WO1986004351A1 - Stabilized human prourokinase - Google Patents

Description

明 細 書 安定化されたヒ ト ープロゥロキナーゼ 技術分野

本発明は安定化されたヒ ト ープロゥロキナーゼ様ボリ ぺブ チ ド、 ヒ ト ―プロウ口キナーゼ様ボリ ペプチ ドをコー ドする D N Aセグメ ン ト、 該 D N Aセグメ ン トを含有するプラス ミ ド、 該ブラス ミ ドを含有する大腸菌、 及びこの大腸菌を用い るヒ ト —プロゥロキナーゼ様ポリ ぺブチ ドの製造方法に関す る。

本発明の安定化されたヒ ト -プロウロキナーゼは各種の蛋 白寳分解 素に対して安定であり、 このため、 これも高収率 且つ高純度で製造することができる。 また、 これらがヒ トゃ 動物に投与された場合、 生体内で酵素により加水分解されに く いから、 それによつてもたらされる薬効が長時間持続する ことが期待される。

他方、 本発明の、 ヒ ト ープロゥロキナーゼ様ポリ ペプチ ド をコー ドする D N Aセグメ ン トを含有する遣伝子系を用る場 合、 該ポリ ぺプチ ドが効率よ く発現され、 従って、 該ボリ ぺ プチ ドが経済的に有利に製造される。 背景技術

ヒ ト -ゥ口キナーゼは人尿中に微量に存在する酵素であり 不活性のブラス ミノ -ゲンをプラス ミ ンに活性化する作用を 有し、 生成したプラスミ ンはフイ ブリ ンを溶解することがで きる。 このゥロキナーゼはジスルフィ ド桔合により連結され た 2本のポリ ペプチ ド鎖からなる。 これに対してヒ ト ープロ ゥロキナーゼは前記の 2本のボリべプチ ド鎮がアミ ド結合に よつて連結された 1本鎮ボリ ペプチ ドであり、 このプロゥロ キナーゼ自体は前記の活性を有しないが、 1価のアミ ド結合 が切断されることにより、 活性を有する前記のゥロキナーゼ に転換される。 ゥロキナーゼは、 成熟ゥロキナーゼとも称さ れる。

ヒ ト —ゥロキナーゼは前記の作用を有するため、 血栓溶解 治療薬として使用されている。 ヒ ト —ゥ口キナーゼは静脈注 射薬として用いられるところから高度な精製品が要求される が、 一般にゥロキナーゼは不安定な酵素で り精製工程で'分 解されやすいといわれている。 例えば人尿より製造されたゥ 口キナーゼは分子量約 54 , 000の高分子ゥ口キナーゼと分子量 が約 33 , 000の低分子ゥ口キナーゼから成り、 この低分子ゥロ キナーゼは高分子ゥロキナーゼがプロテアーゼによって切断 されて生ずる。 この切断部位は成熟高分子ゥロキナーゼの N 末端のセリ ンから 135番目と 136番目の 2 .偭のリ ジン残基間 のペプチ ド結合であることが示唆されている。 このような切 断は、 人尿からのゥ口キナーゼの精製過程においてのみなら ず、 D N A組換技法によつて産生されたブロウ口キナーゼの 精製過程においても同様に生じ、 さらにはプロウ口キナーゼ を静脈注射した場合にも血漿中に含まれる ト リ プシン様プロ テアーゼによって生ずると予想される。 しかしながら、 生体内でのフィプリ ンの溶解に際しては高 分子ゥ口キナーゼの方が低分子ゥ口キナーゼより も効果的で あると考えられる （文献 1 ) 。 従って、 天然ヒ ト高分子ゥ口 キナーゼと同様の活性を有し且つプロテアーゼによって分解 されに く い安定化されたゥ口キナーゼをもたらす安定化され たプロウ口キナーゼ及びその製造方法が強く求められている < しかしながら、 ア ミノ酸を変換することによるこのような安 定化されたプロゥロキナーゼ及びその製造方法は知られてい ない。

ヒ ト —プロゥロキナーゼは、 分子量約 54000の 1本鎮構造 のボリ ペプチ ドとして単離された （文献 2 , 3 ) 。 グレビッ チ等は、 このプロゥ ロキナーゼが体内に投与されてゥロキナ ーゼに転換された場合には、 ゥロキナーゼが直接投与された 場合に比べて血栓溶解活性が強く 、 また副作用であるフイ ブ リ ノ —ゲン分解性の少ないことを報告しており （文献 4 ) 新 しい血栓溶解剤としての可能性を示唆している。 プロゥロキ ナーゼが投与された場合、 この活性化は血栓の存在する局所 において血栓に吸着している少量のプラス ミ ンによってなさ れるために、 言い換えるとプロゥロキナーゼは血栓特異的に 活性化されるため血中の阻害剤の影響を受けに く く、 また副 作用も少ないと考えられている。

ところがこの活性化は非常に起こり易く、 ブロウ口キナー ゼがー旦ゥ口キナーゼに活性化されれば、 自らの酵素活性に よりその分解が急速に進行する。 この結果、 生体内において は血栓溶解活性が長時間持続することができない。 また、 前 記の活性化がプロゥロキナーゼの製造過程で生じた場合、 プ ロウ口キナーゼが高分子ゥ口キナーゼに分解され、 これがさ らに低分子ゥ口キナーゼに分解されて製品中の低分子ゥ口キ ナーゼの含量が増加する （文献 5 ) 。

従って、 比較的活性化されにく く、 そしてそれ故に前記の ごとき天然ヒ トーブロウ口キナーゼが有する欠点を有しない 新しいタイプのヒ ト ―プロウ口キナーゼが求められている。 しかしながら、 そのような改良されたヒ ト ープロウロキナー ゼは知られていない。

ところで、 従来、 ゥロキナーゼは人尿から抽出精製するこ とによって製造れている。 しかしながら、 この方法において は原料である人尿の安定供給に問題があり必ずしも工業的に 優'れた方法とは言い難い。 一方、 最近ではヒ ト腎細胞を分離、 継代培養してゥロキナーゼを製造する方法が開発されている (文献 2 9 ) 。 しかしながらこの組織培養法においては、 治 療薬として有効な高分子ゥ ロキナーゼの産生が代を錢るに従 つて減少し、 低分子ゥ口キナ—ゼの産生が増加することが報 告されており （文献 6 ) 、 実用的なゥロキナーゼの製造方法 としては必ずしも理想的とは言えない。

特開昭 59 - 51300には遺伝子工学的手法によるゥ口キナーゼ の製造方法が開示されている。 しかしながらゥロキナーゼの 発現が具体的に確認されている方法は、 ゥロキナーゼをコ一 ドする遺伝子を trpE遺伝子と連結して tr_P Eとゥロキナーゼの 融合蛋白質を発現せしめ、 これを切断して低分子ゥロキナー ゼを得る方法であって、 プロウ口キナーゼの直接癸現は確認

- 1

5 されていない。 また、 前記融合蛋白質の発現量は示されてい ない。

以上のように、 ブロウ口キナーゼを効果的に発現させ、 こ れを経済的に製造する方法は知られていない。

従って、 この発明は、 生体外及び生体内において種々の酵 素により分解され難く、 そのために高純度の製品として容易 に製造することができ、 そして生体内に投与された場合に血 栓に対してより特異性が高く 、 且つ血栓溶解についての改良 された持続性をもたらす安定化されたヒ ト ープロゥロキナー

10 ゼ様ポリ ぺプチ ド、 該ボリ ぺプチ ドを製造するための遺伝子 系、 及びこの遺伝子系を用いる該ボリ ペプチ ドの製造方法を 提供するものである。 発明の開示

従って、 この発明は 次の式

1 135 157

( M e t ) i> e r X Υ -

(式中、 M e tは場合によっては存在するメ チォニンであり、 S erは N 末端の 1位に存在するセリ ンであり、 Xは 135位

20 に存在する リ ジン又は塩基性ア ミノ酸以外のア ミノ酸であり

Yは 157位に存在するフヱニルァラニン又は酸性ア ミノ酸で あり、 そして実線部分は天然ヒ ト —プロウ σキナーゼのア ミ ノ酸配列の対応する部分と同一のア ミノ酸配列であるが、 伹 し、 Xがリ ジンである場合には Υはフエ二ルァラニンではな

25 い、 ） で表わされるア ミノ酸配列、 又はこれと実質上同一の ァミノ酸配列を有する安定化されたヒ トープロゥロキナーゼ 様ポリ ぺプチ ドを提供する。

この発明はまた、 前記の安定化されたヒ ト ―ブロウロキナ 一ゼ様ポリ ぺプチ ドをコ一ドする、 大腸菌において効率的に 発現する D N Aを提供する。

この発明はさらに、 前記の D N A、 前記プロゥロキナーゼ 様ポリぺプチ ドの発現のための制御領域、 及び大腸菌中で複 製するのに必要な D N A配列を含有するプラスミ ドを提供す る。

この発明はさらに、 前記のプラスミ ドにより形質転換され た大腸菌を提供する。

この発明はさ らに、 前記大腸菌を用いる前記ヒ ト ―プロウ 口キナーゼ様ポリ ぺプチ ドの製造方法を提供す^。 図面の簡単な説明

第 1図は、 本発明に関するプラス ミ ドの系統図である。 第 2図は、 プラス ミ ド pPE3の制限酵素地図を示す。

第 3図はブラスミ ド pPE3とプラス ミ ド PKYU21からのプラス ミ ド PKYU22の作製を示す。

第 4図— 1図〜第 4 — 3図は、 ヒ ト—ブロウ口キナーゼの 全コー ド領域を含む天然 m R N Aからの c D N Aの塩基配列 を示す。

第 5図は、 プラス ミ ド PKYU22と合成 D N Aオリ ゴマーから のプラス ミ ド pKMUl の作製を示す。

第 6図は、 プラス ミ ド pKMUl とプラス ミ ド pTCMl 力、らプラ ス ミ ド pMUML等を作製する過程を示す。

第 7図は、 プラス ミ ド PKYU22及びファ ージ M13pm8RF の

D N Aからの 1200bp揷入部を有する一本鎮ファ ージ D N Aの 作製を示す。

第 8図はブライ マーを用いる 135位のア ミノ酸のコ ドンへ の点変異形成の方法を模式的に示す。

第 9図は、 プラス ミ ド pYTUl 及び pKMUl からのブラス ミ下 PMUP1 の製作を示す。

第 1 0図は変異体ファージ M 1 3ニ本鎮 D N A (pml) 及び プラス ミ ド pMUPl からのプラス ミ ド pMUPlpm の作製を示す。 第 1 1図はプラス ミ ド PSTN16及び PKK223-3からのプラス ミ ド pKKtrpの作製を示す。

第 1 2図はプラス ミ ド pKKtrp及び pMUT4Lpml からのプラス ミ ド _PtrpUK2 の作製を示す。

第 1 3図、 第 1 4図、 及び第 1 6図は、 大腸菌で発現され たゥロキナーゼのフイ ブリ ンォー トグラフ ィ ーを示す。

第 1 5図は天然型プロゥロキナ—ゼと本発明の変異体（ΡΠΙ3) プロウ 口キナーゼとをプラス ミ ンによる活性化について比較 したグラフである。

第 1 7図はプラス ミ ド ρΗΤ3からのプラス ミ ド pYTUl の作製 を示す。 発明を実施するための最良の形態

A . 安定化されたヒ ト ープロゥロキナーゼ様ポリ べプチ ド この発明の安定化されたヒ ト —プロゥロキナーゼ様ポリ ペプチ ドは、 次の式

1 135 157

( Me t)― Ser X - Y -

(式中、 M e tは場合によっては存在するメ チォニンであり、 S erは N—末端の 1位に存在するセリ ンであり、 Xは 135位 に存在する リ ジン又は塩基性ァミノ酸以外のァ ミノ酸であり Yは 157位に存在するフエ二ルァラニン又は酸性ア ミノ酸で あり、 そして横線部分は天然ヒ ト ―ブロウ口キナーゼのア ミ ノ酸配列の対応する部分と同一のァミノ酸配列であるが、 但 し、 Xがリ ジンである場合には Yはフエ二ルァラニンではな い、）で表わされるア ミノ酸配列、 又はこれと実質上同一のァ ミノ酸配列を有する。

ゥロキナーゼは 410偭のァ ミノ酸からなる蛋白質でありそ のア ミノ酸配列はすでに知られている （文献 8および 9 ) 。 ゥロキナーゼのプラス ミノ ーゲンァクチベータ一活性はその

C —末端側の 275個のア ミノ酸からなるぺプチ ド部分により もたらされることが知られているが、 この部分のみから成る ペプチ ドはプラス ミノ ーゲンに対する親和性が低いことが指 摘されている （文献 7 ) 。 前記の活性部分のみから成るぺブ チ ドは低分子ゥロキナーゼと称され、 他方、 ア ミノ酸 410偭 から成るゥロキナーゼは高分子ゥロキナーゼと称される。 前 記のごと く 、 低分子ゥ口キナーゼは、 プラスミノ 一ゲンとの 親和性が低いと考えられるため、 高分子ゥロキナーゼの含有 率が高いゥ口キナーゼ製品が強く求められている。

従って、 ゥロキナーゼの前駆体であるプロゥロキナーゼに ついても、 低分子化しにく いものが好ましい。 本発明者等は、 プロゥロキナーゼの N —末端のセリ ンを 1位として 135位に 位置する リ ジ ンを、 塩基性ァ ミノ酸以外のア ミノ酸に変える ことによって、 135位と 136位の 2個のリ ジン間の切断 （ゥ 口キナーゼにおける高分子ゥ口キナーゼから低分子ゥロキナ ーゼへの変化に相当する） が生じ難く なり、 しかもそのよう にァ ミノ酸が置き換えられた変形されたポ リ べプチ ドが、 天 然プロウ口キナーゼと同様の生理的性質 （活性化されてゥロ キナーゼが活性を示す性質） を有するという驚く べき事実を 見出した。

本発明の安定化されたプロゥロキナーゼ様ボリ ペプチ ドは、 前記の一般式において、 Xはリ ジ ンか、 又ば塩基性ア ミ ノ 酸 以外のア ミノ酸のいずれかであるが、 Xがリ ジ ンである場合 には、 後で詳細に説明するように、 Yはフヱニルァ ラ ニ ンで はない。 Xの塩基性ア ミノ酸以外のア ミノ酸と しては、 目的 ボリ ペプチ ドの生理学的性質に不都合な影響を与えない中性 ァ ミ ノ酸又は酸性ァ ミノ g突であれば何でもよ く、 例えばァラ ニ ン、 ァ ス ノ、'ラギ ン、 ァスパラギ ン酸、 グルタ ミ ン、 グルタ ミ ン酸、 フ エ二ルァ ラ ニ ン、 グ リ シ ン、 イ ソ ロ イ シ ン、 ロ イ シ ン、 メ チォニ ン、 セ リ ン、 ス レオニ ン、 ノ リ ン、 ト リ ブ ト フ ァ ン、 チロシ ン、 プロ リ ン等を挙げることができ、 具体例 と して例えば、 酸性ア ミノ酸のア ミ ドであるァスパラギン又 はグルタ ミ ン ； ヒ ド ロ キ シア ミ ノ 酸であるセ リ ン又はス レオ ニン ； 酸性アミノ酸であるグルタ ミ ン酸又はァスパラギン酸 ； 分枝鎮中性ア ミ ノ 酸である イ ソ ロ イ シ ン、 ロ イ シ ン又はバリ ン等に分けることができる。 本発明者等はヒ ト―ブロウロキ ナ一ゼの 135位のリ ジンを実際にグルタ ミ ン、 ス レオニン、 グルタ ミ ン酸、 又はィ ソロイ シンのいずれかで置き換えたぺ プチ ドを調製し、 それらの 135- 136 位間の切断に対する抵抗 性及び生理学的活性を調べたところ、 いずれのボリ ペプチ ド も 135- 136 位間の切断に対する高い耐性を有し、 しかも天然 プロウ口キナーゼの生理的性質を保持していることが確認さ れた。 この事実から、 135位のリ ジンが塩基性ア ミノ酸以外 のァ ミノ酸により置換されたプロウ口キナーゼは、 2個の塩 基性ア ミノ酸を認識して該 2個の塩基性ァ ミノ酸間の結合を 切断する各種のプロテアーゼに対して安定化されたこと、 及 びゥロキナーゼ活性のたかに 135位のァ ミノ酸は必ずしもリ ジンである必要はないことが^理的に結論される。

