JPS63150298A - マクロフア−ジ活性化因子及びその製造方法 - Google Patents
マクロフア−ジ活性化因子及びその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はマクロファージ活性化因子及びその製造方法に
関する。 癌免疫において、マクロファージ活性化因子（以下ＭＡ
Ｆと略）により活性化されたマクロファージは、正常細
胞と識別して癌細胞のみを殺すことができること、また
その殺腫瘍活性が癌細胞のもつ転移能の強弱、制癌剤感
受性あるいは免疫原性の有無と無関係に発揮されること
、等の理由により大きな役割金はたす。そこでマクロフ
ァージを抗腫瘍マクロファージに誘導するリンパ球由来
の液性因子（リンホカイン）であるぬ「は安全性の高い
制癌剤として、又今までの制癌剤では克服が困難とされ
ている癌転移の治療剤として期待されている。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕マク
ロファージの活性化剤としては、ＢＣＧ１コリネバクテ
リウム・パルパム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐ
ａｒｖｕｍ ） 、内毒素などの細菌製剤及びムラはル
ジペゾテド等が知られているが、いずれも毒性が強かっ
たシ、単独ではマクロファージヲ活性化できないなどの
欠点金有し臨床への応用は困難である。ＭＡＦ ！−１
！Ｊンパ球の産生する液性因子であり、ヒト細胞由来の
ＭＡＦは毒性が低く、抗原性を持たないなど理想的な活
性化剤であるが、安定した活性を持つＭＡＦ’ｉ多量得
ることは困難である。すなわちヒト末梢血リンパ球を抗
原（ＳＫ−’ＳＤ）と共に培養すると、その培養上清中
にはＭＡＦが産生されるが、ヒト末梢血リンパ球をヒト
血液よシ大量に取得することが困難なこと、種々の分子
量、等電点を有するＭＡＦが得られるため一定の品質を
有するＭＡＦが得ら扛ないという問題点を有する。（Ｄ
、Ｊ、Ｃａｍｅｒｏｎ； Ｊ。 Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １３４７ （
１９８４） 〕本発明者らは細胞融合によりヒト単球に
作用し抗腫瘍性マクロファージを誘導するＭＡＦｉ産生
するヒトＴ細胞ハイプリドープを取得し、そのヒトＴ細
胞ハイブリドーマを培養し、その培養上清から（１）ヒ
ト及びマウスマクロファージに作用して抗腫瘍性マクロ
ファージを誘導しく２）マクロファージに作用し、マク
ロファージから腫瘍細胞障害因子を産生させ（３）分子
量が４０．０００〜１５０．０００等電点が４．６＋０
．２ （４）ｐＨ２又は、５６℃３０分処理で失活しな
い等の特性を有するＭＡＦ ｉ大量にかつ安定に取得す
ることに成功しく３） ている（特願昭６０−２４２７２０号明ＭＢ ｔ ）。 更にその後の研究で同じヒトＴ細胞ノ＼イブリドーマ（
Ｈ３−Ｅ９６株）の培養上清からヒト単球系マクロファ
ージの腫瘍細胞障害性を相乗的に誘導する二種のＭＡＦ
（プライばング作用を有するＭＡＦ−Ｃ１及びトリガ
リング作用を有するＭＡＦ−ＣＩＩ ）に分離できるこ
とが明らかとなった。〔樋口ら、第６回国際免疫学会要
旨集。 ３７２ページ、１９８６年〕。ＭＡＦ−ＣＩ及びＭＡＦ
−ＣＩ単独でもヒト単球系マクロファージを活性化し
うるが両者を混合した際により高い抗腫瘍活性を相乗的
に誘導し、又ＭＡＦ−Ｃ［Ｕマウスインターフェロンガ
ンマド相乗的ニマウスマクロファージの腫瘍細胞障害性
を誘導する。Ｍｅｌｔｚ−ｅｒ ［： Ｍｅｌｔｚｅｒ
、 Ｍ、 Ｓ、 ’４ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ 、
１２７１７９（１９８１）〕はマウスマクロファージが
腫瘍細胞傷害活性を示すための活性化は、マクロファー
ジ２ ｐｒｉｍｅｄマクロファージに誘導する物質（ｐ
ｒｉｍｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ）によってｐｒｉｍｅｄ
−ｖクロファージ〔癌細胞の増殖を阻止するが破壊しな
いマクロファージ〕へ誘導され、次いで腫瘍細胞障害性
マクロファージに誘導する物質（Ｔｒｌｇｇｅｔｉｎｇ
ｓｉｇｎａｌ ）によッテ行わレルというマクロファ
ージの２段階活性化説を提唱したがＭＡＦ−ＣＩ及びＭ
ＡＰ’−Ｃｌは各々マクロファージに対するｐｒｉｍｉ
ｎｇ ｓｉｇｎａｌ 、 Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｓｉ
ｇｎａｌに相当すると考えられる。プライミング作用ｔ
（ＬＰＳ ）が知られておシ、他にＨａｒｎｍａｎ ’
ｇ、及びＫｒａｍｍｅ＊ Ｐ、 Ｈ（Ｅｕｒ、Ｊ、■ｍ
ｍｕｎｏｌ、 １５１８（１９８５） ：］ ４”ｔ
Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ２示すＭＡＦ
