UA72185C2 - Cytochrome p450 monooxygenases - Google Patents

Description

Даний винахід стосується генної інженерії рослин з застосуванням технології рекомбінантних ДНК взагалі, і, зокрема, до ферментів, що приймають участь у біосинтезі ціаногенних глікозидів, та генів, що кодують ці ферменти. Протеїни та гени згідно з винаходом використовують для підвищення поживної цінності або опірності рослин до паразитів.

Ціаногенні глікозиди є основою вторинних рослинних метаболітів у понад 2000 видах рослин. У деяких випадках вони є джерелом НСМ, які можуть зробити рослину отруйною, якщо її вживати як їжу. Наприклад, бульби ціаногенної маніоки (Мапіпої езсшепіа) є одним з найважливіших продуктів харчування у тропічних районах. Ціаногенні глікозиди, присутні у бульбах, можуть викликати ціанідне отруєння людини через недостатню обробку продуктів з маніоки. Серед інших видів рослин, у яких їхня потенційна отруйність при надмірному вживанні у їжу або використанні як кормів для тварин пояснюється ферментним продукуванням

НСМ - біла конюшина (Тгітоїйшт гереп5), сорго (Богдпит бБісоїог), льон (Сіпит и5наїїззітит), триглохінін (Тгідіоспіп тагйіта), квасоля ліма (Рпазеоіи5 Ішпаїи5), мигдаль (Атудааїц5) та насіння абрикоса (Ргипив), вишні та яблуні (МаїЇш5). Токсичні властивості можуть бути знижені шляхом блокування біосинтезу ціаногенних глікозидів у цих рослинах.

Коло основних попередників природних ціаногенних глікозидів обмежується п'ятьма амінокислотами гідрофобних протеїнів: валіном, лейцином, ізолейцином, фенілаланіном та тирозином та однією непротеїновою амінокислотою, циклопентенілгліцином. Ці амінокислоти перетворюють за допомогою серії реакцій на ціангідрини, які зрештою зв'язуються з цукровим залишком. Амигдалін, наприклад, являє собою

О-р-гентіобіозид, а пруназин - О-Д-глюкозид (А)-манделонітрилу. Іншим прикладом ціаногенних глікозидів, що мають ароматичні аглікони, є епімерна пара ціаногенних глікозидів дуррин та таксифілін, які можна знайти у рослинах родів Зогдапит та Тахи5 відповідно. р-гідроксиманделонітрил, наприклад, перетворюють на дуррин (Д-ЮО-глюкопіранозилокси-(5)-р-гідроксиманделонітрил) за допомогою уридиндифосфатглюкозної (ПОРО) глікозилтрансферази. Вважають, що подібні глікозилтрансферази присутні у більшості рослин.

Віціанін та лукумін також є прикладами подібних до амигдаліну похідних дисахаридів. Самбунігрин містить (5)-манделонітрил як аглікон і тому є епімерним до пруназину.

Прикладами ціаногенних глікозидів, що мають аліфатичні аглікони, є лінамарин та лотавстралін, присутні у конюшині, льоні, маніоці та бобах. З детальним аналізом ціаногенних глікозидів та їх біосинтезу можна ознайомитися у роботі Сопп, Майшгміззепзспайеп 66:28-34, 1979, на яку нами робиться посилання.

Шлях біосинтезу ціаногенного глюкозиду дуррину, що походить від тирозину, широко вивчався (НаїКіег еї а), "Суаподепіс діисозідев: (те Бріозупіпеїййс раїйулау апа Ше епгуте 5узієт іпмоїмеа": "Суапіде сотроипав іп Біооду", ММіеу Спіспевіег (Сіра РГошпдайоп Зутрозішт 140), стор.49-66, 1988; НаїКіеєг апа Моїег, Ріапі

Рпузіої. 90:1552-1559, 1989; НаїКієг єї аїЇ, Те 9. ої Віої. Спнет. 264:19487-19494, 1989; НаїКіеєг апа Моїег,

Ріапі Рнузіої. 96:10-17, 1990, НаїКіег апа Моїіег, ТНе 9. ої Віої. Спет. 265:21114-21121, 1990; НаїКієг еї а),

Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 88:487-491, 1991; 5іррезеп еї а!: "Віоспетівзігу апа Віорпувзісв ої суюспготе Р450.

Зігисішге апа Рипсійп, Віоїесппоіодіса! апа Есоіодіса! Азресів", Агоспакоу, А.І. (єд.), 1991, Кос еї аї, вій Іпі.

Сопі. оп Суюспготе Р450, Абрвігасі РІІ.053; апа 5іррезеп еї аї, 8Ій Іпії. Сопі. оп Суюспготе Р450, Арвігасі

РІИ.О16). І-тирозин перетворюють на р-гідрокси-манделонітрил (попередник дуррину) з М- гідрокситирозином, М,М-дигідрокситирозином, (Е)- та (2)-р-гідроксифенілацетальдегідним оксимом та р- гідроксифенілацетонітрилом як проміжними продуктами. У цьому шляху беруть участь дві монооксигенази цитохромів типу Р450. У маніоці використовують подібний шлях, у якому бере участь цитохром-Р450- залежна монооксигеназа, для синтезу лінамарину та лотавстраліну з валіну та ізолейцину відповідно (Косп еї аї, Агспімез ої Віоспетізіу апа Віорпувісв, 292:141-150, 1992). Складний шлях від І-тирозину до р- гідроксиманделонітрилу у Зогдпит бБісоїог показав, що потрібні лише дві багатофункціональні цитохром-

Р4А.50-залежні монооксигенази. Перший фермент, позначений як Р4і5Отув, перетворює тирозин на р- гідроксифенілацетальдегідний оксим. Другий фермент, позначений як Р450ох, перетворює альдоксим на р- гідроксиманделонітрил. З огляду на подібність шляхів біосинтезу ціаногенних глюкозидів у різних рослинах можна зробити загальний висновок, що вищезгаданий шлях включає дві багатофункціональні РА50-залежні монооксигенази, Р450ї та Р4501ї, які перетворюють попередню амінокислоту на відповідний альдоксим, а альдоксим - на відповідний ціангідрин, відповідно. Р.450і є специфічним ферментом, який визначає субстратну специфічність а отже, і тип продукованого глюкозиду, тоді як від Р4А50ї очікують меншої специфічності у перетворенні ряду різних за структурою альдоксимів на відповідний ціангідрин.

Глюкозинолати є гідрофільними, нелеткими тіоглікозидами, які знаходяться у кількох послідовностях дводольних покритонасінних (Стгопдціб5і, "Те Емоїшіоп апа Сіазвійсайоп ої Ріожегіпд Ріапів", Мем Могк

Воїапіса! Сагаеп, Вгопх, 1988). Одночасне існування ціаногенних глюкозинолатів та глюкозидів є взаємно виключним. Найбільше економічне значення глюкозинолатів полягає у їхній присутності в усіх рослинах, які належать до Вгаззісасеае (ряду Саррагаіе5), численні культури яких протягом сторіч людство використовувало для приправ, закусок, салатів, як овочі, так само як і корми та фураж. Згодом рапс (головним чином, Вгаззіса пари5 та Вгаззіса сатревігії) став основною комерційною олійною культурою.

Відомо близько 100 різних глюкозинолатів, які мають таку саму загальну структуру, але відрізняються природою бокових ланцюгів. Глюкозинолати утворюються з протеїнових амінокислот або прямо, або після одноразового або багаторазового розтягування ланцюга (Опаегії! еї а!, Віоспет. ос. Зутр. 38:303-326, 1973). М-гідрокси амінокислоти та альдоксими, які були визначені як проміжні продукти у біосинтезі ціаногенних глікозидів, також служать ефективними попередниками для біосинтезу глюкозинолатів (Кіпаї еї а!, Рпуіоспетівігу 7:745-756, 1968; Маїзицо еї аі!, Рпуоспетівзігу 11:697-701, 1972; Опаєетії, Єшиг. У. Віоспет. 2:61-63, 1967). Цитохром Р4і50,, що використовується у синтезі ціаногенного глікозиду, таким чином, функціонально дуже схожий на відповідний біосинтетичний фермент у синтезі глюкозинолату і тому, найімовірніше, належить до тієї ж родини Р4А50-ферментів. Таким чином, авторами було виділено КкДНК клон з БЗіпарі5 аіра, що кодує РА5О-фермент (ЗЕО ІЮ МО:17) з 5495 ідентичністю з Р45Отув (СУР 79) і каталізує перший етап у біосинтезі глюкозинолатів, яким є утворення альдоксиму з вихідної амінокислоти.

Цей кКДНК клон виявляє приблизно 9095 ідентичність з ЕбТ-послідовністю Агірідорзі5 (Т42902), що чітко вказує на те, що цей фермент цитохром Рі50 значною мірою зберігається у видах, що містять глюкозинолат.

Скорочення складного біосинтетичного шляху для вищеописаних ціангідринів до каталітичної активності лише двох ферментів, цитохром Р4і50ї та Р.іБ5Ої, дозволяє керувати ходом біосинтезу ціаногенних глікозидів у рослинах. Шляхом трансфекції послідовностей генів, що кодують одну або обидві монооксигенази, біосинтетичний шлях для ціаногенних глюкозидів може бути змінений, відновлений, або розпочатий заново.

Зміна або введення біосинтетичного шляху для ціаногенних глікозидів у рослинах відомими спеціалістам способами є дуже цікавими, оскільки ціаногенний глікозид може бути отруйним для комах, акарид та нематод. Отже, зміна, введення або відновлення біосинтетичного шляху для ціаногенних глікозидів у рослинах або окремих тканинах рослин дозволяє зробити рослини неїстівними для комах, акарид або нематод і, таким чином, допомагає зменшити ушкодження врожаю, викликане паразитами. У поєднанні з іншими інсектицидними складовими, такими як ендотоксини Васійй5 (пПигіпдіеп5зі5, можна досягти ще більшого зменшення шкоди для врожаю, якої завдають паразити.

У альтернативному варіанті, послідовності генів, що кодують монооксигенази згідно з винаходом, використовують для конструювання плазмід ДНК, які після трансфекції у рослини, такі як маніока, сорго або ячмінь, що містять ціаногенні глікозиди, видаляють ціаногенні глікозиди, які за нормальних умов продукуються у диких рослинах. Це може бути досягнуто шляхом експресії антисмислових або смислових

РНК або рибозимів, як описано в ЕР-458367-А1, ЕР-240208-А2, О5-5,231,020, УМО89/05852 та УМО90/11682, що інгібуює експресію монооксигеназ згідно з винаходом. Це є дуже цікавим, оскільки, незважаючи на численні спроби, ще досі не вдалося традиційними способами вирощування рослин повністю видалити ціаногенні глікозиди, наприклад, з маніоки або сорго. З іншого боку, було продемонстровано, що підвищена кількість ціаногенних глікозидів в епідермальних клітинах культури ячменю підвищує чутливість до нападів збудників борошнистої роси - грибків Егузірпе дгатіпі5 (Рогтопепві, РІО пезіз, сойціпдеп, 1989; Ібепіпаї! еї аі, Апдем/. Вої. 67:97-106, 1993). Подібний ефект спостерігали у ціаногенному каучуковому дереві Немеа ргазійепвзіз після ураження грибком Місгосусіцв шеї (ерегеї еї аї, Ріапі Рпув5. 90:3-36, 1989) та у льоні, ураженому СоПеїоїгіспит Ійпі (І цаїкКе еї аї, Віоспет. 7. 324:433-442, 1953). У цих прикладах кількісна опірність вищезазначених та інших рослини, коли ціаногенні глікозиди роблять рослину більш чутливою до нападів мікроорганізмів, може бути підвищена шляхом, що запобігає продукуванню ціаногенних глікозидів у таких рослинах. У ячмені ціаногенні глікозиди розташовані в епідермальних клітинах. Експресію антисмислових, смислових або рибозимних послідовностей, таким чином, краще, але не обов'язково стимулювати специфічним до епідермісу промотором.

Присутність ціаногенних глікозидів у рослинах навіть у незначних кількостях також може викликати проблеми з харчуванням через утворення небажаних канцерогенів, як це було продемонстровано на прикладі ячменю. Ячмінний солод, наприклад, містить у малих кількостях ціаногенний глюкозид епігетеродендрин, який у процесі виробництва спиртів з зернових культур може перетворитися на етилкарбамат, який вважають канцерогеном. Останнім часом проводяться пробні досліди щодо обмеження максимально допустимої концентрації етилкарбамату у харчових продуктах, напоях та спиртах, отриманих шляхом ферментації (Роса Спетіса! Мему5 29:33.35, 1988).

У УМ0О95/16041 описано молекулу ДНК, що кодує цитохром Р4і50І-монооксигеназу, яка каталізує перетворення амінокислоти на відповідну М-гідроксиамінокислоту, М,М-дигідроксиамінокислоту та перетворення М,М-дигідроксиамінокислоти на відповідний альдоксим. Вихідну амінокислоту вибирають з групи, яка складається з тирозину, фенілаланіну, триптофану, валіну, лейцину, ізолейцину та циклопентенілгліцину. Молекули ДНК відповідають або природним генам, або їх функціональним гомологам, які виникли в результаті мутації, делеції, зрізання і т. ін., але продовжують кодувати цитохром

Р4А50і-монооксигеназу, здатну каталізувати більше однієї реакції шляху біосинтезу ціаногенних глікозидів.

Монооксигенази в оптимальному варіанті містять єдиний каталітичний центр.

Крім того, у М/О95/16041 описані молекули ДНК, що кодують цитохром Р450и1-монооксигенази, такі як

Раб5бОох 5огдпит бБісоїог() Моепсіп. Вони каталізують перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення нітрилу на відповідний ціангідрин. Каталіз перетворення тирозину на р-гідрокси-фенілацетонітрил двома багатофункціональними Р.і50-ферментами пояснює, чому спрямовуються в одне русло всі проміжні продукти цього перетворення, за винятком (2)-р-гідроксифенілацетальдоксиму.

В субстрат алгоритму, запропонованого для виділення Р45бох, покладено порядок виділення РА5Отув (СУР79, 5іррезеп еї аї, Ргос. Май. Асай сі. ОБА 91: 9740-9744, 1994) з сорго. При такому підході діетиламіноетилсефарозна іонообмінна колонка служить для зв'язування РА50-ферментів, причому жовті пігменти у пробі не зв'язуються. Видалення пігментів служить для досягнення подвійної мети. Воно є передумовою для зв'язування РА450-ферментів з наступними колонками і дозволяє оцінити вміст РА5О шляхом спектрометрії (зв'язування монооксиду вуглецю та субстрату). Даний винахід показує, що Р45бох, навпаки, виявляє низьку спорідненість до зв'язування з діетиламіноетилсефарозною колонкою і значною мірою відновлюється у погонній та промивальній фракціях. Для відділення активності Рі45Оох від жовтих пігментів за допомогою фази на основі тритону Х-114 застосовують процедуру розділення. При оптимальному використанні від 0,6 до 1956 тритону Х-114 виявляють, що Р450ох розподіляється по обох фазах, на відміну від Р45Отун, який відновлюється у багатій на детергент верхній фазі. Зі збільшенням концентрації тритону Х-114 до 695 більша частина Р450ох відновлюється з бідної на детергент нижньої фази, тоді як жовті пігменти перебувають у верхній фазі. Недолік використання 695 тритону Х-114 полягає у посиленні перетворення Р450ох на його денатуровану Р.4.20-форму. Цей факт використовується у даному винаході для очищення на ранній стадії РА5О-монооксигенази, такої як Р4і45бох, з метою клонування генів, що кодують монооксигенази, та стабільної трансформації рослини з генами, що кодують монооксигеназу.

Виділення Р4і50ох та визначення часткових амінокислотних послідовностей дозволяє конструювати олігонуклеотидні зонди й виділяти КДНК, що кодують Р45бох. Однак у даному разі клонування здійснювали за іншим принципом.

Винахід стосується, насамперед, молекул ДНК, що кодують цитохром Ра5би-монооксигенази, які каталізують перетворення альдоксиму на нітрил, та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. В оптимальному варіанті альдоксим є продуктом перетворення амінокислоти, вибраної з групи, яка складається з тирозину, фенілаланіну, триптофану, валіну, лейцину, ізолейцину та циклопентенілгліцину або амінокислоти, вибраної з групи, що складається з І-тирозину, І-валіну та І1- ізолейцину, каталізованих Р450І-монооксигеназою, як описано у М/О095/16041. Молекули ДНК згідно з винаходом відповідають або природним генам, або їхнім гомологам, які виникли в результаті мутації, делеції, зрізання і т. ін., але продовжують кодувати цитохром Р.і5бі-монооксигеназу, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та наступне перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. Монооксигенази згідно з винаходом каталізують більше однієї реакції шляху біосинтезу ціаногенних глікозидів і в оптимальному варіанті містять єдиний каталітичний центр.

