die insbesondere opiatartig wirken.
Diese Aufgabe ist gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß die Peptide folgende Struktur aufweisen:
Tyr-Pro-Phe-Thr-T Tyr-Pro-Phe-Thr-A-T Tyr-Pro-Phe-Thr-A-B-T
Tyr-Pro-Phe-Thr-A-B-C-T
Tyr-Pro-Phe-Thr-A-B-C-D-T
Tyr-Pro-Phe-Thr-A-B-C-D-E-T wobei Tyr gleich der Aminosäure Tyrosin, Pro gleich der Aminosäure Prolin, Phe gleich der Aminosäure Phenylalanin und Thr gleich der Aminosäure Threorrin ist. A, B, C, D und E kennen jede beliebige Aminosäure der D- oder L-Form sein. T steht für OH, OR, NH2, NHR, NR2 oder NHNHR', wobei R gegebenenfalls die folgende Bedeutung hat: Substit. lineares oder verzweigtes C1-10-Alkyl, Adamantyl, C1-10-Cycloalkyl oder C6-8-Aralkyl, zweckmäßigerweise Phenyl, Benzyl oder Phenyläthyl bedeutet, und R' Wasserstoff, lineares oder verzweigtes C1-10-Alkyl, Cycloalkyl oder C6-8-Aralkyl, lineares, verzweigtes oder cyclisches allphat. C1-16-Acyl, gegebenenfalls durch OH, NH2, C1-4-Alkoxy oder Halogen substituiert, aromatisches Acyl, gegebenenfalls durch OH, NH2, Halogen oder C1-4-Alkoxy substituiert; lineares, verzweigtes oder cyclisches C3-11 aliphatisches Urethan darstellt und deren pharmazeutisch annehmbare Salze. Nach einer weiteren Ausbildung sind die Peptide dadurch gekennzeichnet, daß A= Isoleucin, Leucln, Serin oder Threonin, B= Isoleucin, Glycin, Serin oder Valin, C= Glycln, Leucin, Threonin, Asparagin oder Arginin, D= Glutamin, Lysin oder Arginin und E= Valin, Asparaginsäure, Leucin oder Arginin ist.
Nach einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung liegt das Phenylalanin in der 3. Aminosaureposition des Peptids (vom linken, N-terminalen Ende des Peptids her gerechnet) in der D-Form vor.
Dies hat insbesondere den Vorteil, daß die opiatartige Wirkung erhalten bleibt Czum Teil gesteigert wird) und eine besonders hohe Stabilität gegenüber peptidspaltenden Enzymen resultiert.
Den gleichen, o.g. stabilisierenden Effekt weisen die Peptide auf, wenn das Threonin der 4. Aminosäureposition in der D-Form vorliegt.
Die Aminosäure L-Threonin in der 4. Aminosäureposition kann nach einer Weiterbildung der Erfindung durch Glutamin, Glycin oder Asparaginsäure ersetzt sein.
Nach einer Weiterbildung der Erfindung sind die Peptide dadurch gekennzeichnet, daß a) das N-termlnale L-Tyrosin der allgemeinen Formel:
Figure imgf000004_0001
vorliegt, wobei im einzelnen bedeuten:
R3 für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C¬
Atomen, R4 für Wasserstoff oder zusammen mit R3 für eine Äthylenbrücke,
R5 für Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen oder eine R6CO-Gruppe, R6 für einen gesättigten oder ungesättigten, geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 17 C-Atomen, einen Phenylrest oder einen Phenylakylrest mit 7 bis 12 C-Atomen, wobei die Phenylreste durch 1 oder 2 Substituenten aus der Reihe Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 4 C-Atomen substituiert sein können, wobei die R5O-Gruppe sich in metaoder para-Stellung zum
Figure imgf000005_0002
W für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 5 C-Atomen, Alkenyl mit 3 bis 5 C-Atomen, Cyclopropy Imethyl, Cyclobutylmethyl, R6CO-, H-Val, H-Ser, H-Arg, H-Lys, H-Ile,
H-Tyr, oder H-Phe. b) das Phenylalanin der allgemeinen Formel vorliegt:
Figure imgf000005_0001
wobei im einzelnen bedeuten: R7 für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, R8 für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Nitro, Alkyl mit
1 bis 4 C-Atomen, z für 1 oder 2 steht. c) das Prolin der allgemeinen Formel vorliegt:
Figure imgf000006_0001
wobei im einzelnen bedeuten: R9 für Wasserstoff, eine Hydroxygruppe, eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 oder 4 C-Atomen - am Stickstoff eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit
1 bis 4 C-Atomen gebunden ist - eine oder mehrere Ketogruppen in den Ring eingeführt sind.