プロゥロキナーゼは、 N —末端のセ リ ンを 1位として 158 番目のリ ジンと 159番目のイ ソロイ シンの間のぺプチ ド結合 がプラスミ ン、 ト リ プシン等のプロテアーゼにより切断され ることにより、 ゥロキナーゼに活性化される。 そして一旦活 性化されれば、 ゥロキナーゼは自らの蛋白質分解活性により 分解され低分子化され、 活性を失う。 従って、 生体内におい て持続的なゥロキナーゼ活性を得るには、 前記の切断を抑制 することが望ましい。 他方、 156位のアルギニンと 157位の フエ二ルァラニンとの間のぺプチ ド結合は ト 口 ンビン等によ り切断され、 この切断はゥロキナーゼ活性を低下せしめる。 本発明者等は 157位のフユ二ルァラニンを酸性ア ミノ酸で あるァスパラギン酸又はグルタ ミ ン酸で置き換えるこ とによ つて、 ト ロ ンビ ン等による前記の切断が抑制され、 しかもこ のような置換によつて天然プロゥロキナーゼの生理的性質が なんら失われないという驚く べき事実を見出した。 この事実 は、 この切断に関与するプラス ミ ン、 ト リ プシンなどのプロ テアーゼは 158番目のリ ジ ン残基側鎖の陽電荷を認識してお り、 この近傍のア ミノ酸たとえば 157番目のフヱニルァラ二 ンの代わりに側鎖に負電荷をもつ酸性ァ ミノ酸を導入するこ とによってプロテァーゼの認識を抑制することにより、 切断 速度を低下せしめることができると考えることにより合理的 に説明することができる。

本発明においては、 前記 X及び Yの組合わせの具体例とし て次のようなボリ ぺプチ ドを調製した。

JB _ ¾ X.

lpm G i n P h e pra2 T h r P h e

E135 G 1 u P h e

1135 l i e P h e pm3 L y s A s p

Q135D157 G i n A s p

E135D157 G 1 u A s p 上記の各種のポリ ペプチ ドを、 後で詳細に記載するように Xにおける置換の効果については ト リ ブシ ンに対する感受性 により、 そして Yにおける置換の効果についてはプラス ミ ン に対する感受性、 及び ト ロンビンに対する感受性により調べ - 1

5 12 た。 この結果、 前記の置換はいずれも目的とする安定化効果 をもたらし、 しかもこれらの置換によつて天然プロウロキナ ーゼ本来の生理的性質が失われないことが確認された。 従つ つて、 これらの事実は、 前記の推定される安定化機構と相ま つて、 前に定義した Xと Yのすベての組合わせからなるポリ ぺプチ ドは本発明の安定化効果を発揮するものと、 合理的に 推定される。 従って、 前に定義した Xと Yの組合わせからな るプロウ口キナーゼ様ポリ ぺプチ ドはすべて本発明の範囲に 属する。

10 前記一般式中の横線で示されるア ミノ酸配列は、 天然のヒ ト —プロウ口キナーゼのァ ミノ酸配列の対応する部分と同一 である。 天然ヒ ト ープロゥロキナーゼのァ ミノ酸配列として、 ヒ ト ー腎臓由来の m R N Aに対応する c D N Aにより コー ド されている、 ア ミノ酸 411個から成る配列を挙げることがで きる。 このア ミノ酸配列は第 4 — 1図〜第 4 — 3図にアルフ アベッ トの大文字 3文字からなるア ミノ酸記号により示され ている。

前記一般式中、 （Me t) は、 プロゥロキナーゼの N 末端 の 1位の S erに隣接してその N末端側に存在する場合がある

20 メ チォニ ンを示す。 後に詳細に記載するこの発明の製造方法 によれば、 N末端に翻訳開始コ ド ンに由来するメ チォニンを 有するポリ ペプチ ドが発現されるが、 このメ チォニンが大腸 菌の細胞内の酵素により除去されるこ とによつて N末端にメ チォニンが付加されていないポリ ぺプチ ドが得られることが

25 ある。 従って、 本発明はこのメ チォニ ンを有するボリ べプチ 5 P /JP86/00 1

13 ド及び有しないボリ ペプチ ドの両者を包含する。

本発明の安定化されたヒ ト ープロゥロキナーゼ様ボリぺプ チ ドは、 上に詳細に記載したァ ミノ酸配列を有するボリ ぺブ チ ドのほかに、 これと実質上同じア ミノ酸配列を有するボリ ペプチ ドを包含する。 こ こで、 "実質上同じア ミノ酸配列 " とは、 上記のァ ミノ酸配列中の X及び Y以外の少数個のァ ミ ノ酸が他のア ミノ酸によって置き換えられており、 又は除去 されており、 あるいは上記のァミノ酸配列に少数偭のァ ミノ 酸が付加されているが、 しかしなおプロ—ゥロキナーゼの生 理的性質及び本発明の特徴である安定性をもたらすァ ミノ酸 配列を意味する。 特定の生理活性を有するボリ ペプチ ド中の 該生理活性に閔与しない領域においてァ ミノ酸配列に変更を 加えても、 該'生理活性が影響を受けない場合があることは、 当業者により良 知られている。 従って、 そのような変更を 含むポリ ペプチ ドも、 本発明の特徴を保持している限り本発 明の範囲に属するものである。

B , ヒ ト ープロゥロキナーゼの遺伝子系

この発明はさらに、 安定化されたヒ ト ープロゥロキナー ゼを製造するために有用な遺伝子系に関する。 こ こで、 遺伝 子系とは、 目的とするヒ ト ープロゥロキナーゼ様ポリ べプチ ドをコ一 ドする D N Aセグメ ン ト、 この D N Aを舍有するプ ラス ミ ド、 及びこのプラス ミ ドが導入された宿主を包含する。 本発明の代表的な D N Aセグメ ン 卜には、 N -末端の複数 個のア ミノ酸をコー ドするコ ドンが大腸菌中で高頻度で使用 されるコ ドンであり、 そして前記 N—末端の複数個のァ ミノ 酸並びに前記 X及び Yをコー ドするコ ドン以外のコ ドンがヒ ト腎臓由来の mR N Aに対応する c D N A中の対応するァ ミ ノ酸のコ ドンと同一である D N Aが包含される。

ヒ トープロゥロキナーゼのごとき多数のアミノ酸からなる 蛋白質をコー ドする遺伝子としては、 その蛋白質を天然に産 生する生物細胞、 すなわちヒ ト細胞由来の D N Aセグメ ン ト、 例えばプロ—ゥ口キナーゼをコ一ドする m— R N Aに対して 得られた c D N Aを用いるのが便利であり、 このような高分 子蛋白質をコ一ドする D N Aを合成することは不可能ではな いが多大の努力を必要とする。 他方、 大腸菌中で蛋白質を効 果的に発現せしめるには大腸菌において高頻度で使用されて いるコ ドンから成る遺伝子を使用するのが好ましいと考えら れる ^、 ヒ ト由来の c D N Aにおいてはこのょゔな条件は必 ずしも十分には満足されず、 このような条件を満足させる - D -X Aを得るには化学合成に頼らざるを得ない。

本発明者等は、 ヒ ト —プロゥロキナーゼをコ一ドする遺伝 子として主としてヒ ト由来の c D Aを用い、 この 。 D N A の内プロ—ゥ口キナーゼの N端の少数個のァ ミノ酸をコ一 ド するコ ド ンのみを、 大腸菌において高頻度で使用されている コ ドンからなる合成 D N Aで置き換えることによって、 大腸 菌中で効果的に発現される遺伝子が得られる。

前記の合成 D N A部分のコ ドンの選択に当ってはさらに、 天然型ゥ ロキナーゼ遺伝子 （ c D N A) の 1 6塩基の逆向き I桑り返し配列を消失せしめることによって m R N Aの折りた たみ構造の形成を防止し、 さらに、 m R N Aのレベルにおい て、 本発 の発現プラス ミ ドの好ましい具体例において使用 されるメ タビロカテカーゼ遺伝子 （ C 230)の S D配列付近の 塩基配列と、 ヒ ト ―プロウロキナーゼ遺伝子の 5 ' 端の塩基 配列との相補的構造を消失せしめてこれら相補的会合を防止 するように選択するのが好ましい。 さ らに、 翻訳開始コ ドン A T Gの次の塩基が Aとなるように第 1位のア ミノ酸である セ リ ンのコ ドンを選択するのが好ましい。

この発明の好ま しい態様においては、 上記のように設計さ れたコー ド領域の N未端ア ミノ酸であるセリ ンのコ ドンに隣 接してその上流にメ チォニンをコー ドする翻訳開始コ ドン

A T Gを設けることによって、 プロゥロキナ—ゼの直接発現 を可能にする。 さ らに、 この発明の好ま しい態様においては このコ ー 'ド領域の D N Aを発現べクタ一に挿入し'た場合に、 この発明の好ま レぃ発現ベクターにおいて使用されるメ タピ ロカテカーゼ遺伝子の S D配列と挿入された高分子ゥロキナ · 一ゼ遺伝子の A T G間の距離及び構造が、 天然のメ タ ピロカ テカーゼ遺伝子におけるそれと同一になるように、 前記 A T

Gに隣接してその上流に制限酸素 A l の認識配列、

5 ' C (ATG) 3 '

3 ' TGCAG(TAC) 5 '

を設ける。

従って、 この発明の最も好ま しい態様においては、 ヒ ト ー プロゥロキナーゼをコー ドする c D M Aの内、 ヒ ト ープロウ πキナーゼの N端の 6偭のァ ミノ酸をコー ドする D N A配列 及びその上流が第 1図に示すように変えられ、 その他のコ ー ド領域においては c D N Aの D N A配列 （該当する場合には ア ミノ酸 X又は Yをコー ドするための変異を含む） が使用さ れる。 なお、 この領域中には、 組換体のスク リ ーニング及び 他の D N A配列への置換を可能にするため制限酵素部位 S s t l が設けられている。

第 5図には、 変形された本発明の塩基配列の 1例が示され ている。 この塩基配列においては、 ァスパラギン、 グルタ ミ ン酸、 ロイ シン、 ヒスチジン、 グルタ ミ ン及びプロ リ ンのコ ドンとして大腸菌において高頻度で使用されるコ ドンが使用 されている。 さ らに、 この塩基配列においては、 ヒ ト ープロ ゥロキナーゼの直接発現を可能にするため、 天然 c D N Aに 存在する リ ーダー配列が除去され、 それに代えて、 ヒ ト ープ sゥロキナーゼの第 1 ア ミノ酸であるセ'リ ンのコ ドンに隣接 してその上流にメ チォニンをコー ドする翻訳開始コ ドン A T Gが設けられており、 さ らに発現プラス ミ ドへの揷入を可能 にするために A a t π部位が設けられている。

一般式中、 Xが塩基性ア ミノ酸以外のア ミ ノ鈸である場合 には、 Xがリ ジンである場合の c D Ν Αのコ ドンに代えて目 的とする塩基性ァ ミ ノ羧以外のァ ミ ノ酸をコー ドするコ ドン を用いなければならない。 135番目のリ ジンのコ ドンに代る コ ドンとしては該当するア ミノ酸をコー ドし大腸菌中で容易 に発現され得る ものであれば何でもよいが、 例えば 135番目 のア ミ ノ酸としてグルタ ミ ンを用いる場合には、 C A Aから なるコ ドンを用いるのが好ましく 、 スレオニンを用いる場合 には A C Aが好ま しい。 さらに、 各ア ミノ酸について例えば 51 /JP86/ 1

17 次のようなコ ドンを用いることができる。

135番目のア ミ ノ酸 3 ドン

ァラニン G C A

ァスパラギン A A C

ァスパラギン酸 G A C

グルタ ミ ン酸 G A A

フエ二ルァラニン T T C

グリ シン G G T

イ ソ ロイ シン A T C

ロイ シン C T G

メ チォニン A T G

セ リ ン A G C

ノ リ ン ' G T A ' ト リ プ ト.ファ ン T G G

チコ シン T A C

プロ リ ン C C G 一般式中、 Yが酸性ア ミ ノ酸である場合には、 Yがフエ二 ルァラニンである場合の c D N Aのコ ドンに代えて酸性ア ミ ノ酸をコ ー ドするコ ドンを用いなければならない。 157番目 のフエ二ルァラニンのコ ドンに代わるコ ドンと しては該当す るア ミ ノ酸をコ ー ドし大腸菌中で容易に発現され得る もので あれば何でもよいが、 例えば 157番目のア ミ ノ酸としてァス パラギン酸を用いる場合には、 G A Tからなるコ ドンを用い るのが好ま し く 、 ダルタ ミ ン酸を用いる場合には G A Aが好 ま しい。

' (2) プラス ミ ド

この癸明のヒ ト -プロウ口キナーゼ様ポリべプチ ドを発 現せしめるためには、 動物細胞中で機能するベクタ一を用い てもよいが、 前記コ一ド領域と共に前記遺伝子を、 微生物、 特に大腸菌中で発現せしめるために必要な発現制御領域及び 大腸菌中で複製するために必要な領域を含んで成るプラス ミ ドを用いるのが好ましい。'発現制御領域としては大腸菌中で 外来性遺伝子を発現するために有用な任意の系を用いること ができ、 例えば、 tac , P _L , l acU V5 , P _R , trp , l pp 等 のプロモーターノオペレータ一系を使用する。 特に、 tacプ 口モーター /オペレータ一系、 P _L プロモータ一ノオペレー ター系及び trpプ口モータ一/オペレータ一系が好ましい。 また S D配列としては、 例えば、 メ タピロカテカーゼ遺伝子 の S D配列 （C230S D) (文献 1 0 ) 、 l acSD 等を使用するこ とができる。

本発明のポリ ペプチ ドを発現することができるプラス ミ ド として、 例えば次のものを挙げることができる。

プラス ミ _ドの略称 X Y

pMUPlpm Gin Phe pMUT4Lpm2 Thr Phe ptrpUK2(B135) Glu Phe ptrpU 2(I135) He Phe pMUT4Lpra3 Lys Asp ptrpUK2(Q135D157) Gin Asp ptrpUK2(E135D157) Glu Asp

(3) プラス ミ ドが導入される宿主

前記のブラス ミ ドが導入される宿主としては、 動物細胞. 微生物、 例えば細菌、 酵母等を使用することができるが、 細 菌、 特に大腸菌を使用するのが好ま しい。 - 本発明の宿主大腸菌としては、 腸管寄生性のない無毒大腸 菌株、 例えばェシ.エ リ シャ · コ リ (Escherichia coli) K-12 株に由来する任意の菌株を使用することができ、 例えば JM83, JM103, JM105, RB791, SM32.N99, RR1, W3110, χ 1776等を使用す ることができる。

C . 遺伝子系の作製

この発明に係る遺伝子の作製方法の 1例は次の段階すな わち、

(1) ヒ ト —ブロウ口キナーゼを完全にコー ドする D N A 断片を調製する段階 ；

(2) 前記ヒ ト —プロゥロキナーゼのボリ ペプチ ドの 135 番目のァスパラギン酸をコー ドするコ ドンに変化を生じさせ 塩基性ア ミノ酸以外のア ミノ酸をコー ドするコ ドンに転換す る段階 ；

(3) 前記ヒ ト ープロゥ ロキナーゼのボリ ペプチ ドの 157 番目のア ミノ酸をコー ドするコ ドンに変化を生じさせ、 酸性 アミノ酸をコー ドするコ ドンに転換する段階 ；

(4) 前記 (1) , )及び (3)により調製したいずれか 2種類の D N A断片を連結して目的とする安定化されたヒ ト ープロゥ 口キナーゼ様ボリ ペプチ ドをコー ドする D N A断片を調製す る段階 ； 及び、

(5) 前記ボリ ぺプチ ドの N端の少数偭のァミノ酸をコ一 ドする前記 D N Aセグメ ン ト中の部分を、 同じア ミノ酸をコ 一ドし且つ大腸菌中で発現されやすいコ ドンからなる D N A 断片によって置き換える段階 ； .

