WO1984002912A1 - Protein with oncostatic effect, process for its preparation, and oncostatic drug containing it - Google Patents

Description

明 細 書

発明の名称 制ガ ン作用を有する蛋白質、 その製造法及び これを含む抗腫瘍剤

技 術 分 野

本発明は制ガ ン作用 を有する新規な蛋白質、 その製造法 及びこ れを含む抗腫瘍剤 に関する 。

背 景 技 術

カ ース ゥエル （ C arswe I I ) ら は 、 バチルス カ ルメ ッ ティ グエ リ ン （ B aci l lus C a I mette G u e r i n 、 B C G ) で感作 し たマ ウスに 、 1 4 曰 目 に エン ド 卜 キシンを投与す る と 、 2 時間後にその血清中 に 、 L一細胞に対 して細胞毒 性を有する因子が産生されるこ と を見い出 し 、 こ れをツ ー モ ア ネ ク ロ シス フ ァ ク タ ー （ T umor necrosis

factor, T N F ) と名付けた C P roc. N at. A cad .

S ci., U S A , 7 2巻， 3 '6 6 6頁， 1 9 7 5年 〕 。 グ リ ー ン （ G reen) ら は、 上記物質を硫酸ア ンモニゥ 厶 に よ る分画沈澱、 ゲル泸過など に よ り 部分精製 し 、 上記 T N F の分子量が約 1 5 0 0 0 0である と報告 し た （ P roc, N at. A cad. S ci . , U S A , 7 3 巻， 3 8 1 頁， 1 9 7 6年 〕 。 その後マティ ゥ 一ス （ M atthews ) ら は、 ゥサギ に B C G を投与 し 、 2週間後にエン ド ト キ シ ンを投与 し て 、 T N F を産生 し 、 精製 し て 、 ゲル泸過法に よ る分子量が 3 9 00 0で、 ボ リ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動法

( P 0 I yacry I - am i de gel e I ect rophores i s_P P A G E ) に よっ て 6 7 0 0 0である と報告 した 〔 B J , C ancer , 4 -2巻， 4 1 6頁， 1 9 8 0年 〕 。 更に原中ら は、 プ ロ ピ オンパ ク テ リ ゥム ァ クネス （ P rop i on i bacterium acnes ) とエン ド 卜 キシンを用 いて 、 マ ウス及びゥサギで T N Fを産生 し、 その分子量はゲル沪過法及び P A G Eに よ り 3 9 0 0 0であると報告 し た 〔 日本臨床、 4 0巻、 1 8 7 2頁、 1 9 8 2年〕 。

上記の如 く 、 T N Fはその生理活性から当初よ り 悪性腫 瘍治療剤 と して期待されてきた が、 これ ら は ヒ 卜 以外の動 物血清か ら製造され、 工業的規模での製造が困難であるこ と 、 精製が困難であるこ と 、 また ヒ 卜以外の動物に由来す る蛋白成分であるため、 抗原性の問題等があ り 、 ヒ 卜 の治 療上の安全性等に問題があった 。 しか し て 、 ヒ 卜培養株化 細胞'か ら 、 周様の生理活性物質を製造する試みがなさ れ、 例えばァ ミ ノ （ A M I N O ) ら は、 ヒ 卜培養株化 リ ンパ系 細胞 M— -7 0 0 2又は 8 - 7 0 0 1 に ァ カ イ ンゲンマメ レ ク チン （ P H A ) を作用させる こ と に よ り 、 マ ウス し — 細 胞に対 し て細胞毒性作用を有する可溶性因子 （ H L T— L C ） の誘導産生を報告した 〔 T he J ournal of I mmunology , V ol. 1 3 , N o . 4 , 1 3 3 4〜 1 3 4 5 ( 1 9 7 4 ) 該報告に よ れば 、 上記可溶性因子の分子量 はゲル泸過法 で 6 8 0 0 0〜 1 5 0 0 0 0の範囲 と さ れた が 、 未だそ の 本体を単離同定 する に は至っ て い な い 。

本発明者 ら も 上記 細胞に対 し て細胞毒性を有す る物 質の本体を究め る べ く 鋭意研究を重ね て き た 。 そ の結果 、 ヒ 卜 由 来の培養株化 リ ンパ系細胞か ら 、 上記生 理活性を有 し 、 し かも報告さ れた可溶性因子 と は分子量に お いて 相違 す る別個 の蛋白 質を単離精製す る こ と に成功 し 、 こ れ が制 ガ ン作用 を有 し 、 ヒ 卜 の治療上安全性の高い こ と を見出 し こ こ に 本発明 に 到達 し た 。

発 明 の 開 示

本発明 の新規な蛋 白質は 、 ヒ 卜 由来の培養株化 リ ンパ 系 細胞 に 、 抗腫瘍物質誘導剤を作用 さ せ る こ と に よっ て 誘導 産出 さ れ 、 以下の特性を有す る こ と に よ り 特徴付け ら れる 。

( 1 ) 分子量

A . バ イ オゲル A 1 . 5 m を用 い た ゲル泸過法 に よ る分

子量

バ イ オゲル （ B iogel ) A . 5 m ( バ イ オ ♦ ラ ド社製 、 ア メ リ カ ） を カ ラ ム （ 1 6 x 1 0 0 0 mm、 フ ア ルマ シ ア 社 製 、 ス エ ー デ ン ） に 充塡 し 、 0 . 0 4 M 卜 リ ス — 塩酸

0 . 1 % ドデ シル硫酸ナ ト リ ウ ム （ S D S ) / 4 M尿素ノ 0 . M N a C S ( p H 7 . 8 ) の緩衝液を用 い 、 本発 明物質試料 2 0 0 g ( 蛋 白 蠆 ） を添加 し 、 ゲル泸過を行

ΟΜΡΙ u. ない 、 試料の溶出位置よ り標準分子量キッ 卜. 〔 フ アルマシ ァ社製、 スエーデン、 マー カ ー ； 牛血清アルブミ ン （ 分子 量 6 7 00 0 ) 、 卵白 アルブミ ン （ 分子量 4 3 0 0 0 ) 、 キモ 卜 リ プシ ノ ーゲン A ( 分子量 2 5 0 00 ) 、 リ ポヌ ク レア一ゼ （ 分子量 1 3 7 0 0 ) 〕 から求めた標準曲線を用 いて分子量を算出 し た 。 尚上記蛋白量は、 ブラッ ドフ ォー ド （ B radford ) の方法 〔 A naLB iochem., 7 2 、

2 4 8頁、 1 9 7 6年〕 に準じ てク ーマジープ リ リ ア ン 卜 プル一 G— 2 5 0に よる色素結合法に よ り求めたもので あ り 、 以下周様である。

その結果、 本発明物質は、 相対移動度が約 1 . 3 7に位 置 し 、 卵白 アルブミ ンの前に溶出 し 、 その分子量は

約 5 5 0 ひ 0である と認め られる。

B . T S Kゲル G 3 0 0 0 S Wを用いたゲル 戸過法に よ る分子量

フ アルマシア F P L Cシステム （ フ アルマシア社製、 ス エーデン 〉 に T S Kゲル G 3 0 0 0 S W ( 東洋曹達社製） カ ラムを接続 し 、 0. 2 Μ N a C 2 / 0. 1 Μ リ ン酸ナ ト リ ウム （ Ρ Η 7 . 0 ) の緩衝液を用 いて 、 本発明物質試 料 1 0 0 ^ 9 ( 蛋白量 〉 を付加 し てゲル 戸過を行ない 、 髙 速液体ク ロ マ 卜用標準分子量キッ 卜 〔 オ リ エンタル酵母社 製、 マー カ ー ； グルタ ミ ン酸脱水素酵素 （ 分子量

2 9 0 0 0 0 ) 、 エ ノ ラ ーゼ （ 分子量 6 7 0 0 0 ) 、 アデ

ΟΜΡΙ

WIPO

、 ニル酸キ ナ ーゼ （ 分子量 3 2 0 0 0 ) 、 チ 卜 ク ロ ー ム C

( 分子量 1 2 3 0 0 ) 〕 を用 い 、 こ れ ら の溶出パ タ ー ン よ り 、 本発明物質試料の分子量を算出 し た 。 そ の結果、 発 明物質の溶出時間 は 、 約 4 0分であ り 、 アデニル酸キ ナ ー ゼ の前 に 溶出 し 、 そ の分子量 は約 5 6 0 0 0 と 算出さ れる 。 C . S D S Zポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲルを用 い た電気泳動