Nach einer anderen Weiterbildung der Erfindung liegen die Aminosäuren Prolin, Phenylalanin als Dehydroaminosäuren vor.
Besonders vorteilhaft sind insbesondere Peptide folgender Struktur:
Tyr-Pro-Phe-Thr-OH Tyr-Pro-Phe-Thr-NH2
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-Ile-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-Ile-Gly-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-Ile-Gly-Gln-OH Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-Ile-Gly-Gln-Val-OH
Tyr-Pro-D-Phe-Thr-OH
Tyr-Pro-D-Phe-Thr-NH2
Tyr-Pro-D-Phe-Thr-Ile-OH
Tyr-Pro-D-Phe-Thr-Thr-OH Tyr-Pro-Phe-D-Thr-Ile-OH
Tyr-Pro-Phe-D-Thr-Ile-NH2
Tyr-Pro-Phe-D-Thr-Thr-OH
Tyr-Pro-Phe-D-Thr-Thr-NH2
Tyr-Pro-Phe-Gln-OH Tyr-Pro-Phe-Gln-NH2
Tyr-Pro-Phe-Gly-NH2
Tyr-Pro-Phe-Asp-OH Tyr-P ro-Phe-Asp-NH2 Ty r-Pro-Phe-Th r-Thr-OH Tyr-P ro-Phe-Th r-Se r-OH Tyr-P ro-Phe-Th r-Leu-OH
Die erfindungsgemäßen Peptide können Wi.rkun.gen auf das zentrale Nervensystem ausüben. Das kann zum Beispiel eine schmerzstillende (analget ische) Wirkung sein; die analgetische Wirkung kann ganz oder teilweise über opioide Rezeptoren vermittelt werden. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide endokrine Wirkungen auslösen, z.B. eine Erhöhung des Wachstumhormonspiegels.
Die erfindungsgemäßen Peptide können als Immunmodulatoren Anwendung finden. Die Verabreichung solcher Peptide führt z.B. bei einem geschwächten Organismus zu einer Stimulation des körpereigenen Immunsystems.
Die Substanzen können auch zur Aktivierung des Zellstoffwechselsystems dem Säugetierorganismus zugeführt werden; hierbei wird die Sauerstoffaufnähme der Gewebszellen erhöht, dies kann insbesondere bei altersbedingten Krankheiten von Bedeutung sein.
Die erfindungsgemäßen Peptide können nach Kopplung an Thyreoglobulin oder andere makromolekulare Eiweißkörper als Antigene zur Erzeugung von Antikörpern im Säugetierorganismus verwendet werden. Hierbei wird das Peptid in üblicher Weise mit Carbodlimid an das Makromolekül gekoppelt und intracutan in die Rücken- und Bauchhaut von Kaninchen injiziert.
Die Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Peptide können zur Bestimmung derselben in Körpergeweben und -Flüssigkeiten verwendet werden. Dies kann sowohl zur Bestimmung exogen zugeführter, wie auch endogen entstandener Peptide verwendet werden (Diagnostik). Die erfindungsgemäßen Peptide und/oder deren Derivate und/oder deren Salze können in Human- und Tierarzneimitteln enthalten sein. Diese können insbesondere als Antitussiva, Antidiarrhoika, Modulatoren des Immunsystems, Analgetika, Antipsychotika, Tranquilizer, Durchblutungsföderer und zur Förderung der Wundheilung Verwendung finden.
Beispiel: 1) Synthese zweier erfindungsgemäßer Peptide folgender Sequenz:
Tyr-Pro-Phe-Thr-OMet/-OH Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-OMet/-OH
Die verwendete Synthesemethode benützt Benzyloxγcarbonyl-geschützte Aminosäuren als gemischte Anhydride (Lottspeich et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1835-1839, 1980).