を含んで成る。 '

上記 ω〜（⁵)の段階の内、 段階 a)は必須であるが、 段階 ）〜 は）は目的とするヒ ト ープロゥロキナーゼ様ポリ ペプチ ドのタ イ ブに応じて選択実施され、 実施の順序は任意に選択するこ とができる。 効率的に発現する遺伝子を得るには段階 (5)をも 実施するのが好ま し く、 この段階を実施する順番は任意に選 択するこ.とができる。

本発明の遺伝子系の D Ν Αセグメ ン トは勿論全合成の手段 階によってもよい。 ぞの際、 天然のコ ドンに代えて大腸菌で 発現されやすいコ ドンを採用することができる。

本発明に関する各種プラス ミ ドの作製の系統図を第 1図に 示し、 具体的な方法を実施例及び参考例に記載する。 D . 遺伝子の発現及び発現生成物の特徴付け

前記のようにして作製したプラス ミ ドを適当な宿主、 例え ば大腸菌 JM 103、 大腸菌 W3110等に形質転換し、 この形質転 換体を適当な培地、 例えば 50 <« g /m£ のア ンビシリ ンを舍 有する場合がある L -培地中で培養し、 大腸菌が一定量、 例 えば 550nm において吸光度 0. 3〜 0. 5まで、 増殖した時に遺 伝子の発現を誘導する。 この誘導は使用するプラス ミ ドのプ 口モータの種類により異なる。 例えば、 プラス ミ ド pMUPlpm を使用する場合には、 これらのプラス ミ ドで形質転換された 大腸菌を 3 0 でで培養し、 そして培養温度を 4 2 に上昇せ しめることにより誘導する。 また、 プラス ミ ド pMUT4Lpm2 、 又は pMUT4Lpm3 を使用する場合にはィ ソプロビル— — D — チォガラク ト ビラノ シ ド （ IPTG) により誘導する。 さ らに、 プラス ミ ド ptrpUK2(I135) 、 p trpUK2 (E135) 、 ptrpUK2(Q135 D15T) 、 又は ptr_PUK2(E135D157) を使用する場合には、 培養 菌体濃度が一定値、 例えば 550nm における吸光度 0. 3〜 0. 5 に達したときにイ ン ド—ル酢酸を添加する こ とにより誘導す る ことができる。

このようにして遺伝子の発現を誘導した後、 目的とするポ リ ペプチ ドを生成せしめるためにさらに 3〜10時間培養する。 次に、 こう して培養された細胞を集め、 そして常法に従って、 例えば後の実施例に具体的に記載する方法に従って、 目的ポ リ ペプチ ドを舍有する無細胞抽出液を得る。 次に、 場合によ つては、 これらの抽出液から、 抗ゥロキナーゼモノ クローナ ル抗体が結合したセファ ロースカ ラムによるァフ ィ 二ティ ー クロマ トグラフィ一を行なう ことによってプロゥロキナーゼ 様ぺプチ ドを精製する。

この発明においては、 上記のようにして調製した抽出液に ついて、 酵素活性、 分子量、 ト リ プシ ン感受性、 プラス ミ ン 感受性、 及び ト ロンビン感受性について試験した。

(1) 酵素活性の測定

合成基質法 ； 試料 100 < " に 0. 2 mM S - 2444 ( L - ピログノレタ ミ ルーグ リ シル一 L —アルギニ ン P—二 ト ロア二 リ ド， Kabi社、 ス ウ ェ ーデ ン） 、 0. 1 M Tris-HCjg (pH7. 5 ) 、 0.01¾TritonX - 100 を 700 £ 加え 3 7 で にて 3 0分間ィ ンキュペー ト した後酢酸 100 を加えて反応を停止し、 405nm における吸光度を測定する。

フイ ブリ ン平板法 ί 1 %牛フイ ブリ ノ一ゲン （Miles 社の bovine fibrinogen, 9 5 ¾ clottable) _Ν 0,25%ァガ α -ス を含む 6 7 mMリ ン酸緩衝液 （ΡΗ7. 4 ) に最終濃度 1 ュニッ ト / πι となるように ト ロ ンビ ンを加えて作成したフ ィ プリ ン平板上に 1 0 の試料をスポ ッ ト し 3 7 て にて 1 6時間 ィ ンキュベー ト後の溶解円の面積を測定し標準ゥロキナーゼ (日本曹達㈱製） と比較して活性を測定する。

(2) 分子量の測定

抽出液サンプルを、 2 —メ ルカプ ト エタノ ールを舍まな い条件でレムリ —等の方法 （文献 3 0 ) により、 S D Sポリ ァク リルァ ミ ドゲル電気泳動により分離し、 次にフイ ブリ ン ォー トグラフィ 一により可視化して標準サ ンプルと比較する ことにより測定する。 (3) ト リ プシン感受性

サンプルを ト リ ブシンで処理した後、 前記 (2)の方法によ り、 処理物中の酵素活性を有する生成物の分子量を測定する。 この試験により、 135位のァミノ酸の置換によるプロゥロキ ナーゼの安定化を確認する。

(4) プラス ミ ン感受性

サンプルの酵素活性をフ イ ブリ ン平板法にて測定し、

500IU/ m5 となるように 5 O mMベロナ一ル緩衝液、 0. 1 M aCi 0.001% Tween 8 0を含む溶液に希釈する。 これら の溶液 にプラス ミ ンをそれぞれ l g s 2 g、 5 〃 g加え、 3 7 'cにてィ ンキュベー 卜 し経時的に 1 0 μ ί 採 取して 5 μ gのダイ ズ ト リ プシンィ ンヒビターを加えて反応 を停止し、 S - 2444による合成基質法によって活性を測定す る。 ブロウ αキナーゼはプラス ミ ンにより 158位のリ ジンと 159位のィ ソロイ シンの間が切断されて活性化されるため、 プラス ミ ン処理により分解されに く いことが 157位のァ ミノ 酸の置換によるプロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドの安定化の 指標となる。

(5) ト ロ ンビン感受性

サンプルの酵素活性をフイ ブリ ン平板法にて測定し、 50

IU/ mjg となるように 5 O mMベロナ一ル緩衝液、 0. 1 M aC^ 0.00 1 % Tween 8 0を含む溶液に希釈する。 これら の溶液 1 m £ に ト ロ ンビン 1ュニ ッ トを加え、 3 7 'Cにて 3 0分間イ ンキュベー トする。 100 ₍ " を採取して天然型酵 素については のプラス ミ ンで 3 7 で、 3 0分間、 変異 体については 5 gのプラス ミ ンで 3 7 で、 6 0分間処理し、 S 一 2444による合成基質法で活性を測定する。 ト ロ ンビンを 加えずに同様の操作を行なったものを対照として ト ロ ンビン 処理後の残存活性を求める。 ブロウ口キナーゼは、 ト ロ ンビ ンにより 156位のアルギニ ンと 157位のフ ヱニルァ ラ ニ ンと の間の結合が切断された場合ゥ口キナーゼ活性が低下する。 従って ト ロンビン処理後の残存活性が低下しないことが、 157位のァ ミノ酸の置換によりプロゥロキナーゼ様ボリ ぺプ チ ドが安定化されたことを意味する。

結 果

(1) 酵素活性

この発明のブラスミ ドにより形質転換された大腸菌か 得られたサ ンブルはすべて、 前記 (1)に記載した酵素活性の測 定において、 目的の活性を示した。

(2) ト リ プシ ン感受性

135 位のァ ミノ酸及び 157位のァ ミノ酸がいずれも置換 されていないプロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドをコ一 ドする ブラス ミ ド ρΜϋΡΙ ; 135位のア ミノ酸のみが置換されているプ ロウ口キナーゼ様ポリ ぺプチ ドをコ一ドする遺伝子を舍有す るプラス ミ ド pMUPlpm 、 pMUT4Lpm2 、 p tr_PUK2 ( 1135) 及び p trpUK2 (E135)；並びに 135位のア ミノ酸及び 157位のアミノ 酸が共に置換されているプロゥロキナーゼ様ボリ ペプチ ドを コ一ドする遺伝子を含有するプラス ミ ド p trpUK2 (Q 135D 157) 及び p trpUK2 (E135D157)のいずれかにより形質転換された大 腸菌から調製したサ ンプルは、 pMUPl 由来のサ ンプルを除き いずれも ト リ プシン処理に対して耐性を示した。

例えば、 プラスミ ド pMUPl 及び pMUPlpm のそれぞれを大腸 菌 W3110に形質転換し、 これらの形質耘換菌を L -ブロス中 で 3 0 でにて培養し、 600nm の 0.D が 0. 3 に達したとき培養 温度を 4 2 'Cに上昇せしめることにより遺伝子を発現せしめ た。

培養菌体を集め、 その無細胞抽出液を調製した。 これらの 抽出液について S D Sボリ アク リ ルア ミ ドゲル—フ ィ プリ ン オー トグラフィ 一により分子量を推定したところ、 いずれの 抽出液についても分子量は約 5万であった （第 1 3図中レー ン 2及び 4 ) 。 また、 両抽出液を ト リ プシ ンで処理した後同 様にして分子量を測定したところ、 pMUPl 由来の抽出液にお いては分子量約 3万の生成物が生じていたが、 pMUPlpm 由来 の抽出液においては分子量約 3万の生成物はほとんど生じな かった （第 1 3図中レー ン 3及び 5 ) 。

以上の結果から、 pMUPl 由来の生成物は ト リ プシンによつ て容易に低分子化されるのに対して pMUPlpm 由来の本発明の 生成物は ト リ ブシンにより低分子化されないこ とが明らかで ある。

同様にして、 プラス ミ ド pMUT4Lpm2 を大腸菌 JM 103に形質 転換し、 この形質転換菌を L —ブロス中で 3 7 Vにて 550nm における吸光度が約 0. 5 になるまで培養し、 誘導剂として IPTG (イ ソプロピノレー ー D—チォガラク トビラノ シ ド） を 最終濃度が 1 m Mとなるように添加し、 3 7 でにてさらに培 養し遺伝子を発現せしめた。 この培養菌体を上記同様に処理 し、 生成物を上記と同様にして分折した。

この結果を第 1 4図に示す。 この図中レーン 1 は標準ゥロ キナーゼ （ 1 ュニッ ト） 、 レー ン 2 は pMUP l により形質転換 された大腸菌からの粗抽出液を ト リ プシンで処理したもの、 レーン 3 は pMUT4L piri2 により形質転換された大腸菌からの粗 抽出液を ト リ ブシンで処理したもの、 レーン 4は pMU P lpm に より形質転換された大腸菌からの粗抽出液を ト リ プシ ン処理 したものの結果を示す。 この結果から明らかな通り、

PMUT4Lpm 2 に由来する遺伝子産物も ト リ プシンにより低分子 化されにく い。

前記の分子量約 5万の生成物及び約 3万の生成物はそれぞ れ高分子ゥロキナーゼ及び低分子ゥロキナーゼ-に相当するも のと考えられる。 これらの分子量が人尿由来の標準ゥロキナ ーゼのそれに比べてやや小さいのは、 大腸菌内では糖鎖の付 加が生じないためであると推定される。

135位のァ ミノ酸置換の普遍性

上記の結果は、 ヒ ト ープロゥロキナーゼと実質的に同一の ァ ミノ酸配列を有し、 N未端のセリ ンから 135番目のリ ジン がグルタ ミ ン、 ス レオリ ン、 グルタ ミ ン酸、 又はィ ソ ロイ シ ンにより置き換えられているヒ トプロウ口キナーゼ様ポリ べ プチ ドがいずれも天然ヒ ト ープロゥ πキナーゼと同様にフィ ブリ ン分解活性すなわちゥロキナーゼ活性を示し、 しかも天 然ヒ ト ―プロウ口キナーゼと募 ト リ ブシンにより分解され に く いことを明瞭に示している。

このことは、 高分子ゥロキナーゼの N末端から 135番目と 136番目の 2個の塩基性ア ミノ酸 （リ ジン） の間のペプチ ド 結合が ト リ プシ ン様プロテアーゼにより切断されて抵分子ゥ 口キナーゼが生成するとする推定が正しいことを示している。 さらに、 N末端から 135番目のア ミノ酸が前記のア ミノ酸で ある場合、 いずれも ト リ プシ ンによる前記切断が生じ難いこ とは、 第 135位のア ミノ酸が塩基性ア ミノ酸以外のいずれの ア ミノ酸であっても、 135位のア ミノ酸と 136位のア ミノ酸 との間のぺプチ ド結合が切断され難く なることを示している。 さ らに、 N末端から 135位目のァ ミノ酸が、 天然ヒ トウ口 キナーゼの様にリ ジンであっても、 又本発明のヒ ト —ゥロキ ナーゼ様ボリべプチ ドのように前記のァ ミノ酸であってもゥ 口キナーゼ活性が生ずることは、 この 135位目のア ミノ酸の 種類のいかんはゥロキナーゼ活性にとって必須ではないこと を示している。

しかも、 多く のプロテアーゼは塩基性ア ミノ酸を認識する と言われているので、 N末端から 135番目のア ミノ酸が塩基 性ア ミノ酸以外のアミノ酸であればこ の明細書において具体 的に開示したポリ べプチ ドの場合と同様の結果が発揮される と考 られる。

(3) プラ ス ミ ン及び ト ロ ンビン感受性

157 位のア ミノ酸のみが置換されているプロゥロキナー ゼ様ポリ ペプチ ドをコー ドする遺伝子を舍有するプラス ミ ド Pi UT4Lpm3;並びに 135位のア ミノ黢及び 157位のア ミノ酸の 両者が置換されているプロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドをコ ー ドする遺伝子を舍有するプラス ミ ド ptrpUK2(Q135D157) 及 び p trpUK2 (E135D 157) のいずれかにより形質転換された大腸 菌から調製されたサンプルではいずれもブラス ミ ンによる活 性化の速度が天然型プロゥロキナーゼの場合に比べて低かつ た。 この結果の 1例を第 1 5図のグラフに示す。

このグラフから明らかなごと く、 この発明の 157位のア ミ ノ酸が置換されたプロウ口キナーゼ様ポリ ぺプチ ドは、 天然 形のそれに比べてプラスミ ンにより分解 （活性化） されに く いことが明らかである。

ト口ンビン処理した後の残存酵素活性は次の通りであった。 プロゥロキナーゼ トロンビン処理後の残存活性 天然型プロゥロキナ—ゼ 3 6 ¾

変異体 （_{p m} 3 ) " 1 0 7 ¾ .

" (Q 135D 157) 〃 1 0 5 %

〃 (B 135D 157) 〃 9 8 ¾ 以上の結果は、 157位のァ ミノ酸が置換されたプロゥ ロキナ 一ゼ様ポリ ぺプチ ドは ト ロ ンビンに対して不活性化されに く いことを示している。

以上のごと く 、 135位のリ ジンが塩基性ァ ミノ酸以外のァ ミノ酸により置き換えられているヒ ト ―プロウ口キナーゼ様 ポリ ぺプチ ド、 157位のフヱニルァラニンが酸性ア ミノ酸に より置き換えられているヒ ト —プロゥロキナーゼ様ポリ ぺブ チ ド、 及びこれら両ァ ミノ酸が上記のように置き換えられて いるヒ ト ―プロウ口キナーゼ様ポリ ペプチ ドは、 この発明に おいて定義されるア ミノ酸の範囲内において、 いずれも、 天 然型ヒ ト -プロゥロキナーゼと同様の生理的活性を有し、 し かも、 ト リ ブシン、 ブラス ミ ン、 ト ロ ンビン等のプロテア一 ゼ類に対して極めて安定化されているこ とが明らかである。

このこ とは、 本発明の安定化されたヒ ト ―ブロウ σキナー ゼ様ボリ ペプチ ドが、 血栓溶解剤等の医薬の活性成分として 有望であることを示している。

次に実施例及び参考例により この発明をさ らに具体的に説 明する。 但し、 この発明の範囲がこれらの実施例により限定 されるものではない。

参考例 1. m R Ν Αの調製

J.M.Chirgwinらの方法 （文献 1 1 ) に従い、 グァニジンチ オシアナー トを用いる方法によって m R N Aを調製した。

- 8 0 'Cに凍結しておいた腎組織 2 0 gを液体窒素中でヮ ー リ ングブレンダ一にて破砕し、 5 Mグァ二.ジンチオシアナ - ト溶液 （ 5 Mグァニジンチオシアナ一 ト、 0. 5 % N—ラウ コイ ルサルコ シンナ ト リ ウム、 2 5 m M酒石酸ナ ト リ ウム、 0. 1 Mメ ノレ力ブ トエタノ ール、 0. 1 %ア ンチフォ ーム A ) 8 0 m& に懸濁した。 この液をテフ ロ ンホモゲナイザーで均 質化し、 2 0 G ½注射針を用いて核酸を剪断した。 5. 7 M CsC^g 1 2 & に前記溶液 2 4 mi を重層し、 ベッ クマン超 遠心機 S W 2 8 ロータ -により 1 5 'cにて 2 4時間、 25000 rpm で遠心後、 粗全 R N Aを回収した。

2 %酢酸カ リ ウム溶液に粗全 R N Aを溶解し、 2倍容量の エタノ ールを加えて、 — 2 0 でにて一晩放置後、 沈澱を遠心 により回収精製した。 ボリ（A) ⁺ R N AはH· Aviv らの方法 （文献 1 2 ) に従い、 オリ ゴ （ d T) セルロースカラムク ロマ トグラフ ィ ーにより 全 R N Aから単離精製した。 腎組織 1 0 gからの収量は、 全 R N Aは約 3 m gであり、 その 2 〜 3 %がポリ（A)⁺ R N A であった。

参考例 2. c D N Aライ ブラ リ ー （ I ) の作製

参考例 1で得られたポリ（A) ⁺ R N A 4 0 gを用いて c D N A合成を行った。 オリ ゴ（dT) _{l 2}-₁₈ 4 0 μ gをプライ マーとして、 逆転写酵素 4 0ユニッ トを用いて、 4 2 でにて 2時間反応させて第一鎖を合成し、 鐯型の m R N Aをアル力 リ処理で除き、 第二鎮の合成を 100ュニッ トの E.coli D N A ポリ メ ラーゼ I Klenow断片を用いて行つた。

S 1 ヌク レアーゼでヘアピン部をとり除き、'末端デォキシ - ヌク レオチジル転移酵素により、 二重鎮 c D N Aの 3 ' 端に ( d C ) _{1 0} - 2 o 鎖を結合し、 約 400ng の （ d C ) ティ ル c D N Aを得た。

これを市販の （ d G) ティノレ pBR322 (Pst I §β ) (New England Nuclear 製） 800ngとァニールし、 大腸菌： ί 1776を、 Hanahan の方法 （文猷 1 3 ) により形質転換し、 テ ト ラサイ ク リ ン耐 性で且つア ンピシリ ン感受性の形質転換菌約 2 X 10^s 個から なる c D N Aライブラ リ 一 ( I ) を得た。

これらの形質転換菌についてアル力 リ溶菌法による迅速単 離法 （文献 1 4 ) により c D N A挿入断片の大きさを調べた。 参考例 ³. c D N Aライ ブラ リ一検索用プローブと しての 合成 D N Aオリ ゴマーの調製