を産生ずるマウスＴＮｉ胞クローン及びマウスＴ細胞ハ
イブリドーマについて報告しているが詳しい物質として
の解析はなさ扛ていない。 本発明者らは、このトリガリング作用を有するＭＡＦ
ｉ取得することに成功し、本発明全完成した。 〔問題を解決するための手段〕 すなわち、本発明の第１は、ヒト及びマウスマクロファ
ージに作用し、抗腫瘍性マクロファージを誘導し、分子
量がＳＤＳ−電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウム存在下
のアクリルアミドグル電気泳動：以下ＳＤＳ −ＰＡＧ
Ｅと略）下で１４００〜２１００であることを特徴とす
るＭＡＦであシ、特に、ヒト及びマウスマクロファージ
に作用しプライミング作用を有するマクロファージ活性
化因子と相乗的に抗腫瘍性マクロファージを誘導するこ
とを特徴とするＭＡＦである。 また、本発明の第２は、ヒトＴ細胞ハイブリドーマを培
養し、その培養上清をタンパク分解酵素で処理し、尿素
存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することによりＭＡＦ
ｆ取得することを特徴とするＭＡＦの製造方法である。 以下、本発明の製造方法に順を追い、本発明の詳細な説
明する。以下、本発明にいうＭＡＦ 全ＭＡＦ−Ｃ７ｌ
と称する。 本発明に用いられるＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイブリドー
マは、例えば特開昭５８−７２５２０号公報に示すごと
く、ヒト白血病性Ｔ細胞株をタンパク質合成阻害剤又は
これとＲＮＡ合成阻害剤との併用により処理し、ヒトＴ
細胞をマイト−ジエン又は抗原で刺激し、両者を融合促
進剤の存在下で融合させ得られる融合細胞（ヒトＴ細胞
ハイグリドーマ）だけを分離し、そのヒトＴ細胞ハイグ
リドーマからクローニングによＪ ＭＡＦ産生ヒトＴ細
胞ハイブリドーマだけを分離して作製できる。本発明の
ＭＡＦ−ＣＩ産生細胞としては特願昭６０〜２４２７２
０号明細書記載のＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマ
のクローニング株Ｈ３−Ｅ９−６株が好適に用いること
ができる。 培養上清は、ＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ノ・イブリド培地（
以下ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍと略）で培養し
、その培養上清からも取得できるが、Ｆｃｓ ＠含まな
イｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ中で培養するか又
は（７ン ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ中３７℃で培養して
得たＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマ全コンカナバ
リンＡ（以下Ｃ０ｎＡと略）を含むｅｓｓｅｎｔｉａ１
ｍｅｄｉｕｍ中、３７℃で培養し、次いでこのｃｏｎＡ
活性化ＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイグリドー￥を０．１５
ＭＮａαを含む１０ｍＭ！７７酸バッファー（ｐｎ７−
２＋以下ＰＢＳと略）で洗浄後ＦＣ８を含まなイｅｓｓ
ｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ中３７℃で培養して得た無
血清培養上清であることが、Ｆｃｓ中に含まれる種々の
不純物（タンパク質、多糖類、リポ多糖類など）を混入
しないことから有利である。培養液から遠心分離又は限
外濾過法により培養土清全得、更に濃縮し、濃縮液（Ｃ
８Ｊを得た。 ■ＣＳの蛋白分解酵素処理 ＣＳに蛋白分解酵素全Ｃ８中に含まれる蛋白質重量の１
／１０〜１７５０量加え攪拌下に反応させる。本発明に
用いられる蛋白分解酵素は特に限定されないが、ゾロナ
ーゼＥ （ＳＩＧＭＡ 社製）、アクチナーゼＥ（科研
製薬Ｍ）、トリゾシン（ＳＩＧＭＡ社製）、キモトリプ
シン（ＳＩＧＭＡ社製）が好適に用いられる。反応温度
は使用する酵素の最適条件下でよく反応時間は反応温度
により適宜変更できるが、３７℃、１８〜２４時間の反
応条件が最適である。 ■ＭＡＦ−ＣＩＩの取得 ■で作製したＣＳの蛋白分解酵素処理液を０．１％ＳＤ
Ｓ （ドデシル硫酸ナトリウム）を含む１０ｍＭリン酸
バッファー（ｐ１１７．４）に対し透析する。この透析
内液２ ＲｌＴ 、３ｗａｎｋとに、 Ｄ。 Ｍｕｎｋｒｅｓの方法［Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、 ３ ｇ ４６２〜４７７ （１９７１））に従い、
尿素存在下、５Ｄ８−電気゛泳動を行い、泳動後ダルを