Ферменти цитохрому Р4501ї можуть бути присутні у більшості живих організмів. Молекули ДНК згідно з даним винаходом, що кодують Раі50і-монооксигенази, структурно та функціонально є подібними до молекул ДНК, які одержують з різних рослин, які продукують ціаногенні глікозиди. В оптимальному варіанті винаходу молекули ДНК гібридизують з фрагментом молекули ДНК з нуклеотидною послідовністю, представленою у 5ЕО ІЮ МО:1. Вищезгаданий фрагмент має довжину понад 10 нуклеотидів, а в оптимальному варіанті - понад 15, 20, 25, 30 або 50 нуклеотидів. Чинники, які впливають на стабільність гібридів, визначають суворість дотримання умов гібридизації і можуть вимірюватися залежністю від температури плавлення Тт утворених гібридів. Розрахунки Тт описані у багатьох працях. Наприклад,

Коллер зі співавторами (Кеїїег еї а!) описує у роботі "ОМА Ргорез: Васкдгоцпа, Арріїсайоп5, Ргоседигев",

МастіМйап Рибіїєпег5 ЦЯ, 1993, на сторінках з 8 по 10, чинники, на які слід зважати при розрахунках значень

Тт для реакцій гібридизації. Молекули ДНК згідно з даним винаходом гібридизують з фрагментом 5ЕО ІЮ

МО:1 при температурі, на 30"С нижчій за розраховану Тт гібриду, який має бути утворений. В оптимальному варіанті їх гібридизують при температурах, на 25, 20, 15, 10, або 57С нижчих за розраховану Тт.

Для маніпуляції генами з використанням технології рекомбінантних ДНК молекула ДНК згідно з винаходом, крім гена, що кодує монооксигеназу, може включати ДНК, яка дозволяє здійснювати реплікацію та відбір ДНК згідно з винаходом у мікроорганізмах, таких як Е. соїї, Васіїш5, Адгорасіегічт, Зігерютусев або у дріжджах. Вона також може включати ДНК, яка дозволяє експресувати й відбирати гени монооксигенази у гомологічних або гетерологічних рослинах. Такі послідовності включають, крім інших, гени, використання кодонів яких було пристосоване до використання кодонів гетерологічних рослин, як описано у М/О93/07278; генів, які забезпечують резистентність до неоміцину, канаміцину, метотрексату, гігроміцину, блеоміцину, стрептоміцину або гентаміцину, до аміноетилцистеїну, гліофосфату, сульфонілсечовини або фосфінотрицину; до маркерних генів, таких як галактозидаза; до її природного промотора та сигналів термінації транскрипції; до промоторних елементів, таких як 355 та 195 Самм промотори, або тканинно-специфічних рослинних промоторів, таких як промотори, специфічні до коріння (описані, наприклад, в ЕР-452269-А2, УУОУ1/13992, |И5-5,023,179), зеленого листя, таких як фосфоенолпіруваткарбоксилаза (РЕРС) кукурудзи, серцевини або пилку (описані, наприклад, у

УУ093/07278) або індукованих рослинних промоторів (ЕР-332104); а також до гетерологічних сигналів закінчення транскрипції.

Даний винахід також стосується Р450и-монооксигеназ, які каталізують перетворення альдоксиму на нітрил і перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. В оптимальному варіанті винаходу монооксигенази очищають і використовують для створення моноклональних або поліклональних антитіл, які специфічно зв'язуються з монооксигеназами. Зокрема, цитохром Р45б0ох, що має молекулярну масу 55КкДа, як визначено електрофорезом з додецилсульфатом натрію в поліакриламідному гелі (5ЗО5-РАСЕ), виділяють з Хогапит бБісоог (І) Моепсп. Його амінокислотну послідовність представлено у ЗЕО ІЮ МО:2.

Каталітичні властивості Р4а5О0ох нагадують активність цитохрому Р450, яку спостерігають у мікросомах з печінки щура (ОеМавіег еї аї, У. Огд. Спет. 5074-5075, 1992). Характеристика цитохрому Р45О0ох та інших членів родини цитохромів Р45Оох полягає у тому, що дегідратація альдоксиму до відповідного нітрилу залежить від присутності відновленого нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату (МАОРН), але цю залежність у деяких випадках можна подолати шляхом додавання дитіоніту натрію або інших відновників.

З усіх відомих послідовностей для ферментів цитохромів РА4А5О0 цитохром Р450ох виявляє найвищу ідентичність амінокислотної послідовності (4495) до ферменту авокадо СУР7ТА1Т і меншу за 4095 ідентичність до усіх інших членів родини СУР71. Авокадо не продукують ціаногенні глікозиди, а СУР71А1 не каталізують перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. Таким чином, згідно з даним винаходом може бути визначена родина цитохром Ра5О- монооксигеназ, члени якої каталізують перетворення альдоксиму на відповідний ціангідрин і мають 4095 або вищу ідентичність амінокислотної послідовності до-послідовності цитохрому Р45бох. В оптимальному варіанті ідентичність амінокислотної послідовності до цитохрому Рі45бох є вищою за 5095 або вищою за 5595.

Було запропоновано позначити Р450ох перший член нової СУР71 підродини (СУР71Е1), оскільки він групується з іншими СУР71 послідовностями у дендрограмах, на яких показано порядок послідовностей у графічному виконанні. Взагалі, згідно з положеннями номенклатурного комітету, цитохром Р450, щоб його можна було віднести до нової СУР родини, повинен мати менш, ніж 4095 ідентичність до послідовності на амінокислотному рівні, а послідовності, які є ідентичними більше, ніж на 5595, відносять до однієї підродини.

При визначенні порядку послідовностей розглядають не лише ідентичність послідовностей, але й подібність послідовностей, наприклад, однаковий загальний заряд або схожу гідрофобність/гідрофільність окремих амінокислот. За такого порядку Р45Оох групується з іншими СУР7-послідовностями і, таким чином, має бути включеним до СУР71-родини, незважаючи на те, що він виявляє менш, ніж 4095 ідентичність до усіх інших членів СМУР71-родини, за винятком СМУР7ТА71 з авокадо. Оскільки він виявляє низьку ідентичність послідовності до інших членів родини, то він має бути віднесений до нової підродини. Усі інші члени СУР71- родини належать до неціаногенних видів і їхня функція невідома. Каталітичні властивості раніше ідентифікованих Р450, що належать до СМР71-родини, залишаються нез'ясованими. Вважають, що вони беруть участь у гідроксилюванні терпенів. Про жоден з них не згадується, що він використовує оксими як субстрат, або що він є багатофункціональним і перетворює альдоксими на нітрили та ціангідрини.

Інший варіант втілення даного винаходу пов'язаний зі способом приготування кКДНК, що кодує цитохром

РабБО-монооксигеназу, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. Він включає

(а) виділення та розчинення мікросом з рослинної тканини, які продукують ціаногенний глікозид, (б) очищення цитохром Р450-монооксигенази, (в) вироблення антитіл проти очищеної монооксигенази, (у) зондування бібліотеки експресії КДНК рослинної тканини, що продукує ціаногенний глікозид, вищезгаданим антитілом, і (д) виділення клонів, які експресують монооксигеназу.

Мікросоми можуть бути виділені з тканин рослин, які виявляють високу активність ферментативної системи, що відповідає за біосинтез ціаногенного глікозиду. Ці тканини можуть бути різними у різних видів рослин. Оптимальним джерелом мікросом є щойно ізольовані паростки, зібрані протягом 1 до 20 днів, краще - від 2 до 10 днів, і найкраще - від 2 до 4 днів після проростання. Кращими вважають етіольовані сіянці рослин, що продукують ціаногенні глікозиди, але можна використовувати й сіянці, пророщені при світлі. Після виділення мікросоми розчиняють у буфері, що містить один або кілька детергентів.

Оптимальними детергентами є КЕМЕХ 690 (9. Гогепігеп А/5, Кмізідага, Оептагк), відновлені тритон Х-100 (АТХ-100), тритон Х-114 та СНАР5.

Цитохром Р.і50-монооксигенази можуть бути очищені з застосуванням стандартних технологій очищення протеїнів, таких як ультрацентрифугування, фракціоноване осадження, діаліз, електрофорез додецилсульфатом натрію в поліакриламідному гелі (5О5-РАСЕ) та колонкова хроматографія. Серед інших можливих колонок - іоннообмінні колонки, такі як діетиламіноетилсефарозна (ДЕАЕ), колонки з реактивами, такі як колонка з агарозою марки Сірасгоп уеПом/ 3, колонка з агарозою марки Сірасгоп рісе та колонка з агарозою марки Кеасіїме гей 120, та фільтраційні колонки, такі як колонка з гелем марки Зерпасгу! 5-1000.

Вміст цитохрому Р450 в окремих фракціях визначають по різниці спектрів монооксиду вуглецю. Особливою проблемою під час виділення Р450ох, що також утруднює визначення кількості Р45Оох, є його взаємне змішування з жовтими пігментами під час початкових етапів очищення замість зв'язування на іонообмінній колонці, яку зазвичай використовують для очищення Рі450-ферментів, наприклад, Р45Отув. Присутність жовтих пігментів перешкоджає зв'язуванню Р45б0ох з багатьма різними матеріалами на колонці і, таким чином, являє головну перешкоду на шляху до подальшого очищення. Щоправда, відокремлення Р4і5Оох від жовтих пігментів може бути здійснене при температурі, що викликає розділення фаз тритону Х-114. Цей спосіб був оптимізований щодо відновлення Р450ох та видалення пігментів шляхом підвищення кількості тритону Х-114. При 69, що у шість-десять разів перевищує рівень, використовуваний для інших Р4А50, приблизно 8095 активної частини Рі450ох надходить до прозорої нижньої фази. Крім видалення жовтих пігментів, більшого очищення на цьому етапі досягти майже не вдається. Однак при застосуванні Р45бох, який містить нижню фазу, на колонці з Сірасгоп Брісе, градієнтне елюювання солі надавало майже однорідний РаБбох, про що свідчила присутність основної забарвленої по Кумасі смуги з явною молекулярною масою 55кДа у тих фракціях, які при відновленні виявляли активність РА5Оох.

Виділений Р450ох давав спектр монооксиду вуглецю з піком абсорбції 450нм, але відносно велика частина виділеного ферменту була присутня у формі денатурованого Р420. Безперервне перетворення

Ра4б5Оох на денатуровану форму Р4і20 заважало кількісно визначити загальний вміст та специфічну активність Р45Оох на різних етапах процесів виділення. До того ж, специфічна активність Р450ох залежить від інгібуючого впливу, який справляють різні використовувані детергенти. Загальний вміст РА5БО у фракціях, таким чином, має вважатися визначеним напівкількісно.

Очищені протеїни використовують для виявлення антитіл, наприклад, у мишей, кіз, баранів, кролів або курчат після введення. Від 5 до 50мкг протеїну вводять кілька разів протягом приблизно 14-денних періодів.

В оптимальному варіанті винаходу вводять від 10 до 20Омкг від 2 до б разів протягом 14-денних періодів, ін'єкції здійснюють у присутності або за відсутності ад'ювантів. Імуноглобуліни очищають від антисироваток, і селезінку використовують для гібридного злиття, як описано у роботі Напом апа Гапе, "Апііродіе5: А

Іарогаюгу Мапиа!", Соїа Бргіпд Нагброг І арогаїогу, Соїй бргіпд Нагброг, МУ, 1988, на яку авторами робиться посилання. Антитіла, що специфічно зв'язуються з цитохром Ра5бі-монооксигеназою, також використовують у вирощуванні рослин для виявлення рослин, які у змінених кількостях продукують цитохром Р450-монооксигенази, а, отже, й ціаногенні глікозиди.

Ці способи приготування бібліотек КДНК рослинних тканин широко описані у роботі Затогоок еї аї,

Моїесшіаг сіопіпд: А Іарогаїгу тапиаї!. Соїа 5ргіпд Нагрог ІГарогаюгу Ргез5, Соїй Зргіпд Нагброг, МУ, 1989, на суттєву частину якої, що стосується бібліотек КДНК, авторами робиться посилання. ПоліА" РНК виділяють з рослинної тканини, яка виявляє високу активність ферментативної системи, що відповідає за біосинтез ціаногенних глікозидів. Ці тканини можуть бути різними у різних видах рослин. Оптимальною тканиною для виділення поліА" РНК є тканина зі щойно ізольованих паростків, зібраних протягом від 1 до 20 днів, краще - від 2 до 10 днів і найкраще - від 2 до 4 днів після проростання. Одержані бібліотеки КДНК зондують антитілами, які специфічно зв'язують цитохром Р4501і-монооксигеназу, і виділяють клони, що експресують монооксигеназу.

Альтернативний спосіб приготування кКДНК, що кодує цитохром Р4А501і-монооксигеназу, включає (а) виділення й розчинення мікросом з рослинної тканини, що продукує ціаногенні глікозиди, (б) очищення цитохром Р450и-монооксигенази, (в) одержання повної або часткової протеїнової послідовності монооксигенази, (у конструювання олігонуклеотидів, які визначають ДНК, що кодує від 4 до 15 амінокислот вищезгаданої протеїнової послідовності монооксигенази (д) зондування бібліотек КДНК рослинної тканини, що продукує ціаногенний глікозид з вищезгаданими олігонуклеотидами, або молекул ДНК, одержаних від ампліфікації кКДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (РСК) з використанням вищезгаданих олігонуклеотидів, і (є) виділення клонів, які кодують цитохром Р450и-монооксигеназу.

Амінокислотні послідовності внутрішніх пептидів, що виникли в результаті розщеплення протеазою, можуть бути одержані стандартними способами, такими як розщеплення за Едманом. Олігонуклеотиди, які визначають ДНК, що кодує часткові протеїнові послідовності монооксигенази згідно з винаходом, одержують шляхом зворотної трансляції частин протеїнової послідовності згідно з генетичним кодом.

Протеїнові послідовності, які кодуються ДНК послідовностями низького виродження, є оптимальними для зворотної трансляції. Вони мають довжину від 4 до 15, краще - від 5 до 10 амінокислот. У разі необхідності кодони, які використовують в олігонуклеотидах, можуть бути пристосовані для використання кодонів рослинного походження (Мигтгау еї аї, Мисіеіс Асіа5 Кезеагсп 17:477-498, 1989). Одержані олігонуклеотиди використовують для зондування бібліотеки кКДНК, як описано у роботі Затьгоок еї аї, (МоїІесшіаг сіопіпд: А

Іарогаюгу тапиаї. Соїа бргіпд Нагброг І арогаїгу Ргез5, Соїа бргіпд Нагрог, МУ, 1989) для клонів, які здатні до спарювання основ з вищезгаданими олігонуклеотидами. Або ж олігонуклеотиди використовують у полімеразній ланцюговій реакції, методологія якої відома спеціалістам, з рослинною кКДНК як матрицею для ампліфікації. У цьому випадку одержані продукти ампліфікації використовують для зондування бібліотек

КДНК. Виділяють клони, що кодують цитохром Р4501-монооксигенази.

Альтернативний спосіб клонування генів базується на створенні бібліотеки генів, що складається з векторів експресії. Таким чином, аналогічно до вищеописаних способів, геномні ДНК, краще - кДНК, спочатку виділяють з клітин або тканин, здатних до експресії Р4А501-монооксигенази, а потім сплайсують у відповідний вектор експресії. Бібліотеки генів, утворені таким чином, після цього можуть бути піддані скринінгові з застосуванням відповідних засобів, в оптимальному варіанті - антитіл. Відбирають клони, що включають як інсерт потрібний ген або принаймні частину гена.

Як альтернатива, молекули кДНК, що кодують цитохром РаБ5О-монооксигеназу, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин, можуть бути одержані шляхом (а) створення вироджених олігонуклеотидів, що охоплюють від З до 10 амінокислот збережених ділянок цитохромів А-типу, (б) використання вироджених олігонуклеотидів для ампліфікації одного або кількох специфічних до цитохромів фрагментів ДНК з застосуванням полімеразної ланцюгової реакції, (в) скринінг бібліотеки КДНК за допомогою специфічних до цитохромів фрагментів для одержання КкДНК повної довжини, (г) експресії КДНК повної довжини у мікробі-хазіїні, (д) ідентифікація хазяїв, що екс пресують цитохром Р450-монооксигеназу, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин, і (е) очищення клонованоїДНК вищезгаданого хазяїна.

Повну ДНК з бібліотеки ДНК, в оптимальному варіанті - з бібліотеки кКДНК, використовують як матрицю у полімеразній ланцюговій реакції (РСК) з одним або кількома праймерами, що представляють збережені ділянки цитохромів А-типу (ЮОиг5і еї аі, Огид Меїароїїзт апа Огид ІпбФегасіоп5 12: 189-206, 1995), які вважають похідними від спільного попередника - рослинного цитохрому Р4і50. На основі порядку послідовностей цитохромів Р450 А-типу можуть бути визначені три добре збережені ділянки на амінокислотному рівні: ділянка 1 (МОКЕХ(/АУ)К, ділянка 2 ЕХРЕРКЕ та ділянка З РЕОХОКЕХСХО. Можуть бути сконструйовані праймери, що містять вироджений інозин (І), кожен з яких включає від З до 10, в оптимальному варіанті - приблизно 5 або 6 амінокислот двох відповідних ділянок. Полімеразну ланцюгову реакцію (РСК), наприклад, здійснюють у три послідовні етапи. Етап 1 з використанням праймера, який включає спільну ділянку ЕХРЕКЕ, та стандартного Т/ праймера, який включає Т7 промотор у векторі бібліотеки, ампліфікує КДНК, які походять від МРНК, що кодують цитохром Р450 А-типу. Другий етап полімеразної ланцюгової реакції (РОК) з використанням праймерів, що включають дві спільні ділянки, та ампліфікованих ДНК з етапу 1 як матриці, в оптимальному варіанті ампліфікує фрагмент з 100п.н., який після цього лігують у рВінезсгірі і секвенують. Ген-специфічні праймери створюють на основі одержаної

ДНК послідовності. їх використовують на етапі З у поєднанні з праймером, комплементарним з полі-А хвостом (праймером ЯТ-М) та ДНК толімеразної ланцюгової реакції (РОК) з етапу 1 як матрицею для ампліфікації, фрагменту ДНК приблизно у 500п.н.,, який використовують як ген-специфічний зонд для виділення кКДНК повної довжини. Така полімеразна ланцюгова реакція характерна не лише для виділення

Р4а5БоОох, а є спільною для виділення цитохрому Р450 А-типу. Одержані цитохроми Р450 А-типу мають бути гетерологічно експресовані для визначення їхньої функції.