法 に よ る分子量

近藤 ら の方法 〔 生化学、 4 4巻 、 3 0 4頁 、 1 9 7 2年 〕 に 従い 、 リ ン酸ナ ト リ ウ ム Z S D S ( P H 7 . 2 ) で 、

S D S— ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル に 、 本発明物質試料

5 Q ( 蛋 白 量 ） を付与 し 、 4 0 m Aで 7 時間電気泳動 を 行な い 、 標準分子量キッ ト 〔 フ アルマ シ ア社製 、 ス エ ー デ ン 、 マ ー カ ー ； 上記 A . に周 じ 〕 を用 い て 、 電気泳動バ タ ー ンを 記録 し 、 こ れ よ り 分子量曲線を作成 し 、 試料の分子 量を算出 し た 。 そ の結果 、 本発明物質 は 、 相対移動度が約 0 . 4 1 に 位置 し 、 そ の分子量 は約 5 6 0 0 0 と算出 さ れ

( 2 ) 等電点

等電点測定装置 （ バ イ 才 · ラ ド社製 、 ア メ リ カ ） と ア ン ホ ラ イ ン （ A»mphol i ne ) ポ リ ア ク リ ル 7ミ ド プ レ ー 卜

( H 3 . 5〜 9 . 5 ) ( L K B社製、 ア メ リ カ ） を使用 し 、 標準等電点測定マ ー カ ー キ ッ 卜 （ フ アルマ シ ア社製 、 ス エ ー デ ン ） を使用 し 、 本発明物質の等電点を測定 し た 。

OMPI すなわち 、 沪紙片に本発明物質試料約 5 g (蛋白量 ） を 吸収させ、 ゲル上にのせ、 1 0 W定電力 に て 、 約 2時間泳 動させ、 電流が一定 となった時点で泳動を終了 した 。 ゲル は 1 mra間隔で切 り 取り 、 緩衝液に て溶出 し 、 L一細胞に対 する活性の測定に供 し た 。 等電点は等電点マー カ ーを基準 に算出 し た 。 その結果、 本発明物質の等電点は P H 4 . 9 ± 0. 3 と算出された 。

( 3 ) 溶解性、 色及び性状

本発明物質試料を 3 mg蛋白量 Z m β 濃度に 0. 0 2 Μ 卜 リ ス 一塩酸緩衝液 （ ρ Η 7. 8 ) に溶解 し た溶液は、 無 色透明である。

該溶液に アセ ト ン又はエ タ ノ ールを 7 0 VZ V %以上加 える と沈殿を生ずる。

ま た本発明物質の 3 mg蛋白量 Zm S 水溶液は、 弱酸性を 示す 。

( 4 ) 呈色反応 '

ビユウ レツ 卜 反応、 フ才 リ ン ロ ー リ ー反応法、 な らびに 塩酸加水分解後のニ ン ヒ ド リ 反応につ いてペプチ ド結合 な らびに ア ミ ノ 酸の呈色反応は、 いずれも陽性である。

ま た、 本発明の蛋白質は、 以下の生理 性を有する点に おいて特徴付け られる 。 ：

( a ) L一細胞に対する細胞毒性作用

前記カ ースゥエル （ C arswel I ) ら の方法及びク ロ スタ 一ガ ー ド （ K loster gaard ) の方法. ！： M ol., I mm. , 1 7 巻、 6 1 3頁、 1 9 8 0年 〕 に 準 じ て 、 本発明物質の L 一 細胞殺細胞効果を 評価 し た 。 す なわち 、 L 一細胞を 2 5 0 単位 Zm β の ペ ニ シ リ ン と 1 2 5 ju g / m 2 の ス 卜 レ ブ 卜 マ イ シ ン と を含むイ ー グルス ミ ニマル エ ッ セ ン シ ャル メ ディ ウ 厶 （ M E M ) 培地 に 2 x 1- 0⁵ 細胞 β と な る ¾度で懸濁 さ せ 、 こ の し — 細胞懸濁液各 0 . 1 m β 及び適 当濂度に 希 し た本発明物質試料各 0 . 1 m S を、 9- 6穴 マイ ク ロ プ レ ー 卜 （ コ ー ス タ ー 社製 、 ア メ リ カ ） の各 ゥ ェ ル に 入れ、 こ れを 5 %炭酸ガ ス 含有空気中 、 3 7で で 4 8 時間培養す る 。 培養細胞を ニ ュ ー 卜 ラル レ ッ ド

( neutral red ) で染色 し 、 生細胞数を タ イ タ ー テ ッ ク マ ルチスキ ャ ン （ フ ロ ー ラ ボ ラ 卜 リ ー ズ社製 、 ア メ リ カ ） に よ り 比色定量 す る 。 活性 は L 一細胞 を 5 0 %殺す力 を 1 単 位 と し 、 こ れ に 試料の希釈倍数を 乗ずる 。

そ の結果 、 本発明物質の L 一 細胞 に 対す る細胞毒性 は 、 約 3 . 5 X Ί 0⁸ 単位 / mg蛋白 質以上であっ た 。

( ) メ ス A — ザル コ ー マ （ M eth A - sarcoma ) 担ガ ン マ ウ ス に よ る抗腫瘍作用

2 X 1 0 ⁵ 個 メ ス A — ザル コ ーマ細胞を 、 B A L B Z c マ ウ ス腹部皮内 に 移植 し 、 7 日 後腫瘍の大きさ が直径 7 〜 8 mmと なっ たマ ウ ス の尾静脈よ り 、 上記 L — 細胞に対 す る 細胞毒性作用 測定 法 （ a 〉 で 5 X 1 0³ 〜 5 X 1 Q 4 単位

O PI / m β に希积 し t本発明物質試料の 0 . 2 m lを注射し 、 4 8 時闥後、 前 15カ ースゥエル らの方法に準じて、 以下の 判定基準に よ り抗腫瘍作用を判定 した 。

( 一 ） ： 変化な し

( + ) ： かすかな出血性壊死

( 朴 ） ： 中程度の出血性壊死 （ 移植癌表面の真ん中から

5 0 96以上にわたって壊死 ）

( w ) ： 顕著な出血性壊死 （ 移植癌の中央部が重度に壊 死 し 、 周囲の癌組織がわずかに残 っ た状態 ） 得ら れた結果を下記第 1 表に示す。

表

投 与 価

( g 蛋白量 Zマウス ） -H- 卅

( 生理食塩水） 6 0 0 0

0 . 2 8 6 1 3 2 0

0 . 5 7 2 0 3 2 1

1 . 4 3 0 1 4

2 . 8 6 0 1 2 3 次に本発明の新規蛋白質を得る方法について記述する 。 本発明の物質は、 ヒ 卜 由来の培養株化 リ ンパ系細胞に 、 抗腫瘍物質誘導剤を作用させる こ と に よって誘導される 。 ここで培養株化 リ ンパ系細胞と し ては、 特に限定がな く 、 既に確立されている公知の各種 リ ンパ系細胞株、 或い は正 常の リ ンパ系細胞を各種の ウ ィ ルス 、 薬剤 、 放射線等で処 理 し 培養株化 し た細胞株等を使用でき る 。 そ の具体例 と し て は 、 例え ば I mmunol. C ommun. , 9 ( 8 ) , ρ 7 3 1 〜 7 3 4 ( 1 9 8 0 ) 、 蛋 白 質核酸酵素 、 2 3 巻 、 6号 、 2 9 1 〜 3 0 5頁 、 及び生化学デ ー タ ー プッ ク 互 、

Ρ 8 2 9〜 9 0 5 、 株式会社東京化学周人 、 1 9 8 0年 6 月 2 3 日 発行に記載の Τ一 細胞系 、 Β — 細胞系 、 ミ エ ロ イ ド細胞系 、 non — T細胞系及び non — B細胞系等の各細胞 株を例示する こ と ができる 。 之等の う ち で特に 好適な ヒ 卜 由来の培養株化 リ ンパ系細胞 は C C R F — C E M、 D N D - 4 1 、 丁 A L L — 1 、 R P M I - 8 4 0 2及び C C R F - H S B — 2細胞 〔 いず れも I mmunol、 C ommun . , 9 ( 8 ) 、 Ρ 7 3 1 〜 7 3 4 ( 1 9 8 0 ) に 記載の も の 〕 で あ 。