G.J. Sfeffens 等 （文献 8 ) 及び Gunzler 等 （文献 9 ) に より報告されたヒ ト ウ口キナーゼのア ミ ノ酸配列 Asn¹⁶⁹. Gin. Pro.Trp.Phe¹⁷³に対応する m R N Aに相捕的な 1 4塩基から なる下記の D N Aオ リ ゴマー 1 6種類をホスホ ト リ エステル 法により合成した。

AACCAAGGTTGATT

AACCAAGGTTGGTT AACCAGGGTTGATT

AACCACGGTTGATT

AACCACGGTTGGTT ,

AACCATGGTTGATT

AACCATGGTTGGTT AACCAAGGCTGATT

AACCAAGGCTGGTT

AACCAGGGCTGATT

AACCAGGGCTGGTT

AACCACGGCTGATT AACCACGGCTGGTT

AACCATGGCTGATT

AACCATGGCTGGTT

AACCAGGGTTGGTT

これら 1 6種類の D N Aオ リ ゴマーを U Kプローブ I と称す る。 また、 確認用プローブとして Met ²⁸³. Try. Asn. Asp. Pro²⁸⁷ に対応する m R N Aに相捕的な 1 4塩基から成る下記の D N Aオリ ゴマー 8種類の D N Aオリ ゴマーを同様にして合成し た。

5 ' GGATCATTATACAT 3，

GGATCGTTATACAT GGATCGTTGTACAT GGATCATTGTACAT GGGTCATTATACAT GGGTCGTTATACAT

GGGTCGTTGTACAT GGGTCATTGTACAT

これら 8種類の D N Aオリ ゴマーを U Kプローブ Π と称する , これら、 U Kブローブ I 及び U Kプローブ IIのそれぞれ

200ng ずつを、 T 4ポリ ヌク レオチ ドキナーゼを用いて 3000 Ci/m_m0le³²P 7" A T Pにより 5 ' 端放射能標識を行い、 コ ロ ニーハイ ブリダィゼーシヨ ン用プローブとした。

参考例 4. c D N Aライ ブリ ー （ I ) 検索

(1) 検索

I S g Zm のテ ト ラサイ ク リ ンを舍有する L B寒天 培地に、 ォー トク レーブ殺菌したニ ト ロセルロースフィ ルタ 一 （ 0.45 m, TYPE TM-2) (東洋濾紙製） を置き、 約 2000個 の形質転換菌コ 口ニーが生育するように、 実施例 2 において 調製した形質転換菌を撒いた。 3 7 でにて 8時間培養した後 2枚のニ ト ロセルロースフ ィ ルターにレプリ カ （複写） し、 これをさ らに 3 7 でにて 3時間培養した。 最初のニ ト ロセル ロースフ ィ ルターをマスターフ ィ ルタ一とし、 後者の 2枚を、 1 5 fi g / £ のテ ト ラサイ ク リ ン及び 100 ii g / m£ のク 口ラムフ 二コールを含有する L B寒天培地に移し、 3 7 で にて一晩培養した。 次に、 Grunstein Hogness の変法 （文献 1 5 ) に従って 0. 5 M NaOH 及び 1. 5 M NaC 上に 3分間フ ィルターを置き、 コ ロニーの溶菌及び D N Aの変性を行い、 0. 5 M Tris-HCjg ( H 7. 6 ) 及び 1. 5 M NaC 上で中和し、 フ ィ ルターを風乾し、 そして 8 O 'cにて 2時間焼成した。 次に、 フ ィ ルターを 4 X S S C中で 6 0 でにて 3 0分間ず つ洗浄し、 続いて 4 x S S C、 1 0 x Denhardt及び 5 0 g Z m 変性 E.coli— D N A中で 6 0 'Cにて 1時間プレハイ ブ リダィゼーショ ンを'行い、 さ らに 0. I m M A T P及ひ:放射 能標識 U Kプローブ I (約 10⁷cpmZフ ィ ルター） を加えて 3 7 'Cにて 1 6時間ハイ ブリダィ ゼーシヨ ンを行った。 4 X S S C中で 3 9 でにて 6 〜 8回洗浄した後、 フ ィ ルターを風 乾し、 オー ト ラジオグラフ ィ 一により、 U Kプロ 一ブ I とハ イ ブリダイ ブする形質転換菌を検索した。 この方法により 8 10⁴ 個のコ ロニーから 2 1個の候補ク ロー ンを得た。 これ らのク ロー ンのブラス ミ ドを pKYUl〜pKYU21と称する。

得られた候補ク ローン 2 1偭を上記と同様に処理し、 U K プローブ ]! とハイ ブリダィ ズするク ローンを得た。 このク α ーン中のブラス ミ ドを pKYU21と称する （第 3図） 。

(2) pKYU21プラス ミ ド D Ν Αの特性

PKYU21プラス ミ ド D N Aを各種の制限酵素で消化し、 Maxam -Gilbert 法 （文献 1 6 ) により、 又は M13mp8にサブ クローン化した後ジデォキシチヱイ ンターミネーショ ン法

(文献 1 7 ) により、 塩基配列の决定を行った。 これをゥロ キナーゼの公知のア ミノ酸配列と対照した結果、 c D N Aは 低分子ゥロキナーゼのコー ド領域を完全に舍むが、 高分子ゥ 口キナーゼのコ一ド領域中の 5 ' 端領域の約 100 b p の D N Aが欠損していることが確認された。

参考例 5. プライ マ ー延長反応による c D N Aライブラ リ

- ( Π ) の作製

参考例 4 (2)において決定した塩基配列に基づき、 ⁸⁹Ser.

Asp. Ala. Leu. Glu⁹ に対応する m R N Aの配列に相補的な

1 5塩基から成る D N Aオリ ゴマー ：

" 5 ' CTGAAGAGCATCAGA 3 '

をホスホ ト リ エステル法によって合成した。

鐯型としてボリ（A) + R N Aを 100 gを用い、 Agarwall等

(文献 1 8 ) 、 又は Stewart 等 （文献 1 9 ) の方法に基づき、 5 ' 端 ³²P— 標識プライ マ — ¹ g と共に逆転写酵素 100ュ ニッ トにより第 1鎮 c D N Aを合成し、 次に E.coli D N Aポ リ メ ラーゼ I Π enow断片 100ュニッ トを用いて第 2鎮を合成 した。 次に S 1 ヌク レアーゼにより一重鎮 D N Aを消化し、 末端デォキ シヌ ク レオチジル転移酵素を用いて 3 ' 端に（dC) n鎮を付加した。 この d Cティ ルイ ンサー ト （ c D N A ) と d Gティ ルべクタ - (p BR322)とをァニールした後、 大腸菌 ズ 1776を形質転換して約 5 10⁴ 個の形質転換体からなる c D N Aライ ブラ リー （ Π ) を得た。 51 P T/JP86/0 1

35 参考例 6. c D N Aライブラリ ー （ Π ) の検索

参考例 5 において得た形質転換菌を、 参考例 4 (1)に記載し た方法と同様にして処理しハイ ブリダィゼーショ ンを行った。 この場合 PKYU21からの 150bp P st I - B gl Π 5 ' 端消化断片 を、 or³²P dCTP(3000 Ci Zmmole)を用いてニック ト ラ ンス レ ーシヨ ン法 （文献 1 3 ) により放射能標識したものをブ α— ブとして用いた。 ハイブリダィゼーシヨ ンを 6 0 でにて行つ た。

次に、 2 X S S Cにより 6 0 'Cにて 2〜 3 回フ ィ ルターを 洗浄し、 風乾し、 ォー ト ラジオグラフィ ーにより上記のプ口 ーブとハイ ブリダィ ズするク ロー ンを検索した。 約 3 X 10⁴ 個のク ローンから 8個の陽性ク ローンを得た。 これらのク ロ ーン中のアラス ミ ド ρΡΕ1〜ρΡΕ8と称する。 これらのプラス ミ ド D Ν Αを制限酵素 I で消化した結果、 プラス ミ ド pPE3 (第 2図） が約 420bp の c D N A挿入部を含有することが確 認された。

■ このプラス ミ ド pPE3の D N Aを制限酵素 P st I で消化して 得られた断片を M13mp8にサブク 口一ン化し、 ジデォキシチェ ィ ンター ミネーショ ン法 （文献 1 7 ) により塩基配列の決定 を行ったところ、 プロゥロキナーゼ遺伝子の 5 ' 端側の十分 な長さのコー ド領域を含み、 さらに翻訳開始コ ドン A T Gの 上流に 6 6 bpから成る 5 ' 非翻訳領域を含むことが確認され た （第 2図） 。

参考例 7. プロゥロキナーゼ遺伝子の作製 （第 3図）

低分子ゥ口キナーゼの完全なコ一ド領域を含むブラス ミ ド PKYU21の D N A 5 gをそれぞれ 1 0 ュニッ 卜ずつの制限酵 素 Bgl II及び Hind ΠΙにより二重消化し、 そして電気溶出して、 約 5. 7 K bの D N A断片を得、 他方同プラスミ ド PKYU21の

D N Aをそれぞれ 1 0ュニッ トずつの B gl Π及び Nco I によ り二重消化し、 そして電気溶出して 6 6 bpの D N A断片を得 た。 また、 参考例 6において得たブラスミ ド pPE3の D N A 5 <" gをそれぞれ 1 0ュニッ トずつの Nco I及び Hind IEにより 二重消化して約 1. 1 Kb D N A断片を得た。 これら 3種の D N A断片はフヱノ ール/ク ロ口ホルム抽出を操り返し、 2倍量 のエタノ ールで沈殺をするこ とにより精製 1¾収した。 これら 3種類の D N A断片を T 4 D N Aリガーゼにより連結し、 大 腸菌 ¾ 1776を形質転換した。 得られた形質転換体をアルカ リ 溶菌法による迅速単離法により調べ、 プロゥロキナーゼの完 全な遺伝子を含むブラス ミ ド PKYU22を有するクローンを得た。 このク ロー ンェシエ リ シャ - コ リ （Escherichia col i)

τ 1766ZPKYU22は 1985年 1月 1 1 日に工業技術院微生物工業 技術研究所 （茨城県筑波郡谷田部町東 1 丁目 1番 3号、 日本） に微ェ研菌寄第 8041号 （FERMP-8041) として寄託され、 1986 年 1月 22日に微ェ研条寄第 ？ 号（FERM BP— ) として、 ブタぺス ト条約に基く国際寄託に移管された。

参考例 8. プラス ミ ド PKYU22の挿入部の塩基配列の決定 プラス ミ ド PKYU22の揷入部の塩基配列を、 Haxam-Gilbert 法、 及び M13mp8にサブクローン化した後のジデォキシチエイ ンター ミネーシヨ ン法により決定した。 この結果を第 4一 1 図〜第 4 - 3図に示す。 この結果と文献 2 0 に記載されてい る塩基配列とを比較した場合、 254番目のァ ミノ酸 Asnのコ ドン （A A T) (文献では A A C ) 、 360番目 （第 4 — 2図 中のア ミノ酸の番号） のア ミノ酸 Leuのコ ドン C T G (文献 では C T A ) 、 365番目のア ミノ酸 P roのコ ドン C C A (文 献では C C C ) 、 及び 366番目のァ ミノ酸 G inのコ ドン C A G (文献では C A A) において相互に異なっていた。 A A T は大腸菌において翻訳されに く いコ ドンであるが、 C T G及 び C A Gはともに大腸菌において翻訳されやすい （使用頻度 が高い） と言われ、 大腸菌における発現にとって有利となる。 なお、 C C Cは C C Aより若干有利であると考えられる。

参考例 9. 5 ' 端を変形したプロゥロキナーゼ遺伝子の

合成 （第 5図）

参考例 7 におい T作製した、 プロゥロキナーゼをコー ドす る天然型 c D N Aの 5 ' 端部分の約 3 0 bpの構造を、 プロウ 口キナーゼ遺伝子がシュ— ドモナス由来の C230遺伝子の S D 配列のもとで大腸菌中で効率よ く発現されるように変形した。

下記の、 2 9塩基、 1 5塩基及び 2 0塩基からなる 3種類 の単鎮 D N Aオ リ ゴマ ーをホスホ ト リ エステル法により合成 した。

5 ' CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT 3 '

3 ' TGCAGTACTCGTTGC 5 '

3 ' TCGAGGTGGTCCAAGGCAGC 5 '

次に、 これら 3種類の合成 D N Aオリ ゴマー 1 μ gずつを 9 5 てにて 2分間加熱処理した後、 T 4ポリ ヌク レオチ ドキ ナーゼにより 5 ' 端矮酸化し、 セ ップパッ ク （ C 18) カ ラム (Waters 製） により精製し、 乾燥した後、 2 0 m M Tris-HC i (pH 7. 6 ) 、 1 0 m M MgC ₂ の溶液 5 0 に溶解し、 9 5 でにて 2分間加熱した後室温まで徐冷し、 1 2 でにて一 晚保持することによってァニールし、 下記に示す二重鎮 D N Aを得た。

5 ' CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT 3 '

3 ' TGCAGTACTCGTTGCTCGAGGTGGTCCAAGGCAGC

Aa_tII Sstl BstNI Taql

一方、 プラスミ ド PKYU22の D N A 5 gを制限酵素 B gl Π 及び A at Πにより二重消化し、 約 5. 7 Kbの D Ν Α断片を電気 溶出により 13収した。 他方、 同じブラス ミ ド PKYU22の D N A 5 β gを制限酵素 P st I及び B g 1 Π により二重消化し、 電気 溶出して約 400bp の D M A断片を得。 さらにこれを制限酵素 Tag I で消化して電気溶出する ことにより約 260bp の D N A 断片を回収した。 これら 2種類の D N A断片はフヱノ —ル ク ロロホルム抽出および 2倍量のエタノ ールによる沈殺によ り精製回収した。

これら 2種類の D N A断片と、 前記の合成二重鎮 D N Aォ リ ゴマーとを T 4 D N Aリガーゼにより連結し、 大腸菌 ズ 1776を形質転換した。 形質転換体をアルカ リ溶菌法による 迅速単離法により調べ、 変形されたプロウ口キナーゼ遺伝子 を舍有するプラス ミ ド ρΚΜϋΙ を有するク ロー ン、 ェシヱ リ シ ャ ' コ リ （Escherichia coli) ¾ 1776/ρΚΪΙϋΙ を得た。 この プラスミ ド pKMUl が導入された大腸菌ェシヱ リ シャ · コ リ (Escherichia col i) χ 1776/p ilUl は工業技術院微生物工業 技術研究所に、 微ェ研菌寄第 8040号 （FERMP-8040) として寄 託されている。

参考例 1 0. プロゥロキナーゼの直接発現型ブラス ミ ド

(pi UT4L)の作製 （第 6図）

参考例 9 において得られた 5 μ gのプラス ミ ド pKMUl を制 限酵素 AatH 1 0ュニッ トにより消化し、 子牛消化管ホスフ ァターセ ' （ C I P ) で処理し、 単離した。 他方、 5 gのブ ラス ミ ド pTCMl を制限酵素 Aat E 1 0ュニッ トにより消化し、 電気溶出法により約 500bpの D N A断片を単離した。 これら 2 種類の D N A断片はフヱノ ール/ ク ロ口ホルム抽出および エタノ ール沈殺を缲り返すことによつて精製回収した。

両者を T 4 D N Aリ ガーゼにより連結し、 大腸菌 JM 103に 形質転換した。 形質転換体をアルカ リ溶菌法による迅速単離 法によって調べ、 tac プロモーター/オペレーター及び C230 SD配列がプロウ口キナーゼ遺伝子に対して正方向に入つたプ ラス ミ ド pMUTILを有するク ロー ンを得た。

前記のプラス ミ ド pTCMl は、 発明者等によつて作製された 新規なプラス ミ ドであって、 tac プロモーター /オペレータ 一、 lacSD 及び C230SD配列から成る発現制御領域、 並びに C 230 構造遺伝子を含有する。 このプラス ミ ドが導入された 大腸菌ェシェ リ シャ · コ リ （Escherichia col i) JM 103/pTCMl は工業技術院微生物工業技術研究所に、 微ェ研菌寄第 7779号 (FERM P — Να7779) として寄託されている。

プラス ミ ド pMUTILにおいては、 tac プロモーターノォペレ 一ター、 lacSD 及び C230SDからなる発現制御領域の下流の適 切な位置に本発明の変形されたプロゥ口キナーゼ遺伝子が揷 入されている。

次にブラス ミ ド PKK223-3 (文献 22— 23および 2 4 ) 5 μ g を制限酵素 Hiridm 1 0 ュニッ トで消化し、 子牛消化管ホスフ ァターゼ （P.L.Biochemicals) で処理した。