Клони кДНК або продукти полімеразної ланцюгової реакції (РСЕ), приготовані як описано вище, або їхні фрагменти можуть бути використані як зонди гібридизації у процесі ідентифікації подальших ДНК послідовностей, що кодують протеїновий продукт, який виявляє активність Р450иі-монооксигенази з гомологічного або гетерологічного органічного джерела, такого як грибки або гетерологічні рослини.

Придатним джерелом є тканина з рослин, що містять ціаногенні глікозиди.

Вищезгадані клони або продукти полімеразної ланцюгової реакції (РСЕ) також можуть бути використані як маркер поліморфізму рестрикційних фрагментів (КР Р) для визначення, наприклад, розташування гена цитохром Р450-монооксигенази або тісно зв'язаної особливості у рослинному геномі, або для вирощування за допомогою маркера (ЕР-А 306139; УМО89/07647І.

Застосовуючи способи, описані вище, можна виділити різні гени, які кодують Р4501і-монооксигеназу.

Вищезгадані гени використовують згідно зі способом продукування очищеної рекомбінантної цитохром

РабО-монооксигенази, яка каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин; цей спосіб включає (а) конструювання гена, що кодує вищезгадану монооксигеназу, яка має бути експресована в організмі- хазяїні, такому як бактерії, дріжджі або клітини комах, (б) перетворення вищезгаданого організму-хазяїна обробленим за допомогою інженерії геном, і (в) виділення протеїну з організму-хазяїна або супернатанту культури.

В оптимальному варіанті винаходу цей спосіб використовують для одержання очищеного рекомбінантного цитохрому Р45бох або цитохрому Р45О0ох, який було змінено традиційними способами генної технології. В оптимальному варіанті зміни ведуть до посиленої експресії рекомбінантного протеїну або до зміненої субстратної специфічності.

Молекули ДНК згідно з винаходом використовують для одержання трансгенних рослини, резистентних до комах або акарид. Конкретні приклади, які не є вичерпними, подані у Таблиці В МУО95/16041 (стор.45), так само, як і нематоди, описані нижче. Для зручності лише вищезгадана Таблиця не повторюється у цьому описі, але вона згадується авторами шляхом посилання на опис з М/095/16041. В оптимальному варіанті трансгенні рослини є резистентними до СоіІеорієга та І ерідоріеєга, таких як блощиця довговуса західна (Оіабгоїїса мігдітега мігдітега), блощиця довговуса північна (Оіаргоїїса Іопдісогпі5 рагрегі), блощиця довговуса південна (Оіабгоїїса ипадесітрипсіаїа ПпПомагії), совка бавовняна, метелик кукурудзяний, блощиця кукурудзяна, рожевий коробочковий черв'як та совка.

Нематоди є основними тваринними паразитами рослин, що завдають сільському господарству втрат у світовому масштабі, які оцінюються у 5100 мільярдів щороку. Деякі нематоди викликають у місцях живлення зміни рослинних клітин і живляться на одному місці протягом кількох годин або значно довше. Серед них види, які належать до родів МеіІоідодупе Сіородега, Неїегодега, Коїуіепспии5, Туїепспии5, Массорив,

Хірпіпета, І опдідогив, Рагаіопдідогив, Стурподега; ТгорноїуІепспцив, Нетісусііорпога, СтісопетеїПа, Мегпиив та Неїїосоїуіепспи5. Роди, які живляться протягом більш обмеженого часу на одному місці, включають

РгаїуІєпспив, Найорпоїив5, Нігзсптаппієїа, Тісподогив, Рагайіснподогиз, Ойуіепспив5, АрПпеїІепспоідев,

ЗзсшеїПопета та ВеіІопоїаітив5.

Трансгенні рослини включають ДНК, що кодує нові монооксигенази, які каталізують перетворення вищезгаданого альдоксиму на нітрил та перетворення вищезгаданого нітрилу на відповідний ціангідрин. До того ж, трансгенні рослини можуть включати монооксигеназні гени, генетично зв'язані з генами резистентності до гербіцидів. Трансгенні рослини в оптимальному варіанті є однодольними або дводольними рослинами. Конкретні варіанти подано у Таблиці А з УУО95/16041 (стор.33-44). Для зручності лише вищезгадана Таблиця не повторюється у цьому описі, але вона згадується авторами з посиланням на опис із М/095/16041. В оптимальному варіанті їх вибирають з групи, що складається з кукурудзи, рису, пшениці, ячменю, сорго, бавовни, сої, соняшника, злакових трав, олійного рапсу, цукрового буряка, брокколі, цвітної капусти, качанної капусти, огірків, цукрової кукурудзи, редьки дайкон, репав, салату, дині, перцю, гарбуза столового, томатів та кавуна.

Рослини отримують способом, який включає (а) введення у рослинну клітину або рослину тканину, яка може бути регенерована до цілої рослини,

ДНК, що включає ген, який може бути експресований у цій рослині, що кодує монооксигеназу згідно з винаходом, (6) відбір трансгенних рослин.

Подібним чином молекули ДНК згідно з винаходом використовують для одержання трансгенних рослин, що експресують антисмислові або смислові РНК або рибозими, призначені для генів ендогенної РА50О- монооксигенази. Експресія цих молекул у трансгенних рослинах послаблює експресію цитохром Р4А50и- монооксигенази. Такі рослини виявляють поліпшену стійкість до хвороб або поживну цінність завдяки зниженій експресії ціаногенних глікозидів. Такі рослини можуть бути одержані способом, який включає (а) введення у рослинну клітину або тканину, яка може бути регенерована до цілої рослини, ДНК, що кодує смислову РНК, антисмислову РНК або рибозим, експресія якого послаблює експресію цитохром

Р45О-монооксигенази, і (6) відбір трансгенних рослин.

Існує багато ефективних способів введення ДНК у рослинні клітини, які базуються на використанні векторів перенесення генів або на способах прямого перенесення генів.

Згідно з одним з можливих способів інсерції генної послідовності до клітини застосовують інфікування рослинної клітини бактерією Адгорасієегцт іштеїасіеп5 та/або Адгорасіегішт гпігодепе5, яку було перетворено вищезгаданою послідовністю гена. Трансгенні рослинні клітини після цього культивують у відповідному відомому спеціалістам культуральному середовищі для формування з них паростків та коріння, а зрештою, і цілої рослини.

До даного винаходу належить так зване перетворення листових дисків з використанням Адгобасіегійт (Ногїесп єї аїЇ, Зсіепсе 227:1229-1231, 1985). Стерильні листові диски з придатних рослин інкубують з клітинами Адгобрасіегішт, що включають одну з химерних генних послідовностей згідно з винаходом, а потім переносять у або на відповідне живильне середовище. Особливо придатними, а отже, й оптимальними у межах даного винаходу є І 5-середовища, затвердлі після додавання агару й збагачені одним або кількома традиційними регуляторами росту рослин, головним чином, вибраними з групи ауксинів, що складається з снафтилоцтової кислоти, піклораму, 2,4,5-трихлорфеноксиоцтової кислоти, 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти, індол-З-бутирової кислоти, індол-З-молочної кислоти, індол-3-сукцинової кислоти, індол-3-оцтової кислоти та р-хлорфеноксиоцтової кислоти, і з групи цитокінінів, що складається з кінетину, б-бензиладеніну, 2-ізопентеніладеніну та зеатину. Оптимальна концентрація ауксинів та цитокінінів становить від 0,1мг/л до 10мг/л.

Після інкубування протягом кількох днів, в оптимальному варіанті - після інкубування протягом 2-3 днів при температурі від 207"С до 40"С, краще - від 23"С до 35"С і найкраще - при 25"С їі при дифузному освітленні листові диски переносять до відповідного середовища для пророщення. Особливо придатним для відбору трансформантів є І 5-середовище, що не містить ауксину, але містить цитокінін і до якого було додано селективну речовину. Культури тримають при світлі й переносять до нового середовища з відповідними інтервалами, в оптимальному варіанті - з інтервалами в один тиждень. Зелені паростки, що розвиваються, відрізають і культивують далі у середовищі, яке викликає формування у паростків коріння.

Особливу перевагу згідно з даним винаходом віддають І З-середовищу, яке не містить ауксину або цитокініну, але до якого було додано селективну речовину для відбору трансформантів.

Крім опосередкованого Адгобрасіегішт перетворення, згідно з даним винаходом можливе застосування способів прямого перетворення для інсерції генної послідовності згідно з винаходом у рослинний матеріал.

Наприклад, генетичний матеріал, що міститься у векторі, може бути вставлений прямо у рослинну клітину, наприклад, з застосуванням суто фізичних процедур, наприклад, шляхом мікроїін'єкції з використанням мікропіпеток тонкого волочіння (Мешипацз еї аї, Тпеогеїїса! апа Арріїеєй Сепеїїсв 74:363-373, 1987), електропорації (ОС'Найшіп еї аї, Тпе Ріапі Сеї! 4:1495-1505, 1992; УМО92/09696) або, в оптимальному варіанті, бомбардування клітин мікрочастинками, вкритими перетворюючою ДНК (МісгоргоїесшШе

Вотбрагатепі"; Уапд еї а. Ріапі МоІесцаг Віоіоду 11:433-439, 1988; Согаоп-Катт еї аї, ТНе Ріапі Сеї! 2:603- 618, 1990; МеСаре еї аї, Віо/ТесппоЇоду 11:596-598, 1993; Спгізіои єї, Ріапі Рпузіої!. 87:671-674, 1988; Коліє! еї аї, Віоїтесппоїоду 11: 194-200, 1993). Крім того, рослинний матеріал, який має бути перетворений,

необов'язково піддають попередній обробці осмотично активною речовиною, такою як цукроза, сорбіт, поліетиленгліколь, глюкоза або маніт.

Серед інших можливих способів прямого перенесення генетичного матеріалу у рослинну клітину - обробка протопластів з застосуванням процедур, які змінюють плазматичну мембрану, наприклад, обробка поліетиленгліколем, теплова обробка або електропорація, або поєднання цих процедур (ЗПШНО еї аї,

Віоїтесппоіоду 3:1099-1103, 1985).

Ще один спосіб прямого введення генетичного матеріалу у рослинні клітини, який базується на суто хімічних процедурах і який дозволяє здійснювати перетворення дуже ефективно і швидко, описано у роботі

Медгийи еї а, Ріапі МоіІесшіаг Віоіоду 8:363-373, 1987.

Також придатним для перетворення рослинного матеріалу є пряме перенесення генів з застосуванням котрансформації (Зспоспег еї аї, Віотесппоїоду 4:1093-1096, 1986).

Поданий вище як приклад перелік можливих способів перетворення не претендує на повноту і аж ніяк не вичерпує предмету винаходу.

Описані вище генетичні властивості, надані шляхом інженерії трансгенному насінню та рослинам, передаються через статеве розмноження або вегетативний ріст і можуть, таким чином, зберігатися й передаватися потомству. Взагалі, для вищезгаданого збереження й передачі застосовують традиційні сільськогосподарські методики, розроблені спеціально для конкретних цілей, таких як оранка, сівба або збір врожаю. Можуть бути застосовані також спеціальні технології, такі як гідропоніка або вирощування у теплицях. Оскільки вирощувані культури є вразливими до нападів та шкоди, якої завдають комахи або інфекції а також до бур'янів, то вживають заходи для контролю над бур'янами, хворобами рослин, комахами, нематодами та іншими негативними чинниками з метою поліпшення врожайності. Серед них - механічні заходи, такі як обробка грунту або видалення бур'янів та інфікованих рослин, а також застосування агрохімікатів, таких як гербіциди, фунгіциди, гаметоциди, нематициди, регулятори росту, агенти визрівання та інсектициди.

Корисні генетичні властивості трансгенних рослин та насіння згідно з винаходом можуть також використовуватися у вирощуванні рослин, яке має на меті розвиток рослин з такими поліпшеними властивостями, як стійкість до паразитів, гербіцидів або стресів, підвищена поживна цінність, підвищена врожайність або поліпшена структура, що зменшує втрати від полягання або осипання. Різні етапи розведення характеризуються чітко визначеним втручанням людини, таким як відбір ліній для схрещування, спрямування запилення батьківських ліній або відбір відповідного потомства. Залежно від потрібних властивостей вживають різні заходи вирощування. Подібні технології спеціалістам добре відомі і включають, крім інших, гібридизацію, інбридинг, зворотне схрещування, багатолінійне розведення, змішування сортів, міжвидове схрещування, анеуплоїдні технології і т. ін. Способи гібридизації також включають стерилізацію рослин для одержання чоловічих або жіночих стерильних рослин механічними, хімічними або біохімічними засобами. Перехресне запилення чоловічих стерильних рослин пилком різних ліній гарантує, що геном чоловічих стерильних і жіночих фертильних рослин рівномірно набуває властивостей обох батьківських ліній. Таким чином, трансгенне насіння та рослини згідно з винаходом використовують для вирощування поліпшених рослинних ліній, які, наприклад, підвищують ефективність традиційних способів, таких як обробка гербіцидами або пестицидами, або дозволяють обходитися без вищезгаданих способів завдяки своїм зміненим генетичним властивостям. Як альтернатива, можуть бути одержані нові культури з поліпшеною стійкістю до стресів, які завдяки їхньому оптимізованому генетичному "обладнанню", дають врожай кращої якості, ніж продукти, не здатні переносити несприятливі умови розвитку.

У виробництві насіння якість та рівномірність проростання насіння є суттєвими характеристиками продуктів, тоді як якість та рівномірність проростання насіння, що збирається й продається фермерами, значення не має. Оскільки важко тримати культуру окремо від інших культур та насіння бур'янів, контролювати хвороби насіння та одержувати насіння з добрим проростанням, виробниками, що мають досвід у вирощуванні, зберіганні й продажу чистого насіння, були розроблені досить широкі й чітко означені методи виробництва насіння. Таким чином, серед фермерів є звичною купівля сертифікованого насіння, яке відповідає конкретним стандартам якості, замість використання насіння, зібраного з власного врожаю.

Матеріал для розведення, який має використовуватися як насіння, зазвичай обробляють захисним покриттям, яке включає гербіциди, інсектициди, фунгіциди, бактерициди, нематициди, молюскіциди або їхні суміші. Традиційно застосовувані захисні покриття включають такі сполуки, як каптан, карбоксин, тирам (ТМ), металаксил (Аргоп") та піриміфосметил (АсіеїІїсУ). Якщо потрібно, ці сполуки розробляють разом з іншими носіями, поверхнево-активними речовинами або ад'ювантами що полегшують нанесення, які традиційно застосовують у розробці для забезпечення, захисту від шкоди, якої завдають бактерії, грибкові та тваринні паразити. Захисні покриття наносять шляхом просочування матеріалу для розведення рідкою композицією або шляхом вкривання комбінованою вологою або сухою композицією. Можливі й інші способи застосування, такі як обробка, спрямована на паростки або плоди.

Ще один аспект даного винаходу полягає у забезпеченні нових сільськогосподарських способів, таких як наведені вище способи, які характеризуються використанням трансгенних рослин, матеріалу трансгенних рослин або трансгенного насіння згідно з даним винаходом.

Нижчеподані приклади далі описують матеріали та способи, застосовувані при втіленні винаходу, та наслідки цього застосування. Вони пропонуються для ілюстрації, і їх перелік не повинен розглядатися вичерпним для заявленого винаходу.

Приклади

Приклад 1: Приготування мікросом

Усі етапи, пов'язані з приготуванням мікросом, здійснюють при 4"С, якщо не вказано іншої. Усі буфери дегазують при перемішуванні іп масцо й продувають аргоном. Насіння Зогапит бБісоїог (І) Моепсі (гібрид

З51000 від АдгіРго, Техас, США) пророщують у темряві протягом 4Огод. при 28"С на металевих ситах, вкритих марлею. Мікросоми приготовляють з приблизно 3-сантиметрових етіольованих сіянців. Сіянці збирають і гомогенізують з використанням ступки та пестика у 2 об'ємах (об'єм/маса) 250мМ цукрози, 100мМ Тгтгісіпе (рН 7,9), 2иМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) та 2мМ дитіотреїтолу (ДТТ). Перед гомогенізацією додають прлівінілполіпіролідон (0,1г/г сирої маси). Гомогенат фільтрують крізь 22мкм нейлонову тканину і центрифугують протягом 10 хвилин при 16500 х 9. Супернатант центрифугують протягом 1 години при 165000 х д. Мікросомний осад ресуспендують і гомогенізують в ізоляційному буфері з використанням гомогенізатора Ройцег-ЕіІмепіегп з тефлоновим пестиком. Після повторного центрифугування та повторної гомогенізації гомогенат заморожують у рідкому азоті і зберігають при -807С до використання.