スライスし、各スライス６、ｏ、ｉ％ＳＤＳ ’ｉ含む
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐｎ ７゜４）で抽出し、
ＭＡＦ−ｃ［活性を測定する。 ＭＡＦ−Ｃ［の定量は、後述するように、マ、ウス−イ
ンターフェロン−ガンマ（ｍ−ＩＦＮ−γ）、ポリミキ
ンンＢの存在下、マウス腹腔浸出マクロファージの腫瘍
細胞障害活性（ＭＡＦ−Ｃｍ活性）を測定することによ
り行った。 ＭＡＦ−ｅＩＩ活性は分子量１４００〜２１００の位置
に検出され、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥｔ、、銀染色する
と、分子量１４００〜２１００の位置に１本のバンドの
み存在することから、得られたＭＡＦ−ｅｌ［が高純度
であることを確認した。 ■ＲＩｆＡＦ−ｃｌＩの確認 本発明で得たＭＡＦ−ｃ■は、ヒト−インターフェロン
−ガンマと相乗的にヒト末梢血由来単球を活性化するこ
とから、ヒトマクロファージ活性化作用を有することを
確認した。 又、本発明のＭＡＦ−Ｃｌｌ がＬＰＳと異なることは
、ＭＡＦ−ｃｌ’［中に含まれるＬＰＳ含量が０．１
ｎｒ／ ｍｌ以下であること、ＬＰＳ作用を十分除去し
うる量の？リミキシンＢ存在下でマクロファージを活性
化することから、明らかである。 〔実施例〕 実施例１ ％願昭６０−２４２７２０号明細書の実施例１に示す方
法で取得したＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイツリドーマ（２
Ｘ １０’ｃｅｌｌｓ／ｍＡ’ ）を２０ ｔｔｔ／ｍ
ｌのＣｏｎＡを含むｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ
中２４時間培養し、次いで細胞をＰＢＳで３回洗浄し
た。 このＣｏｎＡ活性化Ｈ３−Ｅ９−６細胞（２×１０’
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をＦｅ２を含まな、いｅｓｓｅｎｔ
ｉａｌｍｅ ｄ ＋ ｕｍ 中７２時間培養した。培養
物を遠心分離後、上溝をベリコンカセットシステム〔日
本ミリポア（株）〕を用いて１００倍に濃縮し、濃縮液
（ＣＳ ） を得た。 Ｃ８のタンパク量（４〜／ｍ７！；タンノやり含有量は
Ｂｉｏ Ｒａｄ社のプロティン アッセイキットにより
定量）の１／２０ｉのアクチナーゼＥ （１０’チロシ
ン単位／２）をＣＳに加え３７℃で２４時間処理した後
、０．１％ＳＤＳを含む１０ｍＭ リン酸バッファー
（ｐ）Ｉ ７．４ ） Ｋ対し透析した。この透析液２
０ ｔＪ をＲ，Ｔ、 Ｓｗａｎｋ及びに、 Ｄ、Ｍｕ
ｎｋｒｅｓの方法に従い、２−メルカゾトエタノール存
在下、尿素（８Ｍ）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ （１ｕｍ
厚）を行った。電気泳動の後、ダルを３酵の切片にスラ
イスし、各スライスを０．１％ＳＤＳ’を含む１０ｍＭ
リン酸パン−ｙ７−（ｐＨ７，４） ０．２ゴで１０時
間抽出し、各抽出液のＭＡＦ−Ｃｍ活性を測定した。 泳動後のダルは、銀染色法によシ染色し、分子ｉは分子
量既知のマーカー ミオグロビン（１７，２００）、ば
オゾロビンＩ 十Ｉｆ （１４，６００）、ミオグロビ
ンＩ（８，２４０）、ミオグロビン■（６，３８０）、
ミオグロビンＩ［Ｉ（２，５６ｏ）よシ求めた検量線か
ら定量した。図１に示すようにＭＡＦ −（：ｍ活性画
分の分子量は１４００〜２１００でおった。図１におけ
る各スライス抽出液のＭＡＦ −（：ｍ活性は、各抽出
液’ｋ ２０．０００倍希釈し、特願昭６０−２４２７
２０号明細書に示す以下の方法により行った。 ＭＡＦ−Ｃｍ活性 Ｍｅｌｔｚｃｒの方法を修正して測定した（Ｍｅｌｔ−
ｚｅｒ、 Ｍ、Ｓ、 ； Ｊ、 Ｉｒｒｍｕｎｏｌ、
１２７１７９（１９８１）：］。ＤＢＡ／２（６〜８週
令、メス）に１０％プロテオースペゾトンプロス（ｐｉ
ｒｃ。 Ｌａｂ、製）１．５１１Ｌｌを腹腔内接種３日後の腹腔
浸出細胞ｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍにサス
ペンド（２ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／コ） １．、その
１００μｔｋｇ６ウエル平底マイクロタイターグレート
にまき、９０分、３７℃でインキュベート後、非接着細
胞（ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ） ２除云
し、ＭＡＦ希釈液、ｍ−ＩＦＮ−ｒ （２０ｕ／ｍｅ）
及びポリミキシ７ Ｂ （Ｓｉｇｍａ社、２５ ｐｔ／
ｍｌ ） ｔ：含むＭＡＦサンプルを加えて４時間イン
キュベートした。上清を除去後 ３Ｈ−チミジンラベル
したＰ８１５（マウス腫瘍細胞）を各ウェルに加え（１
×１０’ｃｅｌｌｓ／ウエル）、４８時間後プレート遠