ま た 上記培養株化 リ ンパ系細胞 に作用 さ せ る抗腫瘍物質 誘導剤 と し て は 、 公知 の各種 ウ ィ ルス 、 グ ラ ム 陰性菌由 来 の エ ン ド 卜 キ シ ン 、 植物由来の レ ク チ ン 、 免疫賦活作用 を 有す る物質等を使用 す る こ と がで き る 。 そ の代表例 と し て は 、 例 えば大寢菌 、 緑膽菌 、 チフ ス菌等 に 由 来す る リ ポ ポ リ サッ カ ラ イ ド （ L P S ) 等の グ ラ ム 陰性蘭由 来の エ ン ド 卜 キ シ ン ； タ チナ タ マ メ レ ク チ ン （ コ ン カ ナパ リ ン A、 C onA ) 、 ダイ ズマメ レ ク チン （ S B A ) 、 ァ カ イ ン ゲ ン マメ レ ク チ ン （ P H A ) 等の植物 由来の レ ク チン ； セ ン ダ ィ ウィルス （ H V J 》 等のウィ ルス及びバチルス カ ル メ ッティ グエ リ ン （ B C G ) 、 コ リ ネパク テ リ ゥム パ ルバム （ C oryne bacterium parvum ) 、 プロ ピ才ンパクテ リ ウム ァクネス （ P ropionibacterium acnes ) 、 ミ コ ゾ クテ リ ウム プチ リ カ ム （ M ycobacterium buty p i cum ) コ リ ネゾ クテ リ ゥ ム グラニュ ロ サム （ G orynebacterium granu I osum ) 、 ス 卜 レプ 卜 コ ッカ ス ピ ロ ジネス

( S treptococc s py rogenes ) 、 プラスモディ ウ 厶

( P lasmodium ) 、 ザィ モザン （ Z y osan) 、 ノ カルディ ァ ァス 卜 ロ イデス （ N ocardia asteroides) 、 リ ステ リ ァ モノサイ 卜 ジ工ネス ( L yster！ a monocytogenes ) 、 グルカ ン （ glucan) 、 細胞膜骨格 （ cel lwal l skel ton ) 、 デキス ト ラ ン硫酸 （ dextran sulfate ) 、 ムラミルジぺ プタ イ ド （ muramy I d i pept ide) 、 ク レスチン （ 呉羽工業社 製〉 等の免疫賦活作用を有する物質を例示するこ とができ、 これら は組合せて用 いるこ ともできる 。

上記培養株化 リ ンパ系細胞は、 抗腫瘍物質誘導剤の処理 に先立ち 、 必要に応じ て適宜培養、 増殖させるこ と ができ る 。 該培養条件と して は、 特に制限はな く 常法に従う こ と ができる。 例えば R P M I — 1 6 4 0培地、 M E M培地等 の通常の栄養培地を牛胎児血清 （ F C S ) 等の血清補液で 改質し た培地中、 イ ン ビ 卜 口で増殖させる方法、 又は ヒ 卜 以外の哺乳動物に上記細胞を移植 し、 その体内で増殖させ

OMPI る方法等を適宜採用 できる 。 後者の方法で ば、 移植する動 物 は 、 ヒ 卜 細胞に 対 し 免疫反応を起こ す場合が あ り 、 好 ま し く は幼弱期の動物 、 2 0 0〜 6 0 0 レ ム程度の放射線処

理、 抗血清処理、 免疫抑制剤処理等 に よ り 免疫を抑制 し た 動物 、 ヌ ー ドマ ウ ス等を使用 す るのが よ い 。 上記の如 く し て 増殖 さ れた ヒ 卜 由来の培養株化細胞は 、 こ れを前記栄養

培地 （ 通常 Ρ H 6. 5〜 8 . 0 ) に て 、 細胞濃度が 1 X

1 0 ^Α 〜 Ί Χ Ί 0⁷ 個 ιπβ程度に 浮遊さ せ 、 こ れに 前記抗

腫瘍物質誘導剤を作用 さ せ る こ と に よ り 、 所望の本発明物

質を誘導産生 さ せ る こ と がで き る 。 抗腫瘍物質誘導剤 に よ

る処理 は 、 例えばエ ン ド 卜 キ シ ン及び免疫賦活作用 を有す

る物質の場合は 、 1 〜 1 0 0 g Z me程度の溏度で 、 レ ク

チ ン の場合 は 、 1 0〜 5 0 0 g /m2程度の濃度で 、 ウ イ

ルス の場合 は 、 5 0〜 5 0 0 0 H A Zmaの程度の濃度で加

え 、 通常 3 7 C下、 1 〜 6 日 間 イ ン キ ュ ベ ー 卜 す れば よ い

か く し て 、 その栄養培地中 に 本発明物質が産生 さ れる （ 以

下斯 く し て 得 ら れる液を粗製溶液 と言 う ） 。

上記で得た粗製溶液か ら の本発明物質の採取及び分離精

製 は 、 得 ら れる粗製溶液中 に 含有さ れる 当該物質の性質を

利用 し た物理化学的又 は生化学的手段 に 従い実施さ れる 。

例 え ば塩析 、 ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー 、 電気泳動法、 抽 出法 、

遠心分離法 、 透析法等を適宜組合せ る こ と に よ り 行なわ れ

る 。 よ り 好 ま し く は 、 上記粗製溶液を次の 工程に 付す こ と

OMPI WIPO 、 に よ り実施される

( 1 ) 硫酸アン ニゥ ム塩析

( 2 ) ゲル沪過

( 3 ) ハイ ド 口 キシァパタ イ 卜 ク ロマ ト グラフィ ー

( 4 ) フ アルマシ ァ F P し Cモ ノ Qカ ラムク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー

( 5 ) 硫酸アンモニゥム塩析溶解ク ロマ ト グラ フ ィ ー

( 6 ) ゲル沪過

以下に、 これら工程の詳細を説明する。

精製ェ程 1

粗製溶液に硫酸アンモニゥ厶 （ 以下 「硫安」 と記す 〉 を 添加 し 、 5 0〜 8 0 %飽和溶液を調製する。 この溶液を 2 時圜〜一夜低温室 ( 4 Ό ) に放置 し 、 生理活性蛋白質を充 分沈殿させる 。 次いで冷却遠心分離機 （ 日 立製作所製 ） を 使用 し 、 1 0 0 0 0回転 Z分で 1 0〜 3 ひ分間遠心分離を 行ない生理活性を有する沈殿を集める。 この段階での活性 回収率 ( 前記 し —細胞に対する細胞毒性活性測定法による ） は 8 0〜 1 0 0 %であ り 、 精製度は 1 0〜 2 0倍である 。 精製ェ程 2

工程 1 で得ら れた沈殿を 0 . 0 2 M 卜 リ ス一塩酸

( P H 7 . 8 ) , 0 . 1 M N a C S の緩衝液に懸濁させ る （ しの懸濁液に 2〜 8 Mの尿素を加え、 不溶性物質を

1 0 0 0 0回転 Z分で 1 0〜 3 0分間冷 ίΡ遠心分維を行な

OMPI WIPO い 、 清澄な生理活性を有する上清液を得 、 こ れをゲル沪過 に付す 。 ゲル沪過用 担体 と し て は ウル 卜 口 ゲル A c A 4 4

5 4 ( し K B 社製 、 ァ メ リ 力 ） 、 あるい はバ イ オゲル A

. 5 m ( バィ 才 ♦ ラ ド社製、 ァ メ り 力 ） 等が用 い ら れ る ゲル ί 過分画物 に つ ぎ 、 記 し一細胞 に対す る細胞毒性 活性測定 を行ない 、 活性画分を集め て 、 眼外泸過膜