Приклад 2: Ферментні аналізи: Визначення загальної кількості цитохрому Р450. Визначення загальної кількості цитохрому Р4А50 здійснюють шляхом спектроскопії з використанням коефіцієнту екстинкції 91ММ' 1тст" для аддукту між відновленим цитохромом Р450 та монооксидом вуглецю (А450-490) (Отига е6ї аї, У.

Вісі. Спет. 239:2370-2378,1964).

Приклад 3: Очищення цитохрому Р45бох Усі етапи, пов'язані з очищенням ферменту, здійснюють при 4"С, якщо не вказано іншої.

Буфер А: 8,990 гліцерин 10мММ КНгРОЗ/КгНРО: (рН 7,9) 0,2ММ ЕДТА 2,0мМ ТТ 1,095 (об'єм/об'єм) Кепех 690 0,0595 АТХ-100

Буфер С: 8,990 гліцерин 40ММ КНгРОЗ/К»НРО:Х (рН 7,9) 5,0ММ ЕДТА 2,0мМ ТТ 1,095 (маса/об'єм) СНАР5

Буфери дегазують тричі при перемішуванні іп масо, перш ніж додати детергент та ОТТ. Між дегазаціями буфер продувають аргоном. Здатність різних фракцій колонки метаболізувати радіомічений р- гідроксифенілацетальдоксим контролюють протягом усього процесу очищення для виявлення присутності

Р4АіБОох у фракціях.

Мікросоми (400мг протеїну у 20мл) розводять до 100мл буфером, який складається з 8,995 гліцерину, 10ММ КНгРОЗК»НРО:х (рН 7,9), 0,2ММ ЕДТА, 2мМ ОТТ, після чого при постійному перемішуванні поволі додають 100мл 10мМ КНгРОК»НРО» (рН 7,9), 8,995 гліцерин, 02МмМ ЕДТА, 2мМ ОТТ, 0,195 ЕТХ-100 (об'єм/об'єм), 295 Кегзех. Після подальшого перемішування протягом ЗОхв. та подальшого ультрацентрифугування При 150000 х уд протягом 35 хвилин приблизно 190мл супернатанту наносять при швидкості потоку 100мл/год на 5х5см колонці ЕЕ/5-100 з діетиламіноетилсефарозою (20/80 сирого об'єму,

РПпагтасіа) врівноваженої у буфері А. Діетиламіноетилсефарозну іонообмінну смолу розводять 5-100- зерпагозе гель-фільтраційним матеріалом у співвідношенні 1:4 для уникнення надмірних концентрацій ферментів цитохрому Р450 при зв'язуванні, що може призвести до необоротної агрегації. Колонку після цього промивають 150мл буферу А. Р450ох слабо зв'язується з колонкою, і його виділяють головним чином у фракціях для змивання та промивання, які містять жовтий пігмент. Комбінують фракції (приблизно 200мл), що містять Р45Оох, які розпізнають за їхньою абсорбцією при 420нм, їхніми спектрами зв'язування СО та їхньою здатністю метаболізувати оксим в експериментах з відновлення (див. Приклад 4). Їх використовують для подальшого очищення або заморожують.

У змішані фракції Р450ох під час постійного перемішування додають краплинами у відповідній кількості суміші гліцерину та тритону Х-114 до досягнення концентрації 30905 (об'єм/об'єм) гліцерину та 695 Т/йоп Х- 114 шляхом додавання по краплях у відповідних кількостях суміші гліцерину та Тгйоп Х-114. Перемішування триває протягом 20хв, після чого протягом 25 хвилин здійснюють центрифугування при 24500 х 9, 2570 (температура, при якій відбувається розподіл фаз Тгйоп Х-114) без зупинок. Утворюють дві фази: жовту верхню фазу та прозору нижню фазу. Нижню фазу, яка містить основну частину активності цитохрому

Р4а5БоОох, розводять у 2,5 рази до приблизно З50мл буфером С і наносять при швидкості потоку 7Омл/год на 1,9х5см колонку з агарозою марки Сірасгогиріцче ЗСА, врівноваженої у буфері С. Колонку промивають 50мл буферу С і цитохром Р45бох, що залишається, піддають елюції приблизно бОмл лінійного градієнту 0-1,5М

КСІ у буфері С. Десять фракцій, які при електрофорезі додецилсульфату натрію в поліакриламідному гелі (505-РАСЕ) виявляють присутність єдиної поліпептидної смуги на ділянці 50-60кДа, змішують і діалізують в атмосфері азоту протягом 24год проти 1л 8,995 гліцерину, 10ММ КНгРО/К»НРО: (рн 7,9), 5МмМ ЕДТА, 2ММ

ОТ (буфер для діалізу) для зниження вмісту солей та детергентів. Ферментний препарат заморожують у рідкому азоті й зберігають при -807С.

Приклад 4: Визначення характеристик цитохрому Р45бох, одержаного шляхом виділення з мікросом сорго 4.1. Визначення молекулярної маси та амінокислотної послідовності

Молекулярна маса Р45бох, як визначено за допомогою електрофорезу з додецилсульфатом натрію в поліакриламідному гелі (50О5-РАСЕ), становить 55кДа. Протеїнову смугу, що відповідає Р450ох, виділеному з колонки з агарозою марки Сірасгоп рісе ЗА, вирізають з 8-2595 5О5-поліакриламідного гелю й піддають електроелюції. Електроелюйований протеїн обробляють ендопротеїназою сіІШ-С (секвенування протеази

М8, 18год, 23") згідно з вказівками виробника (Воепгіпдег Мапппеійт) з використанням приблизного масового співвідношення 1:100 між протеїназою та протеїном. Електроелюйований протеїн та зразок обробленого протеїну піддають 50О5-РАСЕ, і протеїн та фрагменти переносять на мембрани РгоВіой (Аррієй Віозувзіет5). Забарвлені по Кумасі ділянки мембрани вирізають і піддають М-кінцевому амінокислотному секвенуванню на секвенаторі Арріїеа Віозузіет5, модель 470А, оснащеному системним фенілтіогідантоїнамінокислотним аналізатором моделі 120А.

М-кінцеве амінокислотне секвенування дало дві послідовності, які могли читатися незалежно одна від одної завдяки їхній різниці щодо відносного вмісту. Пошук за допомогою бази даних (ВІ АБ5Т) показав, що: послідовність -5Ї МКЕСМОМЕЕСТІ. відрізняється лише в одній позиції від М-кінцевої послідовності В-

субодиниці АТРази вакуолей ячменю (Ногдент мцІдаге) яка являє собою МОЇ МКЕСАОМЕЕСТІ. (інвентарний номер І11862). В-субодиниця ячменю має молекулярну масу, яка відповідає теоретичній - 54кДа (20). Присутність В-субодиниці АТРази вакуолей як забруднюючої домішки у препараті Р45бох виявляли шляхом Вестерн-блотингу, який показав єдину смугу у 55кДа при використанні моноклонального антитіла, виробленого проти В-субодиниці АТРази вакуолей з коріння вівса (Ог. Немеп 52єе). В-субодиниця може бути видалена з препарату Р4і45бох шляхом іммобілізації на вкритих антитілами мікротитрувальних лунках. Такий підхід дозволяє напевно визначити М - кінцеву амінокислотну послідовність Р4А5б0ох як -

АТТАТРОГ /ООБМРЕО і, крім того, дає послідовність фрагмента пептиду внутрішнього РаА5Оох,

МОРГМАОГОКАДАА. Спроби видалити залишкову кількість В-субодиниці АТРази вакуолей призводили до утворення спектрів різниці монооксиду вуглецю, у яких значно зростав 420нм компонент, що представляє неактивну денатуровану форму Р420 цитохрому Р4і5бох, та до втрати або значного зниження здатності до відновлення активності Рі45б0ох в одержаних фракціях. Це відображає характерну для Р45Оох нестійкість. В- субодиниця АТРази вакуолей, очевидно, не має ніяких каталітичних властивостей, пов'язаних з Р45бох.

Таким чином, присутність В-субодиниці як забруднюючої домішки враховували при вивченні метаболічних перетворень за допомогою Р45Оох, про яке сказано нижче.

М-кінцева послідовність: -АТТАТРОЇ І ССОС5МРЕО-- (ЗЕО ІЮ МО: 3)

Внутрішня послідовність: --МОВІ МАО ОВААА- (ЗЕО ІЮ МО: 4) 4.2. Виділення МАОРН-Р.450-ОКСМПорепУкКТазн

МАОРН-Р4і50-оксидоредуктазу зв'язують з ОБАЕ-сефарозою на колонці марки ЕР/5-100-5ерпагозе й піддають елюції шляхом додавання буферу А з 0,5М КСІ. Редуктазу після цього очищають до гомогенності на колонці марки 2',5'-АОР-Зерпагозе 4В (Рпагтасіа), як було описано раніше у роботі Наїкіег апа МопПег,

РіІапі Рпузіої!. 96:10-17, 1990, і концентрують до приблизно 15 одиниць/мл. 4.3. Приготування розчинної уридиндифосфатглюкозної (ШОРО) глюкозилтрансферази

Глюкозилтрансферазу частково очищають шляхом фракціонування сульфатом амонію супернатанту після центрифугування, одержаного під час приготування мікросом. Глюкозилтрансферазну фракцію осаджують 4095-6095 (МНа)250»х і розчиняють у 5мл 50мММ трицину (рН 7,9), 2мМ ОТ і діалізують проти 2л того ж самого буферу протягом доби. 4.4. Відновлення активності цитохрому Р4А50ох

Відновлення ферментативної активності мікросомного цитохрому Р450 здійснюють шляхом введення цитохрому Р4і50 й відповідної МАОРН цитохром Р.і50О-оксидоредуктази у ліпідні міцели. Може використовуватися суміш ліпідів, але у разі цитохрому Р4Б50ох дилауроїлфосфатидилхолін (ОІРС) забезпечує найкращу ферментну активність. Кількість правильно сформованих комплексів цитохрому

Р4аБ5бох та МАОРН цитохром Р450-оксидоредуктази є фактором, що обмежує швидкість. Надмірні кількості оксидоредуктази та концентрованих ферментних розчинів використовують для забезпечення достатньої кількості активних комплексів.

Функціонально відновлений фермент одержують з використанням таких компонентів:

Цитохром 20мкг/мл у буфері для діалізу

Р4АБоОох:

МАОРН 100мкг/мл у 5ОММ калій- цитохром Р450- фосфатному буфері (рн 7,9) оксидоредуктаза з зогдапит рісоог

Ліпід: 10мг/мл дилауроїлфосфатидилхоліну, обробленого ультразвуком у 5ОММ трицині (рін7,9)

МАОРН: 25мг/мл у НгО 14б-оксим, 0О,01мкКі/мкл, 394мКі/ммоль ферментативно одержаного з (О- 1423-І -тирозину з використанням відновленого

РАбОтув і очищеного шляхом РХВР 5мкл суспензії ліпіду змішують в посудині Епендорфа з 5мкл МАОРН цитохром Р450-оксидоредуктази (0,075од.), 10мкл розчину цитохрому Р45бох (приблизно 0,4пмоль) та 0,5мкл ""С-оксиму (0,014мкКі/мкл, 394мКі/ммоль). Остаточний об'єм доводять до ЗОмкл з використанням 50мМ трицину (рн 7,9) і викликають ферментативну реакцію додаванням їмкл розчину МАОРН. Контрольні проби приготовляють, виключаючи

МАОРН цитохром Р.4і50-оксидоредуктазу або МАОРН з реакційної суміші. Посудини інкубують при постійному обережному збовтуванні при 30"С протягом год. Після інкубування реакційні суміші наносять на вкриті силікагелем пластинки для тонкошарової хроматографії (ТІС) (Силікагель 60 Ез25л4, МегсК) і проявляють з використанням суміші етилацетат/толуол (1:5 об'єм/об'єм) як рухомої фази. Пластинки поміщають на фосфорні (люмінофорні) екрани і зберігають протягом доби, й одержані в результаті продукти, р-гідроксифенілацетонітрил та р-гідроксибензальдегід, візуалізують з використанням люмінофорного фотоприймача ЗТОКМ 840 від МоїІесшаг бупатісв.

Далі вставлений у ліпідні міцели цитохром РібБОох каталізує перетворення -р- гідроксифенілацетальдегідоксиму на р-гідроксиманделонітрил, який дисоціює до р-гідроксибензальдегіду та

НМ. Це показує, що цитохром Р45бох є багатофункціональними протеїном, що каталізує як перетворення р-гідроксифенілацетальдегідоксиму на р-гідроксифенілацетонітрил, так і перетворення р- гідроксифенілацетонітрилу на р-гідроксиманделонітрил. Активність Р4і5Оох повністю залежить від присутності МАОРН-Р450-оксидоредуктази та МАОРН. Дитіоніт натрію (10мММ) не сприяє перетворенню р-

гідроксифенілацетальдоксиму. Якщо фермент не піддають діалізу перед відновленням, це викликає відносне збільшення накопичення р-гідроксифенілацетонітрилу порівняно з р-гідроксибензальдегідом. 4.5. Відтворення повного шляху синтезу дуррину з вихідної амінокислоти тирозину іп міго

Остаточні реакційні суміші містять: Змкл виділеного, рекомбінантного Р450-тув (бпмоль, гетерологічно експресованого в Е.соїї й виділеного, як описано у НаїКіег еї аї, Агоп. Віоспет. Віорпув. 322: 369-377, 1995), 1О0мкл виділеного й діалізованого Р45бох (приблизно 0,4пмоль), 5мкл. МАОРН-Р450-оксидоредуктази (0,075од.), 1мкл частково очищеної ШОРО глюкозилтрансферази з сорго, 5мкл ОРОС (10мг/мл у 50мММ Крі (рН 7)), 0,25мкл (О-С|-тирозину (0,05мкКі/ммоль, 443мКі/ммоль, Атегзпат), Змкл ШОРС (ЗЗмг/мл у 50ММ

Кр, (рН7)) та Змкл кастаносперміну (2мМ у 50мМ Кр, (рнН7)) Компоненти змішують повторним суспендуванням, і якщо необхідно, то остаточний об'єм доводять до ЗОмкл шляхом використання 50мМ Крі (рнН7). Ферментативну реакцію розпочинають за допомогою 1мкл МАОРН (25мг/мл).

Дуррин також синтезують через відновлення Р450ох р-гідроксифенілацетальдегідоксимом (за винятком

Ра4бБОтув та тирозину з реакційних сумішей, усі додаткові компоненти залишають незмінними). Ці проби містять або 0,5мкл ГШ-12С|-р-гідроксифенілацетальдегідоксиму (0,014мкКі/мкл, 394мКі/ммоль), або Змкл неміченого р-гідроксифенілацетальдегідоксиму (20мМ) як субстрат для Р450ох. В останньому випадку радіоактивною міткою є мкл (0-1221-(0ОРС) (0,025мкКі/мкл, 287мКі/ммоль, Атегзпат). Усі реакційні суміші приготовляють у двох примірниках. Після інкубування протягом 1год. при 30"С кожен набір реакційних сумішей наносять на пластинки для тонкошарової хроматографії. Перший набір реакційних сумішей аналізують з використанням етилацетату/голуолу як розчинника за прикладом 4.5. Другий набір реакційних сумішей аналізують З використанням системи розчинників, що складається З етилацетату/ацетону/дихлорметану/ метанолу/води (20/15/6/5/4, усі - за об'ємом) для досягнення відокремлення гідрофільного продукту дуррину від тирозину і від гідрофобних проміжних продуктів.

Радіомічені субстрати та продукти візуалізують з використанням люмінофорного фотоприймача З5ТОЕМ 840.

Змішане використання виділених РА50-тув та Р450ох в експериментах з відновлення за допомогою радіоміченого тирозину як субстрату в результаті приводить до продукування р-гідроксифенілацетонітрилу та р-гідроксибензальдегіду. Це показує, що Р.і5О-тув та Ра4Ббох здатні діяти спільно іп мйго. Р- гідроксифенілацетальдоксим, утворений Р4А50-тув, таким чином, ефективно використовують як субстрат для

Р4БОох. За відсутності МАОРН-Р450-оксидоредуктази або за відсутності МАОРН ніякої активності не спостерігалося.

Іп міго продукування дуррину з використанням р-гідроксифенілацетальдоксиму як основи здійснювали шляхом відновлення Р450ох разом з частково очищеною розчинною ООРО-глюкозилтрансферазою у присутності МАОРН та ООРО. Клон кКДНК з сорго, що кодує ШОРО-глюкозилтрансферазу, яка специфічно використовує р-гідроксиманделонітрил як субстрат, є відсутнім. Відповідно, у даному дослідженні сирий екстракт розчинної ШОРОС-глюкозилтрансферази з сорго використовували для глюкозилування р- гідроксилманделонітрилу й для того, щоб показати відновлення іп міго повного шляху біосинтезу дуррину.

Застосований радіомічений р-гідроксифенілацетальдоксим повністю метаболізували. Додавали кастаноспермін для інгібування активності глюкозидази, яка спостерігається при приготуванні ПООРО- глюкозилтрансферази. Крім системи тонкошарової хроматографії, застосованої раніше для відокремлення гідрофобних сполук, застосовують додаткову систему тонкошарової хроматографії для відокремлення таких гідрофільних сполук, як дуррин. Р-гідроксиманделонітрил, утворений при відновленні, частково був перетворений на дуррин, про що свідчило утворення радіоміченої сполуки, яка комігрує зі справжнім дуррином. Визначення цієї радіоміченої сполуки як дуррину було підтверджене її розпадом за відсутності кастаносперміну та утворенням комігруючого радіоміченого продукту, коли експеримент був повторений з радіоміченою ОРОС замість радіоміченого р-гідроксифенілацетальдоксиму. Радіомічена ООРО неспецифічно містила ряд відносно гідрофільних сполук. Через нестійкість р-гідроксиманделонітрилу його перетворення на дуррин експериментальним шляхом виявлялося через зникнення р-гідроксибензальдегіду.