Hierbei wird die Aminokomponente bei -15°C oder niedrige r in D i met hy l fo rmam id (DMF) m i t e i nem 0 . 5 mo la ren Überschuß an gemischtem Anhydrid einer Z-Aminosäureisobutylcarbonsäure (wobei Z- als Schutzgruppe dient und einen N-Benzyloxycarbonyl-Rest darstellt) 2-4 Stunden umgesetzt. Nach der 2-4 stündigen Kupplung wird der Überschuß an Anhydrid zerstört. Bei 0°C wird dann der pH-Wert des Reaktionsproduktes mit wässriger, gesättigter KHCO3-Lösung auf 8 eingestellt und 30 Minuten bei 0°C gerührt. Die Peptide werden mit Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat/Pept idgemisch wird, um das Z-Aminosäure-Kaliumsalz zu entfernen, 3 mal mit NaCL/Wasser, 3 mal mit Wasser gewaschen und abgedampft. Das so erhaltene Peptid, welches noch die Schutzgruppe Z trägt, wird dann in Methanol hydriert. Hierbei werden 100-500 mg Pd/Aktivkohle als Katalysator pro mmol Peptid zugesetzt. Die CO2-Abspaltung wird mit Ba(OH)2-Lösung kontrolliert. Der Katalysator wird dann abfϊltrlert (Papierfilter), mit Wasser ausgiebig gewaschen und das Filtrat auf einem Rotationsverdampfer eingedampft. Das gewünschte deblokkierte Peptid ist im Rückstand enthalten.
I. Herstellung des Zwischenproduktes L-Pro-L-Phe-L-Thr-OMet (I) I/Stufe 1a) Herstellung des gemischten Anhydrids: Z-Pro-Phe- gem. Anhydrid
592,5 mg (1.5 mmol, = 50%iger Überschuß) des Dipeptids Z-Pro- Phe (Bachem, Schweiz) werden in 20 ml DMF mit 200 μl (1.5 mmol) Chlorameisensäureisobutylester bei -15°C nach Zusatz von 170 μl (1.5 mmol) N-Methylmorpholin 15 Minuten umgesetzt.
I/Stufe 1b) Vorbereitung der Aminokomponente.
170 mg (1.0 mmol) Threon inmethy lesterhydrochlor id (Novabiochem, Schweiz) werden in 20 ml DMF unter Zusatz von 110 μl (1.0 mmol) N-Methylmorphin bei -15°C aufgelöst.
I/Stufe 2) Umsetzung des gemischten Anhydrids der Stufe I/1a mit der Aminokomponente der Stufe I/lb.
Das Z-Pro-Phe-gem. Anhydrid wird mit dem Thr-OMet In insgesamt 40 ml DMF bei -15°C 4 Stunden zum Z-Pro-Phe-Thr-OMet umgesetzt.
Vor der Aufarbeitung wird der 50%ige Überschuß an gemischtem Anhydrid zerstört. Bei 0°C wird der pH-Wert des Reaktionsproduktes mit wassriger, gesättigter KHCO3-Lösung auf pH 8 eingestellt und 30 Minuten bei 0°C gerührt. Danach wird das Peptid mit 50-100 ml Äthylacetat (EtAc) extrahiert; das EtAc/Peptidgemisch wird mit gesättigter, wassriger NaCl-Lösung gewaschen. Nach einem weiteren abschließenden Waschen mit Wasser wird die EtAc-Phase eingedampft. I/Stufe 3) Abspalten der Schutzgruppe durch Hydrierung.
Das Peptid wird in 30 ml Methanol gelöst und 100 mg
Palladium auf Aktivkohle (Merck) zugegeben. Nach dem
Verdrängen der Luft durch Stickstoff wird in das Reak¬tlonsgefäß Wasserstoff eingeleitet. Die Hydrierung wird bei 25°-30°C durchgeführt. Die Hydrierung ist beendet, wenn kein CO2 mehr freigesetzt wird, d.h. wenn nach Kontrolle in wassriger Ba(OH)2-Lösung kein Niederschlag mehr gebildet wird. Die Lösung wird filtriert, mit Wasser gewaschen und am Rotationsverdampfer einrotiert. Das bleibende Produkt Pro-Phe-Thr-OMet (I) wird dann später als Aminokomponente eingesetzt.
II. Herstellung des Zwischenproduktes L-Pro-L-Phe-L-Thr-L-Ile-OMet (II)
II/Stufe 1a) Herstellung des gemischen Anhydrids:
Z-Thr-gem. Anhydrid.