一方、 前記のようにして得た l gのプラス ミ ド P!IUTILを 4ュニッ トの制限酵素 D ra I で消化し、 この消化断片と 5 ' 端矮酸化し feHindlリ ンカー（dCAAGCTTG) 1 g とを T 4 D N Aリガーゼにより連結し、 次に 1 2 ュニッ トの制限酵素 Hind IIで消化し、 0.15M aC^ 溶液とし、 等容量のフヱノ ー ルノク 口口ホルムで抽出後、 これに 2倍容量のェタノ ールを 加えて D N Aを沈殺せしめ、 16000rpm、 4 'Cにて沈緵物を集 め、 これを乾燥した。 ' この pMUTIL消化断片と、 前記の PKK223-3の Hindm消化断片 とを T 4 D N Aリガーゼにより連結し、 大腸菌 JM 103を形質 転換した。 これらの形質転換菌をアル力 リ溶菌法による迅速 单離法により調べ、 プラス ミ ド PMUT2Lを含むク ロー ンェシェ リ シャ ' コ リ (Escherichia coli) JM 103/ pMUT2L を得た。 このプラス ミ ドは、 プロゥロキナーゼ遺伝子の上流に前記 の発現制御領域を有すると共に、 下流に PKK223-3由来の大腸 菌のリ ポゾ一ム遺伝子の転写タ一ミネ一ター（rrnB, T！ T ₂) を有する。 なお、 プラス ミ ド pKK223-3は Pharmacia P - L Biochemicalsから販壳されており、 容易に入手することがで きる。

5 g のプラス ミ ド PMUT2Lを、 1 0 ユニッ トずつの制限酵 素 S ph I及び T thl 11 I によりより消化し、 フヱノ ールノク ロロホルム抽出後、 エタノ ールで沈藏せしめ、 回収した D N Aを 0. 1 m Mの dGTP , dCTP , dATP及び ΤΤΡ の存在下で Τ 4ポ リ メ ラーゼを用いて末端を平滑化し、 Τ 4 D Ν Αリガーゼに より再環化した。 これを大腸菌 JM 103に形質転換し、 5 0 fi g / & のアンピシリ ンを舍有する L B寒天培地上にコ 口 ニーを形成せしめ、 アルカ リ溶菌法による迅速単離法 （文献 1 ) で調べ、 プラ ス ミ ド PMUT4Lを舍むク ロ ー ンェ シエ リ シ ャ . コ リ (Escherichia coli) J 103 /pilUT4Lを得た。

実施例 1. M l 3 ファ ージを用いる 135 位のア ミノ酸のコ ド ンへの特異的塩基置換変異の導入 (1)

1 ) 1本鎮鐯型 D N Aの調製 （第 7図）

プラス ミ ド PKYU22及びファ ージ M13pm 8ニ本鎮 D N Aそれ ぞれ 1 ' gずつを、 1 0 m M Tris-HC^ (pH 7. 5 ) 、 7 m M MgC & z . 7 m M 一メ ルカプ トエタノ ール及び 5 O m M aC£ を舍有する溶液 2 0 μ H 中で、 5ュニッ ト の P st l を 用いて 3 7 'cにて 1時間消化した。 フ ノ ール処理、 ェタノ ール沈殺によってそれぞれの D N A断片を回収し、 両者を混 合した後、 6 6 m M Tris-HC^ (pH 7. 5 ) 、 5 m M MgC ί ₂ 5 m 0丁丁及び 1 111 ¾1 A T Pを舍有する溶液 2 0 ί 中で 100ュニッ トの Τ 4 D N A リ ガーゼを用いて 1 2 。cにて 1 6時間連結反応を行つた。 反応後、 反応液を用いてメ ッ シ ング等の方法 （文献 2 5 ) に従って大腸菌 JM 103を形質転換 し、 0.02% X — gal 及び I m M IPTG を含有する軟寒天と共 にプレー ト し、 3 7 。cにて一晩培養した。 組換体によつて形 成された白いプラークより一本鎮型 D N Aを調製した。 すな わち、 白いプラークをつまよう じの先端で約り、 大腸菌

JM 103が生育している 1, 5 mjg の 2 x Y T培養液 （ 1. 6 %バ ク ト ト リ プ ト ン、 1 %酵母ヱキス ト ラク ト及び 0. 5 % NaC ) 中に懸濁して 3 7 でにて 5時間培養し、 そして培養液上清か ら、 ボリ エチレングリ コール沈殺、 フヱノ ール処理及びエタ ノ ール沈殺によつて一本鎮組換体ファージ D N Aを回収した。 得られた一本鎮 D N Aを铸型としてメ ッ シングらの方法 (文献 2 5 ) に従ってジデォキシ法により塩基配列を決定し、 クローニングされた一本鎖 D N Aの配列を確認した。 第 7図 に示すように、 コ ーディ ング鎮及びアンチコ一ディ ング鎮が 得られた。

2 ) オリ ゴヌク レオチ ドをプライ マーとするニ本鎮 D N A の合成 （第 8図）

上記のようにして得られた一本鎮 D N Aの内、 ク ローン化 されたアンチコ一ディ ング鎮を寿型として用い、 合成オリ ゴ ヌク レオチ ド ：

5 ' GATGGACAAAAGCCC 3 '

をプライ マー（1)として、 D N Aポリ メ ラーゼ K 1 enow断片によ る修復反応を行った。 すなわち、 铸型一本鎮 D N A 0. 5 pmole に 5 ' 末端を矮酸化したプライ マー 2 pmole を加え、 そして 7 m M Tris-HC^ (pH 7. 5 ) 、 0. 1 m M EDTA 、 2 0 m M NaC£ 及び 7 m M MgC S, ₂ を含有する溶液 1 0 中で 6 0 でにて 2 0分間ィ ンキュベー ト し、 続いて 2 3 でにて 2 0分 間イ ンキュベー ト した。 さ らに、 この反応混合物に、 dATP、 dGTP、 dTTP及び dCTPをそれぞれ 0. 5 m Mになるように加え、 全体を 2 0 ^ 2 として D N Aポリ メ ラーゼ Klenow断片 2ュニ y トを加え、 そして 2 3 でにて 2 0分間ィ ンキュベー 卜 した。 続いて、 1 0 m M A T Pを 及び T 4 D N Aリ ガ—ゼ 1 ユニッ トを加え、 1 2 でにて一晩イ ンキュベー ト した。

3 ) S 1 ヌク レアーゼによる消化

上記のようにして得られた二本鎖 D N Aからバックグラウ ン ドとなる未反応の一本鎮 D N Aを除去するために S 1 ヌ ク レア—ゼによる消化を行った。 すなわち、 上記反応液 2 μ & を 280 m M NaC£ 、 4. 5 m M ZnC 8, ₂ 、 3 0 m M NaOAc

(pH 4〜 4. 5 ) を舍有する反応液 2 5 に溶解し、 2. 3ュ ニッ 卜の S 1 ヌク レア一ゼをカ 1えて 2 6 'C て 3 0分間処理 した。 反応後、 0.25M Tris-HC^ (_PH 8. 0 ) 1 0 « " を加え て反応を停止した。

4 ) 大腸菌 103の形質転換

上記反応液 1 0 を用いてメ ッ シング等の方法 （文献 2 5 ) に従い大腸菌 JM 103を形質転換した。

5 ) 変異体の検索

上記のようにして得られたファ ージプラークについて、 プ ライ マーとして用いたオリ ゴヌク レオチ ド （³² Pで標識した もの） をプローブとして用いて、 プラークハイ ブリダィゼー ショ ンによる変異体ファ ージのスク リ ーニングを行つた。 す なわち、 ベン ト ン ' デイ ビス等の方法 （文献 2 6 ) に従って 軟寒天培地からニ ト ロセルロ ースフ ィ ルターにプラークを移 し、 真空中 8 0 'cにて 2時間べ一キングした。 このニ トロセ ルロースフイノレターを 6 x S S C、 1 O x Denhardt溶液中で、 ³² Pで標識したプライ マーオリ ゴヌク レオチ ドをプローブと して 2 3 でにて一晩ハイブリダィゼーシヨ ンを行った。 次に、 このフ ィ ルターを 6 S S C中で 4. 6 'Cにて洗浄し、 そして ォー トラジオグラフィ一を行い饞性シグナルを示す変異体フ ァージプラークを単離した。 この変異体ファ一ジから変異 2 本鎮型ファ ージ D N A (pml)を得た。

6 ) 変異体 D N Aの塩基配列の決定

変異体ファージ D N Aを铸型としてジデォキシ法により塩 基配列を決定し、 一塩基置換変異が生じたことを確認した。

実施例 2. M l 3 ファージを用いる 135位のァ ミノ酸のコ ドンへの.特異的塩基置換変異の導入 (2)

実施例 1 で用いたものと同じ組換え体 M13ファ一ジ一本鎮 D A (ゥ ロキナーゼ遺伝子のアンチコ一ディ ング鎖がク ロ -ユングされている。 ） を铸型として新たなオリ ゴヌク レオ チ ド変異原剤による部位特異的変異導入をおこなった。 但し、 プライ マー ）として次の合成オリ ゴヌク レオチ ド ：

5 ' GGAACAAAGCCCTCCTCT 3 '

を用いた。 この 1 8塩基のォリ ゴヌク レオチ ドは一本鎮鐯型 D N A中のゥロキナーゼ遺伝子と相補的であるがリ ジンコ ド ン A A Aがスレオニンコ ドン A_^_Aへと一塩基のみ変化して いる。

このオリ ゴヌク レオチ ドをプライ マーとして試験管内で二 本鎖 D N Aを合成した。 すなわち、 铸型一本鑌 D N A 0. 5 pmole に 5 ' 末端をリ ン酸化したプライ マー 2 pmole を加え、 そして 7 m M Tris-HC£ (_PH 7. 5 ) 、 0. 1 m M BDTA 、 2 0 m M NaC£ 及び 7 m M MgC & ₂ を含有する溶液 1 中で、 6 0 でにて 2 0分間ィ ンキュベー ト し、 続いて 2 3 でにて 2 0分間イ ンキュベー ト した。 さらにこの反応混合物に dATP、 dGTP、 dTTP、 及び dCTPをそれぞれ 0. 5 m Mになるように加え、 全体を 2 0 μ & として D N Aボリ メ ラ一ゼ Klenow断片 2ュニ ッ トを加え、 そして 2 3 'Cにて 2 0分間ィ ンキュベー ト した。 続いて 1 O m M A T Pを 1 ί 及び T 4 D N Aリガーゼ 1 ユニッ トを加え、 1 2 。cにてー晚ィ ンキュベ一 卜 した。 上記 反応液を直接、 メ ッ シング等の方法 （文献 2 5 ) に従って大 腸菌 JM 103に形質転換した。 このよう にして上記反応液 1 ϋ 当たり約 1万俪のファ ージプラークが得られた。

得られたプラークを軟寒天培地からベン ト ン . デイ ビス等 の方法 （文献 2 6 ) に従ってニ ト ロセルロースフ ィ ルタ一に 移したのち、 真空中 8 0 にて 2時間べーキングした。 この ニ ト ロセノレロースフ ィ ルタ 一を 6 X S S C、 1 0 X Denhardt 溶液中で³² Pで標識したプライ マーォ リ ゴヌク レオチ ドをプ ローブとして 3 7 'Cにて一晩ハイ ブリダィ ゼ一ショ ンを行つ た。 次にこのフイ ノレターを 6 X S S C中で 5 2 。cにて洗浄し、 そしてォ— ト ラジオグラフ ィ ーを行い陽性シグナルを示す変 異体ファ ージプラークを単離した。 この変異体ファ 一ジから 変異体 2本鎖型ファ ージ D N A (pm2)を得た。 変異体 D N A の塩基配列は、 変異体ファ ージ D N Aを鏵型とするジデォキ シ法により塩基配列を決定し、 目的とする一塩基置換変異が 生じたことを確認した。 同様にして、 例えば下記の右欄の変異剤ォリ ゴヌク レオチ ドを用いることにより、 135番目のァミノ酸リ ジンに代る下 記左欄のァ ミノ酸をコー ドするコ ド ンを導入することができ る。

135位のァ ミノ酸 変異剤ォリ ゴヌク レオチ ド

ァラニ ン 5 ' GATGGAGCAAAGCCC 3 ' ァスパラギン 5 GATGGAAACAAGCCC 3 ' ァスパラギン酸 5 GATGGAGACAAGCCC 3 ' グルタ ミ ン酸 5 GATGGAGAAAAGCCC 3 ' フ エ二ルァ ラ ニ ン 5 GATGGATTCAAGCCC 3 ' グリ シ ン 5 GATGGAGGTAAGCCC 3 ' イ ソ ロ イ シ ン 5 GATGGAATCAAGCCC 3 ' ロ イ シ ン 5 GATGGACTGAAGCCC 3 ' メ チ才ニ ン 5 GATGGAATCAAGCCC 3 ' セ リ ン 5 GATGGAAGCAAGCCC 3 ' ノヾリ ン 5 GATGGAGTAAAGCCC 3 ' ト リプ トフ ァ ン 5 GATGGATGGAAGCCC 3 ' チロシ ン 5 GATGGATACAAGCCC 3 ' プロ リ ン 5 GATGGACCGAAGCCC 3 ' なお、 上記のオリ ゴヌク レオチ ドプライ マーを用いる点突 然変異導入法に代えて、 135番目のリ ジンのコ ド ンの代りに 他のア ミノ酸、 例えばグルタ ミ ン、 ス レオニ ン等のコ ド ンを 有するがその他のコ ドンが変化していない D N A断片を合成 し、 これを天然 m R N Aよりの c D N Aの対応する部分と組 換えることによつても変異を導入することができる 前記のようにして得られた変異体ファ ー ジ D N Aを P st I で切り出して変異した揷入部を得、 これを完全なコー ド領域 の対応部分と置き換えた後、 このコー ド領域を例えば大腸菌 用発現用ベクターに挿入し、 これを大腸菌に形質転換して該 大腸菌を培養することにより、 本発明のボリ ぺプチ ドを発現 せしめることができる。

実施例 3. ヒ ト ープロゥロキナーゼ遺伝子を舍有する大腸 菌用発現プラス ミ ド（PMUPI) の作製 （第 9図） P _L プロモーター及びメ タピロカテカ一ゼ由来の S D配列 を含む pYTUl (文献 2 7 ) をベクターとして、 ヒ ト腎臓由来の ゥロキナーゼ _c D A (ゥロキナーゼの N端の複数個のァ ミ ノ酸のコ ドンが前記のごと く置換されている） の発現プラス ミ ドを作製した。 す ¾わち、 1 0 g のプラス ミ ド pYTUl を 1 0 m Tris一 HC^ (pH 7. 4 ) 、 7 m M MgC & _z 及び 150 m M NaC£ を含有する反応液 100 β ϋ 中で、 1 0ュニッ トの S al ί 及び 1 0ュニッ トの A at Dを用いて 3 7 。Cにて 2時間 消ィ匕し、 ァガロース電気泳動により約 4. 5 K b の S al I 一 Aat Πベター断片を単離した。

一方、 l O g のプラス ミ ド pKMUl を、 1 0 m M Tris-HCi (pH 7. 4 ) 、 7 m MgC SL _z 及び 6 0 m M NaC を含む反応 液 100 中にて、 1 0 ユニ ッ トの D ra I により 3 7 。Cにて 2時間消化し、 次に 0.66 m Mとなるように A T Pを加え、 S al I リ ンカ一 D N A ( 5 ' GGTCGACC 3 ' ) 1 g及び T 4 D N Aリ ガ-ゼ 100ュニ ッ トを加えて 1 2 でにて一晩反応を 行った。 次に、 フヱノ ール処理及びエタノ ール沈籙によって D N A断片を回収し、 1 O mM Tris-HC^ (_PH 7.4 ) 、 7 m M MgC & z 及び 150m M aCjg を含有する反応液 100 £ 中で、 1 0ユニッ トずつの Aat Π及び S al I により 3 7 'Cに て 2時間消化し、 そしてァガロース電気泳動によつて約 2.2 k bのヒ トウ口キナーゼ遺伝子断片を単離した。 これら 2種 類の D N A断片それぞれ 1 ' gを混合し、 6 6 mM Tris-HC£ (pH 7.4 ) 、 7 m M MgC Si _z 、 0.66 m M A T P及び 1 O mM ジチオスレィ ト一ルを舍有する反応液 2 0 ^ " 中で 100ュニ ッ トの T 4 D N Aリガーゼにより 1 2 'Cにて 1晚連結反応を 行った。

この反応液を用いて大腸菌 H B 101 を形質転換し、 形成さ れたコ ロニーをアル力 リ溶菌法による迅速単離によりスク リ 一ユングし、 'プラス ミ ド pMUPl を有するク ロー ンを得た。' こ の菌よりプラスミ ド D N Aを調製した。

実施例 4. プラス ミ ド pMUPlpm—の作製 （ 1—0図）

ゥロキナーゼの N末端から 135番目のリ ジンのコ ドン A A Aがグルタ ミ ンのコ ドン C A Aに変異した c D N A断片を含 有する変異体 M l 3 ファ ージニ本鎮 D M Aと、 P _L プロモー ター及び C 2 3 0 S D配列の下流にプロゥロキナーゼの構造 遺伝子を有するプラス ミ ド pMUPl を用いて、 変異した遺伝子 を含む大腸菌用発現プラスミ ドを作製した。

すなわち、 1 0 <t gの変異体 M l 3二本鎖 D N Aを Pst l により完全消化し、 約 1. 2 K b断片を単離した。

—方、 1 0 ' gのプラス ミ ド pMUPl を P st I により部分消 化し、 約 1. 2 K b断片のみが除去された約 5. 4 K bの断片を 単離した。 _