Коли радіомічений р-гідроксифенілацетальдоксим використовували як субстрат, крім дуррину, утворювалося багато нерозпізнаних гідрофобних радіомічених сполук. Утворення цих сполук відбувається за відсутності ШОРО, але вимагає присутності розчинного екстракту, який показує, що екстракт ШОРО- глюкозилтрансферази має додаткову ферментативну активність. Глюкозилування фенольної групи р- гідроксиманделонітрилу веде до утворення р-глюкопіранозилоксиманделонітрилу. Не спостерігалося жодного радіоміченого продукту, що комігрує зі справжнім стандартом р- глюкопіранозилоксиманделонітрилу. Активність глюкозидази, яку має екстраєт ПОРОБ- глюкозилтрансферази, ефективно інгібується кастаносперміном.

Після іп міго відновлення показник перетворень для Р450-тув (СУР79) становить 230хв"! (5іррезеп еї аї,

У. Віої. Спет. 270: 3506-3511, 1995). Часткове перетворення Р450ох на його денатуровану Р420-форму перешкоджає визначенню цього показника. З використанням мікросомної системи значення Кт та Мтах ДЛЯ продукування р-гідроксиманделонітрилу з тирозину, р-гідроксифенілацетальдоксиму /-( та р- гідроксифенілацетонітрилу становлять 0,03, 0,05 та 0,10мМ і 145, 400 та 5Онмоль мг протеїн" год" відповідно (Меїег еї аї, У. Вісі. Спет. 254: 8575-8583, 1979).

Повний шлях біосинтезу дуррину, починаючи від вихідної амінокислоти тирозину, був відновлений іп мійго шляхом поєднання Раі5О-тув, Р4БбБ0ох, МАОРН-Р450-оксидоредуктази у ОГРС міцелах з ООРО- глюкозилтрансферазою, тирозином, МАОРН, ШОРО та кастаносперміном. Тирозин перетворюють за допомогою РагбБО-тув на р-гідроксифенілацетальдоксим, який далі перетворюється на р- гідроксифенілацетонітрил та р-гідроксибензальдегід за допомогою Р45бох. Накопичується певна кількість р- гідроксифенілацетонітрилу, тоді як весь утворений р-гідроксиманделонітрил перетворюється на дуррин та деякі нерозпізнані сполуки. У цій серії експериментів стехіометричне співвідношення між РА50-тув та РА5Оох становить приблизно 15. Тому нічого дивного немає у виявленні накопичення -р- гідроксифенілацетальдоксиму у досліді з відновленням. Накопичення р-гідроксифенілацетонітрилу, що спостерігалося, є несподіваним, оскільки попередні експерименти з мікросомами сорго показали, що р- гідроксифенілацетонітрил важко накопичити й відокремити. Часткова денатурація або інактивація виділеного Р4б5Оох може пояснити, чому р-гідроксифенілацетонітрил накопичується в експериментах по відновленню з виділеним Р4А5бох. 4.6. Зв'язування субстрату

Ідентифікація РаБОох як багатофункціонального ферменту, що перетворює р- гідроксифенілацетальдоксим на р-гідроксиманделонітрил з р-гідроксифенілацетонітрилом як проміжною сполукою, спонукала до дослідження здатності РаібБбОох до зв'язування субстрату. Для р- гідроксифенілацетальдоксиму було отримано зворотний спектр І типу з мінімальною абсорбцією З381нм та максимальною абсорбцією 418нм, що свідчить про зміну спіну з високого на низький після додавання субстрату. При інкубуванні амплітуда зростала й досягала стабільного максимуму через приблизно 45хв.

При додаванні р-гідроксифенілацетонітрилу не було отримано спектра зв'язування субстрату.

Р4БбОох виявився значно лабільнішим порівняно з іншими РА50-ферментами, виділеними з сорго.

Виділений РаіБбОох дає зворотний спектр зв'язування субстрату ! типу при інкубуванні з р- гідроксифенілацетальдоксимом. Коефіцієнт екстинкції Еа2о-ззо, який відповідає повному переходові від одного стану спіну до іншого, становить 130мМ'см'!. В отриманих спектрах зв'язування субстрату максимальні амплітуди є приблизно вдвічі більшими за теоретично розраховані, навіть якщо припустити повну зміну високого спіну на низький спін. Ця невідповідність показує, що концентрацію Р450ох було занижено при визначенні за 450нм піком у спектрі зв'язування монооксиду вуглецю. Або ж РА20 форма

Р4Ббох здатна зв'язувати оксим і, таким чином, сприяє збільшенню утвореного спектру зв'язування субстрату. Остання ймовірність може пояснити, чому максимальні амплітуди можуть бути отримані лише після тривалої інкубації.

Раніше вже повідомлялося про опосередковану Р.і.50 дегідратацію альдоксимів до нітрилів з використанням мікросом печінки (ОеМазіег еї аї, У. Огд. Спет. 5074-5075, 1992). Головна різниця між системою мікросом печінки та Р450ох полягає у тому, що перша вимагає суворого дотримання анаеробних умов, тоді як для останнього потрібні аеробні умови, він каталізує подальшу реакцію С-гідроксилування й метаболізує (е)-, а також (2)-ізомер. За анаеробних умов мікросоми печінки дають слабкий спектр І типу.

При додаванні МАОРН або дитіоніту утворюється виразний Богеї-пік 442-444нм. Звідси можна зробити висновок про те, що він представляє основні активні різновиди Р450 у стані Ре (ІІ). Вивчення спектру Р45Оох за анаеробних умов не виявляє утворення 442нм абсорбуючого комплексу, але присутність МАОРН необхідна для каталітичної активності, яка показує, що Р450ох також має перебувати у стані Ре (ІЇ) для того, щоб бути посередником у реакції дегідратації.

Приклад 5: Утворення зонду цитохрому Р450 А-типу

Полімеразну ланцюгову реакцію (РСЕК) здійснювали на плазмідній ДНК, виділений з односпрямованої бібліотеки плазмідної кКДНК (Іпмігодеп) з етіольованих сіянців Зогапит бБісоїоціІ) Моепсіп 1-2см заввишки з використанням значною мірою виродженого інозину (І), що містить праймери, які вибірково відбирають цитохроми Ра.50 А-типу (Меізоп апа Оитг5ї, Огид Меїароїїзт апа Огид Іпіегасіоп5 12: 189-206 (1995)).

Праймер 1 (смисловий ланцюг) з послідовністю 5-ЯаС(ааААТТСОТТМПССМадАМамтт-3 (5ЕО ІЮ МО:5) охоплює узгоджену амінокислоту послідовність ЕХРЕКЕ (ЗЕО ІО МО:6), у якій Х є будь-якою амінокислотою.

Праймер 2 (антисмисловий ланцюг) з послідовністю 5'ЯСОааЗАТССПАСАПМСКМОСКМОС-3 (5ЕО 1О МО:7) охоплює узгоджену амінокислоту послідовність ОКеЕХОХО (5ЕО ІЮО МО:8). Праймер 1 та праймер 2 мали на кінцях ЕсокКіІ та Ватні сайти відповідно, що гарантувало клонуваня лише продуктів полімеразної ланцюгової реакції (РСЕ), утворених від обох праймерів, у ферментованому ЕсовІ/Ватні рВішевзсгірі ІІ ЗК (5ігагедепе).

Полімеразна ланцюгова реакція (РСК) здійснювалася у два послідовні етапи. Етап 1 з використанням праймера 1 та стандартного Т7 праймера 5-ААТАСЕАСТСАСТАТАС-3' (5ЕО ІО МО:9) збагачує пул кКДНК, що кодують цитохроми Р450 А-типу. Етап 2, включаючи праймер 1 та праймер 2, утворював, головним чином, один ланцюг завдовжки приблизно у 100п.н., специфічний для цитохромів Р450 А-типу. Полімеразну ланцюгову реакцію для етапу 1 здійснювали у загальному об'ємі 100мкл, що містив 595 ДМСО, 200мкМ дезоксинуклеозидтрифосфату (аМТР), 200пмоль праймера 1, 100пмоль стандартного Т7 праймера, 2,5 одиниці Тад ДНК полімерази у РСЕ буфері та 1мкл розведеної у 100 разів плазмідної ДНК з бібліотеки

КДНК. РСЕ для етапу 2 здійснювали у загальному об'ємі 100мкл, що містив 596 ДМСО, 200мкмМ амтР, 200пмоль праймера 1 та праймера 2, 2,5 одиниці Тад ДНК полімерази у РСК та 1мкл продукту, отриманого в результаті РСЕ. етапу 1. Протягом обох етапів РОК за одним циклом у 5хв. при 957С ішли 35 циклів по

Зосек. при 95"С, 1хв. при 50"С та Збосек. при 72"С. Приблизно 100п.н. продукту РСЕ етапу 2 вирізали з 2905 агарозного гелю й повторно ампліфікували перед клонуванням у рВішпезсгірі. З 19 секвенованих клонів 10 мали дуже високу ідентичність послідовності на амінокислотному рівні з гідроксилазою коричної кислоти (СУР 74) і тому не піддавалися подальшому вивченню. Порівняння решти 9 послідовностей поділило їх на дві групи з 8 та 1 послідовності, які отримали позначення "12" та "7" відповідно. Ген-специфічний праймер послідовності "12", розташований між праймером 1 та праймером 2: 5-4СссаСпАТСССАСТАСТАСЯЯСТООО- 3 (ЗЕО ІЮ МО:10), та праймер 5'-ЯСОСАТССТТТТТТТТТТТТТТТТМ-3' (ЗЕО ІЮ МО:11), які мають на кінцях

Ватні, використовували для ампліфікації "12" ген-специфічного фрагменту з приблизно 500п.н. РСК-етапу 1 ї клонували у рВінезсгірі Подібним чином одержували ген-специфічний фрагмент для "7" з використанням "7" ген-специфічного праймера 5-ЯСасАТСССАСАТСААДОСасСАас(а-3 (5ЕО ІЮ МО 12) та праймера 5-ЯСасАТССТТТТТТТТТТТТТТТТУ-3 (5ЕБО ІО МО:11). Вставки мітили, Оідохідепіп-11-4О0ТР (Воепгіпдег Мапппеїт) шляхом ампліфікації за допомогою РОК стандартними 17 та ТЗ праймерами згідно з вказівками виробника і використовували для скринінгу бібліотек КкДНК.

Приклад 6: Скринінг бібліотек та секвенування ДНК

Усі фільтрувальні гібридизації здійснювали з використанням ОІС-системи (Воепгіпдег Мапппеіт). Шари колоній приготовляли з використанням нейлонової мембрани (Воепгіпдег Мапппеїт) і гібридизували протягом доби при 68"С у 5х55С (розчині хлориду й цитрату натрію), 0,190 М-лауроїлсаркозин, 0,02905 додецилсульфату натрію (505). 195 ВіосКіпд Кеадепі (Воепгіпдег Мапппеїт). Фільтри промивали двічі протягом 15 хвилин у 0,1х55С, 0,190 505 при 65"С перед детектуванням. Одержували клони повної довжини для "12" та "7", про що свідчив аналіз послідовності. Секвенування здійснювали з використанням міченого Тпепто бБедцепазе Ріпогезсепі комплекту секвенування циклу праймера (7-деала астрР) (Атегзпат) і аналізували на АГ Р-Ехрге55 (Рпагтасіа). Комп'ютерний аналіз послідовності здійснювали з використанням програми у ОСО УМізсоп5зіп зедцепсе Апаїузі5 РасКкаде. КДНК послідовність повної довжини

Р4бБОох і похідна амінокислотна послідовність кодуючої ділянки, отримані в результаті секвенування нуклеотиду "12", подані у ЗЕО ІО МО: 1 та 5ЕО ІО МО2 відповідно.

Приклад 7: Експресія в Е. Соїї

Вектор експресії реР19910! (Вагпе5, Меїпод5 іп Епгутоіоду 272: 3-14, 1996) одержали у д-ра Генрі

Барнза (Ог. Непгу Вагпе5 (Зупіпебіс сСепеїїс5/Іттипе Сотріех Іпсогрогайоп. Зап Оіедо, СА)). Ця плазміда містить Іас7 промотор, злитий з короткою лідерною послідовністю гена 10 з 17 бактеріфага, 9101, яка була зафіксована як відмінна лідерна послідовність для експресії різних гетерологічних протеїнів (Оїїп еї аї., 1988). "7" та "12" були змінені шляхом РСЕ з використанням Рухо-полімерази (Воепгіпдег Мапппеїт) для введення МаеіІ-сайту у старт-кодоні й для зміни стоп-кодону до оспге стоп-кодону, після якого безпосередньо йде Ніпаї сайт. Для утворення експресійного клону для "7" використовували праймер З (смисловий ланцюг) 5-СаСО)ааАТССАТАТаВАСОаСАТСАТТАСТ ССТОТОСОТСОСасто-3 (5ЕО ІЮ МО:13) та праймер 4 (антисмисловий ланцюг) 5'-СаСААаСТТАТТАСАТСТСААСОаасвАСССТ-3 (5ЕО ІБ'МО:14).

Праймер З вводить мовчазні мутації у кодони 3, 4 та 5 для зниження вмісту 5/С навколо сайту ініціації трансляції та Ватні сайту безпосередньо перед Мае! сайтом. Одержаний РСОК-фрагмент ферментували

Ватні та НіпаПй і лігували у ферментований Ватні та Ніпапй! рВісезспрі і контролювали шляхом секвенування для виключення помилок РСЕ. Подібним чином "12" вводили у рВісезспрі з використанням праймера 5 (смисловий ланцюг) 5-СаСацпАТССАТАТаССААСААСАаСААССССасАастосто-3' (5ЕО ІЮ

МО:15) та праймера 6 (антисмисловий ланцюг) 5-СаСААаСТТАТТАТОСТОСОСООИС ват сСстТатАТТТОс-3 (5БЕО ІЮО МО:16). Праймер 5 вводить мовчазні мутації у кодони 2, 3,4 таб, а праймер б вводить мовчазні мутації в останні 2 кодони для зниження вмісту 5/С. Вставки вирізали з використанням мае! та НіпаІ і лігували у ферментований Маеї та Ніпап! реР1994910. Експресійні плазміди перетворювали на УМ109-клітини Е. соїї. Одиничні колонії вирощували протягом доби у І В-середовищі, що містило 100мг ампіциліну/мл при 37"С та 5мл вчорашньої культури, використовуваної для інокуляції Х00мл

ТВ-середовища, що містило 50мг/мл ампіциліну, 1мММ тіаміну, 1мММ ізопропіл-рД-тіогалактопіранозиду та мМ 5-амінолевулінової кислоти. Клітини вирощували при, 287С протягом 48 годин при 125об/хв. Імл. Е. сої перетворювали за допомогою експресійних послідовностей "7"; "127 і рБЗРІ9д10Ї осаджували центрифугуванням (2000г, 10хв), промивали й концентрували у 10 разів у 5Х0мММ трицину рН 7,9 й інкубували з 14пКі 0-19 р-гідроксифенілацетальдегідоксиму зі специфічною активністю 394мКі/ммоль при 30 протягом ЗОхв. Інкубовані суміші екстрагували етилацетатом, нанесеним на пластинку для тонкошарової хроматографії (Силікагель 60 Ров4., МегсК), проявляли з використанням суміші етилацетату/толуолу (1:5 об'єм/об'єм) як мобільної фази і візуалізували з використанням апарату 5ТОЕМ 840 від МоіІесшаг бупатісв.

Е. соїї, перетворена послідовністю, що експресує "12", була здатна перетворювати р- гідроксифенілацетальдегідоксим на р-гідроксифенілацетонітрил.

СО різницеві спектри солюбілізованих сферобластів Е. соїї, які експресують Р450ох мали найвищий пік 417нм і найнижчий пік 457нм. Взагалі, СО-спектр з піком оптичної густини близько 420нм є показником цитохрому Р450 у нефункціональній конформації (Ітаї еї аї, Еиг. У. Віоспет. 1: 419-426,1964). Наявність найвищого піка 417нм свідчить про присутність більшої частини експресованого цитохрому Р450 у нефункціональній конформації. Явний зсув піка оптичної густини з 450нм до 457нм може бути зумовлений присутністю великої кількості цитохрому Рі450 у неконформаційному стані. На основі піка 457нм було розраховано вихід 5Онмоль Р45Оох на 1 літр культури Е. сої за 65 годин. 5мкл мембран, виділених, як описано у роботі НаїКієг еї аї, Агспіме5 ої Віоспетівзігу апа Віорпузісв 322: 369-377, 1995, з Е. соїї, що експресує "12", було відновлено 0,225 одиницями МАОРН-цитохром Р450- редуктази, 50мкг МАОРН, 42псїі р-гідроксифенілацетальдегідоксиму та 100мкг дилаурилфосфатидилхоліну в загальному об'ємі 1ї00мкл ЗО0мММ трицину, рН 7,9. Після інкубування при 30"С протягом 30 хвилин реакційну суміш наносили на пластинку для тонкошарової хроматографії й аналізували, як описано вище.