379,5 mg (1.5 mmol) Z-L-Thr (Novab iochem, Schweiz) werden in 20 ml DMF unter Zusatz von 170 μl (1.5 mmol) N-MethyImorpholin gelöst und mit 180 μl Chlorameisensäureisobutylester bei -15°C 15 Minuten umgesetzt.
II/Stufe 1b) Vorbereitung der Aminokomponente.
185 mg (1.0 mmol) L-Isoleucin-Methy lesterhydrochlorid (Bachem, Schweiz) werden in 20 ml DMF unter Zusatz von 170 μl (1.5 mmol) N-Methylmorpholin gelöst. II/Stufe 2) Umsetzung des gem. Anhydrids der Stufe H71a mit der Aminokomponente der Stufe Il/lb.
Das Z-Thr-gem. Anhydrid wird mit dem Ile-OMet in insgesamt 40 ml DMF bei -15°C 4 Stunden zum Z-Thr-Ile-OMet umgesetzt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt analog wie bereits unter I/2 und I/3 beschrieben. Schließlich erhält man den Dipeptidmethylester Thr-Ile-OMet, der nachfolgend als Aminokomponente weiter umgesetzt wird.
II/Stufe 3a) Herstellung des gemischten Anhydrids: Z-Pro-Phe-gem. Anhydrid
Der gleiche Ansatz wird wie unter Stufe I/1a) beschrieben hergestellt. II/Stufe 3b) Vorbereitung der Aminokomponente. Das in Stufe II/2 erhaltene Dipeptid wird in 20 ml DMF unter Zusatz von 170 μl (1.5 mmol) N-Methylmorpholin gelöst. II/Stufe 4) Umsetzung des gemischten Anhydrids der Stufe II/3a) mit der Aminokomponente der Stufe II/3b Das Z-Pro-Phe gem. Anhydrid wird mit dem Thr-Ile-OMet in 40 ml DMF bei -15°C 4 Stunden zum Z-Pro-Phe-Thr-Ile-OMet umgesetzt. Die weitere Aufarbeitung erfolgt analog wie bereits unter I/2 und I/3 beschrieben. Das erhaltene Tetrapeptid Pro-Phe-Thr-Ile-OMet (II) wird dann später als Aminokomponente eingesetzt.
III. Weiterverarbeitung der Zwischenprodukte Pro-Phe-Thr-OMet (I)
Pro-Phe-Thr-Ile-OMet (II)
III/Stufe 1a) Herstellung des gem. Anhydrids: Z-Tyr-gem. Anh.
674 mg (1.5 mmol) N, O-di-Z-Tyrosin (Novab iochem, Schweiz) werden in 20 ml DMF unter Zusatz von 170 μl (1.5 mmol) N-Methylmorpholin gelöst und mit 200 μl (1.5 mmol) ChlorameIsensäureisobutylester bei -15°C 15 Minuten umgesetzt.
III/Stufe 1b) Die Zwischenprodukte I und II werden in 20 ml DMF gelöst und mit je einem Ansatz der Stufe III/ la bei -15°C 4 Stunden umgesetzt.
HI/Stufe 2)
Die Aufarbeitung der jeweiligen Reaktionsprodukte der Stufe Ill/lb erfolgt wie unter 1/2 und I/3 beschrieben. Die Syntheseendprodukte Tyr-Pro-Phe-Thr-OMet
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-OMet werden dann entweder direkt über Säulenchromatographie (Biogel P 2) gereinigt (bzw. nach einer in üblicher Weise durchgeführten sauren Esterhydrolyse) und nachfolgend analysiert, so wie von Lottspeich et al. (HoppeSeyler's Z. Physiol. Chem., 361, 1835-1839, 1980) beschrieben. Die gereinigten und mittels Aminosäureanalyse analysierten Peptide
Tyr-Pro-Phe-Thr-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-OH wurden dann auf pharmakologische Wirkungen hin untersucht. (Vgl. Beispiel, 2) Die Herstellung der anderen erfindungsgemäßen Peptide erfolgte auf die gleiche Weise, wie dies oben be re i ts beschrieben wurde, wobei entsprechend der gewünschten Sequenz andere Z-Aminosäurederivate eingesetzt werden, so z.B. statt Z-L-Threonin, Z-D-Threonin; statt Z-ProPhe, Z-Prq-D-Phe; bzw. andere Aminosäuremethylester z.B.
