UA68333C2 - Modified factor vii - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується нових способів лікування та нового використання модифікованих форм Фактора 2 МІ, які інгібують формування тромбів, підтримують або поліпшують прохідність судин, поліпшують місцевий кровотік у міокарді та модулюють пошкодження міокарду під час постішемічної реперфузії.

Коагуляція крові є процесом, який складається зі складної взаємодії різних компонентів крові або факторів і який зрештою викликає утворення фібринового згустку. Взагалі, компонентами крові, що беруть участь у процесі, який отримав назву "каскаду" коагуляції є проферменти або зимогени, ферментативно неактивні 70 протеїни, які перетворюються на протеолітичні ферменти завдяки дії активатора, який сам є активованим фактором коагуляції. Фактори коагуляції, які були піддані такому перетворенню, які мають загальну назву "активні фактори" і позначаються додаванням малої літери "а" (наприклад, Фактор Ма).

Активований Фактор Х ("Ха") є необхідним для перетворення протромбіну на тромбін, який після цього перетворює фібриноген на фібрин на остаточному етапі утворення фібринового згустку. Існують дві системи або 72 два шляхи, які сприяють активації Фактора Х. "Внутрішній шлях" стосується реакцій, які ведуть до утворення тромбіну через використання факторів, присутніх лише у плазмі. У результаті серії опосередкованих протеазою активацій зрештою генерується Фактор ІХа, який разом з Фактором Мійа розщеплює Фактор Х на Ха. Такий самий протеоліз здійснюється Фактором Мііа та його кофактором, тканинним фактором, "зовнішнім шляхом" коагуляції крові. Тканинний фактор зв'язаний з мембраною протеїном, і він за звичайних умов не циркулює у плазмі. Однак, після розриву судини він може об'єднатися з Фактором Мііа для каталізу активації Фактора Х або Фактора ІХ у присутності Са"" та фосфоліпіду (Метегвоп апа Сепігу, Віоопет. 25:4020-4033 (1986)). Тоді як відносна роль двох шляхів коагуляції у гемостазі досі не з'ясована, в останні роки було виявлено, що Фактор МІ! та тканинний фактор відіграють ключову роль у регулюванні коагуляції крові.

Фактор МІ! є залишковим глікопротеїном плазми, який циркулює у крові як одноланцюговий зимоген. Зимоген с 29 є каталітично неактивним (Мате еї аї., Л Віої. Спет. 264:7536-7543 (1989); Као еї а!., Ргос. Май. Асай. (У

Зсі. ОБА. 85:6687-6691 (1988)). Одноланцюговий Фактор МІІ може бути перетворений на дволанцюговий Фактор

Міа за допомогою Фактора Ха, Фактора ХіІІа, Фактора ІХа або тромбіну іп міго. Фактор Ха вважається основним фізіологічним активатором Фактора МІЇ. Як і деякі інші протеїни плазми, задіяні у гемостазі, Фактор МІЇ залежить від активності вітаміну К, що вимагається для д-карбоксилювання залишків глутамінових кислот зі Шк складною структурою, які утворюють кластер на амінному кінці протеїну. Ці д-карбоксильовані глутамінові со кислоти є необхідними для зв'язаної з металами взаємодії Фактора МІ! з фосфоліпідами.