心機で上清と細胞を分離し、上清の放射活性を液体シン
ナレーションカウンターで測定した。 ＭＡＦ−Ｃｍ活性値Ｃ％）は次式により算出した。 ＭＡＦ−Ｃｍ＝ （Ｓ−Ｃ）／（Ａ−Ｆ）Ｘ１００Ｓ：
サンプル添加系での上清中の放射活性（ｃｐｍ ） Ａ：全放射活性（３Ｈラベル化Ｐ８１５ １Ｘ １０’
ｃｅｌｌｓの放射活性、ｃｐｍ）ｐ ： ５ｐｏｎｔ
ａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ （”Ｈラベル化Ｐ８１
５ １ＸＩＯ’／ウエルを含む ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ２３７℃４８時間
培養した後、遠心分離して得た上清の放射活性、ｃｐｍ
） Ｃ：サンプルの代少に培地全添加した系での上清中の放
射活性（Ｃｐｍ） ダル切片Ａ１３．１４の抽出液を合わせて（以下これ全
ＭＡＦ−Ｃ１試料とする）濃縮後、５Ｄｓ−ＰＡＧＥを
行った結果、同分子量位置に１本のバンドが認められた
。 また、ＭＡＦ−ｃｌ試料中のＬＰＳ含量を、リムルステ
ストワコー（和光紬薬製）を用いて測定′ｎｌ した結果、ＬＰＳ含量は０．１４９／ＩＩ／！以下Ｔ４
ツた。 実施例２ ヒト末梢血リンパ球からパーコールを用いて単球を分離
した。この単球を９６ウエルマイクロタイターグレート
にはりっけ非付着細胞を除去し、実施例１で得たＭＡＦ
−ｃＴＬ試料０−０８Ｖ／ｖ％とヒト組換え型インター
フェロンーガンマ１単位／１／（いずれも最終濃度）を
入れ２４時間活性化し洗浄後、あらかじめ３Ｈ−チミジ
ンでラベルしたＨｅ１ａ細胞（、２Ｘ １０３ｃｅｌｌ
ｓ ／つｘル）を入れ４８時間後の３Ｈ−チミジンのｒ
ｅｌｅａｓｅ テ活性を測定し、活性値ｆ ＭＡＦ−Ｃ
ｉ １ ｄ ａ’ｆ（％）として次式より算出した。 ＭＡＦ−Ｃ１ｄａＹ’％）−（Ｓ−Ｃ）／（Ａ−Ｐ）Ｘ
１００Ｓ：サンプル添加系での上清中の放射活性（ｃｐ
ｍ）Ａ：全放射活性（ｊＢラベル化ａｅｌａ ２ ｘ
１０３ｃｅｌｌｓの放射活性、ｃｐｍ） Ｐ ： ５ｐｏｎｔａｎｅｏｎｓ ｒｅｌｅａｓｅ （
”Ｈラベル化Ｈｅ１ａ２ Ｘ ｌ Ｏ８ｃｅｌｌｓ ／
ウニＡ／ ｆ含むｅｓｓｅｎｔ １−ａｌ ｍｅｄｉｕ
ｍ ２３７℃、４８時間培養した後、遠心分離して得た
上清の放射活性、ｃｐｍ） Ｃ：サンプルの代りに培地を添加した系でのったが、Ｍ
ＡＦ−ＣＩ単独又はインターフェロン単
関する。 癌免疫において、マクロファージ活性化因子（以下ＭＡ
Ｆと略）により活性化されたマクロファージは、正常細
胞と識別して癌細胞のみを殺すことができること、また
その殺腫瘍活性が癌細胞のもつ転移能の強弱、制癌剤感
受性あるいは免疫原性の有無と無関係に発揮されること
、等の理由により大きな役割金はたす。そこでマクロフ
ァージを抗腫瘍マクロファージに誘導するリンパ球由来
の液性因子（リンホカイン）であるぬ「は安全性の高い
制癌剤として、又今までの制癌剤では克服が困難とされ
ている癌転移の治療剤として期待されている。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕マク
ロファージの活性化剤としては、ＢＣＧ１コリネバクテ
リウム・パルパム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐ
ａｒｖｕｍ ） 、内毒素などの細菌製剤及びムラはル
ジペゾテド等が知られているが、いずれも毒性が強かっ
たシ、単独ではマクロファージヲ活性化できないなどの
欠点金有し臨床への応用は困難である。ＭＡＦ ！−１
！Ｊンパ球の産生する液性因子であり、ヒト細胞由来の
ＭＡＦは毒性が低く、抗原性を持たないなど理想的な活
性化剤であるが、安定した活性を持つＭＡＦ’ｉ多量得
ることは困難である。すなわちヒト末梢血リンパ球を抗
原（ＳＫ−’ＳＤ）と共に培養すると、その培養上清中
にはＭＡＦが産生されるが、ヒト末梢血リンパ球をヒト
血液よシ大量に取得することが困難なこと、種々の分子
量、等電点を有するＭＡＦが得られるため一定の品質を
有するＭＡＦが得ら扛ないという問題点を有する。（Ｄ
、Ｊ、Ｃａｍｅｒｏｎ； Ｊ。 Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １３４７ （
１９８４） 〕本発明者らは細胞融合によりヒト単球に
作用し抗腫瘍性マクロファージを誘導するＭＡＦｉ産生
するヒトＴ細胞ハイプリドープを取得し、そのヒトＴ細
胞ハイブリドーマを培養し、その培養上清から（１）ヒ
ト及びマウスマクロファージに作用して抗腫瘍性マクロ
ファージを誘導しく２）マクロファージに作用し、マク
ロファージから腫瘍細胞障害因子を産生させ（３）分子
量が４０．０００〜１５０．０００等電点が４．６＋０
．２ （４）ｐＨ２又は、５６℃３０分処理で失活しな
い等の特性を有するＭＡＦ ｉ大量にかつ安定に取得す
ることに成功しく３） ている（特願昭６０−２４２７２０号明ＭＢ ｔ ）。 更にその後の研究で同じヒトＴ細胞ノ＼イブリドーマ（