これらのそれぞれをフヱノ ール処理及びエタノ ール沈殺に より回収した後混合し、 T 4 D N Aリガーゼを用いて 1 2 で にて 1晚連結反応を行い、 反応混合物を用いて大腸菌 HB 101 を形質転換し、 形成されたコ ロニーをアルカ リ溶菌法による 迅速単離法によりスク リ ーニングし、 pMUPlpm を舍むク α — ンを得た。 このプラス ミ ド pMUPlpnt が導入された大腸菌ェシ ヱ リ シャ * コ リ （Escheria coli) x 1776 / pMUPlpm は、 1985 年 1月 1 1 日に工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研菌 寄第 8042号 （FERMP- 8042) と して寄託され、 1986年 1月

12 日に微ェ研条寄第 タ ？ 号 （FEUM BP ？ άラ )とし てブタペス ト条約に基く国際寄託に移管された。

プラス ミ ド p UPlpm は本発明の代表的なプラス ミ ドであり、 P L プロモーター及び C230SD配列の下流の適切な位置にヒ ト ープロウ口キナーゼ様ポリ ペプチ ドをコ - ドするコ ー ド領域 を含有し、 このコ一ド領域においては該ボリ ぺプチ ドの N端 の 6個のア ミノ酸のコ ドンが大腸菌中で発現されやすいコ ド ンにより置き換えられており、 さ らに 135番目のア ミノ酸で ある リ ジンのコ ドン A A Aがグルタ ミ ンのコ ドン C A Aに変 えられている。

実施例 5. プラス ミ ド _PMUT4Lpm 2 の作製 （第 9図及び第

1 0図を参照のこと）

大腸菌 tacプロモーターの下流に上記点突然変異を有する ヒ ト -プロゥロキナ―ゼ構造遺伝子を挿入した発現型プラス ミ ド p!1UT4Lpni 2を以下のようにして作製した。 1 0 g の変異体 M 1 3ニ本鎮 D N A (pm2) を P st I によ り完全消化し、 約 1. 2 K b断片を単離した。 一方、 1 0 g のプラス ミ ド PMUT4Lを P st I により部分消化し、 約 L 2 K b 断片のみが除去された約 4. 6 K bの断片を単離した。

これらのそれぞれをフエノ ール処理およびエタノ ール沈殺 により回収した後混合し、 T 4 D N Aリガーゼを用いて 1 2 でにて一晩連結反応を行い、 反応混合物を用いて大腸菌 HB 101 を形質転換し、 形成されたコ ロニーをアルカ リ溶菌法に よる迅速単離法により スク リ ーニングし、 f>MUT4Lpm 2を舍む ク ロー ンを得た。 プラス ミ ド pMUT4Lpm 2が導入された大腸菌 ェシエ リ シャ . コ リ (Escherichia coli) l 1776 / p UT4Lpm2 は、 1985年 4月 18日に工業技術院微生物工業技術研究所に微 ェ研菌寄第 8188号 （FERMP- o.8188号） として 託され、' 1986 年 1月 22日に微ェ研条寄第 9 ク 号 （FERM BP ? ) と してブタぺス ト条約に基く国際寄託に移管された。

プラス ミ ド pMUT4L_Pm 2 もまた本発明の代表的なプラス ミ ド であり、 tacプロモーターの下流の適切な位置にヒ ト ープロ ゥ ロキナーゼ様ポリ べプチ ドをコ一 ドするコ — ド領域を含有 し、 このコー ド領域においては該ポリ ベプチ ·ドの N端の 6個 のァ ミノ酸のコ ドンが大腸菌中で発現されやすいコ ドンによ り置き換えられており、 さらに 135番目のア ミノ酸である リ ジンのコ ドン A A Aがス レオニンのコ ドン A C Aに変えられ ている。

実施例 6. M l 3 ファ ージを用いる 157位のァ ミノ酸のコ

ドンへの特異的塩基置換変異の導入 (1) 1本鎮铸型 D N Aの調製

プラス ミ ド 1122¾びファ ージ M13mp8ニ本鎮 D N Aそれぞ れ 1 gずつを、 1 0 m M Tris-HC (pH7.5) 、 7 m M MgC £ 2 s 7 m M 一メ ルカプ トエタノ ール及び 5 O mM NaC^ を舍有する溶液 2 0 μ ί 中で 5ュニッ トの P st l を用 いて 3 7 でにて 1時間消化した。 フヱノ ール処理、 エタノ ー ル沈殺によってそれぞれの D N A断片を回収し、 両者を混合 した後、 6 6 m M Tris-HCjg (pH7.5) 、 5 m M MgC ₂ 、 5 m M D T T及び I mM A T Pを舍有する溶液 2 0 中 で 100ュニッ トの T 4 D N Aリ ガーゼを用いて 1 2 でにて

1 6時間連結反応を行つた。 反応後、 反応液を用いてメ ッ シ ング等の方法 （文献 2 5 ) に従って大腸菌 J M103 を形質転 換し、 0.02 % Χ - g al及び I mM IPTG を舍有する寒天と共 にプレー ト し、 3.7 'Cにてー晚培養した。 組換え体によって 形成された白いブラークより一本鎖 D N Aを調製した。

得られた一本鎖 D N Aのい く つかを铸型としてメ ッ シング らの方法 （文献 2 5 ) に従ってジデォキシ法により塩基配列 を決定し、 ク ローニングされた一本鎮 D N Aの配列を確認し た。

(2) 特異的塩基置換変異の導入

前記のようにして得た組換え体 M 1 3 ファ ージ一本鎖 D N A (ゥロキナーゼ遺伝子のアンチコ 一ディ ング鎖がク ロー二 ングされている。 ） を铸型として新たなオリ ゴヌク レオチ ド 変異原剤による部位特異的変異導入をおこなった。 但し、 プ ライ マーとして次の合成オリ ゴヌク レオチ ド 5， GGCCCCGCGATAAGATTA 3'

を用いた。 の 1 8塩基のオリ ゴヌク レオチ ドは一本鎮铸型 D N A中のゥロキナーゼ遺伝子と相補的であるがフニニルァ ラニンコ ドン T T Tがァ スノ ラギン酸コ ドン G A Tへと二塩 基が変化している。

このオ リ ゴヌク レオチ ドをプライ マーとして試験管内で二 本鎮 D M Aを合成した。 すなわち、 寿型一本鎖 D M A 0.5 pmole に 5 ' 末端をリ ン酸化したプライ マ一 2pmoleを加え、 そして 7 m M Tris-HCi (_PH7.5) 、 0. 1 m M EDTA 、 2 0 m M NaCjg 及び 7 m M MgC & _z を舍有する溶液 1 0 ί中で、 6 0 。cにて 2 0分間ィ ンキュベー 卜 し、 続いて 2 3 'cにて 2 0分間イ ンキュベー ト した。 さ らにこの反応混合物に dATP、 dGTP、 dTTP、 及び dCT'Pをそれぞれ 0. 5 m Mの濃度になるよう に加え、 全体を 2 0 として D M Aポリ メ ラ一ゼ Klenow断 片 2 ュニ ッ トを加え、 そして 2 3 。cにて 2 0分間イ ンキュべ ― ト した。 続いて 1 0 in M A T Pを 1 μ ί 及び Τ 4 D N A リ ガーゼ 1 ュニ ッ トを加え、 1 2 °cにてー晚ィ ンキュベー ト した。 上記反応液を直接、 メ ッ シング等の方法 （文献 2 5 ) に従って大腸菌 JM 103に形質転換した。 このよ う にして上記 反応液 1 H 当たり約 1万個のファージプラークが得られた。

得られたプラークを軟寒天培地からベン ト ン · デイ ビス等 の方法 （文献 2 6 ) に従ってニ ト ロセルロースフ ィ ルターに 移したのち、 真空中 8 0 。cにて 2時間べ一キ ングした。 この ニ ト ロセノレロースフ ィ ルタ一を 6 X S S C、 1 0 X Denhardt 溶液中で³² Pで標識したプライマ ーオリ ゴヌク レオチ ドをプ 51 JP8

53 ローブとして 3 7 'cにて一晩ハイ ブリダィゼーショ ンを行つ た。 次にこのフィルターを 6 x S S C中で 5 2 でにて洗浄し、 そしてォー ト ラジオグラフィ一を行い陽性シグナルを示す変 異体ファ ージブラークを単離した。 この変異体ファ一ジから 変異体 2本鎮型ファージ D N A (pm3) を得た。 変異体 D N A の塩基配列は、 変異体ファ ージ D N Aを涛型とするジデォキ シ法により塩基配列を決定し、 目的とする一塩基置換変異が 生じたことを確認した。

また変異剤として次のオリ ゴヌク レオチ ド ：

5' GGCCCCGCGAAAAGATTA 3'

を用いて、 157番目のア ミノ酸フエ二ルァラニンのコ ドン T T Tをグルタ ミ ン酸のコ ドン G A Aに置きかえることもで きる。 . . - 実施例 7. プラス ミ ド pMUT4Lpm 3 の作製

大腸菌 tacプロモーターの下流に上記点突然変異を有する ヒ トウ口キナーゼ構造遺伝子を挿入した発現型プラス ミ ド pMUT4Lpm 3を以下のようにして作製した。

1 0 g の変異体 M l 3二本鎖 D N A ( p m 3 ) を P st I により完全消化し、 約 1. 2 K b断片を単離した。 一方、 1 0 μ g のプラス ミ ド pMUT4Lを P st I により部分消化し、 約 1. 2 k b断片のみが除去された約 4. 6 K bの断片を単離した。 これらのそれぞれをフヱノ ール処理およびエタノ一ル沈緵 により回収した後混合し、 T 4 D N Aリガ—ゼを用いて 1 2 'Cにてー晚連結反応を行い、 反応混合物を用いて大腸菌 HB 101を形質転換し、 形成されたコ ロニーをアルカ リ溶菌法に よる迅速単離法によりスク リ ーニングし、 pMUT4Lpm 3を含む クロー ンを得た。 ブラス ミ ド pMUT4Lpm 3が導入された大腸菌 ェシエ リ シァ ' コ リ （Escherichia coli) x 1776 / pMUT4Lpm 3が 1985年 7月 11日に工業技術院微生物工業技術研究所に微 ェ研菌寄第 8341号 （FERMP-8341) として寄託され、 1986年 1 月 2 曰に微ェ研条寄第 ？ 7 / 号 （FEM BP- 7/ ) と してブタペス ト条約に基く国際寄託に移管される。

プラス ミ ド pMUT4Lpm 3 は本発明の代表的なプラス ミ ドであ り、 tacプロモータ—の下流の適切な位置にヒ ト —プロウ 口 キナーゼ様ボリ ペプチ ドをコ - ドするコ一 ド領域を含有し、 このコー ド領域においては該ポリ ぺプチ ドの N端の 6個のァ ミノ酸のコ ドンが大腸菌中で発現されやすいコ ドンに置き.換 えられて り、 さらに 157番目のア ミノ酸であるフヱニルァ ラニンのコ ドン T T Tがァスパラギン酸のコ ドン G A Tに変 えられている。

実施例 8. プラス ミ ド pKKtrpの作成 （第 1 1 図)

5 μ g のプラス ミ ド PKK223-3と 3 0 ュニッ トの EcoR I及び 2 0 ュニ ッ トの P vu Πを-緩衝液 （ 1 0 m M Tris-C^ 、 _PH 7. 5、 1 0 m M gC £ ₂ 、 5 0 m M NaC£ 、 1 m M D T T) 100 < " 中、 3 了 。 cで 1時間反応させた。 この反応液を 0. 7 %ァガロース電気泳動にかけ、 ア ンピシリ ン耐性遺伝子、 複 製開始領域及び rrnB Tz転写終結領域を含む約 2600塩基対の D N A断片を慣用法によって回収した。

この断片と 1ュニッ トのク レノ ウ断片とを緩衝液 （ 5 0 m Tris-C^ pH 7. 2 1 0 m M M g S0₄. 0. 1 m D T T、 B 0 fs M dNTPs) 2 5 中、 2 5 でで 1時間反応させ、 さ らにアルカ リ フ ォ スファターゼ 1ュニッ トを加え、 6 8 でで 0. 5時間反応させた。 フ ヱノ ール処理後ェタノ —ル沈 '凝し、 沈澱物を 2 0 M & T E緩衝液 （ 1 O mM Tris-HC pH 8. 0 、 1 mM EDTA)に溶解した。 こう して得た D N A断片を 〔 A〕 とする。

一方、 1 0 gのプラス ミ ド PSTN16と 2 0ュニッ トの C la I及び 2 0 ュニ ッ トの P vu H とを緩衝液 （ 1 O mM Tris-Ci pH 7. 5 、 1 O mM Mgcl₂、 5 O mM NaC 5. 1 m M D T T ) 100 中 3 7 でで 1時間反応させた、 この反応液を 0. 7 % ァガロース電気泳動にかけ、 ト リ プ トファ ンォペロ ンのプロ モーター、 オペレーター及びリ ボソ ーム結合部位を含む約 300 塩基対の断片を慣用'法により回収した。

この断片と 1 ュ.二ッ トのク レノ ゥ断片を緩衝液 （ 5 0 m M Tris-HC^ pH 7. 2 1 0 m gS0₄- 0. 1 m M D T T、

8 0 A' d TP_s) 2 5 中 2 5 。cで 1時間反応させた。

フ ユノ ール処理後エタ ノ ール沈澱し、 沈殺物を 2 0 i T E 緩衝液に溶解した。 こう して得た D M A断片を 〔 B〕 とする。

D N A断片 〔 A〕 0. 5 g及び D N A断片 〔 B〕 0. 5 g を緩衝液 （ 6 6 m M Tris-C^ pH 7. 6 6. 6 m M MgC & ₂ 、

1 0 m M D T T、 1 m M A T P ) 2 0 ^ 中 T 4 D N A リ ガーゼ 2. 5ユニッ ト と 1 5 でで 1 5時間反応させた。 この 反応液を用いて、 大腸菌 HB 101株を形質転換し、 ア ンピシ リ ン耐性菌の中から、 pKKtrpプラス ミ ドを有するコ ロニーをス ク リ ーニングし、 慣用法によりブラス ミ ドを単離した。 実施例 9. プラ ス ミ ド ptrpUK 2 の作成 （第 1 2図）

プラス ミ ド pKKtrp及び PMUT4Lを材料として、 ト リ プ トファ ンプロモーターの下流にヒ ト —プロウ口キナーゼ遺伝子の挿 入されたプラス ミ ド ptrpUK2 を作成した。

すなわち 1 g の pKKtrpと 5ユニッ トの E coRIを緩衝液

( 1 0 m M Tris-HCjg H 7. 5 . 1 0 m M MgC 9. ₂ 、 5 0 m M aC^ 、 1 m M D T T) 5 0 中、 3 7 'Cで 2時間反応 後、 さらにアルカ リ ホスファターゼ 2ュニッ トを加えて 6 5 で、 3 0分間反応した。 フヱノ ール処理、 エタノ ール沈緵に より D N Aを回収した 〔 C〕 。

一方 1 0 g ©pMUT4Lと 2 0ュニッ トの E coRIを上と同様 の緩衝液 100 中 3 7 で 、 2時間反応後 1. 2 %ァガロース ゲル電気泳動により ヒ トウ口キナーゼ遺伝子の N末端部分を 含む 640bp断片を単離した 〔 D〕 。

D A断片 〔 C〕 及び ί D〕 を緩衝液 （ 6 6 m M Tris-HC£ pH 7. 6、 6. 6 m M MgC & ₂ 、 1 0 m D T T . 1 m

A T P ) 1 0 M ϋ 中で T 4 D N Aリガーゼ 2. 5ュニッ ト と 1 2 て で 1 5時間反応後大腸菌 HB 101株に形質転換し、 ア ン ピシリ ン耐性窜の中から ptrpUKl プラス ミ ドを有するコ ロニ 一をスク リ ーニングし慣用法により プラ ス ミ ドを単離した。 繞いて 1 / g の ptrpUKl と 5ュニッ トの P st I を緩衝液 ( 1 0 m M Tris-HC^ pH 7. 5 、 1 0 m M gC _z 、 5 0 m M NaC 、 1 m M D T T) 5 0 ₁ " 中 3 7 でで 2時間反応後、 さらにアルカ リ ホスファタ一ゼ 2 ュニッ トを加えて 6 5 で、 3 0分間反応させたフヱノ ール処理、 及びエタノ ール沈殺に /JP86 1

57 より D N Aを回収した 〔 E〕 。

一方、 1 0 ·" ^ の PMUT4Lと 2 0ュニッ トの P st I を上と同 様の緩衝液 100 // 中 3 7 で 2時間反応後、 0. 7 %ァガロー スゲル電気泳動により、 ヒ トウ口キナーゼ遺伝子の C末端部 分を含む 1.2 kb断片を単離した 〔 F〕 。

D N A断片 〔 E〕 及び 〔 F〕 を緩衝液 （ 6 6 m M Tris-HCjg pfl 7. 6 6. 6 m M MgC £ ₂ . 1 0 m M D T T、 1 m M A T P ) 1 0 fi & 中で T 4 D N A リ ガ一ゼ 2, 5 ュニ ッ ト と 1 2 でで 1 5時間反応後、 大腸菌 HB 101株に形質転換し、 ア ン ピシ リ ン耐性菌の中から ptrpUK2 プラス ミ ドを有するコ ロニーをス ク リ ーニングし、 慣用法によりプラス ミ ドを単離した。