Відновлення мембрани з Е. соїї, що експресує "12" вело до накопичення р-гідроксибензальдегіду, який є стабільним продуктом дисоціації р-гідроксиманделонітрилу, останнім проміжним продуктом біосинтезу ціаногенного глюкозиду дуррину. Це свідчить про те, що "12" є цитохромом Р4і50, який каталізує перетворення р-гідроксифенілацетальдегідоксиму на р-гідроксиманделонітрил. КДНК позначають як

Ра4Ббох. Клон, що включає описану кКДНК Р45БОох, був зданий на зберігання 10 січня 1997р. до Німецького зібрання мікроорганізмів та культур клітин (05М2-Юецівспе Заттійпд моп Мікгоогдапізтеп ипа 7еїкийшШгеп сСітрН, Мазспегодег УУєд 16, 0-38124 Вгапп5зспмеїд) під інвентарним номером О5М 11367.

Коли радіомічений р-гідроксифенілацетальдоксим вводили до клітин Е. соїї, перетворених Р45Оох, р- гідроксифенілацетонітрил накопичувався у клітинах Е. соїї, що експресують Р45Оох. Е. соїї, що не містять ендогенних цитохромів Р4-50 або МАОРН-цитохром Р4і50-редуктази, виявили підтримку каталітичної активності гетерологічно експресованих цитохромів Р4і50. Два розчинних флавопротеїди БЕ. соїїЇ, флаводоксин та МАОРН-флаводоксинредуктаза, передають відновлюючі еквіваленти рекомбінантним цитохромам Р4і50. Відновлення виділених мембран Е. соїї або очищеного рекомбінантного ферменту за допомогою МАОРН-цитохром Р450-редуктази сорго веде до перетворення р-гідроксифенілацетальдоксиму на р-гідроксиманделонітрил, тоді як клітини ЕЕ. соїї що експресують Р4і5Обох, метаболізують р- гідроксифенілацетальдоксим лише до р-гідроксифенілацетонітрилу. Нездатність Е. соїї підтримувати перетворення р-гідроксифенілацетонітрилу на р-гідроксиманделонітрил є першим прикладом того, що система БЕ. соїї флаводоксин/МАЮРН-флаводоксинредуктаза, не здатна підтримувати каталітичну активність реакції мікросомного цитохрому Р450. Попередні експерименти по відновленню з мембранною та розчинною фракціями клітин Е. соїї, що експресують Р4і50ох, показали, що система розчинний флаводоксин/МА ОРН-флаводоксинредуктаза лише підтримує РаБОох у перетворенні р- гідроксифенілацетальдоксиму на р-гідроксифенілацетонітрил і що інгібуючий фактор, який перешкоджає подальшій реакції гідроксилування, відсутній у розчинній фракції. Нездатність Е. соїї підтримувати повну активність Р450ох може відображати нетипову каталітичну реактивність Р4А45Оох. У клітинах БЕ. сої, перетворених за допомогою Р4іБ5бох або вектора експресії, накопичується сполука з дещо нижчою мобільністю, ніж у р-гідроксифенілацетальдоксиму. Це показує, що Е. соїї може метаболізувати р- гідроксифенілацетальдоксим незалежно від присутності РА5Оох.

Приклад 8: Очищення рекомбінантного Р4А5бох (СУР7ТЕ1)

Сферобласти з 2 І Е. соїї, що експресують Р45бох, піддавали розподілу фаз під впливом температури за допомогою 195 тритону Х-114, як було описано вище (НаїКіегеї аї, Агспімез5 ої Віоспе пізігу апа Віорпувзісв

З22: 369-377, 1995). Верхню фазу, що містить Р45Оох, розводили у 100 разів у 10мММ КР, рН 7,0, 0,059 відновленого тритону Х-100, 1мМ ОТТ, 0,5мММ фенілметилсульфонілфториду (РМ5БЕ), рН доводять до 7,0 оцтовою кислотою й подають на 1бмл колонку швидкого потоку СМ-Зерпагозе (Рпаптасіа), врівноважену у буфері О (10ММ КР, рН 7,0, 0,295 тритону Х-114, 0,0595 відновленого тритону Х-100, 1095 гліцерину, 1мММ

ОТТ, 0,595 РМ5Б). Колонку промивали у буфері О і Р45бох елюювали 0-1М КСІ лінійним градієнтом (35О0мл) у буфері О. Комбіновані фракції що містять Р45бох (4Змл), використовували для експериментів з відновлення, а електроелюйований рекомбінантний Р450ох використовували для вироблення антитіла у курчат.

Очищений рекомбінантний Р450бох, відновлений МАЮРН-цитохром Р450-редуктазою у ОІ РС каталізує перетворення р-гідроксифенілацетальдегідоксиму на р-гідроксиманделонітрил у присутності МАОРН, як описано у прикладі 4, розділ 4.2 для очищення рослинних ферментів.

Приклад 9: Експресія дуррину у трансгенних рослинах Агабрідорві5 та тютюні 9.1 Побудова векторних плазмід

Утворювали три бінарні вектори для опосередкованого Адгобасіегійт Шштетїасіеп5 перетворення, а саме - РРАР111.79, рРАР221.71ЄЕ1 та рРАР111.79Е1.

Для побудови рРАР111.79 клон кКДНК з Р45Отук (М/095/16041; Косі еї аї, Агсп Віоснет Віорпуз 323:177- 186, 1995) спочатку вирізають за допомогою ЕсокІі і вводять у ЕсоКіІ сайт рКТ101 (Коргег еї аї, Мисіеїс Асіаз

Кезеагсп 15:5890, 1987) для функціонального приєднання кКДНК до 355-промотора та плазміди рКТ101,79, що генерує сигнал поліаденілування Саму. Перед введенням Р45Отув КДНК частину полілінкера реЕТ101 видаляють шляхом ферментації за допомогою Зай та Хбраї, після чого здійснюють релігування "тупих" кінців, отриманих способом Кленова, залишаючи, таким чином, лише ЕсоК!І та Хпо!Ї сайти. Р4А5БоОтув, включаючи 355-промотор та сигнал поліаденілування Саму, вирізають з рЕТ101,79 з використанням 5рп1.

Для утворення плазміди рРАР111,79 кінці "затуплюють" полімеразами Кленова, і отриманий фрагмент лігують у вирізану ЕсокІ плазміду рРАР111 (На/диківеуіс: еї аї, Ріапі Мої Віо! 25: 989-994, 1994), кінці якої також були "затуплені" полімеразою Кленова й дефосфорильовані.

Для побудови рРАР221.71 Е1 клон кКДНК Р4і5бох спочатку вирізають за допомогою Крпіта Хбваї й лігують у Крпі та Храї сайти реЕТ101, утворюючи рЕТ101.71 Е1. Після цього Р450ох, включаючи 355-промотор та сигнал поліаденілування Саму, вирізають з рКТ101.71 Е1 за допомогою Ніпапі і лігують у Ніпап | сайт рРАЕР221 (Наддикіеміся еї аї, Ріапі Мо! Віої 25: 989-994, 1994), таким чином, утворюючи рРАР221.71 Е1.

Для створення рРаАРІ11.79.71Е1ї клон кДНК РаіБбБбОох, включаючи 355-промотор та сигнал поліаденілування Саму, вирізають з рРАР221.71Е1 з використанням Ніпаїї, "затуплюють" полімеразою

Кленова й лігують у Ззтаї сайт рРАР111,79. 9.2 Перетворення Агарідорвіз (ПпаІапа

Бінарні вектори рРАР111, рРАР221, рРарР-111.79, рРАР221.71Е1 та рРАР111.79.71Е1 вводять у штам

Адгорасієгічт їштеїтасіеп5 С58С1/роу3850 шляхом електропорації, як описано у роботі УУепішп апа Еогае,

Мисієїс Асіайз Незеагп 17: 8385, 1989. Агарідорві5 Іаійапа, екотип Соіотбріа, перетворюють шляхом вакуумної інфільтрації, практично так, як описано у роботі Весптоїай еї аЇ, МоїІесшаг Віоіоду апа Сепеїіс5 316:1194-1199, 1993. Трансформанти відбирають на пластинках для мас-спектрометрії, що містять 50мкг/мл канаміцину для рРАР111-векторів, або 200мкг/мл сульфату гентаміцину для рР2Р221-векторів.

Через 4-6 тижнів після проростання рослини, резистентні до канаміцину або гентаміцину, переносять у грунт. 9.3 Перетворення Місоїапа їарасит суХНапії

Місоїйапа їарасит см Хпапії перетворюють практично згідно зі способом перетворення листових дисків, описаним у роботі Змар еї аІ, Меїйоаз іп Ріапі МоІесшаг Віоіоду, Соїй Зргіпд Нагрог, рр.55-60, 1995, з використанням Адгобасіегцт штеїасіеп5 С58С1/рМ3850 перетворену за допомогою рРагРІ11.79, рРАР221.71Е1 або рР2Р111.79.71 Е1. 100мкг/мл канаміцину використовують для відбору трансформантів за допомогою рРАРІ111,79-вектора, 100мкг/мл сульфату гентаміцину - для відбору трансформантів за допомогою рРаР221.71Е1-вектора, і 5Омкг/мл (0-418 - для відбору трансформантів за допомогою рРАР111.79.71Е1-ВрВктор3. Після утворення кореневої системи рослини переносять у грунт і вирощують в оранжереї. 9.4 Визначення дуррину

Вміст дуррину визначають з застосуванням спектрофотометричного ціанідного аналізу, раніше описаного у роботі НаїКіег еї аї, Ріапі Рпузіо! 90: 1552-1559, 1989, тільки у даному разі 5-10мг тканини листя тричі заморожують і розморожують, перш ніж додати 0,1мг р-д-глюкозидази, Тип І! (Бідта). 9.5 Аналіз трансгенної рослини Агарідорвів5 Ттаійапа

Відірвані листки А. Іпаійапа просочують 2мкл (11-14С)-тирозину (0,05мкКі/мкл, 443 мКі/ммоль, Атег5пат) і залишають на добу у 100мкл Н2гО у закритих посудинах Епендорфа. Метаболіти екстрагують шляхом кип'ятіння 9095 метанолу протягом 5хв, екстракти концентрують і наносять на пластинки для тонкошарової хроматографії (Силікагель 60 254). Метаболіти відокремлюють у трьох різних системах розчинників, залежно від їхньої гідрофобность/гідрофільності. Систему розчинників етилацетат/ацетон/дихлорметан/метанол/вода (20/15/6/5/4, усі - за об'ємом) в оптимальному варіанті використовують для відокремлення різних ціаногенних глюкозидів. Система розчинників ізопропанол/етилацетат/вода (7/1/2) відокремлює різні глюкозинолати. Система розчинників толуол/етилацетат (5/1) відокремлює гідрофобні проміжні продукти. Радіомічені субстрати та продукти візуалізують з використанням люмінофорного фотоприймача ЗТОКМ 840 (МоїІесшаг бупатісв, ОА).

Метанольні екстракти листя А. Тпаїїапа, які аналізували шляхом тонкошарової хроматографії рослин, перетворених за допомогою Ра4бБОтув та Р4бБОох з використанням А. їштеїасіеп5

С58С1/роУЗ850/рРЯРІ111.79.71Е1, виявляють присутність нової сполуки, яка комігрує з ціаногенним глюкозидом дуррином. Обробка радіоміченим тирозином відірваних листків показує, що радіомітка міститься у смузі, яка комігрує з дуррином. Колориметричний ціанідний аналіз усієї тканини листя перетвореної рослини (Гатрегі еї аї, 1975, Апаїміс Спетівзігу 47, 917-919) виявляє, що Т1 трансформанти містили від 1 до бнмоль ціаніду/мг сирої маси. На відміну від них, контрольні рослини, перетворені лише прі з використанням А. Шптеїасіеп5 С58С1/роУз3850/рРАР1І111 виявили вміст ціаніду 1,2250,35нмоль на мг сирої маси. У диких рослин А. ІПпаійапа не було виявлено вмісту ціаногенних глюкозидів, і видимий рівень ціаніду, виявлений у контрольних рослинах, найбільш імовірно відображає присутність тіоціанатів.

Тіоціанати є продуктами розпаду глюкозинолатів, і відомо, що вони дають несправжню реакцію при колориметричному ціанідному аналізі (Ервіеєїп, 1974, Апаїуїйс Спетівігу 19, 272-274).

Продукування великої кількості ціаногенного глюкозиду дуррину в результаті введення Р45Отув та

РабБОох, яке спостерігалося на прикладі А. Тпаїіапа, свідчить про присутність ПШОР-глюкозилтрансферази, яка глюкозилує р-гідроксиманделонітрил, утвореного у правильній позиції. Оскільки стереоспецифічність глікозилтрансферази не відома, то існує можливість того, що утворений ціаногенний глюкозид насправді є таксифіліном, який є епімером (дзеркальним ізомером) дуррину.

Коли Р45Отув вводять за допомогою С58С1/руЗ3850/рР2Р111.79 А. штегасіепз в А. Таїїапа, у великій кількості накопичується сполука, яка комігрує з похідним від тирозину глюкозинолатом, р- гідроксибензилглюкозинолатом. Це свідчить про те, що введення Р4іБ5Отув веде до утворення р- гідроксифенілацетальдоксиму з тирозину. Похідний від тирозину оксим у такому разі далі метаболізується ферментами шляхом глюкозитпату до р-гідроксибензилглюкозинолату. Це чітко показує, що фермент, який за оксимом на шляху глюкозинолату, має низьку субстратну специфічність по відношенню до структури бокових ланцюгів і що профіль глюкозинолату в цілому визначають за субстратною специфічністю першого цитохрому Р450 на цьому шляху.

Субстратна специфічність Р450ох є не такою вузькою, як у Р45Отув. Р450ох може метаболізувати інші похідні від амінокислот оксими, наприклад, похідний від фенілаланіну оксим, фенілацетальдоксим, тоді як

РАаБОтув може лише метаболізувати тирозин. При введенні Р450ох у рослини, що продукують глюкозинолат, таким чином, можна сподіватися, що ціаногенні глюкозиди накопичуються як утворені похідними від амінокислот оксимами на шляху біосинтезу глюкозинолату.

Оскільки Р45Отув та Р450ох взаємодіють з ферментами та попередниками на шляху біосинтезу глюкозинолату, очікуєься, що профіль глюкозинолату також має бути змінений. 9.6 Аналіз трансгенної рослини Місоїапа їарасит см Хпапії

Виділені з рослин тютюну мікросоми, які були перетворені за допомогою рРа2Р111.79 і функціонально експресують СУР79У, каталізують формування тирозину у р-гідроксифенілацетальдоксим. Метанольні екстракти з відірваних листків тютюну, що експресують СУР79 і оброблені радіоміченим тирозином, містять три додаткові мічені смуги порівняно з дикою рослиною тютюну, про що свідчить аналіз шляхом тонкошарової хроматографії з використанням системи розчинників ізопропанол/етилацетат/вода (7/1/2).

Додаткові три смуги комігрують у тонкошаровій хроматографії з міченими смугами, виявленими у дикому тютюні, обробленому радіоміченим р-гідроксифенілацетальдоксимом. При, аналізі у системі розчинників толуол/етилацетат (5/1) підтверджується, що одна зі смуг є р-гідроксифенілацетальдоксимом, про що свідчить коміграція з холодними стандартами. Ідентичність двох додаткових смуг досі не виявлена, але, судячи з їх мобільності удвох системах розчинників, вони мають бути менш гідрофобними, ніж р- гідроксифенуіацетальдоксим, і найвірогідніше, вони Є глікозильованими похідними р- гідроксифенілацетальдоксиму. Аналіз СУР7ЗУ-рослин підтверджує, що СМР7З може функціонально експресуватися у тютюні і що при цьому утворюється певна кількість вільного р- гідроксифенілацетальдоксиму, але більша частина утвореного р-гідроксифенілацетальдоксимудалі метаболізується рослинами.

Рослини, що експресують Р45Отув та Р450ох, можуть бути одержані шляхом схрещування рослин, що експерсують РА5Отув, з рослинами, що експресують Р45бох. Або ж рослини, що експресують РА5Отув або

Р4а4Ббоох, можуть бути заново перетворені за допомогою А. іїштетасіеєп5 С58С1/роМ3850/рРАР221.71Е1 або

А. Титегасіеєпе С58С1/реМ3850/ рРАРІ111.79, користуючись тим, що дві послідовності цитохромів Р4А50 зв'язуються з двома різними невиключними маркерами резистентності, прійІ та аассі.