Перетворення зимогенного Фактора МІ на активовану дволанцюгову молекулу відбувається через о розщеплення внутрішнього пептидного зв'язку, розміщеного приблизно посередині молекули. У Факторі МІЇ (се) людини сайт активуючого розщеплення розміщується у Агд 452-Пет5з (Надіп еї аі., Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 83: 2412-2416 (1986), Тіт еї аї., Віоспет. 27:7785-7793 (1988) (на обидві ці роботи авторами зроблено ї-о посилання). Бичачий Фактор МІ! активується через розщеплення аналогічного зв'язку Агд 452-Пеї5з (Такеуа еї аІ., У. Віої. Спет. 263: 14868-14877,1988). У присутності тканинного фактора, фосфоліпідів та іонів кальцію дволанцюговий Фактор Мііа швидко активує Фактор Х або Фактор ІХ шляхом обмеженого протеолізу. « дю Нерідко виникає необхідність у вибірковому блокуванні каскаду коагуляції у пацієнта. Антикоагулянти, такі -о як гепарин, кумарин, похідні гепарину, похідні індандоліну або інші агенти можуть використовуватися, с наприклад, під час діалізу нирок або для лікування глибокого венозного тромбозу, коагулопатії споживання :з» (БІС) та інших розладів. Наприклад, лікування гепарином або екстракорпоральне лікування іонами цитрату (Патент США Мо4 500 309) може застосовуватися при діалізі для запобігання коагуляції в ході лікування. Гепарин використовується також для уникнення глибокого венозного тромбозу у пацієнтів, до яких застосовується б» 395 хірургічне втручання.

Лікування з застосуванням гепарину та інших антикоагулянтів може, однак, мати небажані побічні ефекти. (ее) Доступні антикоагулянти частіше діють у всьому організмі, ніж у якомусь конкретному місці коагуляції. с Гепарин, наприклад, може викликати сильну кровотечу. Крім того, гепарин, який має період напіврозпаду приблизно 80 хвилин, швидко виводиться з крові, викликаючи необхідність його частого введення. Оскільки (95) 50 гепарин діє як кофактор для антитромбіну ПП (АТ ІІ), а АТ І швидко вичерпується при лікуванні со коагулопатії споживання, то нерідко буває важко підтримувати належну дозу гепарину, що викликає необхідність у постійному контролюванні рівнів АТ І та гепарину. Гепарин є також неефективним при крайньому рівні вичерпання АТ І. Крім того, тривале використання гепарину може також підвищити агрегацію тромбоцитів і знизити кількість тромбоцитів, а також пов'язане з розвитком остеопорозу. Похідні індандоліну також можуть 59 мати токсичні побічні ефекти.

ГФ) Крім антикоагулянтів, коротко описаних вище, антикоагулюючу дію виявили кілька природних протеїнів. 7 Наприклад, Ройтелінспергер (Кеціеїпозрегдег) (Патент США Мо4 736 018) виділив антикоагулянтні протеїни з бичачої аорти та пупкових артерій людини. У Макі та ін. (МакКі еї а.) (Патент США Мо4 732 891) описано антикоагулянтні протеїни, що походять з плаценти людини. До того ж, АТ І було запропоновано як бо терапевтичний антикоагулянт (Зспіррег еї аі., І апсе і 1 (8069). 854-856 (1978); догдап, Патент США Мо4 386 025; Воск еї аІ., Патент США Мо4 517 294).

Проліферація клітин гладенького м'яза (ЗМО) у стінці судини є важливим чинником в пошкодженні судин при атеросклерозі після відновлення судин або у відповідь на інше пошкодження судини. Наприклад, лікування атеросклерозу часто включає прочищення заблокованих судин шляхом пластичної операції на судинах, бо ендартеректомію або відновлювальну атеректомію, або через обхідне судинне шунтування, хірургічні процедури,

при яких атеросклеротичні бляшки стискаються або видаляються за допомогою катетеризації (пластичної операції на судинах), зішкрібаються зі стінки артерії за допомогою розрізу (ендартеректомії) або спрямовуються обхідним шляхом з застосуванням природних або синтетичних шунтів. У ході цих процедур видаляється ендотелій судин, порушується інтимальний шар, який розміщується під ним, що призводить до загибелі проміжних клітин гладенького м'яза. Після цього пошкодження відбувається проліферація проміжних клітин гладенького м'яза та їхня міграція до інтими (внутрішньої оболонки судин), що, як правило, трапляється у період від перших кількох тижнів до шести місяців після пошкодження і припиняється після утворення нового шару ендотелію. У людини ці пошкодження складаються з приблизно 2095 клітин та 8095 зовнішньоклітинної /о матриці.