Y 0 ( ア ミ コ ン社製 · ァ メ リ 力 ） を装着 し た 限外 戸過 装置 T C F - 1 0 ( ア ミ コ ン社製 • ァ メ リ 力 ） に よ り 限外 戸過濂縮を行な う 。 但 し 、 灑縮 は 5 0 〜 8 0 %飽和硫安沈 殿法 に よ つ て ち よ い 。 こ の方法 に よ る活性回収率 は 8 0 〜 0 0 % で あ り 、 精製度は 2 0 〜 5 0 倍で あ る 。

精製ェ程 3

ェ程 2 で得 ら れた 生理活性画分の濃縮液を透析用 チュ ー プ （ 半幷化学薬品社製 ） を用 い 、 5 0 〜 1 0 0 倍量の

0 . 0 2 リ ン酸緩衝液 （ Ρ Η 6 . 8 ) に対 し て 4 °C で 数回外液を交換 し な が ら 、 一夜透析 す る 。 透析液を冷却遠 心分離機 （ 4 ) で 1 0 0 0 0 回転 /分 、 2 0 〜 3 0 分間

心分離を行な い 、 清澄な上清を得る 。 次い で こ の上清液 をハ イ ド □ キ シ ァパ タ イ 卜 （ 曰 本ケ ミ カ ル社製 ） に 吸着さ せ 、 0 . 0 2 Μ 〜 0 . 5 リ ン酸緩衝液 ( Ρ Η 6 . 8 ) で連続的 度勾配法 に従い 、 も し く は段階的 に 漉度を上昇 さ せ て 生理活性区分を溶離 す る 。 得 ら れた 生理活性区分を 限外沪 縮、 又 は硫安塩祈 に よ り 濃縮す る の方法 に

OMPI よる生理活性区分の回収率は 4 0〜 8 0 %であ り 、 精製度 は約 4〜 1 0倍である 。

精製工程 4

精製工程 3で得られた生理活性区分の濃縮液を透析用 チ ユ ープに入れ、 5 0〜 Ί 0 0倍量の希薄な リ ン酸、 あるい は 卜 リ ス緩衝液 （ Ρ Η 7 . 0〜 8 . 0 ) に対 して 、 4 °Cで 一夜透析する。 この透析液を フ アルマシア F P L Cモノ Q カ ラム （ フ ァルマシ ア社製、 スエーデン ） に吸着させ、 緩 衝液濃度、 あるいは N a C S 濃度を連続的に上昇させて生 理活性物質の溶離を行なう 。 この工程での活性回叹率は

7 0〜 9 0？ であ り 、 精製度は約 3〜 1 0倍上昇する 。 精製工程 5

精製工程 4 における活性区分につき限外沪過鑲縮を行な い、 硫安塩析溶解力 ラムク ロマ ト グラ フ ィ ーに付する 。 卜 — ョ ーパール S W 5 0、 5 5 、 ま たは 6 0 ( いずれも東洋 曹達社製 ） をカ ラム に充填 し 、 フ アルマシア F P L Cシス テム （ フ アルマシア社製 * スエーデン ） を用い、 カ ラム中 で生理活性区分を 安塩析、 次いで連続的に硫安濃度を下 げて活性区分を溶解分別する 。 この段階での活性回収率は 3 0〜 7 0 %であ り 、 精製度は約 3〜 1 0倍である 。

精製工程 6

精製工程 5で得ら れた活性区分を濃縮 し 、 バイ オ ♦ ゲル A 1 . 5 in あるいはウル 卜 口ゲル A G A 4 4又は 5 4を充 塡 し た カ ラ ム （ 1 6 x 1 000 mm) に付 し 、 ゲル沪過を行 な う 。 あ る い は 卜一ョ ー ソ一ダ髙速液体 ク ロ マ 卜 用 カ ラ ム G 2000 S W又 は G 3000 S W ( 東洋曹達社製 ） を用 い てゲル？戸過を行な う 。 こ の 工程 に おけ る活性回収率 は 2 5〜 75 %であ り 、 精製度は約 3〜 1 5倍で あ る 。

精製工程 1〜 6を通 し て の活性回収率は 、 5〜 30 %で あ り 、 精製度 は約 1 . 0 Χ 0 ⁵ 〜 1 . 0 Χ 1 0 ⁶ 倍であ こ の様 に し て得 ら れた生理活性を有する本発明の蛋白質 の特性を測定 し た結果 は 、 前記 し た通 り で あ る 。

か く し て本発明 の蛋 白質を得る 。 得 ら れる本発明物質 は 前述 し た通 り 、 L一細胞 に対 し て イ ン ビ 卜 口 で直接細胞毒 作用 を有 し 、 ま た イ ン ビ ポで抗腫瘍作用 を有す る に 加 え 、 以下の薬理試験例 に示す通 り ヒ 卜 ガ ン細胞乃 至メ ラ ノ ー マ 細胞 に対 し て も細胞毒作用乃至殺細胞作用 を示 し 、 し かも 低毒性であ る 。

薬理試験例 I 細胞毒乃至殺細胞作用 ·

( a ) ヒ 卜 ガ ン細胞殺細胞作用

ヒ 卜 バ ー キ ッ ト リ ンパ腫由 来株 R aj i ( J . N at.

Cancer I nst .,3 7巻、 5 4 7頁 、 1 9 6 6年 〕 、 ヒ 卜 胃癌 （ 印環細胞癌 ） 由来株 K ato - I ( J n. J . E xp. M ed.，48巻、 6 1 頁、 1 9 78年 〕 及び ヒ 卜 鼻咽腔癌由 来株 K B ( C ancer R es., 1 8巻、 1 0 1 7頁、 1 9 5 8

OMPI IS 年 〕 の各細胞に対する本発明物質の殺細胞効果を評価した 。 すなわち 、 ヒ 卜パーキッ 卜 リ ンパ腫由来細胞株及び ヒ 卜 胃 癌由来細胞株を、 2 5 0単位 Zm 2 のペニシ リ ン、 1 2 5 L Q Zffl δ のス ト レプ ト マイ シン及び 1 0 %非働化牛胎児 血清を含む R P M I 1 6 4 0培地で 2 X 1 0⁵ 細胞 /m 2 に調整し た 。 ま た、 ヒ 卜 鼻咽腔癌由来細胞株を、 2 5 0単 位 g のペニシ リ ン、 1 2 5 ^ g Zin s のス ト レプ 卜マ イ シン及び 1 0 %非働化牛血清を含むイ ーグルス ミ ニマ ル ェッセンシャル メ ディ ウム培地を用いて 2 X 1 0⁵ 翱胞 Zm s に調整 した。

上記各細胞調整液 0. 1 m β と各種濃度に希轵 し た本発 明物質 0 . 1 ra 2 とを 9 6穴マイ ク ロプ レー 卜 の各ゥエル に入れ、 これを 5 %炭酸ガス含有空気中、 3 7でで 4 8時 間培養し た 。

培養 4 8時間後に細胞を 卜 リ パ ンプル一で染色 し 、 顕微 鏡下で ビルケルチュルケ計算盤 （ エルマオプティ カルヮ ー クス社製、 日本） を使用 して生耦胞数を算出 した 。 この結 果、 本発明物質の各種細胞の.増殖を 5 0 %抑制する濂度は、 ヒ 卜 パーキッ 卜 リ ンパ腫由来細胞に対 して は 4 O ng蛋白量 Zm S 以上、 ヒ 卜 胃癌由来細胞に対 し て は 1 4 0 ng蛋白 量 Zm 2 以上、 ヒ 卜奥咽腔癌由来細胞に対しては 5 6 蛋白 量 m S 以上であっ た 。

( ) メ ラノ ーマ細胞に対する細胞毒性作用 ヘルソ ン （ H el son ) ら の方法 （ N atu re , 2 5 8巻 ，

73 1 頁 ， 1 9 7 5年 〕 に 準 じ て 、 本発明物質のメ ラ ノ 一 マ Α— 3 7 5 〔 J . N at I . C ancer I nst ..5 1 巻 ，

1 4 1 7頁， 1 9 7 3年 〕 細胞 に対する細胞毒性作用 を評 価し た 。 即ち 、 グル タ ミ ン 、 非必須ア ミ ノ 酸 、 ペ ニ シ リ ン ス 卜 レブ .卜 マ イ シ ン及び 1 0 % 非働化牛胎児血清を含む ィ ー グルス培地を用 い て メ ラ ノ ーマ A— 3 7 5細胞 5 x