Threoninmethylester oder Serinmethylester verwendet werden. Die Synthese der anderen erfindungsgemässen Peptide erfolgt ebenfalls analog den Syntheseverfahren wie
Lott spe i ch et a l . ( 1980 ) besch r i eben ( s i ehe oben ) . Die Peptidester wurden zum Zwecke der C-terminalen Amidierung in üblicher Weise einer Ammonolyse unterworfen.
2) Pharmakologische Wirkungen zweier erfindungsgemäßer Peptide (Tyr-Pro-Phe-Thr-OH und Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-OH).
Die beiden Substanzen zeigen spezifische opiatartige Wirkungen am elektrisch stimulierten plexus myentericus/Längsmuskel-Präparat des Meerschweinchenileums (GPI), Methode nach Schulz und Goldstein, J. Pharmacol. Exptl. Ther. 183, 400, 1972.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Substanz GPI
Tyr-Pro-Phe-Thr 120,1
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile 290,1
Normorphin 0.1
Tabelle 1. Opiatartige Wirkungen zweier erfindungsgemäßer Peptide; die Zahlen geben diejenige Konzentration (μM) an, die notwendig ist, die elektrisch induzierte Kontraktion des Meerschweinchen-Darm-Präparates (GPI) um 50% zu hemmen (IC50- Wert). Die Zahlen sind Mittelwerte aus 4-5 Bestimmungen; die Standardabweichung von den Mittelwerten ist kleiner als 13%. Die Hemmungen des GPI sind mit dem spezifischen Opioid-Antagonisten Naloxon aufhebbar bzw. bei Vorbehandlung blockierbar.
Die entsprechenden D-Ala 2-Verbindungen zeigen noch stärkere opiatartige Wirkungen am GPI-Präparat.
Opiatartige Wirkungen können auch nach intracerebroventrtkulärer injektion bei Ratten beobachtet werden. Hierbei wird so vorgegangen, wie von Brantl et al., Life Sciences, 28, 1903-1909, 1981 beschrieben wurde. Als wirksame analgetische Dosis erwiesen sich 400 bis 800 μg der o.g. Peptide; die analgetische Wirkung ist mit Naloxon 10 mg pro kg Körpergewicht (intraperitoneal) aufhebbar bzw. bei Vorbehandlung mit Naloxon blockierbar.

Claims

Ansprüche
1) Pharmakologisch aktive Peptide der Formel:
Tyr-Pro-Phe-Thr-T Tyr-Pro-Phe-Thr-A-T Tyr-Pro-Phe-Thr-A-B-T
Tyr-Pro-Phe-Thr-A-B-C-T
Tyr-Pro-Phe-Thr-A-B-C-D-T
Tyr-Pro-Phe-Thr-A-B-C-D-E-T wobei Tyr gleich der Aminosäure Tyrosin, Pro gleich der Aminosäure Prolin, Phe gleich der Aminosäure Phenylalanin und Thr gleich der Aminosäure Threonin Ist. A, B, C, D, und E können jede beliebige Aminosäure der D- oder L-Form sein. T steht für OH, OR, NH2, NHR, NR2 oder NHNHR', wobei R gegebenenfalls die folgende Bedeutung hat: Substit. lineares oder verzweigtes C1 -10-Alkyl, Adamantyl, C1-10-Cycloalkyl oder C6-8- Aralkyl, zweckmäßigerweise Phenyl, Benzyl oder Phenyläthyl bedeutet und R' Wasserstoff, lineares oder verzweigtes C1-10-Alkyl, Cycloalkyl oder C6-8-Aralkyl, lineares, verzweigtes oder cyclisches aliphat. C1-16-Acyl, gegebenenfalls durch OH, NH2, C1-14-Alkoxy oder Halogen substituiert, aromatisches Acyl, gegebenenfalls durch OH, NH2, Halogen oder C1-4-Alkoxy substituiert; lineares verzweigtes oder cyclisches C3-11 aliphatisches Urethan darstellt und deren pharmazeutische annehmbare Salze.
2) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A = Isoleucin, Leucin, Serin oder Threonin, B = Isoleucin, Glycin, Serin oder Valin, C = Glycin, Leucin, Threonin, Asparagin oder Arginin, D = Glutamin, Lysin oder Arginin und E = Valin, Asparaginsäure, Leucin oder Arginin Ist.
3) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenylalanin in der 3.Aminosäureposition des Peptids (vom linken, N-terminalen Ende des Peptids her gerechnet) in der D-Form vorliegt. 4) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das Threonin der 4. Aminosäureposition In der D-Form vorliegt.
5) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure L-Threonin in der 4. Aminosäureposition durch Glutamin, Glycin oder Asparaginsäure ersetzt ist.
6) Parmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß a) das N-terminale L-Tyrosin der allgemeinen Formel :
Figure imgf000015_0001
vorliegt, wobei im einzelnen bedeuten:
R3 für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen,
R4 für Wasserstoff oder zusammen mit R3 für eine Äthylenbrücke,
R5 für Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C- Atomen oder eine R6-CO-Gruppe,
R6 für einen gesättigten oder ungesättigten, geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 17 C- Atomen, einen Phenylrest oder einen Phenylalkylrest mit 7 bis 12 C-Atomen, wobei die Phenylreste durch 1 oder 2 Substituenten aus der Reihe Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 4 C-Atomen substituiert sein können, wobei die R5O-Gruppe sich in meta- oder para-Stellung zum
Figure imgf000016_0003
W für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 5 C-Atomen Alkenyl mit 3 bis 5 C-Atomen, Cyclopropylmethyl, CyclobutyImethyl, R6CO-, H-Val, H-Ser, H-Arg, H-Lys, H-Ile, H-Tyr oder H-Phe. b) Das Phenylalanin der allgemei nen Formel vorliegt
Figure imgf000016_0001
wobei im einzelnen bedeuten:
R7 für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen,
R8 für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Nitro, Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, z für 1 oder 2 steht. c) das Prolin der allgemeinen Formel vorliegt:
Figure imgf000016_0002
wobei im einzelnen bedeutet:
R9 für Wasserstoff, eine Hydroxygruppe, eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 oder 4 C-Atomen - am Stickstoff eine Alkyl- oder Alkoxygruppe mit 1 bis 4 C-Atomen gebunden ist - eine oder mehrere Ketogruppen in den Ring eingeführt sind.
7) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuren Prolin,
Phenylalanin als Dehydroaminosäuren vorliegen.
8) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide folgende Struktur aufweisen: Tyr-Pro-Phe-Thr-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-NH2
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-Ile-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-Ile-Gly-OH Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-Ile-Gly-Gln-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ile-IIe-Gly-Gln-Val-OH
Tyr-Pro-D-Phe-Thr-OH
Tyr-Pro-D-Phe-Thr-NH2
Tyr-Pro-D-Phe-Thr-Ile-OH Tyr-Pro-D-Phe-Thr-Thr-OH
Tyr-Pro-Phe-D-Thr-Ile-OH
Tyr-Pro-Phe-D-Thr-Ile-NH2
Tyr-Pro-Phe-D-Thr-Thr-OH
Tyr-Pro-Phe-D-Thr-Thr-NH2 Tyr-Pro-Phe-Gln-OH
Tyr-Pro-Phe-Gln-NH2
Tyr-Pro-Phe-Gly-NH2
Tyr-Pro-Phe-Asp-OH
Tyr-Pro-Phe-Asp-NH2 Tyr-Pro-Phe-Thr-Thr-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-Ser-OH
Tyr-Pro-Phe-Thr-Leu-OH 9) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-8 dadurch gekennzeichnet, daß diese Wirkungen auf das zentrale Nervensystem ausüben.
10) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß diese endokrine Wirkungen auslösen.
11) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide immunmodulierende Wirkungen vermitteln. 12) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide eine Aktivierung des Zellstoffwechsels bewirken.
13) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß diese nach Kopplung an Thyreoglobulin oder andere makromolekulare Eiweißkörper als Anttgene zur Erzeugung von Antikörpern im Säugetierorganismus verwendet werden.
14) Pharmakologisch aktive Peptide nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Peptide zur Bestimmung derselben in Körpergeweben und -Flüssigkeiten verwendet werden.
15) Arzneimittel und Tierarzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in den Ansprüchen 1-12 charakterisierten pharmakologIsch aktiven Peptide und/ oder deren Derivate und/oder deren Säureadditionssalze und/oder deren Metallkomplexe enthalten.
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