У приблизно 3095 або більшої кількості пацієнтів, яких піддавали пластичній операції на судинах, ендартеректомії або обхідному шунтуванню, тромбоз та/або проліферація клітин гладенького м'язу у внутрішній оболонці судин викликає повторне закупорення судини, і реконструктивна операція зрештою виявляється безуспішною. Це закупорення судини внаслідок операції відоме як рестеноз.

Ї досі існує потреба у поліпшених композиціях, які мають антикоагулюючу дію і які можуть бути призначені у відносно низьких дозах і не створюють небажаних побічних ефектів, пов'язаних з традиційними антикоагулянтними композиціями. Даний винахід задовольняє цю потребу забезпеченням антикоагулянтів, які діють у конкретних ділянках пошкодження, а також забезпечує інші переваги, пов'язані з цим.

Молекули модифікованого Фактора МІ! використовуються, зокрема, для того, щоб призначати їх людині з 2о Метою лікування різних станів, пов'язаних із внутрішньосудинною коагуляцією. Наприклад, хоча глибокий венозний тромбоз та емболія легеневої артерії можуть виліковуватися традиційними.

Незважаючи на використання численних форм механічного втручання, включаючи балонну ангіопластику, відновлювальну атеректомію, встановлення судинних стентів, лазерну терапію або ротоблатор, ефективність цих технологій залишається обмеженою через рестеноз, який становить приблизно 4095 протягом 6 місяців після с ов лікування.

Вважається, що рестеноз є результатом складної взаємодії біологічних процесів, включаючи осадження і) тромбоцитів та утворення тромбів, вивільнення хемотактичного та мітогенного Факторів, а також міграцію та проліферацію клітин гладенького м'яза судин до внутрішньої оболонки судин розширеного артеріального сегменту. со зо Інгібування накопичення тромбоцитів у ділянках механічного пошкодження може знизити ступінь рестенозу у людини. Терапевтичне використання моноклонального антитіла до тромбоциту СріїЇБ/ЛПа може обмежити рівень о рестенозу у людини (Сай ей аїЇ.,, М. ЕпоЇ. У. Мей.. 330:956-961 (1994)) Антитіло здатне зв'язувати с сріІБ/Ла - рецептор на поверхнях тромбоцитів і таким чином знижувати накопичення тромбоцитів. Ці дані дозволяють зробити висновок, що інгібування накопичення тромбоцитів на ділянці механічного пошкодження со зв Коронарних артерій людини є сприятливим для остаточного виліковування наслідків реакції, яка зазвичай «о трапляється. Якщо накопичення тромбоцитів трапляється на ділянках гострих пошкоджень судин, то утворення тромбіну на цих ділянках може зумовлювати активацію тромбоцитів та їхнє наступне накопичення.

Як показано на поданих нижче прикладах, модифікований Фактор МІ! згідно з даним винаходом здатен зв'язувати тканинний фактор поверхні клітин. Наприклад, ОЕСК-Фактор Мііа зв'язує тканинний фактор поверхні « Клітин з еквівалентною або більш високою спорідненістю, ніж у природного Фактора Ма. ОЕСК-Фактор Ма, ств) с однак, не має ферментної активності, хоча й зв'язується з тканинним Фактором і діє як конкурентний антагоніст природного Фактора Мііа, таким чином інгібуючи наступні етапи зовнішнього шляху коагуляції, які ведуть до ;» утворення тромбіну.

Молекули модифікованого Фактора МІЇ, які підтримують зв'язування тканинного фактора, інгібують накопичення тромбоцитів на ділянці пошкодження судини через блокування утворення тромбіну та наступне

Ге» відкладення фібрину.