Ｈ３−Ｅ９６株）の培養上清からヒト単球系マクロファ
ージの腫瘍細胞障害性を相乗的に誘導する二種のＭＡＦ
（プライばング作用を有するＭＡＦ−Ｃ１及びトリガ
リング作用を有するＭＡＦ−ＣＩＩ ）に分離できるこ
とが明らかとなった。〔樋口ら、第６回国際免疫学会要
旨集。 ３７２ページ、１９８６年〕。ＭＡＦ−ＣＩ及びＭＡＦ
−ＣＩ単独でもヒト単球系マクロファージを活性化し
うるが両者を混合した際により高い抗腫瘍活性を相乗的
に誘導し、又ＭＡＦ−Ｃ［Ｕマウスインターフェロンガ
ンマド相乗的ニマウスマクロファージの腫瘍細胞障害性
を誘導する。Ｍｅｌｔｚ−ｅｒ ［： Ｍｅｌｔｚｅｒ
、 Ｍ、 Ｓ、 ’４ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ 、
１２７１７９（１９８１）〕はマウスマクロファージが
腫瘍細胞傷害活性を示すための活性化は、マクロファー
ジ２ ｐｒｉｍｅｄマクロファージに誘導する物質（ｐ
ｒｉｍｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ）によってｐｒｉｍｅｄ
−ｖクロファージ〔癌細胞の増殖を阻止するが破壊しな
いマクロファージ〕へ誘導され、次いで腫瘍細胞障害性
マクロファージに誘導する物質（Ｔｒｌｇｇｅｔｉｎｇ
ｓｉｇｎａｌ ）によッテ行わレルというマクロファ
ージの２段階活性化説を提唱したがＭＡＦ−ＣＩ及びＭ
ＡＰ’−Ｃｌは各々マクロファージに対するｐｒｉｍｉ
ｎｇ ｓｉｇｎａｌ 、 Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｓｉ
ｇｎａｌに相当すると考えられる。プライミング作用ｔ
（ＬＰＳ ）が知られておシ、他にＨａｒｎｍａｎ ’
ｇ、及びＫｒａｍｍｅ＊ Ｐ、 Ｈ（Ｅｕｒ、Ｊ、■ｍ
ｍｕｎｏｌ、 １５１８（１９８５） ：］ ４”ｔ
Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ２示すＭＡＦ
を産生ずるマウスＴＮｉ胞クローン及びマウスＴ細胞ハ
イブリドーマについて報告しているが詳しい物質として
の解析はなさ扛ていない。 本発明者らは、このトリガリング作用を有するＭＡＦ
ｉ取得することに成功し、本発明全完成した。 〔問題を解決するための手段〕 すなわち、本発明の第１は、ヒト及びマウスマクロファ
ージに作用し、抗腫瘍性マクロファージを誘導し、分子
量がＳＤＳ−電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウム存在下
のアクリルアミドグル電気泳動：以下ＳＤＳ −ＰＡＧ
Ｅと略）下で１４００〜２１００であることを特徴とす
るＭＡＦであシ、特に、ヒト及びマウスマクロファージ
に作用しプライミング作用を有するマクロファージ活性
化因子と相乗的に抗腫瘍性マクロファージを誘導するこ
とを特徴とするＭＡＦである。 また、本発明の第２は、ヒトＴ細胞ハイブリドーマを培
養し、その培養上清をタンパク分解酵素で処理し、尿素
存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することによりＭＡＦ
ｆ取得することを特徴とするＭＡＦの製造方法である。 以下、本発明の製造方法に順を追い、本発明の詳細な説
明する。以下、本発明にいうＭＡＦ 全ＭＡＦ−Ｃ７ｌ
と称する。 本発明に用いられるＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイブリドー
マは、例えば特開昭５８−７２５２０号公報に示すごと
く、ヒト白血病性Ｔ細胞株をタンパク質合成阻害剤又は
これとＲＮＡ合成阻害剤との併用により処理し、ヒトＴ
細胞をマイト−ジエン又は抗原で刺激し、両者を融合促
進剤の存在下で融合させ得られる融合細胞（ヒトＴ細胞
ハイグリドーマ）だけを分離し、そのヒトＴ細胞ハイグ
リドーマからクローニングによＪ ＭＡＦ産生ヒトＴ細
胞ハイブリドーマだけを分離して作製できる。本発明の
ＭＡＦ−ＣＩ産生細胞としては特願昭６０〜２４２７２
０号明細書記載のＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマ
のクローニング株Ｈ３−Ｅ９−６株が好適に用いること
ができる。 培養上清は、ＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ノ・イブリド培地（
以下ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍと略）で培養し
、その培養上清からも取得できるが、Ｆｃｓ ＠含まな
イｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ中で培養するか又
は（７ン ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ中３７℃で培養して
得たＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマ全コンカナバ
リンＡ（以下Ｃ０ｎＡと略）を含むｅｓｓｅｎｔｉａ１
ｍｅｄｉｕｍ中、３７℃で培養し、次いでこのｃｏｎＡ
活性化ＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイグリドー￥を０．１５
ＭＮａαを含む１０ｍＭ！７７酸バッファー（ｐｎ７−
２＋以下ＰＢＳと略）で洗浄後ＦＣ８を含まなイｅｓｓ
ｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ中３７℃で培養して得た無
血清培養上清であることが、Ｆｃｓ中に含まれる種々の
不純物（タンパク質、多糖類、リポ多糖類など）を混入
しないことから有利である。培養液から遠心分離又は限
外濾過法により培養土清全得、更に濃縮し、濃縮液（Ｃ
８Ｊを得た。 ■ＣＳの蛋白分解酵素処理 ＣＳに蛋白分解酵素全Ｃ８中に含まれる蛋白質重量の１
／１０〜１７５０量加え攪拌下に反応させる。本発明に
用いられる蛋白分解酵素は特に限定されないが、ゾロナ
ーゼＥ （ＳＩＧＭＡ 社製）、アクチナーゼＥ（科研
製薬Ｍ）、トリゾシン（ＳＩＧＭＡ社製）、キモトリプ
シン（ＳＩＧＭＡ社製）が好適に用いられる。反応温度
は使用する酵素の最適条件下でよく反応時間は反応温度
により適宜変更できるが、３７℃、１８〜２４時間の反
応条件が最適である。 ■ＭＡＦ−ＣＩＩの取得 ■で作製したＣＳの蛋白分解酵素処理液を０．１％ＳＤ
Ｓ （ドデシル硫酸ナトリウム）を含む１０ｍＭリン酸
バッファー（ｐ１１７．４）に対し透析する。この透析
内液２ ＲｌＴ 、３ｗａｎｋとに、 Ｄ。 Ｍｕｎｋｒｅｓの方法［Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、
、 ３ ｇ ４６２〜４７７ （１９７１））に従い、
尿素存在下、５Ｄ８−電気゛泳動を行い、泳動後ダルを
スライスし、各スライス６、ｏ、ｉ％ＳＤＳ ’ｉ含む
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐｎ ７゜４）で抽出し、
ＭＡＦ−ｃ［活性を測定する。 ＭＡＦ−Ｃ［の定量は、後述するように、マ、ウス−イ
ンターフェロン−ガンマ（ｍ−ＩＦＮ−γ）、ポリミキ
ンンＢの存在下、マウス腹腔浸出マクロファージの腫瘍
細胞障害活性（ＭＡＦ−Ｃｍ活性）を測定することによ
り行った。 ＭＡＦ−ｅＩＩ活性は分子量１４００〜２１００の位置
に検出され、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥｔ、、銀染色する
と、分子量１４００〜２１００の位置に１本のバンドの
み存在することから、得られたＭＡＦ−ｅｌ［が高純度
であることを確認した。 ■ＲＩｆＡＦ−ｃｌＩの確認 本発明で得たＭＡＦ−ｃ■は、ヒト−インターフェロン
−ガンマと相乗的にヒト末梢血由来単球を活性化するこ
とから、ヒトマクロファージ活性化作用を有することを
確認した。 又、本発明のＭＡＦ−Ｃｌｌ がＬＰＳと異なることは
、ＭＡＦ−ｃｌ’［中に含まれるＬＰＳ含量が０．１
ｎｒ／ ｍｌ以下であること、ＬＰＳ作用を十分除去し
うる量の？リミキシンＢ存在下でマクロファージを活性
化することから、明らかである。 〔実施例〕 実施例１ ％願昭６０−２４２７２０号明細書の実施例１に示す方
法で取得したＭＡＦ産生ヒトＴ細胞ハイツリドーマ（２
Ｘ １０’ｃｅｌｌｓ／ｍＡ’ ）を２０ ｔｔｔ／ｍ
ｌのＣｏｎＡを含むｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ
中２４時間培養し、次いで細胞をＰＢＳで３回洗浄し
た。 このＣｏｎＡ活性化Ｈ３−Ｅ９−６細胞（２×１０’
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）をＦｅ２を含まな、いｅｓｓｅｎｔ
ｉａｌｍｅ ｄ ＋ ｕｍ 中７２時間培養した。培養
物を遠心分離後、上溝をベリコンカセットシステム〔日
本ミリポア（株）〕を用いて１００倍に濃縮し、濃縮液
（ＣＳ ） を得た。 Ｃ８のタンパク量（４〜／ｍ７！；タンノやり含有量は
Ｂｉｏ Ｒａｄ社のプロティン アッセイキットにより
定量）の１／２０ｉのアクチナーゼＥ （１０’チロシ
ン単位／２）をＣＳに加え３７℃で２４時間処理した後
、０．１％ＳＤＳを含む１０ｍＭ リン酸バッファー
（ｐ）Ｉ ７．４ ） Ｋ対し透析した。この透析液２
０ ｔＪ をＲ，Ｔ、 Ｓｗａｎｋ及びに、 Ｄ、Ｍｕ
ｎｋｒｅｓの方法に従い、２−メルカゾトエタノール存
在下、尿素（８Ｍ）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ （１ｕｍ
厚）を行った。電気泳動の後、ダルを３酵の切片にスラ