実施例 1 0. プラス ミ ド _PtrpUK2(U35) の作成

実施例 1 と同一の方法により、 但しプライ マーとして次の 合成オ リ ゴヌク レオチ ド ：

5 ' CAGATGGAATAAAGCC 3 '

を使用して、 135位のリ ジ ンのコ ド ン A A Aがィ ソ ロ イ シ ン のコ ドン A T Aに変異している D N A断片が挿入された変異 2本鎖型ファ ージ M13RF (1135)を得た。

1 0 M g の M13RF(I135) を P st I により完全消化し、 約 1. 2 k b断片を単離した。 一方、 1 μ gの ptrpUK2 を P st I により完全消化し、 ベクターとなる D N A断片約 3. 4 k bを 単離した。 これらのそれぞれをフヱノ ール処理及びエタノ ー ル沈殺により回収した後混合し、 T 4 D N Aリガーゼを用い て 1 2 でにて一晩反応後大腸菌 HB 101株に形質転換してァン ピシリ ン耐性コ ロニーの中から ptrpUK2(I135) を含むク α— ンをス ク リ ーニ ングした。 この方法の具体的な条件は実施例 4に記載したものと同一であった。

このプラス ミ ドを舍有する大腸菌ェ シヱ リ シャ · コ リ (Escherichia col i) W3110/ptrpUK2 (1135) は、 1985年 1 2 月 2 8 日 Jこ、 D S M— 3622として Deutsche Sammelung von H i kroorgan i smen (Gr i sebachs trasse 8 D-3400 Gottingen) にブタぺス ト条約に基き寄託された。

実施例 1 1. ブラス-ミ ド ptr_PUK(E135)の作成

実施例 1 と同様の方法により、 但しプライ マーとして次の 合成ヌ ク レオチ ド ：

5 ' GATGGAGAAAAGCCCT 3 ¹

を使用して、 135位のリ ジンのコ ドン A A Aがグルタ ミ ン酸 のコ ドン G A Aに変異している D N A断片が挿入された変異 2本鎮型ファージ M13BF(E 135)を得た。

次に、 この M13RF(135)と ptrpUK2 とから、 実施例 1 0 に記 載した方法と同様にしてプラス ミ ド ptrpUK2(E135) を得た。

このプラ ス ミ ドを舍有する大腸菌ェ シヱ リ シャ . コ リ (Escherichia coli) W3110/ptr_PU 2 (E135) は、 1985年 1 2 月 2 8 日 こ、 D S M— 3621と して Deutsche Sammelung von Hikroorganismen こ" "it ₀

実施例 1 2. プラス ミ ド ptr_PUK2(ai35D157) の作成

実施例 1 と同様の方法により、 但しプラ イ マーとして次の 合成ヌ ク レオチ ド ：

5 ' GATGGACAAAAGCCC 3 '

を使用して、 135位のリ ジンのコ ドン A A Aがグルタ ミ ンの 451

59 コ ドン C A Aに変異している D N A断片が挿入された変異 2 本鎮型ファ一ジを得た。

次にこのファ ージから、 実施例 1 に記載されている方法と 同様にして 1本鎖ファ ージ D N Aを得、 上記と同様にして、 但し、 プライ マ一として次の合成オリ ゴヌク レオチ ド ：

5 ' GGCCCCGCGATAAGATTA 3 '

を使用して、 157位のフヱニルァラニンのコ ドン T T Tをァ スパラギン酸のコ ドン G A Tに変異させることにより、 135 位のリ ジンのコ ドン A A Aがグルタ ミ ンのコ ドン C A Aに変 異しており、 且つ 157位のフヱニルァラニンのコ ドン T T T がァスパラギン酸のコ ドン G A Tに変異している D N A断片 が挿入された変異 2本鎮フ 7一ジ 13RF(Q135D157) を得た。

次に、 この M13RF(Q135D157) と ptrpUK2 とから、 実施例 1 0 に記載した方法と同様にして tr_PUK2(Q135D157)を得た。 このプラス ミ ドを含有する大腸菌ェシヱ リ シャ . コ リ (Escherichia co 1 i ) W 3110 / P t r pUK2 (Q 135D157) は、 1985年 1 2月 2 8 日に、 0 3 1— 3623として Deutsche Sammelung von M i kroorgan i smen こ された <>

実施例 1 3. プラス ミ ド tr_PUK2(E135D157)

実施例 1 2 と同様にして、 但し 135位のリ ジンのコ ドンを グルタ ミ ン酸のコ ドン G A Aに変異せしめるために次の合成 ヌク レオチ ド ：

5 ' GATGGAGAAAAGCCCT 3 '

を使用して、 135位のリ ジンのコ ドン A A Aがグルタ ミ ン酸 のコ ドン G A Aに変異しており 、 且つ 157位のフヱニルァラ ニンのコ ドン T T Tがァスノ、'ラギン酸のコ ドン G A Τに変異 している D N A断片が挿入された変異 2本鎮ファージ M13RF (E135D157)を得た。

次に、 この M13RF(E135D157) と tr_PUK2とから、 実施例 1 0 に記載した方法と同様にして t_rpUK2 (E135D157)を得た。

このプラス ミ ドを舍有する大腸菌ェシヱ リ シャ . コ リ (Escherichia coli) W3110/ tr_PUK2 (E135D157) は、 1985年 1 2月 2 8 日に、 D S M— 3624として Deutsche Sammelung von Mikroorganismen Jこ ≤ "れた。

実施例 1 プロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドの発現 (1) 実施例 3 により得たプラス ミ ド pMUPl 及び実施例 4 により 得たプラス ミ ド pMUPlpm を大腸菌 W3110に慣用法に従つ.て形 質転換し、 得られた^質転換菌を 5 m の L -ブロス中で 3 0 °Cにて培養し、 600nmにおける吸光度が約 0. 3 になつた とき培養液の温度を 4 2 でに上昇させ、 さ らに 3時間培養し てゥ ロキナーゼ遺伝子を発現せしめた。

実施例 1 5. 大腸菌からの遺伝子産物の抽出及び

その性質 (1)

, 上記の培養液 5 πι から大腸菌 W3110 の菌体を集め、 これ を 7. 5 Μ塩酸グァニジン及び 0.05Μ Tris- HC (_PH 7. 5 ) を 含有する溶液 0. 5 ιη に懸濁し、 室温にて 9 0分間放置した。 次に、 この懸濁液を lOOOrpm にて 1 0分間遠心分離し、 上清 1 M塩酸グァニジン、 0.05M Tris-HC^ ( pH 7. 5 )、 2 m M還 元型グルタチオ ン及び 0. 2 m M酸化型グルタチオ ンを含有す る溶液 5 πι£ に希釈し、 そして室温にて一晩ィ ンキュベー ト した。 次にこれを、 1 0 m M Tris-HCjg (_PH 7. 4 ) 及び 0. 4 M NaC^ を含有する容器 100倍容量に対して 4 でにて 4時間 透折し、 さらに 1 0 m M Tris-HC£ (pH 7. 4 ) 及び 0. 1 M aC^ を含有する溶液 100倍容量に対して 2時間透折した。 こう して得られた粗抽出物の一部に 3 0 M g / m £ となる よう に ト リ プシンを加え、 3 7 'Cにて 1時間ィ ンキュベ一 ト した。 対照として ト リ プシンの代りに水を加えたものを同様 にイ ンキュベー ト した。

これらを、 レム リ 一等の方法に従って、 12.5%ポリ アク リ ルァ ミ ド及び 0. 1 % S D Sを含有するゲルにおいて電気泳動 した。 次に、 ゲルを 2. 5 %の TritonX-100に浸して室温 1時 間イ ンキュベー ト した後、 フ イ ブリ ン寒天プレー ト上に重層 し、 3 7 でにて約 1時間又は 2時間イ ンキュベー ト し、 フィ プリ ン寒天プレー ト上の溶解ゾーンの位置から分子量を推定 した。 比較のため人尿由来の標準ゥロキナーゼも泳動せしめ た。

第 1 3図において、 レー ン 1 は標準ゥ ロキナーゼ （ 1 ュニ ッ ト） 、 レーン 2 は pMUPlにより形質転換された大腸菌から の粗抽出液、 レーン 3 は PMUP 1 により彤質転換された大腸菌 からの粗抽出液を ト リ プシンで処理したもの、 レー ン 4 は pMUPlpm により形質転換された大腸菌からの粗抽出液、 そし て、 レー ン 5 は pMUPlpm により形質転換された大腸菌からの 抽出液を ト リ プシンで処理したもの、 の泳勖図である。

この図から明らかな通り、 MUPl に由来する遺伝子産物の 分子量は約 5万であるが、 ト リ プシン処理によってその一部 分が分子量約 3万に低分子化した。 他方、 pMU P lpm に由来す る遺伝子産物の分子量も約 5万であるが、 ト リ プシン処理に よって低分子化しなかった。 なお、 これらの生成物の分子量 約 5万及び 3万が人尿由来の高分子ゥロキナーゼの分子量約 5. 4万及び低分子ゥロキナーゼの分子量約 3. 3万に比べてや や低いのは、 大腸菌内では糖鎮の付加が生じないためである と思われる。

実施例 1 6. プロゥロキナーゼ様ボリ ぺプチ ドの発現 (2) 実施例 1 5により得たプラス ミ ド pMUT 4Lpm 2を大腸菌 JM 103に慣用法に従って形質転換し、 得られた形質転換菌を

5 £ の L —ブロス中で 3 7 。cにて培養し、 550 nmにおける 吸光度が約 0. 5 になったとき I P T G (イ ソプロピル一 ー D —チォガラク ト ビラノ シ ド） を最終濃度が 1 m Mとなるよ うに添加することによつて発現を誘導し、 さらに 3時間 3 7 でにて培養することにより ゥロキナーゼ遺伝子を発現せしめ た。

実施例 1 Ί. 大腸菌からの遺伝子産物の抽出及び

その性質 (2)

上記の培養液 5 m を実施例 1 5 に記載したのと同様の方 法により処理して粗抽出物を調製し、 そして一部分を ト リ プ シンで処理した。

これらを、 レム リ 一等の方法に従って、 1 0 %ボリ ァク リ ルア ミ ド及び 0. 1 % S D Sを舍有するゲルにおいて電気泳動 した。 次に、 ゲルを 2. 5 %の Tr i to n X - 100に浸して室温で 1 時間イ ンキュベー トした後、 フイ ブリ ン寒天プレー ト上に ¾ 層し、 3 7 'cにて約 2時間イ ンキュベー ト し、 フ イ ブリ ン寒 天プレー ト上の溶解ゾー ンの位置から分子量を推定した。 比 較のため人尿由来の標準ゥ αキナーゼ、 及び実施例 1 5で得 られた ト リ プシン処理物も泳動せしめた。

この結果を第 1 4図に示す、 この図において、 レー ン 1 は 標準ゥ口キナーゼ （ 1 ュニッ ト） 、 レー ン 2 は ρΜϋΡΙ により 形質転換された大腸菌からの粗抽出液を ト リ プシンで処理し たもの、 レーン 3 は _PMUT4Lpm2 により形質転換された大腸菌 からの粗抽出液を ト リ プシンで処理したもの、 レーン 4 は pMUPlpm により形質転換された大腸菌からの粗抽出液を ト リ プシンで処理したもの、 の泳動図である。

この図から明らかな通り、 pMUT4Lpm2 に由来する遺伝子産 物も p UPlpm に由来する遺伝子産物と同様に ト リ プシ ン処理 による低分子化が起こりに く いこ とがわかる。 なお、 .これら の生成物の分子量約 5万及び約 3万が人尿由来の高分子ゥ口 キナーゼの分子量約 5. 4万及び低分子ゥ πキナーゼの分子量 約 3. 3万に比べてやや低いのは、 大腸菌内では糖鎖の付加が 生じないためである と思われる。

実施例 1 8. プロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドの発現 (3) 実施例 7 により得たプラス ミ ド PMUT4LPIII3 を大腸菌 JM 103 に憒用法に従って形質転換し、 得られた形質転換菌を 5 m の L —ブロス中で 3 7 'Cにて培養し、 550 nmにおける吸光度 が約 0. 5 になったとき I P T G (イ ソプロ ビルー — D —チ ォガラク ト ピラノ シ ド） を最終濃度が 1 m Mとなるように添 加する こ とによ って発現を誘導し、 さ らに 3時間 3 7 。cにて 培養することによりゥロキナーゼ遺伝子を発現せしめた。

実施例 1 9. 大腸菌からの遺伝子産物の抽出及び精製 (3) 上記の培養液 5 ι から大腸菌 JM 103の菌体を集め、 これ を 7. 5 Μ塩酸グァニジン及び 0.05Μ Tris-HCi (pH 7. 5 ) を 舍有する溶液 0. 5 ιιι に懸濁し、 室温にて 9 0分間放置した。 次に、 この懸濁液を lOOOrpm にて 1 0分間遠心分離し、 上清 を 1 M塩酸グァニジン、 0.05M Tris-HC£ (_PH 7. 5 ) 、 2 mM還元型グルタチオ ン及び 0. 2 mM酸化型グルタチオンを 舍有する溶液 5 m に希釈し、 そして室温にて一晩ィ ンキュ ベー 卜 した。 次にこれを、 1 0 m M Tris- HC (pH 7. 4 ) 及 び 0. 4 M NaC を舍有する溶液 100倍容量に対して 4 でにて 4時間透圻し、 さ らに 1 0 m M Tris-HC (pH 7. 4 ) 及び 0. 1 aC^ を舍有する溶液 100倍容量に対して 2時間透折 した。 こう して得られた粗抽出液を、 抗ゥロキナーゼモノ ク ロナール抗体が結合したセファ ロースカ ラムによるァフ ィ 二. ティ一ク ロマ トグラフィ一を行なう ことによって変異体 （pm 3 ) プロゥロキナーゼを精製した。

実施例 2 0. プロウ αキナーゼ様ポリ ぺプチ ドの発現 (4) 実施例 1 2及び 1 3 によつて得たプラス ミ ド ptrpUK 2 (Q135D157)及び ptrpUK 2 (E135D157)を大腸菌 W3110に慣用に 従って形質転換し、 得られた形質転換菌を 5 m£ の L -プロ ス中で 3 7 てにて培養し、 550nmにおける吸光度が約 0. 5 に なったとき I A A (イ ン ドール酢酸） を最終濃度が 5 0 fi g /m になるように添加することによって発現を誘導し、 さ らに 3時間 3 7 。cにて培養することによってゥロキナーゼ遺 伝子を発現せしめた。

実施例 2 L 大腸菌からの遣伝子産物の抽出精製及びその 性質 (4)

上記の培養液のう ち、 ptrpUK 2 (&135D157)に由来するもの 5 m£ を実施例 1 9 に記載したものと同様の方法により抽出 ♦ 精製し、 変異体（Q135D157)プ αゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ド を得た。 その一部を以下のように ト リ プシンで処理した。 サ ンプルの酵素活性を合成基質法にて測定し、 100IU/_mJg とな るよう に 5 O m M ト リ ス塩酸緩衝液 （pH 7. 4 ) 、 0.15M食塩 及び 0. 1 %TritotiX - 100を舍む溶液に希釈した。 この溶液

5 0 β & に対して 1 ノ m 、 2 / mSi 及び S n^Z mjg の ト リ プシン水溶液 3 μ H を加え、 3 7 でで 6 0分間,ィ ンキュ ペー ト した。 次いで 5 nigノ m のダイ ズ ト リ プシンイ ンヒビ タ—水溶液を 5 μ ί 加えて反応を停止した。 対照として ト リ プシンの代りに、 水を加えたものを同様に処理した。

次いで、 これらをレムリ 一等の方法に従って、 0. 1 % S D Sを含有する 1 0 % — 2 6 %ポリ アク リ ルア ミ ド連続濃度勾 配ゲルにおいて、 電気泳動した後、 ゲルを 2. 5 % Tr i ton X — 100 に浸して室温で小一時間イ ンキュべ - ト し、 フイ ブリ ン 寒天プレー ト上に重層して、 3 7 'C、 2時間イ ンキュベー ト し、 フ ィ プリ ン寒天プレー ト上の溶解ゾ—ンの位置から分子 量を推定した。 なお、 比較のために、 実施例 1 4によって得 られた培養液を実施例 1 9 に記載したものと同様な方法によ り抽出 ' 精製して得た、 天然型プロウ口キナーゼ様ポリ ぺプ チ ド及び変異体（Q 135)プロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドに ついても同様な処理を行った。 これらの結果を第 1 6図に示 す。 この図において、 レー ン 1 , 2 , 3及び 4 は PMUP 1 に'由 来する天然型プロウ口キナーゼ様ポリペプチ ドを、 それぞれ 0 , 1 , 2及び 3