Приклад 10: Експресія дуррину у трансгенній кукурудзі 10.1 Створення векторних плазмід

Наступні два вектори, рСІВ 9842 та рсСІВ 9833, утворюються протягом біолітичного перетворення кукурудзи за допомогою Р45Отув та Р4А5Оох. рСІВ 9842: КДНК клон, що кодує Р45Отув, клонований у ЕсокК! сайт рВіцезсгірі ІІ ЗК, як описано у

УУО095/16041, використовують для утворення Ватні сайту у старт-кодоні АТО кодон та Ва ІІ сайт у стоп- кодоні шляхом РСЕ. Ватні-Ва! Ії фрагмент, що містить ген Р45Отув, клонують у Ватні та Ва ІІ розрив рСІВ 9805, рослинний вектор експресії на основі рОС19, підданий інженерії за допомогою АТШИ/Мо/Авсі сайтів за 256 пар нуклеотидів до Ніпаїї! сайту і через 778п.н. після Вод сайту, що містить промотор на зразок металотіоніну, описаний в ЕР-А-452269, та 355 термінатор. рСІВ 9833: Р450ох кКДНК клон за Прикладом, клонований у а Мої-В5іІХІ сайт рсОМАЇ! (Іпийгодеп) використовують для утворення Ватні сайту у старт-кодоні АТО та Ваді ІІ сайту у стоп-кодоні. Ватні-Ваї Ії фрагмент, що містить Р45бох ген, також клонують у рСІВ 9805, обрізаний за допомогою Ватні та Ва. 10.2 Способи перетворення кукурудзи

Ембріогенні калюсні культури | типу (сгееп еї аї, 1983; УМап еї аї, 1994) ланкастерського інбридингу ініціювали з недорозвинених ембріонів, 1,5-2,5мм завдовжки. Ембріони асептично вирізають зі стерильної поверхні вирощуваних в оранжереї колосків приблизно через 14 днів після запилення, поміщують у середовище Дункана для ініціації калюсу з 295 цукрози та 5мг/л хлорамбену і культивують у темряві.

Ембріогенну реакцію видаляють з експлантатів приблизно через 14 днів і поміщують на стабілізуюче середовище Дункана з 295 цукрози та 0,5мг/л 2,4-4. Через 4-8 тижнів щотижневого пересаджування для оновлення стабілізуючого середовища з'являються високоякісні компактні ембріогенні культури. Активно зростаючі ембріогенні фрагменти калюсу відбирають як тканини-мішені для введення генів. Фрагменти калюсу поміщують на планшети-мішені, що містять стабілізуюче середовище з 1295 цукрози приблизно за 4 години до введення генів. Фрагменти калюсу розташовують колами, за 8 та 10мм від центру планшету- мішені. Плазмідну ДНК осаджують на золоті мікроносії, як описано у посібнику биРопі Віоїївііс5. Від двох до трьох мкг кожної плазміди використовують у кожному б-дозовому препараті. Гени вводять у тканинні клітини-мішені з використанням пристрою РОБЗ-І000ОНе Віоїїстіс5. Параметри пристрою Віоїїсііс5 є такими:

Змм між диском розриву та макроносієм, 10мм між макроносієм та гальмуючим екраном і 7см між гальмуючим екраном та мішенню. У кожен планшет-мішень двічі вводять дозу з використанням дисків розриву 6б5Орзі. Між гальмуючим екраном та тканиною-мішенню розміщують сито з нержавіючої сталі 200х200 (МеМазіег-Саїт, Меж Вгипзм/іск, МУ). Через сім днів після введення генів фрагменти тканин-мішеней переносять з високоосмотичного середовища до селективного середовища, що містить 100-120мг/л глюфозинату амонію (Вавзіа). Усі амінокислоти видаляють з селективного середовища. Через 5-8 тижнів на селективному середовищі високого рівня усі колонії, що розвиваються, переносять до середовища, яке містить 20мг/л Вазіа. Ембріогенний калюс переносять кожні 2 тижні протягом 4-8 тижнів, а потім переносять до зміненого М5б-середовища, що містить 395 цукрози, 0,25мг/л анцимідолу, 0,5мг/л кінетину без селективного агента і ставлять під світло. Анцимідол та кінетин видаляють через 2 тижні. Паростки, що відновлюються, з корінням або без нього, переносять до ящиків Магента, що містять М5-середовище з 3905 цукрози, і молоді рослини з корінням зрештою відновлюються і їх переносять у грунт в оранжереї.

Приклад 11: Ідентифікація гомологів Р4А5Отув у видах, що містять глюкозинолат, шляхом РСК

На основі комп'ютерного визначення послідовності гомолога Р4А50 тув Агарідорзіз Е5Т (інвентарний номер Т42902) та гомолога Р45Отук від зіпарі5 конструюють два вироджені олігонуклеотиди-праймери, які дозволяють ампліфікувати фрагменти РСК гомологів Р45Отув з видів геномної ДНК, що містять глюкозинолат. Смисловий ланцюговий праймер (5-саСОсААТТСААНССІСААМИІСАМУТ-3) охоплює збережену амінокислотну послідовність КРЕКНІ (5ЕО ІО МО: 18) і включає сайт клонування Есокі.

Антисмисловий ланцюговий праймер 2 (5-2СОаСАТССАСАІССІСКУТТІССМОТ-3) охоплює збережену амінокислотну послідовність ТОККОС (5ЕО ІО МО: 19) і включає сайт клонування Ватні. РОК здійснюють на геномній ДНК, приготовленій з використанням комплекту Мисіеоп Рпуїориге Ріапї ОМА Ехігасіоп з

Амстердаму. РСЕ здійснюють у загальному об'ємі 100мкл, що містить 5906 ДМСО, 200мкМ амМтР, 200пмоль кожного праймера, 2,5 одиниць Тад-полімерази у буфері для РОК (50мМ КСІ, 10мМ Ттгі5-НСЇІ (рН 8,8), 1,5мММ

Мас» та 0,1 95 тритону Х-100) з використанням 1мкг геномної ДНК з зіпарів аїбра, А. Іпаіапа, Вгаззіса пари»,

Тгораеоїйт та/)из або М. тарасит см Хпапії. РСЕ здійснюють у чотири послідовні етапи: етап 1: один цикл у 5хв. при 957С; етап 2: 5 циклів по Зосек. при 957С, ЗОсек. при 557С, ЗОсек. при 7270; етап 3: 30 циклів по ЗОсек. при 957С, ЗОсек. при 60"С, ЗОсек. при 72"С; і етап 4: один цикл у 5хв. при 7276.

Для утворення достатньої кількості смуги приблизно у 100п.н. з Т. та/)ц5, етап 2 може бути змінений на циклів по ЗОсек. при 957С, З0сек. при 50"С, ЗоОсек. при 71"С. Продукти РСК очищають з використанням комплекту ОІддніскК РОК Ригіїісайіоп Кії (Оіадеп), рестрикційно обробляють за допомогою Есокі та Затні і відокремлюють на 395 ТАЕ-агарозному гелі. Вирізають домінантний ланцюг приблизно у 100п.н. і лігують у лінеаризований за допомогою ЕсокУВатні рВінчезосгірі ІІ ЗК (5ігаїадепе). Приблизно 10 клонів з кожних з 5 зразків секвенують з використанням комплекту для секвенування з флуоресцентно міченим праймером

ТНепто Зедиепсе РіІпогезсепі-ІабеПей Ріїтег (7-деалга СТР) (Атегзпат) і аналізують на АГР-Ехргев5 (Рпаптасіа).

З чотирьох видів, що містять глюкозинолат, 5. аІра, А. (ШТтайапа, В. Мари5 та Т. та|и5 ідентифікують фрагменти РСЕ, що кодують збережену амінокислотну послідовність,

КРЕАВН(І/Р)МЕСЗЕМТІ ТЕМОЇ АРІБЕВТОаКНОГС (БО 10 МО: 20 та 21 відповідно) Ця узгоджена амінокислотна послідовність є ідентичною раніше ідентифікованим гомологічним РА5Отув послідовностям з 5. аіІра та А. Тпаїіапа і є дуже подібною до амінокислотної послідовності РА5ОЇУуг. З рослини, що не містить глюкозинолату, М. тарасит см Хпапії фрагмент РСК, що кодує цю узгоджену послідовність, ідентифіковано не було. Присутність цієї гомологічної Р45Отув узгодженої амінокислотної послідовності у наведених чотирьох видах рослин, що містять глюкозинолат, показує, що цитохром Р4і50 амінокислотної М- гідроксилази з родини Р45Отув перетворює вихідні амінокислоти або вихідні амінокислоти з видовженими ланцюгами на відповідні оксими у глюкозинолатах. Утворення фрагментів РОК, специфічних для гомологів

Р4іБоОтув дозволяє здійснювати виділення гомологічної кДНК або геномних клонів з відповідних бібліотек.

Хоча цей винахід був описаний у деяких деталях шляхом ілюстрацій та прикладів з метою більш чіткого розуміння, зрозуміло, що у ньому можливі певні зміни без відхилення від суті формули.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

(1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ: () ПОДАВЕЦЬ: (А) НАЗВА: СІВА-СЕ|СУ АС (Б) ВУЛИЦЯ: Кіурескеїг. 141 (В) МІСТО: Базель (Д) КРАЇНА: Швейцарія (Е) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС (2ІР): 4002 (Є) ТЕЛЕФОН: 41 61 69 11 11 (Ж) ТЕЛЕФАКС: - 41 61 696 79 76 (3) ТЕЛЕКС: 962 991 (А) НАЗВА: Коуаї Меїегіпагу 5 Адгісинкига! Опімегезйу (Королівський університет ветеринарії та сільського господарства) (Б) ВУЛИЦЯ: 40, ТПпогмаіазепзме) (В) МІСТО: Фредеріксберг (Г) ОКРУГ: Копенгаген (Д) КРАЇНА: Данія (Е) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС (2ІР): 1871 (ї) НАЗВА ВИНАХОДУ: Цитохром-Р450-монооксигенази (її) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 21 (м) ФОРМА КОМП'ЮТЕРНОГО ЗЧИТУВАННЯ: (А) ТИП НОСІЯ: Дискета

(Б)КОМП'ЮТЕР: ІВМ РОС (В) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: РО-ББО5/М5-605 (Г) ПРОГРАМА: Раїепііп КеїІеазе й41,0, Мегвіоп 21,25 (ЕРО) (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 1: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 1929 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: подвійна (У) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: РА5ООХ (іх) ОСОБЛИВІСТЬ: (А) НАЗВА/ЛКОД: СО5 (Б) РОЗМІЩЕННЯ: 81..1673 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО МО: 1

УВК МИАЦВ. МУЛ МТОСВІВІ СЛХПУККЮХ КОСА СеЖХКА й пХУКУАСОХ ВИАХГТАВСВ А 0КУ: МУ МИ КС АБО ОХ СВ РО ТР Мо

Мекодіц бу Ми діа лит шо» ЗІ їх и з к мг дО АЮ СТИ ПО ПАЙ СО ЗДО ПМ ОМА СР СМ СК Я ТО СР ІА сту цім дих ММ) Ето пу пі бро дль Му схе єз іл) бо1 іх: Кк т То хх сорОЖО СІ са М; ЛЕМ ТМ СТМО СТО СО МК М жа МОХ МУ Ме а уп уні ів оім УВО їею Тут ух фео їм В дек Моз їх Вій ШІ

У 5 У

МУ МЕ МД МУ СУ ВМО ОС: ТАМІ САМО СУХУ КЗ СХ СИ АХ ТИХО Ж І: дсу йхх дур бук біт бух їжу МІЖ пу доти Лищ рем Бго Бко су

М що З «СКК СВІ СВО ХУ ММ С С РАС СТО СВО С САМІ СОС хи

Я Ах ошмієм Зо Х1е Їх: ліж бло зо Піо Мео зх ВІУ го їв на ЕЗЯ то

ПО ПАХ АМО АМСУ СЕК УМХ СР КО С СУЯ МАЮ БУ СОМ ТО АТ я5а виз ійкоіув йо їм МУ Сім їм Ма би боху Тут ЗІК Бта УВІ КеУ

ЧЕ Ви 85 ЕІ

СА СИ: ОХ СТА ОКО ТОЮ СП СУХА ВОЗ ППО ЗХ Са СОС МО ЗКУ ТКУ 358

Тім ог бод їм іу хм. го се Маії ул! Меі Бех Пежо щія ДІ че їх 155

ФУХІ ИХУ ТД МІ УА У ПІ МА СМ СУМІ СП ПОС ЩО МОМ АЖ ря

А Ма льи о уді іч дух УА Мік бдромя! Кщросме бух ех ВЕД.

МУ МУ

СХ ХО ТО СХ КИ СЮ ЛІД СУХІ СТО ТОХ ЗУ СК СТО ДАВ МАТ ОВУ я

То ві бу Жхз ЗМУ Жко Цех Луф ім бек обуг Ажи Мо Мих Ві Мах 155 155 135

МОТО ОО АХ М КІЛО МА САМО ях СОУ: СИМ: АЖ ОХ АМО СТО ТВ щі

ПІХ ВИЄ АРА ми Тум шіу ТИ ТУук Тер хру лій вхо буху Іл злих Бх

М 145 ії

Сп СТО ОМ СТО С МУ: МУ; СХ ЗО М ОХ ОО БО ТАЄ СІ хо дж їжю ОБУ хе тим: Бех Мох Аду дуеф М ГМх Віа Мі Сто бе лів.

ІВ 1650 155 УЮ

ХХЖІ СИ СМІХ ЗМІ АТО ЗА РКУЗ ТІК ЛИ МКУ АЮ СО СО п УЮ УК охВ фра Іо со Моє дер Амріїхи: ук Ма зо їх Ме лу Мо Мія у 150 І85

М КМ Ам ОС ОС РО ОО І Аа ек САС СИ Те о с А 5

Віа лек офуз Лія дех Д16 МАХ ра Ас Ака Ніл мкА Бе Важ їею. ТИХ пу 185 тла сп ОЖА АК ВИС Юм МР ТАМ; МОЮ АБО ДО М СК СО МК КЕ

Кер МУ Бе Те ЯМУ їх УВІ АР бе Ху вже ЗХ тує АХ Заг зле 205 а ХР; «доли ху; пі ДМХ ЛИ ЛЮ У СА ПИХО ПУ СО; сбмт ся 0ИОАХ Тло ср оРвя ДІ ІБ іУх Мо Бра Ме см опік ул) їк Акр о бер КАХ Мох. зо ри ж

ФС МІ МИ: У: МУ КИ СХ ОК ОХ АХ СТАС И: КОМ ЛІ АХ ОМ а хр мех Ми Дік йек Ріх Вис до 03 Лех» жо ве Реп доп Ма Ах

Х35 Кози 245 а

ППО СО ШИ САД ОЛОМ СТ ОХ М У СК СЮ СОКОМ АЖ ІМ ТЕ

Оу АК кю Ла Ар лу їх Щи Лу ЖПе де Лія Мо) Вт ПР ОА

М хво ХУ

М: ЗАС Ам ШМРСЛО ВАС РО ТР: СУТ АК МО ЦИ МО А САВ ОАЄ Б фін тре дхе о іо ЛЗ Ма). Би бю бо пох А Лів Бер оліа щцЕ та те з

МРС ЗАТ СК СКМ ОА СО МУ СКУ САМІ АМО МАТ АТ АВ КО МН ТЛІ Ух

Мол со Ах одкщо што МММ Бгто бер Ако ОКУ ХУ Лев мам УА Й ик 25 БЕ

ЯМИ А МО ЛО ОЙ БА СМ СМ Ся! СЮ ДЮ СТ СК З ОКО их

УАдЕ ом ХЕе Ам їх: СУ фра Ім МідоАви П3У ТУ си деч бе пи ло За КаКу

Мф СА ОСС ЛАВОК ДО СО СМС ЗАЛ ОВО МІ ММ: ЕІ КОСА З

Яку бхромомх УК омик іх фе Укі ім Мо бо: я іх піт МОЮ

М за Кая І

СЕМ МК СМ С У МО СИ АХ ЦИ МО ОО АОС: МТ С ща

ВО обме Бе Зеу МА Ки Щів їх Тур Лія Мебобех СР: дл: БМх щоці

З35 З 345

ВМ ОМ; см: ба СМ ОК ла САМІ СМ КАХ ДО ДИ І ШК Ж ПРО 1355 їуо ЖУЛЯ хаз ідо овма Мо МБ сім АХ ЗВ ні рух ме Мій УМ 3 зи зв

КОМ САС ЛА СОХ СОС ОО АЩО ЛІ МА ОК ЛИ КТ АКОТ ІХТИ їла пам Мхо Лу лих гри ох уні хо ех С3МоВою АОдОАЛВМ Млив Діє й з о З;

ДИМ. СД АХ ЖИЗ ХО РІ АМО ВД ОВОЗ СМ; СКУ ХК СО ОС ОК Мих

Жук оїлч ез Мак А У) фух М; це бхи! Вб їххі ВІ Ре бух Ма

Зих ЗЕ з

М СІ СХ; ПУХ ОО ОМ ЗАЗ М: АТ С ДАО ме м мі п 1312

ЧЕ зак: їм Ул) Бл Аа бі бік Моє дуж дер фах Ту Ті) сук МУ п Я 05 ща

ТОМ СТОЮ ТА ОМА РІ ЗИ ОО АМС КО СВК ОА 1

Зупожме МВА бю дій Аоз ТОХ люд УЗ) Же Ум. бук Міо Укр Ал 11ю таз; м см соЗ Ос ВС ОХ ССЗ З ОК ЗАС ОМ ТС А са що 105 бі дм| лко Ми» лів пек Тер Рхо ліва гро Ар уз ше Лаб тк АБИ со ЯМ 45 со тло ОД АЗО ЗДО Те шАС ТАС ТАЄ б ТО СВО ТС СО зн рт не мі СУ пе: АхроМВі ляр Тус Сук бу Бех ор Бе а їх

А «55 «55 ма стаю ох АЮ Же Ол СМ ме м З і592 рго бе ЩіУ Лів бі Люка ли ТМ сСую г» Лу зом тих Мех бі йо авг г сВРОЖЮ АМІОЗ МХ ТМ М СМОЛА СТО ЛІ Б ОМА ТО СТ 1550 жі ли лож) МА Ям Бом обі ім Мій йопоїюм їмо зЗух бук отут Алр а дво их сви то І СО 0 СК МТ Ам СО БАС ОАЄ МТС МУ: УМ САМ НКУ. ї1п58 пр оАіа рез роо Су Аз Мек о фую п) їли Ар Маї Бо май 3М СК з 505 що