イスし、各スライスを０．１％ＳＤＳ’を含む１０ｍＭ
リン酸パン−ｙ７−（ｐＨ７，４） ０．２ゴで１０時
間抽出し、各抽出液のＭＡＦ−Ｃｍ活性を測定した。 泳動後のダルは、銀染色法によシ染色し、分子ｉは分子
量既知のマーカー ミオグロビン（１７，２００）、ば
オゾロビンＩ 十Ｉｆ （１４，６００）、ミオグロビ
ンＩ（８，２４０）、ミオグロビン■（６，３８０）、
ミオグロビンＩ［Ｉ（２，５６ｏ）よシ求めた検量線か
ら定量した。図１に示すようにＭＡＦ −（：ｍ活性画
分の分子量は１４００〜２１００でおった。図１におけ
る各スライス抽出液のＭＡＦ −（：ｍ活性は、各抽出
液’ｋ ２０．０００倍希釈し、特願昭６０−２４２７
２０号明細書に示す以下の方法により行った。 ＭＡＦ−Ｃｍ活性 Ｍｅｌｔｚｃｒの方法を修正して測定した（Ｍｅｌｔ−
ｚｅｒ、 Ｍ、Ｓ、 ； Ｊ、 Ｉｒｒｍｕｎｏｌ、
１２７１７９（１９８１）：］。ＤＢＡ／２（６〜８週
令、メス）に１０％プロテオースペゾトンプロス（ｐｉ
ｒｃ。 Ｌａｂ、製）１．５１１Ｌｌを腹腔内接種３日後の腹腔
浸出細胞ｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍにサス
ペンド（２ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／コ） １．、その
１００μｔｋｇ６ウエル平底マイクロタイターグレート
にまき、９０分、３７℃でインキュベート後、非接着細
胞（ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ） ２除云
し、ＭＡＦ希釈液、ｍ−ＩＦＮ−ｒ （２０ｕ／ｍｅ）
及びポリミキシ７ Ｂ （Ｓｉｇｍａ社、２５ ｐｔ／
ｍｌ ） ｔ：含むＭＡＦサンプルを加えて４時間イン
キュベートした。上清を除去後 ３Ｈ−チミジンラベル
したＰ８１５（マウス腫瘍細胞）を各ウェルに加え（１
×１０’ｃｅｌｌｓ／ウエル）、４８時間後プレート遠
心機で上清と細胞を分離し、上清の放射活性を液体シン
ナレーションカウンターで測定した。 ＭＡＦ−Ｃｍ活性値Ｃ％）は次式により算出した。 ＭＡＦ−Ｃｍ＝ （Ｓ−Ｃ）／（Ａ−Ｆ）Ｘ１００Ｓ：
サンプル添加系での上清中の放射活性（ｃｐｍ ） Ａ：全放射活性（３Ｈラベル化Ｐ８１５ １Ｘ １０’
ｃｅｌｌｓの放射活性、ｃｐｍ）ｐ ： ５ｐｏｎｔ
ａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ （”Ｈラベル化Ｐ８１
５ １ＸＩＯ’／ウエルを含む ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ２３７℃４８時間
培養した後、遠心分離して得た上清の放射活性、ｃｐｍ
） Ｃ：サンプルの代少に培地全添加した系での上清中の放
射活性（Ｃｐｍ） ダル切片Ａ１３．１４の抽出液を合わせて（以下これ全
ＭＡＦ−Ｃ１試料とする）濃縮後、５Ｄｓ−ＰＡＧＥを
行った結果、同分子量位置に１本のバンドが認められた
。 また、ＭＡＦ−ｃｌ試料中のＬＰＳ含量を、リムルステ
ストワコー（和光紬薬製）を用いて測定′ｎｌ した結果、ＬＰＳ含量は０．１４９／ＩＩ／！以下Ｔ４
ツた。 実施例２ ヒト末梢血リンパ球からパーコールを用いて単球を分離
した。この単球を９６ウエルマイクロタイターグレート
にはりっけ非付着細胞を除去し、実施例１で得たＭＡＦ
−ｃＴＬ試料０−０８Ｖ／ｖ％とヒト組換え型インター
フェロンーガンマ１単位／１／（いずれも最終濃度）を
入れ２４時間活性化し洗浄後、あらかじめ３Ｈ−チミジ
ンでラベルしたＨｅ１ａ細胞（、２Ｘ １０３ｃｅｌｌ
ｓ ／つｘル）を入れ４８時間後の３Ｈ−チミジンのｒ
ｅｌｅａｓｅ テ活性を測定し、活性値ｆ ＭＡＦ−Ｃ
ｉ １ ｄ ａ’ｆ（％）として次式より算出した。 ＭＡＦ−Ｃ１ｄａＹ’％）−（Ｓ−Ｃ）／（Ａ−Ｐ）Ｘ
１００Ｓ：サンプル添加系での上清中の放射活性（ｃｐ
ｍ）Ａ：全放射活性（ｊＢラベル化ａｅｌａ ２ ｘ
１０３ｃｅｌｌｓの放射活性、ｃｐｍ） Ｐ ： ５ｐｏｎｔａｎｅｏｎｓ ｒｅｌｅａｓｅ （
”Ｈラベル化Ｈｅ１ａ２ Ｘ ｌ Ｏ８ｃｅｌｌｓ ／
ウニＡ／ ｆ含むｅｓｓｅｎｔ １−ａｌ ｍｅｄｉｕ
ｍ ２３７℃、４８時間培養した後、遠心分離して得た
上清の放射活性、ｃｐｍ） Ｃ：サンプルの代りに培地を添加した系でのったが、Ｍ
ＡＦ−ＣＩ単独又はインターフェロン単
図面は、Ｃ８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画におけるＭＡＦ−
Ｃｍ活性溶出画分と分子量の関係を示している。 図中の検量線は分子量マーカーによるものである。 ５発明の効果 本発明のＭＡＦ−ｃＩＩは、ゾライミング作用を有する
ＭＡＦと相乗的にマクロファージを活性化し抗肺瘍性マ
クロファージを誘導する新規のリンホカインであり医薬