の ト リブシン水溶液を添加して処 理したものの泳動図である。 レー ン 5 , 6 , 7及び 8 は ρΜϋΡ lpm に由来する変異体 （Q135)プロゥロキナーゼ様ポリ ぺプ チ ドを同様に ト リ プシ ン処理したものの泳動図である。 レ一 ン 9 , 10 , 11及び 12は、 ptrpUK 2 (9135D157)に由来する変異 体（&135D157)プロゥロキナーゼ様ポリ べプチ ドを同様に ト リ プシ ン処理したものの泳動図である。 この図から明らかな通 り、 pMUP 1 に由来する天然型プロウ口キナーゼ様ポリ ぺプチ ドの分子量は約 5万であるが、 ト リ プシンにより、 分子量 3 万に低分子化した。 一方、 pMUPlpm 及び ptrpUK 2 (Q135 D157) に由来する変異体プロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドは ト リ プ シ ン処理によって 分子化しなかった。

参考例 1 1 プラ スミ ド pYTUl の作成

工業技術院微生物工業技術研究所に、 微ェ研菌寄第 7776号 (FERMPNo.7776) として寄託されているェシヱ リ シャ . コ リ HB ΙΟΙΖρΗΤ 3 より慣用の方法を用いて pHT 3 プラス ミ ドを得 た。

pHT 3 プラ ス ミ ド 5 g及び B amH115U を緩衝液 （ 1 0 m M Tris-HC^ pH 8. 0 7 m M MgC & ₂ 、 100m M NaC£ 、 2 m M ーメノレカプ トエタノ ール） 2 0 β ϋ 中で 3時間反応 させた。 ェタノ ール沈澱後、 沈澱物を緩衝液 （ 5 Q m M

Tris-HCjg pH 7. 2、 1 0 m M gC & _z 、 0. 1 m M D T T、 8 0 M dNTP) 2 0 中、 Kl enow断片 1 ユニ ッ ト と、 2 2 'cで 0.5時間反応させた。 フヱノ ー ル処理後、 エタノ ー ル沈 澱を行った。 沈殺物を、 緩衝液 （ 1 0 mM Tris-HCjg pH 7.5、 7 m M MgC a 2 6 0 m M NaC 、 7 mM ーメ ルカプ ト ェ タノ ー ル） 2 0 < " 中、 P vu 11 2 0 ュニ ッ ト と 3 7 で 3時 間反応させた。 ェタノ一ル沈毅後、 沈殺物を緩衝液 （ 6 6 m M Tris-HCig H 7. 6 . 6. 6 m M MgC £ ₂ , 1 0 m M D D T 、 1 m M A T P ) 2 O 中、 リ ガーゼ 2. 8 ユニ ッ ト と 1 5 'cで 2 0時間反応させた。 こ の反応物を用いて、 ェ シヱ リ シ ャ . コ リ HB 101株を形質転換させた。 ァ ン ピシ リ ン耐性 形質転換株の中から、 第 1 8図に示すような pHT 3 1 プラス ミ ドをもつ菌を単離した。 更に、 慣用の方法を用いて、 PH T 3 1 プラス ミ ドを得た。 ·

pHT 3 1 プラス ミ ド 1 0 gを緩衝液 （ 1 0 m M Tris-HC^ pH 7. 5 、 7 m M MgC ₂ 、 6 0 m NaC^ 、 7 m M β — メ ルカ フ。 ト エタ ノ ーノレ） 2 0 ' 中、 A at H 2 0 ユニ ッ ト と 3 7 てで 3時間反応させた。 ェタノ一ル沈穀後、 沈殺物を緩 衝液 （ 6 7 m M Tris-HC£ pH 8. 8 、 6. 7 m M MgC ₂ 、 1 0 m 一メ ルカプ ト エタノ ーノレ、 6. 7 m MBDTA. 16.6m M (NH₄) ₂S0" 330 M dCTP) 2 0 Ά 中、 T 4 D Aボリ メ ラーゼ 2. 8 ュニ ッ 卜 と 3 7 で 1 5分間反応させた。 フエノ ール処理及びエタノ一ル沈鎩を行った後、 沈澱物を緩衝液 ( 1 0 m M Tris- HC£ pH 7. 5 、 7 m M ilgC i ₂ 、 150m M、 NaC 、 0. 2 m M EDTA、 7 mM ーメ ノレカプ トエタノ ー ル） 2 0 μ & 中、 S ai l 2 0 ュニ ッ ト と 3 7 でで 3時間反応させ た。 この D N A反応液を 1. 2 %ァガロースゲル電気泳動にか け、 ア ン ビシ リ ン耐性遺伝子及び複製開始領域を含む約 3000 塩基対の D N A断片を慣用手段により回収した。 この D N A 断片を D N A断片 〔A〕 とする。 一方、 pHT 3 1 プラス ミ ド 1 0 β g を緩衝液（100 m M Tris- HC _PH 7. 5 、 7 m M MgC & ₂ M ーメ ルカプトエタノ ール） 2 O 中、 EcoR I 3 0ュ ニッ ト と 3 7 。cで 3時間反応させた。 ヱタノ 一ル沈殺後、 沈 澱物を緩衝液 （ 6 7 m M Tris-HCjg pH 8. 8 、 6. 7 m M MgC & ₂ 、 1 0 m M ーメ ルカプ トエタノ ール、 6. 7 m M BDTA 、

16.6m M (NH₄.) ₂S0₄ 、 330 M d C T P ) 2 0 中、 T 4： D N Aポリ メ ラーゼ 2. 8ュニッ 卜と 3 7 'cで 1 5分間反応さ せた。 フヱノ ール処理及びエタノ ール沈澱を行った後、 沈澱 物を緩衝液 （ 1 0 m M Tris-HC^ _PH 7. 5 7 m M MgC & ₂ 、

150m M NaC 、 0. 2 m M BDTAs- 7 m / —メ ルカプ ト エタノ ール） 2 0 <" 中、 S al I 2 0 ュニ ッ ト と 3 7 。c で 3 時間反応させた。 こ の D N A反応液を、 1. 2 %ァガロ ー スゲ ル電気泳動にかけ、 c I ts及び P L プロモーター · オペ レータ 一を含む約 2100塩基対の D A断片を回収した。 こ の D N A 断片を D N A断片 〔 B〕 とする。 D A断片 〔 A〕 0. 5 g 及び D A断片 〔 B〕 0. δ A' gを緩衝液 （ 6 6 m M Tris-HC£ pH 7. 6 、 6. 6 m M MgC ₂ 1 0 m M D T T、 1 m M A T P ) 2 0 £ 中、 T 4 D N Aリガーゼ 2. 5ユニッ トと 1 5 。c で 1 5時間反応させた。 この反応液を用いて、 ェシヱ リ シャ . コ リ H B 101 株を形質転換し、 ア ンピシリ ン耐性菌の中から 第 1 1図に示した pYTUl プラスミ ドをもつコ ロニーをスク リ - 1

5 ニ ングし、 慣用手段によりプラ ス ミ ドを単離した 文 献

( 1 ) M . サママ， M . カステル， 0. マツォ， M . ホ イ ラ ェルツ及び H.B. リ ジネ ン（1982) ト ロ ンボ ン シス . へモ スタ シス (Throrab. Haemostas) 41, 36-40o

( 2 ) E . ラ イ ヒ等、 ジ ャ ーナル ' ォブ ' ビォ ロ ジカル . ケ ミ ス ト リ ー （J.Biol.Chem.)^J, 7262— 7268 (1982)。 ( 3 ) S.S.フセ イ ン、 V . グ レゥへ イ チ、 B .

10 リ ビンスキ一ス ロ ンボシス · へモスタ シス

(Thromb. Haentostasis) 46, 11 (1981)· ₀

( ) V . グレウ イ ツ チ、 R . ノ、。ネル、 S . リ ュ イ 、 ジ ャ ーナル · ォブ · ク リ ニ力ノレ ' ィ ン べ ス ラ イ ゲ一 シ ョ ン（ J Clin. Invest. ) 73, 1731 — 1739 (1984) 。

( 5 ) C . ノ ラ ン、 し.5.ホ _ル、 （}.11.ノ ー ロ ー 1.1^. ト リ ビー、 ノ -ィ ォ ヒ ミ カ ' ェ ♦ 'ィ オフ イ ジ力 · ァ ク タ

(Biochimica et Biophysica Acta ) 496 , 384- 400 ( 1977)

( 6 ) G.H.パルロ ウ， ョ 一 口 ビア ン · ゥ ロキナ ーゼ ' シ ン ボジゥ ム （Eur. Urokinase Symp.) (1981) ρ 1 〜 5 。

20 ( 7 ) Τ . スャマ等.， Med. Postgraduate, 15, 547 (1977)

( 8 ) G.J.ステフ ェ ンス等， ホ ッ ペ一セ ィ ラ 一ス · ジ · フ イ ジォ ロ ジカル ' ケ ミ ス ト リ ー （Hoppe-Seyler' s Z. Physiol. Chem.) , 363, 1043(1982) ₀

( 9 ) W. Α.ギヤ ン ツラー等， 上記， 1055 (1982) 。

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(16) A . マキサム等， メ ソズ · イ ン ' ェ ンチモロギー (Methods in Enzymology) , 65, 99 (1980) ₀

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(20) 特開， 昭 59-51300。

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(22) J . ブロ ウ シウス-等， プラス ミ ド（Plasmid) J_, 112 (1981)。

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(27) 特願昭 59— 274478明細書。

(28) S. Mizusawa, et. al Proc. Natl . Acad. Sci .U. S. A. ^0, 358(1983) 。

(29) ポール · ポ一ゥ ヱ ン ' · ハ ング特開昭 56— 158799明細 (30) U.K. レム リ —， ネ イ チ ヤ ー （Nature) 227,680 (1970)

Claims

1. 次の一般式 ；

1 135 157

( Me t) Ser X - Y -

(式中、 M e tは場合に青よっては存在するメ チォニ ンであり、 S erは N 末端の 1 位に存在する セ リ ンであり、 Xは 135位 - に存在する リ ジ ン、 又は塩基性ア ミ ノ酸以外のア ミ ノ酸であ の

り、 Yは 157位に存在するフヱニルァ ラ ニ ン又は酸性ア ミ ノ 酸であり、 そして横線部分は天然ヒ ト ―プロウ 口キナーゼの ァ ミ ノ酸配列の対応する部分と同一のァ ミ ノ 突配列であるが 但し、 Xがリ ジ ンである場合には Yはフ ヱ ニルァ ラ ニ ンでは ない、）で表わされる 'ァ ミ ノ酸配列、 又はこれと実質上同一の ア ミ ノ酸配列を有する安定化されたヒ ト -プロ ウ 口キナーゼ 様ポリ ぺプチ ド。

2. 前記 Xがァ ラ ニ ン、 ァ スパラギ ン、 ァスパ ラギ ン羧、 ク" 'レタ ミ ン、 グ レタ ミ ン該、 フ エ ニノレア ラ ニ ン、 グ リ シ ン、 イ ソ α イ シ ン、 ロ イ シ ン、 メ チォニ ン、 セ リ ン、 ス レオニ ン パリ ン、 ト リ ブ ト フ ァ ン、 チロ シ ン及びプロ リ ンから成る群 から選択される天然ァ ミ ノ酸である請求の範囲第 1 項記載の ポ リ ぺプチ ド。

3. 前記 Xがァスパラギ ン及びグルタ ミ ンから成る群から 選択される酸性ァ ミ ノ酸のア ミ ドである請求の範囲第 1 項に 記載のポリ ぺプチ ド。

4. 前記 Xがセ リ ン及びス レオニ ンから成る群から選択さ れる ヒ ドロキ シァ ミ ノ である請求の範囲第 1 項記載のボリ ぺプチ ド。

5. 前記 Xがグルタ ミ ン酸及びァスパラギン酸から成る群 から選択される酸性ァ ミ ノ酸である請求の範囲第 1 項記載の ボリ ぺプチ ド。

6. 前記 Xがイ ソ ロ イ シ ン、 ロ イ シ ン及びバリ ンから成る 群から選択される分技鎮中性ァ ミ ノ酸である請求の範囲第 1 項記載のポリ ぺプチ ド。

7. 前記 Yがァスパラギン駿又はグルタ ミ ン酸である請求 の範囲第 1 項記載のポリ ぺプチ ド。

8. 前記 Xがグルタ ミ ンであり 、 そして前記 Yがフヱニル ァ ラニ ンである請求の範囲第 1 項記載のポリ ぺプチ ド。

9. ' 前.記 Xがス レオニ ンであり 、 そして前記 Yがフエニル ァ ラ ニ ンである請求の範囲第 1 項記載のポリ ぺプチ ド。

10 . 前記 Xがグルタ ミ ン酸であり 、 そして前記 Yがフ エ二 ルァ ラ ニ ンである請求の範囲第 1 項記載のボ リ ぺプチ ド。

1 1 . 前記 Xがイ ソ コ イ シ ンであり 、 そして前記 Yがフ エ二 ルァ ラニンである請求の範囲第 1 項記載のポ リ ぺプチ ド。

12 . 前記 Xがリ ジ ンであ り 、 そ して前記 Yがァスパラギ ン 羧である請求の範囲第 1 項記載のポリ ぺプチ ド。

13 . Xがグルタ ミ ン酸であり、 そして Yがァスパラギ ン酸 である請求の範囲第 1 項に記載のポリ ぺプチ ド。

14 . Xがグルタ ミ ンであり 、 そして Yがァスパラギン羧で ある請求の範囲第 1 項に記載のポリ ぺプチ ド。

15 . 前記天然ヒ ト —プロゥ ロキナーゼのア ミ ノ 酸配列がヒ ト 一腎臓由来の m R N Aに対応する c D N Aにより コ ー ドさ れているァ ミノ酸配列である請求の範囲第 1項記載のポリ ぺ プチ ド。

16. 請求の範囲第 1項に記載のヒ ト -プロウ口キナーゼ様 ポリペプチ ドをコー ドする D N Aセグメ ン ト。

17. 一末端の複数個のァ ミノ酸をコー ドするコ ドンが大 腸菌中で高頻度で使用されるコ ドンであり、 そして前記 N— 未端の複数個のァ ミノ酸並びに前記 X及び Yをコー ドするコ ドン以外のコ ドンがヒ ト ー腎臓由来の m R N Aに対応する c D M A中の対応するア ミノ酸のコ ドンと同一である請求の 範囲第 1 6項記載の D N Aセグメ ン ト。

18. 前記 N—末端 Q複数個のア ミノ該をコ ー ドするコ ドン ' 'が次のコ ドン ：

Ί SER ASN' GLU LEU HIS GLN VAL PRO SER 5 ' ATG AGC AC GAG CTC CAC CAG GTT CCG TCG 3 '

3 ' TAG TCG TTG CTC GAG GTG GTC CAA GGC AGC 5 ' から成る請求の範囲第 1 6項記載の D X Aセグメ ン ト。

19. 前記大腸菌において高頻度で使用されるコ ドンが、 端のコ一 ド領域において、 逆向き繰り返し配列を構成しない ように選択されている請求の範囲第 1 7項記載の D N Aセグ メ ン ト。

20. Xがグルタ ミ ンである場合、 これがコ ドン C A Aでコ — ドされており ； Xがス レオニンである場合、 これがコ ドン A C Aにより コー ドされており ； Xがグルタ ミ ン酸である場 合、 これがコ ドン G A Aにより コー ドされており、 Xがイ ソ ロイ シンである場合、 これがコ ドン A T Aにより コ ー ドされ ており ； Yがァスパラギン酸である場合、 これがコ ドン G A Tでコ ー ドされており ； そして Yがグルタ ミ ン酸である場合、 これがコ ドン G A Aにより コ ー ドされている請求の範囲第 1 6項に記載の D N Aセグメ ン ト。

21. 請求の範囲第 1 6項に記載の D N Aセグメ ン ト、 前記 プロ ゥ ロキナーゼ様ポリ ペプチ ドの発現のための制御領域、 及び大腸菌中で複製するのに必要な D A配列を含有するブラ ス ミ ド。

22. 前記発現のための制御領域と して、 cプロモータノ オペレータ ー、 trp プ πモーター /オペレーター、 又は P _L プロモータノオペレーター、 並びにシユー ドモナス · プチダ

(P-seudomonas putida)由来のメ タ ピロカテカ ーゼ遺伝子（C230) の S D配列を含有し、 大腸菌中でプロゥ ロキナーゼ様ポ リ べ プチ ドを癸現する こ とができる請求の範囲第 2 1 項記載のプ ラス ミ ド。

23. 前記プロ ゥ ロキナーゼ様ポ リ ぺプチ ドの N -末'端の複 数個のァ ミ ノ 酸が大腸菌において高頻度で使用されるコ ド ン によ り コ ー ドされており、 このコ ド ンが、 m R N Aレベルに おいて、 メ タ ピロ力チカ —ゼ遺伝子（C230)の S D配列付近の 塩基配列とプロ ウ 口キナーゼ遺伝子の 5 ' 端の塩基配列とが 相捕的構造を有しないよう に選択されている請求の範囲第 2 2 項記載のプラス ミ ド。

24. 請求の範囲第 2 1項に記載のプラス ミ ドが導入された 大腸菌。

25 . 請求の範囲第 2 4項記載の大腸菌を培養し、 培養菌体 からプロゥロキナーゼ様ポリ ペプチ ドを採取することを特徴 とするプロゥロキナ一ゼ様ポリ ぺプチ ドの製造方法。