ВМО МОВ ШОЛОМИ АД СУТО МІ СЮ АК ДОВ С ОСТРОВІ ВІ СИ С ІМмЕ сх су діа тям Збг ШУ нів дор був ЯК Бию іо Ма) пі уві бо

М ЗМ ша

ВІ Ма ША ВАС АР СХУО ККВМ СКМ СКОТТ ВОМУ 1533

Фе бує бух їж Ах до Деу Ах Ах

Б Зо

МЕПАТАМИ ККУ ЖУМИХА ХЕ СЕЗАМТАМИ УХА И КРАЛУВСТМІ Уа

СТАТКИ АХУ ВИТ АТЕ РОТА ТАСВ ЗОБУ САІ ФОЛІО СУТІ ММ

СКАРКУ ТАРІ ПЕТТІ ІСТУГІТОТ ЗАТАСОТУМТ ВТРУ КУДІХ МТА Та

САБЛЕУЛИХ ВИЕАМТВАВ СОЛІМУСАСА СІОЖАУХТ АЛАЛАЛАЛИА ЛЕВА ІБ

() ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 531 амінокислота (Б) ТИП: амінокислота (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: протеїн (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 2:

Мес Аза пу ЧЕ Аза тає Рко С3р Тсю гед сім С1у Бех чаї ро ої х 5 10 15 біз Тер НТК Суб їеи Гез уУкі Тед геч Рко Маї їео іо ув) бак 20: 25 39 тук тус тем їем ЧО бек олкш Бех Ако Ав дго бет Акщ Бех Су ув

Тепй йіу 5іу Ата Рго Аху їй Ро Ркесбіу Рго Аза біп тей Рко Т1е 55. 60 ївч с1у Аєп ва Нів Тл оїен біу Ро Гей Ргоо Нів Пу5 Аєп Те Мо т 7 во 1) гез Аза йсецоАку Тук Зіу Рго Уві! Ме 14 Гей дку Іжа у Тео на чо ВЕ

УЗЕ Рго їж Уві уаї Маї бек беж ЛІВ бій Аза Аза Ато бі Мак Мо 150 105 110

Тує Маї Ні Азр уві Аяр о Сув Сув Зек Ауд рко Ата Бек Ро сіу рко 115 120 125

Гу Ах Іей Бех Тух Аврорец Гуз Ай Уві С1у Ре Аа Ро» Тух З1У 130. 135 140 сій оТук ТтроАгу Сіно Меє Аку Пув Тец Бе Ата тей бію їхах Тл Ве 145 150 155 о

Мес вк Вку Укі Був Аа Азо Су Тух Аза Ако бій Чіп о С01й Меб др ї65 179 175

Ага рец Уа! АтТа Ар Геи АБО Акп Аза АТа Аза бек їуб Аза Бек ЩО 150 185 1850 що

Маї Гл Ав Авр Нів Уа) пе Аїа Ту Тих Аєробіу ліє тів піу бе 195 200 205 чаї ді РП сіу Акпоїїе Ту літа Бех їме СІВ Ре Аза нів Сук ОХ 210 515 270

Мої ре піп. Ні Маї 125 Абр лер Міла Має вер Ме Мей Аза бек рре 225 235 235 245

Беї Віа СТО Авр РО Бе РКО Асц Аа діа б)у Му їі Аіа Абр АЛ 245 250 255 їсте Бех Сіу Ре цей Аза Ахо Аку біш Ако Те Ре Або бІю Їх Ар

Бо 255 - 275 хаї Ре Ре СТ: рув Уві 112 Ар біб Вів Меб Аєр Бло Дів дру Руо 275 280 285

Мах рРко АВ Ап с1у біу в5р ей Уві Авр Маї Тей їіє деп їй Суб 735 7235 399

Туз Та Ніб АБр о Сіу Тк їм Ако Бе То: лк АвроНія Уві ув лі 305 310 315 320 тТіє ві їев дар Тл Рве Тіе С01у Ма 112 Ар Торг бек бек Уві ТВХ

Зак 330 335 116 Пем о Тжро діа Мер бек бі тео Меє дго ув Рко бій Уаї Бей ху 349 ЗІЗ 350

Іув Аза сій Аза сів Маї Ак вза Ма мах С1у Ар Авр Був ро Ах 355 350 3655 чаї Ат Бех Мр АБр дів Віа Пуво11е Бго Тух їм Ід Меб уві Уві 379. ЗВ 385 їхв бій Шг без Дюд Тем НіБ Ро Ро Хі Твгоїєй їз Уаї Рро ДЯ 285 350 395 400 бій Твг Ме Агро Авробвх бій Тіз був 61Уу Тут АбБр о МА1 Рго Віа Ап 405 Фо 415

Тит обту Уаї Ре Ма)з двлодіа тр Міз І1е б1у Бк Аврорко діа Бех л2а 225 430

Тер Рго Аза Рго Ар СТ Ве АБО го Ар Аку Епе Уві сіу бек Ар 435 440 445 чаї Вр о Тук о тТух біу бвг Дів Ре СІ Іли 116 рРго Рре с1у діа су 459 455 або лу вуа ї1е Су Рто піу Тем Тиг Мес 1у бі зЗрх Ав Ма! ЗДО Не. 455 «0 «715 480

Тох Гео Аза Ази оїєо Тлц Чух Суб Тук бар Тв Аза бе Руто біу дів 485 435 ав

Меб бує Рго 310 Абр оуаї бек Мет сім с15 Тпхо сім Аза Гей Тижк рре 500 505 51Ій ніз Акту бух Того Ії уві У уві Рхо Тас зуб Ту Пув Ави Дю

БІВ 50 - 525 лгч АТаА діа 530 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 3: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 16 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид

(м) ТИП ФРАГМЕНТУ: М-кінцевий (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: М-кінцевий пептид (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮО МО: 3:

Ав Так Тих Аа тлу Рго бій іви ви су (Чу Бег уві Ре Дій 1 5 10 15 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 4: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 13 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНІДЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (м) ТИП ФРАГМЕНТУ: М-кінцевий (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Внутрішній пептид

Меї Ар. Аго цен Ма! Ліз Авр їв Аврі Аго Аа. Аа Дів

І В 16 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 5: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 26 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 1 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО І МО: 6: аСаапААТТСТ ТМПІССМОаА НМОМТТ (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 5: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 6 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (м) ТИП ФРАГМЕНТУ: внутрішній (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Амінокислоти, кодовані праймером 1 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО І МО: 6:

Рпе хав Рго З ме рда і (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 7: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 26 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 2 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО І МО: 7

БСООСАТОСТ ІЯСАННОСК МОСК

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 8: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 7 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (м) ТИП ФРАГМЕНТУ: внутрішній (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Амінокислоти, кодовані праймером 2 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 8 су Аго Аго Хаа Суз хва Сіу 1 : В (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 9: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 17 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна

(ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: 77 праймер (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 9

ААТАССАСТО АСТАТАЄ

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 10: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 24 пари нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (У ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна ) (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: специфічний до гену "12" праймер (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 10:

ОСОСАТООВА СТАСТАВООО ТСОС

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 11: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 25 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (У ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 11: асСОбАТОСТІ ТТ ТМ (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 12: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 24 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (У ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (мії) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: специфічний до гену "7" праймер (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 12:

ВСОЛАТССОА САТСААСООС ССО

2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 13: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 44 пар нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (У ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер З (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 13:

СОВосООАТССА ТАТОБАСОСА ТСАТТАСТОСЄ ТСТОоСатоос сте (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 14: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 31 пара нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (У ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 4 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 14

СОСААССТТА ТТАСАТСТСА АООСОБАССС Т

(2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 15: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 41 пара нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (У ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 5 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 15:

СОСООАТОСА ТАТВОСААСА АСАССААССС СОСЛаСТОСТ Є (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 16: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 39 пар нуклеотидів

(Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (мі) БЕЗПОСЕРЕДНЄ ДЖЕРЕЛО: (Б) КЛОН: Праймер 6 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО І МО: 16

СОСААОСТТА ТТАТОСТОСО СООССОВТТСТ ТаТАТТТОВв (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 17: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 542 амінокислоти (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: невідома (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: протеїн (ії) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (її) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (м) ТИП ФРАГМЕНТУ: внутрішній (м) ДЖЕРЕЛО ПОХОДЖЕННЯ: (Б) ШТАМ: 5іпарів аіра (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 17

Мек деп Трт Где Того бе реп Баг ббу Вер Гея ак Бе тах ТАС Пув їЄ 5 ії0 І5 а Так єс бек ре Бех Ап Меї Туг Тед тло Тр Ліс ем сів діа 20 25 30 тре чаї Аїа т1е ку їла Ма1 Меє тай пе був Був Маї їм Ма. еп 35 «0 «5

Авр ТИХ АБ ІДИ їуБ ПЦув еп бек гей Рго ро 01 Рго Тк СіУ Тр 50 55 (1)

Рто Ха Ба Ру Меб уаї гто Ту МЕС їі див Бех Аху рт Маї пе 65 70 та 80 дто Тер є» Ків бех Т1е МЕ Гув бів їм Аво Тахо сів І1е л)в Суб . 85 50 85

Уаї Вуд шо Сіу бег Тг Ні Маї 16 Тахо уаї То Сує Бго бук Т1Є 100 105 ії

Ліа ду сію Уві їєм був сіл) СІ Ар Дія Те) Бе А1а бекіДка Рго 129 125

Меє ТоготТук діа біп Ай Узі гей бегоАст 0)у Тух Ту Торт Суз Уві 119 135 140

ІМе Тих Бе РБе СТУ 030 сіл Бе цув Гуз Меб Моя тув чаї Маї МеЕ 145 150 155 160

ТЕ Оу єю Маї Сух Ркго А1в Ако Ні Аго Тер оїєю Ні сій Пув Ву 165 50 ь

Ма біз біз АєпоАвр Ніє Ге Трж Але Тер уві Туг Депо Мес уві Доп 180 185 130

Аепо бек Авробек Маї Бер Ре Агко Ріє Уа) Трх Вка Нів туго Сув ДУ. 195 200 205.

Звпов1а тіє ру ув рец Мак Ре О01у Пре люд Тек Бе бек 013 дБ 210 915 220 тре Аза Ро Взпосіу Ту Рго Тато АТа сій лер ЩТ1е 01й Нів Мої бі» 225 230 235 240

Аза мес Ре Їй Аіа іє Су Ве Тух Бе бер Бе був Ше Бек АБИ 285 250 255.

Яут ієм Рко БІ6 Тем Тр Оу їв ляр бе Леп обі нів о3и Муз Ще 250 255 970

Мес дич дер бек Бех Ліа Ї1Те Меб Аер Був Тух Нів Абр Ро Те Те

Й 818 т5а 285 дер та Ато І1е Шуз Мес Тер дк сім Сіу Був пуб ТИ бій Х1Є 253 285 300

Дер ре кем лер Хе іме Х16 беу ХЗе мує Авробту Бі ОБУ АзпобгОо 305 Зо 315 220 тем їла; Тж Аза Ар 10 Тіє Був Веб Тв їЇ1е Був СТ Тєб Ма) Меє 325 330 335

Ма міа рРхо Аброд5В рхо Бек реп Аа Ма) сїй Тср Аза Ме Аза б

За0 45 350

Мек Маі Меп був Руо сім Те 1єб Ак Гуз Аза Мех сій СТЮ І1е Ар 355 350 65

Акз маї МУ сіу їв ім Ахо їм Мах ЗМ біо Бех Авродів Бко ув 370 375 зво

Ім Всп о Тух Уаї ув АЛа 112 Гез Аку біз Дів Ре Ах Те Нів Ро 385 380 395 40 уві вів Аїа Бре Депотей Рхо Ніє баї М1іа Гсе беж Вер Аза їк Маї 805 0 415

Аїа сіу тТук Ні Ше Рго ув с1іу Вет піп о уві Тет ей Бех Аку Тут дгй 425 430 сіу іч 01У ку беп орто Був Уа) Тер Д1а Асро Рго Гец бек Бе Був 435 А4О 445

Вко сії Аку Ні Хєт Мем біз Суд Бек Сі мах отет Бей оїе із ляй 450 455 або

Авроїєч Аку Бре Ле Бет Ре бас Тек П1у- Хва Яку С1у Сує Аза осла 465 ато. 475 4850 го Ма тем С1у Ти Аїя Тез Ту Тех Меб їем Гей Ліз Дкт рей сте; 485 4950 3835 сб сіу Вре Тр Тер оМув їм Ро 01» Ав» бій Тк Ауу Уа Фі Тео. 500 505 510

МеБ Сім Бех бек Нів Аєр Мес Бе ва Ав Ту Рго із Узі Меб Маї

БІ 520 25 су сти їеш Аку Єви Рго Сб Ні Сец Туг Рго Таг Уа! ув 5ЗО ; ЗБ дО (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 18: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 6 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (м) ТИП ФРАГМЕНТУ: внутрішній (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 18:

Гуз Ріо Сі. Аго Ні Бей 1 5 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 19: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 6 амінокислот (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (ії АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (м) ТИП ФРАГМЕНТУ: внутрішній (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 19:

Те у ув Ага сіу був і 5 І (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 20: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 31 амінокислота (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична

(Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (м) ТИП ФРАГМЕНТУ: внутрішній (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІЮ МО: 20: їувляго сви дго Нів беу Ап ли Суз Зег Сіш Ма! ТНг Сем ТВі 1 5 10 15

Авп Ар Мей Деу Рне Пе Зег Ре Зег Тпг Оу був Ага Су Суз 95 30 . (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО. 21: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 31 амінокислота (Б) ТИП: амінокислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: пептид (ії) ГІПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: НЕМАЄ (ії) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: НЕМАЄ (м) ТИП ФРАГМЕНТУ: внутрішній (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 21: ув Рго сім Ага Нів Ре Авзп Сію Суз бег спи Май Тигоау Те см і 5 10 15

Авп Ар ви Аго Ре Ме ет Ріпа. баг Ти сну бує Ага Су Су 29 25 Зо Й

Claims (9)

1. Спосіб виділення ферменту, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил і перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин, який включає: (а) виділення і солюбізацію мікросом з рослинної тканини, яка продукує ціаногенні глікозиди, (б) направлення солюбілізованих мікросом у колонку, яка заповнена ДЕАЕ-сефарозою, промивання колонки і збір прогону та промивних фракцій, (в) ідентифікацію фракцій, які містять фермент, (г) додавання Тпюп Х-114 до фракцій, отриманих на етапі (в) і центрифугування до утворення двох фаз, де нижня фаза містить фермент.

2. Фермент цитохром Р450іі-монооксигеназа, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин, який має молекулярну масу 55 кДа, що встановлено за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (50О5-РАСЕ), та М-кінцеву послідовність, наведену в ЗЕО ІЮО МО: 3, і отриманий з використанням способу за п. 1.

3. Фермент за п. 2, який відрізняється тим, що має послідовність, наведену в 5ХЕО ІЮ МО: 2.

4. Молекула ДНК, яка кодує фермент за пунктом 2 або 3.

5. Молекула ДНК за п. 4, яка відрізняється тим, що вона кодує фермент рослини, вибраної з групи, яка включає види бЗогапит, Т/йоїїшт, І іпит, Тахив, Тгідіоспіп, Маппіної, Атудааїшв, Ргипиз та хрестоцвіті рослини.

6. Молекула ДНК за п. 4, яка відрізняється тим, що кодує (цитохром Р45Осх) монооксигеназу рослини 5огупит Бісоог.

7. Спосіб виділення молекули кКДНК, яка кодує фермент, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил та перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин, який включає: (а) виділення ферменту з використанням способу за п. 1, (б) необов'язково визначення повної або часткової амінокислотної послідовності ферменту, отриманого на етапі (а), та конструювання олігонуклеотидів, (в) зондування бібліотеки КДНК рослинної тканини, яка продукує ціаногенні глікозиди за допомогою вироблених до ферменту антитіл або олігонуклеотидів, специфічних для ДНК, яка кодує 4-15 амінокислот вказаної послідовності ферменту, і (г) виділення клонів з КДНК бібліотеки, де ці клони включають молекулу кКДНК, яка кодує фермент, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил і перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин.

8. Спосіб отримання трансгенної рослини, яка включає стабільно інтегровану в її геном ДНК, яка кодує фермент, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил і перетвореня цього нітрилу на відповідний ціангідрин, що включає: (а) введення у рослинну клітину або тканину, яка може бути регенерована до цілої рослини, ДНК, що включає ген, який експресується у цій рослині, який кодує монооксигеназу за будь-яким з пп. 2-3, або молекули ДНК за будь- яким з пп. 4-6, і (б) відбір трансгенних рослин, які містять вказані ДНК.

9. Спосіб отримання трансгенної рослини, яка виявляє знижену експресію ферменту, який каталізує перетворення альдоксиму на нітрил і перетворення цього нітрилу на відповідний ціангідрин, який включає: (а) введення у рослинну клітину або тканину, яка може бути регенерована до цілої рослини, ДНК, за будь-яким з пп. 4-6, яка кодує смислову РНК, антисмислову РНК або рибозим, експресія яких зменшує експресію ферменту за будь-яким з пп. 2-3, і (б) відбір трансгенних рослин.