特に制癌剤としての利用が期待できる。 特許出願人 電気化学工業株式会社 プ゛ル″切片 Ｎｏ。 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６１年特許願第２９６９９２号 ２、発明の名称 マクロファージ活性化因子及びその製造方法３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 ■１００ 東京都千代田区有楽町１丁目４番１号
昭和６２年２月２４日 （発送日） ５、捕・正の対象 明細書 独ではＭＡＦ −ｃｌ ｄａｙ活性を示さなかった。 〔発明の効果〕 本発明のＭＡＦ −ｃ［ｌは、プライミング作用を有す
るＭＡＦと相乗的にマクロファージを活性化し抗腫瘍性
マクロファージを誘導する新規のリンホカインであシ医
薬特に制癌剤としての利用が期待できる。
Ｃｍ活性溶出画分と分子量の関係を示している。 図中の検量線は分子量マーカーによるものである。 ５発明の効果 本発明のＭＡＦ−ｃＩＩは、ゾライミング作用を有する
ＭＡＦと相乗的にマクロファージを活性化し抗肺瘍性マ
クロファージを誘導する新規のリンホカインであり医薬
特に制癌剤としての利用が期待できる。 特許出願人 電気化学工業株式会社 プ゛ル″切片 Ｎｏ。 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６１年特許願第２９６９９２号 ２、発明の名称 マクロファージ活性化因子及びその製造方法３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 ■１００ 東京都千代田区有楽町１丁目４番１号
昭和６２年２月２４日 （発送日） ５、捕・正の対象 明細書 独ではＭＡＦ −ｃｌ ｄａｙ活性を示さなかった。 〔発明の効果〕 本発明のＭＡＦ −ｃ［ｌは、プライミング作用を有す
るＭＡＦと相乗的にマクロファージを活性化し抗腫瘍性
マクロファージを誘導する新規のリンホカインであシ医
薬特に制癌剤としての利用が期待できる。
図面は、Ｃ８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画におけるＭＡＦ
−Ｃｍ活性溶出画分と分子量の関係を示している。図中
の検量線は分子量マーカーによるものである。
−Ｃｍ活性溶出画分と分子量の関係を示している。図中
の検量線は分子量マーカーによるものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒト及びマウスマクロファージに作用し、抗腫瘍性
マクロファージを誘導し、分子量がＳＤＳ−電気泳動下
で１４００〜２１００であることを特徴とするマクロフ
ァージ活性化因子。 ２ ヒトＴ細胞ハイブリドーマを培養し、その培養上清
をタンパク分解酵素で処理し、尿素存在下ＳＤＳ−電気
泳動で分離することによりマクロファージ活性化因子を
取得することを特徴とするマクロファージ活性化因子の
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61296992A JPS63150298A (ja) | 1986-12-13 | 1986-12-13 | マクロフア−ジ活性化因子及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61296992A JPS63150298A (ja) | 1986-12-13 | 1986-12-13 | マクロフア−ジ活性化因子及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63150298A true JPS63150298A (ja) | 1988-06-22 |
Family
ID=17840851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61296992A Pending JPS63150298A (ja) | 1986-12-13 | 1986-12-13 | マクロフア−ジ活性化因子及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63150298A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03107577A (ja) * | 1989-09-20 | 1991-05-07 | Hitachi Ltd | 水車及び水車動翼 |
-
1986
- 1986-12-13 JP JP61296992A patent/JPS63150298A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03107577A (ja) * | 1989-09-20 | 1991-05-07 | Hitachi Ltd | 水車及び水車動翼 |
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