1 0⁴ 細胞 δ の懸濁液を調整 し た 。 こ の細胞懸濁液各 m δ 及び本発明物質を適当 に希轵調整 し た 試料溶液 1 1 2 を 3 . 5 cm径の シ ャ ー レ に 入れ 、 5 %炭酸ガ ス含有空 気中下 3 7 で で培養 し た 。

培養 3 日 目 に 上記 （ a ) と同様に し て細胞を 卜 リ パ ンブ ル ー で染 色 し 、 顕微鏡下で ビルケルチュ ル ク 計算盤を使用 し て生細胞数を算出 し た 。 こ の結果、 本発明物質の メ ノ ラ 一マ A— 3 7 5細胞の増殖を 5 0 %抑制 するの に 必要な-量 は 7 2 ng蛋 白量 / ^/ m (2 以上で あっ た 。

薬理試験例 H 急性毒性

8週令の Y系雌雄マ ウ ス を各々 Ί 0匹用 い 、 本発明物 質を 1 9 mg蛋 白 量ノ kgの割合で静脈内投与 し 、 急性毒性を 調 べ た 。

そ の結果死亡例は認め ら れず 、 L D s 0 は 1 9. 0 mg/ Kg以上で あ る こ と が確認さ れた 。 ま た 、 観察期間 中 、 本発 明物質に起因 す る と考え ら れる 明 ら かな 中毒症状は認め ら

OMPI れなかつた

以上の通り本発明物質は各種細胞に対し細胞毒作用乃至 殺細胞作用を奏 し、 ま た低毒性である と ころから抗腫瘼剤 と し て有用 C ¾> <s ο

本発明物質はこれを抗腫癟剤 と して利用 するに当つて は その有効量を含有する各種形態に調整され、 該形態に応じ た各種投与 り 処置を必要とする ヒ 卜及び動物に投 与される。 その製剤形態と して は例えば錠剤、 丸剤、 散剤 液剤、 憩 剤、 乳剤 、 顆粒剤、 カプセル剤等の経口剤及び 坐剤、 注射剤 （ 液剤、 懸濁剤等 ) 等の宑経口剤が挙げられ る。 上記錠剤、 丸剤、 液剤、 懸濁剤、 乳剤 、 顆粒剤及び力 プセル剤 は経口投与され、 注射剤 は単独であるいはプ ド ウ 糖、 ァミ ノ酸等の通常の補液と混合 して '静脈内投与される か、 又は単独で筋肉内、 皮内、 皮下も し く は腹腔内投与さ れ、 坐剤は直腸内投与される。

上記各種形態の医薬製剤は通常使用 される担体、 例えば 充塡剤、 増量剤、 結合剤、 保湿剤、 崩壊剤、 崩壊-抑制剤、 表面活性剤 ( 吸収促進剤、 吸着剤等 ） 、.滑沢剤等の希釈剤 あるいは賦形剤を用いて調製され、 必要に応じて着色剤、 保存剤、 防腐剤 、 香料、 風味剤、 甘味剤等や他の医薬品を 添加 れる。 錠剤の形態に成形するに際 して は、 担体 と して この分野で公知のちのを広 く 使用でき、 例えば乳糖 白糖、 塩化ナ 卜 リ ウム 、 プ ドウ糖、 尿素、 デンプン、 炭酸

OMPI カ ルシ ウム 、 カ オ リ ン 、 結晶 セル α — ス 、 ケィ 酸等の賦形 剤 、 水、 エ タ ノ ー ル、 プ ロ ゾ ノ ー ル、 単 シ ロ ッ プ、 ブ ド ウ 糖液 、 デ ンプン液 、 ゼ ラ チン溶液、 カ ルポキ シ メ チルセル ロ ー ス 、 セ ラ ッ ク 、 メ チルセル ロ ー ス 、 リ ン酸カ リ ウ ム 、

5 ポ リ ビ ニル ピ ロ リ ド ン等の結合剤 、 乾燥デ ンプン 、 アルギ ン酸ナ ト リ ウ ム 、 カ ン テ ン末 、 ラ ミ ナ ラ ン末、 炭酸水素ナ ト リ ウ ム 、 炭酸 カ ルシ ウ ム 、 ポ リ 才 キ シ エ チ レ ン ソル ビ タ ン脂肪酸エ ス テル類 、 ラ ウ リ ル硫酸ナ 卜 リ ゥ 厶、 ス テ ア リ ン酸モ ノ グ リ セ リ ド 、 デ ンプ ン 、 乳糖等の崩壊剤 、 白糖 、 l O ス テ ア リ ン 、 カ カ オバ タ ー 、 水素添加油等の崩壊抑制剤 、 第 4 級 ア ン モニ ゥ ム塩基、 ラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ウ ム等の吸 収促進剤 、 グ リ セ リ ン 、 デンプン等の保湿剤 、 デンプ ン 、 乳糖、 カ オ リ ン 、 ベ ン 卜 ナ イ 卜 、 コ ロ イ ド状ケィ 酸等の吸 着剤 、 精製 タ ル ク 、 ス テ ア リ ン 酸塩 、 ホ ウ酸末 、 ポ リ ェ チ 5 レ ン グ リ コ ール等の滑沢剤等を例示で き る 。 さ ら に 錠剤 は 必要に応 じ 通常の剤皮を施 し た錠剤 、 例 えば糖衣錠、 ゼ ラ チ ン被包錠、 腸溶被錠、 フ ィ ルム コ ー テ ィ ン グ錠あ る い は 二重錠、 多層錠 と す る こ と がで き る 。 丸剤 の形態 に 成形す る に 際 し て は 、 担体 と し て公知のも の を広 ぐ使用 でき 、 例0 え ばプ ド ウ糖、 乳糖 、 デ ン プ ン 、 カ カ オ脂、 硬化植物油 、 カ オ リ ン 、 タ ル ク 等の賦形剤、 ア ラ ビ ア ゴム末、 卜 ラ ガ ン 卜 末、 ゼ ラ チ ン 、 エ タ ノ ール等の結合剤 、 ラ ミ ナ ラ ン 、 力 ンテ ン等の崩壊剤等を例示で き る 。 坐剤 の形態に 成形す る

Ο ΡΙ

/ WIPO 2 θ に際 して は、 担体 と して公知のものを広く 使用でき、 例え ばポ リ エチ レング リ コ ール、 カ カ オ脂、 高級アルコ ール、 高級アルコ ールのエステル類、 ゼラチン、 半合成グリ セラ イ ド等を挙げる こ とができる。 注射剤 と し て調製される場 合に は、 液剤、 乳剤及び懸濁剤は殺菌され、 かっ血液と等 張であるのが好ま し く 、 これら液剤、 乳剤及び懸濁剤の形 態に成形するに際 し て は、 希釈剤 と してこの分野において 憤用さ れているものを すベて使用でき、 例えば水、 ェチル アルコ ール、 プロ ピ レング リ コ ール、 ェ 卜キシ化イ ソステ ァ リ ルアルコ ール、 ポ リ オキシ化イ ソ ステア リ レアルコ ー ル、 ポ リ オキシエチ レ ンソルビ タ ン脂肪酸エステル類等を 挙げるこ とができる 。 なお、 この場合等張性の溶液を調製 する に充分な量の食塩、 ブ ドウ糖あるいはグ リ セ リ ンを医 薬製剤中 に含有せ しめてもよ く 、 ま た通常の溶解補助剤、 緩衝剤、 安定剤、 無痛化剤等を添加 してもよい 。 更に上記 注射剤錠剤 はま た使用前に適当な担体の添加に よって液状 に な し得る乾燥品 と して 、 例えば公知の凍結乾燥手段を利 用 し た凍結乾燥粉末 と し て調製する こ ともできる 。.

上記医薬製剤 （ 抗腫瘍剤 ） の投与量は、 その製剤形態、 投与経路、 疾患の程度、 患者の年齢、 性別等に よって異な るが、 通常、 本発明物質を蛋白量と して約 9 . 5 〜 9 5

g / kg z日投与できる量とするのがよ く 、 この製剤は一 日 に 1 〜数回に分けて投与するのが好ま しい。

wipo 以下 に参考例及び実施例を示 し 、 本発明を よ り 具体的に 述べる が 、 本発明 は こ れ ら に 限定 さ れる も ので はな い 。 参考例 1

以下の細胞及び抗腫瘍物質誘導剤を各々 使用 し た 。

( 1 ) 抗腫瘍物質誘導剤

セ ン ダイ ウ ィ ルス （ H V J ： S enda i v i rus,

H emagg I u t i nat i ng virus of J apan) は 、 カ ン テ ノレ

( K . C antel l ) よ り 供与さ れた も ので 、 1 0〜 1 2 曰.目 の受精鶏卵 に 接種 し 、 3 曰 後に漿尿液を採取 し た 。 漿尿液 を連続超遠心 （ 3 5 0 0 0 r m ) し て H V J を精製 し 、 そ の沈渣を P B S ( — ） で浮遊さ せ た 。 精製 H V J は 、 使用 時 ま で適当 に分注 し 、 — 8 0 に て 凍結保存 し た 。

他 に 抗腫瘍物質誘導剤 と し て P H A ( ディ フ コ 社 、 ァメ リ カ ） 、 C onA ( 和光純薬社 ） 、 L P S ( 大腸菌 0 5 5 ： B 5 、 ディ フ コ 社 ） 、 コ リ ネパ ク テ リ ゥ ム ♦ パルパ ム （ ゥ エル カ ム社、 イ ギ リ ス ） を使用 し た 。

( 2 ) 細胞

本発明物質の産生 に 利用 し た細胞 は 、 ヒ 卜 由来の培養株 化 リ ンパ系細胞 （ 〇 C R F — C E M、 D N D — 4 1 、

T A L L - 1 、 R P M I - 8 4 0 2 、 C C R F - H S B - 2細胞 、 い ず れも I mmunoし C omniun. , 9 ( 8 ) , p 7 3 〜 7 3 4 ( 1 9 8 0 ) 記載の も ので あ る ） を 、 1 0 % F C S加 R P M I - 6 4 0培地を用 い て 、 3 7。Gに て 5 %炭酸ガスイ ンキュベー タ 一内で静置培養 して調整した。

ま た上記各 ヒ 卜 リ ンパ系細胞の各々 1 X 1 0⁷ 個を、 自 家繁殖させた生後 2 4 時園以内の新生ハムスタ ー （ ゴール

デン ♦ ハムスタ ー ） に皮下移植 し 、 週に 2回の割で家兎抗

ハムスタ ー胸腺 リ ンパ球血清 （ A L S ) を 0. 投与 し て、 4〜 5週間後に生着腫瘍塊を剔出 し 、 これをイ ーグル

M E M培地で洗浄後、 細断器で細断 し 、 細胞沪過器を通 し て調製 し た ものも使用 し た。

実施例 1

上記参考例 1 一 （ 2 ) で調製 した各 ヒ 卜 由来培養株化 リ ンパ系細胞を、 ィ グル M E M培地にて遠心洗浄後、 1 0

% F C S加 R P M r— 1 640培地で 2 . 5 x 1 0⁶ 個 Z 鱸に調製 し た 。

上記細胞浮遊液に、 前記参考例 1 一 （ 1 ) に示 した各抗 腫瘍物質誘導剤の所定量 （ P H A は 5 0 ^ g Zma、 C onA は 1 0 ^ g ZmS、 H V J は 5 0 0 H A /infi、 し P S は 1 0

g / IS ) を添加 し、 3 7 °Cで 1 〜 6 日 間镜拌培養 し 、 得 ら れる培養上清を遠心分離 ( 1 0 0 0 0 rpm ) によ り採取 し 、 — 2 0で に て凍結保存し た （ 粗製溶液 ） 。

斯く し て得た粗製溶液の丄 ー細胞に対する細胞毒性作甩

( 力価、 単位 / ma ) を、 下記第 2表に示す。 尚、 上記力価 の測定は、 培養上清を無菌沪過後行なった。 ま た H V J を 含む培養上清は、 H V J を不活性化するた め に U V処理

で?、

ΟΜ?Ι 八 WIPO ' ( 1 5 W U Vラ ンプ、 2 0 cm下、 3 0分処理 ） 後 、 力 価 測定を行なっ た 。

2 表

胞 抗腫癟物質誘導剤

P H A C onA H V J L P S

D N D - 4 1 2 4 1 5 9 0 2 0

T A L L - 1 6 0 1 5 6 3 1 5

R P I -

8 4 0 2 5 5 1 2 6 0 1 8

C C R F -

H S B - 2 6 0 1 0 6 0 2 0

C C R F -

G E M 6 0 1 0 1 3 0 2 0

( 2 ) 上記 （ 1 〉 と 同様 に し て 、 5 x 1 0 ^s 個 πιδ

R P M I — 1 6 4 0培地単独、 の C C R F — C E Mに

1 0 0〜 4 0 0 0 Η Α /^/πιδの H V J を添加 し 、 2 4時間培 養 し て 、 周様に粗製溶液を得 た 。 そ の力価 （ 単位 ZmQ ) を 下記第 3表 に示す 。

O PI WIPO . 2 第 3

粗製溶液 H V J添加量 粗製溶液力 価

N ο. ( H A / m ) ( 単位 Zing )

( 3 ) Ί 0 % F C S加 R P- I - 1 6 4 0培地を用 いて

5 x 1 0 ^s 個 Ζιπ に調製 し た C C R F— C E Mに 5 0〜

2 0 0 ^ 0 Ζπιδの P H Aを添加 し 、 7 2時間培養 し 、 前記

( 1 ) と周様に粗製溶液 （ N o.7〜 9 ) を得た 。

ま た 、 上記に おい て P H A 5 0 ^ 9 / ιπδの添加 4 8時間 培養後、 更に Ρ Η Αの 5 0 ^9 / ιπδ ( 粗製溶液 N o.1 0 ) 、 C . parvumの 5 0 ^ g / πιδ ( 粗製溶液 N o.1 ) 、 又は

H V J の 5 0 0 H A Zmfi ( 粗製溶液 N o.1 2 ) を添加 し て 更に 4 日 間培養し て粗製溶液を得た 。 それ ら の力 価 （ 単位

Ζπώ ) を下記第 4表 に 示す 。

REACT

OMPI 第 4 表

粗製溶 抗腫瘍物質誘導剤 力 価

液 N 0. ( f g 又 は H A ιπδ ) ( 単位 ιπΰ )

7 P H A ( 5 0 ) 6 9

8 P H A ( 1 0 0 ) 6 5

9 P H A ( 2 0 0 ) 8 0 1 0 P H A + P H A

( 5 0 ) ( 5 0 ) 8 0

1 P H A + C . parvum

( 5 0 ) ( 5 0 ) 3 0 0

2 P H A + H V J

」 5 0 ) ( 5 0 0 ) 1 5 0

( 4 ) 本発明物質の単離

上記 （ 2 ) に お い て 、 C C R F — C E M に H V J

( 0 0 H A / πιδ ) を作用 させ て 得 た粗製溶液 （ 5 4単位 / ιπδ ) の 1 0 0 0 m 2 に 4 7 29 の硫安を添加溶解後 、 4 で で一夜放置 し 、 活性物質を沈殿さ せ た 。 沈殿を

1 0 0 0 ひ回転ノ分で 3 0分間遠心分離 （ 4 ） し 、 沈 ^ を集め 、 約 1 0 0 m g の 0 . 0 2 M 卜 リ ス 一 塩酸緩衝液 / 0 . 1 M N a C 2 ( p H 7 . 8 ) に 懸濁 さ せた 。 こ の 段階での活性回収率は 9 6 %で精製度は 1 8倍であっ た 。

次いで 、 該沈 懸濁液 1 0 0 m β に対 し 3 6 . 0 4 g の

O PI

4 鶴 尿素を加え溶解させた 。 これを 1 0 0 0 0回転 Z分で 3 0 分闥冷却遠心分離 （ 4で 〉 し 、 不溶物質を除去 した。 この 上清液 5 0 m δ を と り 、 0. 0 2 M 卜 リ ス一塩酸 Z

0 , 5 Μ Ν a C δ 緩衝液で平衡化 し た ウル 卜 口ゲル

5 A C A 5 4を用いゲル泸過 （ カ ラムサイズ 5 0 x 1 00 0

ram) し 、 溶出区分につき L一細胞に対する活性測定法に よ り 、 活性を調べ活性区分を集めた。 該方法による活性回収 率は 9 596で、 精製度は 4 7倍であっ た 。 全段階を通 し て の活性回収率は 9 1 . 29 で精製度は約 8 4 6倍であっ た ェ o 次いでアミ コ ン限外泸過膜 Υ Μ 1 0を装着し た限外沪過

濃縮器 T C F— 1 0を用いて活性区分を穰縮した。 この漉 縮液を透析用 チユープにいれ、 5 0倍量の 0 . 0 2 Μ リ ン酸緩衝液 （ P Η 6. 8 ) に対 して 4で透析を行なった 。

外液を 3時間毎に 3回交換 した後、 同緩衝液中で 、 4で 、

15 —夜放置 し た 9 この透析活性区分をあ らかじめ 0. 0 2 Μ

リ ン酸緩衝液 ( Ρ Η 6. 8 ) で平衡化 し たハイ ド ロ キシ ァパタ イ 卜 ゲルの カ ラム （ サイズ 2 6 x 4 0 0 mm) に付 し た 。 流速 5 . 0 m 時、 3 m 分画の条件下に同緩衝 液で充分洗浄 し た後、 0. 0 2 M リ ン酸緩衝液 （ P H ao 6 . 8 ) 5 0 0 m S 及び 0. 5 M リ ン酸緩衝液 （ Ρ H

6 . 8 ) 5 0 0 m δ を使用 し 、 連続的に濃度勾配を上昇さ せ、 吸着物質を溶離し た 。 この方法では菲吸着区分に活性 は認め られず 、 すべての活性は吸着され、 吸着された活性

OMPI

/ 删 区分 は リ ン酸緩衝液濃度 0 . 1 5 M〜 0 . 3 Mの 間 に 溶出 さ れた 。 活性区分 を集め 、 ア ミ コ ン 限外沪過濃縮装置 T C F— 1 0を用 い 、 4で で 限外沪過濃縮を行なっ た 。 こ の方法 に よ る活性回収率 は 6 3 %で あ り 、 精製度 は 6 . 3 倍で あっ た 。 全工程を通 し て の活性回収率 は 5 7 . 5 %で あ り 、 精製度は 5 . 3 3 X 1 0³ 倍で あ っ た 。

次いで 、 上記方法で得 ら れた 活性区分の濃縮液を透析用 チュ ー ブ に い れ、 5 0倍量の 0 . 0 2 M 卜 リ ス 一 塩酸 ( H 7 . 8 ) 0 . M N a C S 緩衝液 に対 し て 、 4 で一夜透析を行な っ た 。 同緩衝液で緩衝化 し た フ アルマ シ ァ モ ノ Q カ ラ ム に 透析内液を付 し 、 1 m Q Z分、 1 m δ / 分画の条件で活性物質を吸着 さ せた 。 次いで周緩衝液で 充 分洗淨後、 0 . 0 2 Μ 卜 リ ス 一 塩酸 （ Ρ Η 7 . 8 ) / 1 . 0 N a を用 い連続的 に N a 〇 δ 濃度を上昇さ せ 、 吸着 し た活性区分を溶離さ せ た 。 活性区分を ア ミ コ ン 限外沪過膜 Υ Μ 1 0を装着 し た 限外？戶過装置を用 い濃縮 し た 。 こ の方法 に よ る活性回収率 は 8 0 %で あ り 、 精製度 は 5 . 1 倍上昇 し た 。 全工程を通 し て の活性回収率 は 5 0 % で あ り 、 精製度 は 2 . 7 2 x 0¹ 倍で あっ た 。

次い で 、 上記鸛縮液を 0 . 1 Μ 卜 リ ス — 塩酸 （ Ρ Η 7 . 8 ) 7 0 %飽和硫安で平衡化 し た 卜 ー ョ ー パ ー ル S W 6 0 ( カ ラ ム サイ ズ 1 0 x 5 0 0 mm) に 、 流速 1 m β 分 、 2 m 分画で付与 し 、 カ ラ ム 中で塩祈 し た 。 つ い で 0 ， 1 M 卜 リ ス -塩酸 （ P H 7 . 8 ) の緩衝液を用い 連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶離を行なっ た 。 活性 区分を集め、 アミ コ ン限外沪過膜 Y M 1 0を装着 した限外 泸過濃縮装置に よ り 濃縮 した。 この方法に よる活性回収率 は 6 1 %であ り 、 精製度は 3倍であった。 全工程を通 して の活性回収率は 2 8 . 096、 精製度は 8. 1 5 X 1 0⁴ 倍であっ た o

次いで、 上記濃縮液を 0 . 1 M リ ン酸ナ ト リ ウム （ P H 1 . 0 ) / 0 . 2 N a C S Z 0 . 1 % S D S緩衝液で 平衡化 した 卜一ョ ーソ ーダー G 3 0 0 0 S Wカ ラム

( 7 . 5 X 6 0 0 mm) を用い 、 流速 1 m 分、 Ί-m δ / 分画でゲル 過を行なっ た 。 この方法で活性回収率は 2 6 %であ り 、 精製度は 2 . 9倍上昇 し た 。 全工程を通じての 活性回収率は 7 . 2 9 %であ り 、 精製度は 2 . 3 6 X

1 0⁵ 倍であっ た 。

斯く し て 、 本発明の蛋白質を得た 。 該蛋白質は前述 し た 生理活性及び物理化学的性状を示す。 尚 、 本生理活性を有 する蛋白質の比活性は 3 . 5 4 x 1 0 ^s 単位 Z mg蛋白質で あっ た 。

( 5 ) 前記 （ 1 ) において 、 D N D— 4 1 に P H Aを作 用 させて得た粗製溶液 （ 2 4単位 Zma ) を用 いて、 上記

( 4 ) と同様に して 、 本発明蛋白質を得た 。 全工程を通じ ての活性回収率は、 5 . 5 7 %であ り 、 精製度は 4 . 9 2

O PI X 1 0⁵ 倍であ り 、 比活性 は 3 . 4 9 X 1 0⁶ 単位 mg蛋 白質であっ た 。

( 6 ) 前記 （ Ί ) に おい て 、 丁 八 し し ー 1 に 1"1 」 を作 用 さ せ て 得た粗製溶液 （ 6 3 単位 Ζ πιδ ) を用 い て 、 上記

5 ( 4 ) と周様に し て 、 本発明蛋 白 質を得た 。 全工程を通 じ

て の活性回収率 は 、 5 . 5 2 %で あ り 、 精製度は 1 . 9 5

X 0⁵ 倍で あ り 、 比活性 は 3 . 5 1 X 1 0⁸ 単位 /" mg蛋 白質で あっ た 。

( 7 ) 前記 （ 1 ) に おい て 、 R P M I — 8 4 0 2 に

I D C onAを作用 さ せ て得た粗製溶液 （ 1 2単位ノ πώ ) を用 い

て 、 上記 （ 4 ) と 周様に し て 、 本発明蛋 白 質を得た 。 全ェ 程を通 じ て の活性回収率 は 、 7 . 4 5 %であ り 、 精製度 は 8 . 8 7 Χ 1 0⁵ 倍で あ り 、 比活性 は 3 . 5 5 Χ 1 0⁶ 単 位 / mg蛋 白 質で あ っ た 。

is ( 8 ) 前記 （ 1 ) に お い て 、 C C R F— H B S — 2 に

C on Aを作用 さ せ て 得た粗製溶液 （ 1 0単位 Z ma ) を用 い て 、 上記 （ 4 ) と 同様 に し て 、 本発明蛋 白 質を得 た 。 全ェ 程を通 じ て の活性回収率 は 、 6 . 4 %で あ り 、 精製度 は

9 . 5 2 Χ 1 0⁵ 倍であ り 、 比活性 は 3 . 5 2 Χ 1 0⁶ 単 so 位 / mg蛋 白 質であ っ た 。

( 9 ) -上記 （ 4 ) と 同様 に し て 、 前記 （ 1 〉 〜 （ 3 〉 に おい て得た各酵素溶液を用 い て 、 略々周様の活性回収率 、 精製度、 比活性 に て 、 周一 の物性を有する本発明蛋 白質を

O PI 得た 。

以下、 本発明物質を用い fc製剤例を挙げる。

製剤例 1

本発明蛋白質 1 X 1 0 ⁹ 単位の生理食塩水溶液 1 0 0 m を無菌沪過後 2 niQずつ分注し 、 凍結乾燥し て、 注射用抗腫 瘍剤を得る。

OMPI

Claims

請 求 の 範 囲

① ヒ 卜 由来の培養株化 リ ンパ系細胞 に 、 抗腫瘼物質誘導 剤を作用 さ せ る こ と に よっ て 誘導産生 さ れる下記の特性 を有す る蛋 白質。

a ) 分子量 ： 5 6 0 0 0 ± 3 0 0 0

1) ) 等電点 ： 卩 ^ 4 . 9 ± 0. 3

c ) 3 mg蛋白量 Z m β の 0 . 0 2 Μ 卜 リ ス 一 塩酸緩衝液 ( Η 7 . 8 ) 溶液に お い て 無色透明であ り 、 ァ セ 卜 ン 又 はエ タ ノ ールを 該溶液に 7 0 V Z V 96以上加 える と 沈 ¾を生ず る

d ) 水溶液は弱酸性を示す

e ) ビ ユ ウ レ ツ 卜 反応、 フ 才 リ ン ロ ー リ ー反応法な ら び に塩酸加水分解後の ニ ン ヒ ド リ ン反応 に つ い て ぺプ チ ド結合な ら び に ア ミ ノ 酸の呈色反応を示す f ) 培養細胞マ ウス L一細胞 に対 し て イ ン ビ 卜 口 で直接 細胞毒作用 を有す る及び - g ) メ ス Aザル コ ー マ担ガ ンマ ウス に対 し て イ ン ビ ポで 抗腫瘍作用 を有す る 。

② 抗腫瘍物質誘導剤が 、 ウ ィ ルス 、 グラ ム 陰性菌由来の エ ン ド 卜 キ シ ン 、 植物由来の レ ク チ ン及び免疫陚活作用 を有す る物質か ら 選択さ れる 請求の範囲第 1 項 に 記載の

¾曰質 。

③ 抗腫瘍物質誘導剤が大腸菌 、 緑膽菌及びチフ ス菌 に 由 来する リ ポポ リ サッカ ライ ド （ L P S ) 、 タ チナ タ マメ レ ク チン （ コ ン カ ナパ リ ン A C on A ) 、 ダイ ズマ メ レ ク チン （ S B A ) 、 ァカ イ ンゲンマメ レクチン

( P H A ) 、 セ ンダイ ウ イ ルス .( H V J ) 、 バ チルス カ ルメ ッティ グエ リ ン （ B C G ) 、 コ リ ネパ ク テ リ ゥ ム パルパ ム （ G orynebacter i um parvum ) 、 プ ロ ピ オ ンパ クテ リ ゥム ァ ク ネス （ P ropioni baoterium

acnes ) 、 ミ コ ゾ ク テ リ ゥ ム プチ リ カ ム

( M ycobacterium buty r i cum ) 、 コ リ ネパ ク テ リ ゥ ム グ ラ ニュ ロ サム （ G orynebacterium granulosum) ス 卜 レブ 卜 コ ッ カ ス ピ ロ ジネス （ S treptococcus

py rogenes ) 、 プラス モディ ウ ム （ P lasmodium ) 、 ザ - ィ モザ ン （ Z ymosan) 、 ノ カ ルディ ア ァ ス ト ロ イ デス

( N ocard i a astero ides ) 、 リ ス テ リ ア モ ノ サイ 卜 ジ ェネス （ し ysteria monocytogenes ) 、 グル カ ン

( glucan) 、 細胞膜骨格 （ cel lwal l ske I ton ) 、 デキ ス 卜 ラ ン硫酸 （ dextran su 1 fate ) 、 ム ラ ミ ルジ ぺプ タ イ ド （ muramyld ipeptide) 及び ク レ スチン （ 呉羽 工業 社製 ） か ら 選択さ れる請求の範囲第 2 項に記載の蛋 白質。

④ 抗腫瘍物質誘導剤 が L P S C onA P H A H V J

及びコ リ ネパ ク テ リ ゥム · パルバムから選択される請求 の範囲第 3 項に記載の蛋白質。

⑤ ヒ 卜 由来の培養株化 リ ンパ系細胞が C G R F — C E M

OMPI D N D — 4 1 、 T A L し 一 1 、 R P M 1 -.8 4 0 2及び C C R F — H S B — 2細胞か ら 選択さ れる 請求の範囲第 項〜第 4項の いず れか に記載の蛋白質 。

⑥ ヒ 卜 由 来の培養株化 リ ンパ系細胞が C C R F - C E M 細胞であ る請求の範囲第 4項に 記載の蛋 白 質 。

⑦ D N D — 4 1 細胞 に H V J を作用 さ せ て 得 ら れる 請求 の範囲第 1 項に 記載の蛋白質。

⑧ C C R F — C E M細胞に H V J を作用 させ て 得 ら れ る 請求の範囲第 1 項に 記載の蛋 白質 。

⑨ C C R F — C E M細胞に H V J と P H A と を作用 さ せ て 得 ら れる請求の範囲第 1 項に 記載の蛋 白質。

⑩ C C R F — C E M細胞 に P H A と コ リ ネパ ク テ リ ゥ ム • パルバ ム を作用 さ せ て 得 ら れる請求の範囲第 1 項に 記 載の蛋 白 質。

⑪ ヒ 卜 由来の培養株化 リ ンパ 系細胞 に 、 抗腫瘍物質誘導 剤 を作用 さ せ 、 誘導産生 さ れ る下記特性 を有す る蛋 白 質 を採取す る こ と を特徴 と す る制 ガ ン作用 を有す る蛋 白 質 の製造法 。

a ) 分子量 ： 5 6 0 0 0 ± 3 0 0 0

b ) 等電点 ： p H 4 . 9 ± 0 . 3

c ) 3 mg蛋白 質 / mlの 0 . 0 2 M 卜 リ ス 一 塩酸緩衝液 ( P H 7 . 8 ) 溶液に お い て 無色透明であ り 、 ァ セ 卜 ン又 はエ タ ノ ールを該溶液 に 7 O V Z V 96以上加 3 - える と沈殿を生ずる

d ) 水溶液は弱酸性を示す

e ) ビユウ レッ ト 反応、 フ ォ リ ンロ ー リ 一反応法な らぴ

に塩酸加水分解後のニン ヒ ド リ ン反応について ぺプ チ ド結合な らびに アミ ノ酸の呈色反応を示す

f ) 培養細胞マウ ス し —細胞に対 してイ ン ビ 卜 口で直接

細胞毒作用を有する及び

g ) メ ス Aザルコ ーマ担ガンマウスに対し てイ ン ビポで

抗腫瘍作用を有する。

ヒ 卜由来の培養株化 リ ンパ系細胞に 、 抗腫瘼物質誘導 剤を作用 させるこ とに よっ て誘導産生される下記の特性 を有する蛋白質の有効量を含有する抗腫瘍剤。

a ) 分子量 ： 5 6 0 0 0士 3 0 0 0

b ) 等電点 ： P H 4 . 9 ± 0 . 3 ·

c ) 3jg蛋白質 Zmlの 0. 0 2 M 卜 リ ス一塩''酸緩衝液

( H 7 . 8 ) 溶液において無色透明であ り 、 ァセ 卜 ン又はエタ ノ ールを該溶液に 7 0 V V %以上加 える と沈瀕を生ずる

d ) 水溶液は弱酸性を示す

e ) ビ ユウ レツ 卜反応、 フ 才 リ ン □ 一 リ ー反応法な らぴ

に塩酸加水分解後のニン ヒ ド リ ン反応についてぺプ チ ド結 合な らびに ア ミ ノ 酸の呈色反応を示す

f ) 培養細胞マウス し 一細胞に対 し てイ ン ビ 卜 口で直接

OMPI 細胞毒作用を有する及び

メ ス A ザル コ ー マ担ガ ンマ ウ ス に 対 し て イ ン ビポで 抗腫瘍作用を有する 。

OMPI