Завдяки здатності ОЕСК-Фактора МІЇ до блокування утворення тромбіну та обмеження відкладення со тромбоцитів на ділянках гострого пошкодження судин молекули модифікованого Фактора МІЇ, які підтримують 2) зв'язувальну активність тканинного Фактора, але які не мають ферментної активності Фактора Ма, можуть Використовуватися для інгібування рестенозу судин. о Композиції, які включають модифікований Фактор МІІ, використовуються, зокрема, для лікування пацієнтів, сю якщо вони входять до складу фармацевтичних композицій, і можуть бути призначені пацієнтам, що страждають від різних хвороб, з метою виліковування станів, пов'язаних із коагуляцією. Такі молекули модифікованого

Фактора МІЇ, які здатні зв'язувати тканинний фактор, але мають суттєво знижену здатність до каталізу ов активацію інших факторів у каскаді коагуляції, можуть мати довший період напіврозпаду плазми і, відповідно, довший період антикоагулюючої дії порівняно з іншими антикоагулянтами. Серед хвороб, для лікування яких (Ф) показані ці композиції, - ті, які зазвичай лікуються антикоагулянтами, наприклад, глибокий венозний тромбоз, ка емболія легеневої артерії, удар, коагуляція споживання (ІС), відкладення фібрину у легенях та нирках, пов'язане з грам-негативною ендотоксемією (наявністю у крові ендотоксинів), та інфаркт міокарду. Композиції бр Можуть використовуватися для інгібування рестенозу судин, який трапляється після механічного пошкодження судин, такого як пошкодження, викликане балонною ангіопластикою, ендартеректомією, відновлювальною атеректомією, установленням стентів, лазерною терапією або ротаболяцією, або трапляється як побічний ефект шунтування судин, встановлення стентів, обхідних шунтів або трансплантації органів. Композиції, таким чином, можуть використовуватися для інгібування осадження тромбоцитів та пов'язаних із цим розладів. Отже, спосіб 65 інгібування коагуляції, рестенозу судин або відкладення тромбоцитів, включає, наприклад, призначення пацієнтові композиції, яка містить модифікований Фактор МіІЇ, такий як той, що має принаймні одну амінокислотну заміну у каталітичній тріаді Зегзді, Аврогдо "2 Нівчоз, у кількості, достатній для ефективного інгібування коагуляції, рестенозу судин або осадження тромбоцитів. Ці способи також знаходять застосування при лікуванні гострого закупорення коронарної артерії у пацієнта (наприклад, при гострому інфаркті міокарду),

Що охоплює введення модифікованого Фактора МІЇ, який включає ОЕСК-Фактор МІЇ апа ЕРК-Фактор МІ, разом з активатором тканинного плазміногена або стрептокінази, і може прискорювати викликаний ІРА тромболіз.

Модифікований Фактор МІ! призначається перед, разом із або невдовзі після введення тромболітичного агенту, такого як активатор плазміногена.

Міжнародна заявка Мо МО 92/15686 стосується модифікованого Фактора Мііа, полінуклеїнової кислоти та 70 Клітинних ліній ссавців для продукування модифікованого Фактора Міїа, а також композицій, які включають модифікований Фактор Мііа для інгібування коагуляції крові.

Міжнародна заявка Мо МО 94/27631 стосується способів інгібування рестенозу судин, активності тканинного фактора та осадження тромбоцитів.

Міжнародна заявка Мо МУ 96/12800 стосується способу лікування гострого закупорювання коронарної 75 артерії, що включає введення пацієнтові композиції, яка включає модифікований Фактор Ма разом з тканинним активатором плазміногена або стрептокіназою.

Даний винахід стосується способу інгібування утворення тромбів у пацієнта, який включає місцеве введення у ділянку судини, схильної до утворення тромбу, терапевтично ефективної дози композиції, яка включає Фактор

МІЇ, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, що суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора МІ! до активації Фактора плазми Х або ІХ. Ділянка утворення тромбу може бути пов'язана з хірургічною операцією, мікрохірургією, пластичною операцією на судинах або травмою.

Винахід також стосується способу підтримання або поліпшення у пацієнта прохідності судин, який включає місцеве введення у ділянку судини, схильної до зниження прохідності, терапевтично ефективної дози композиції, яка включає Фактор МІЇ, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, яка суттєво інгібує Га

Здатність модифікованого Фактора МІ до активації Фактора плазми Х або ІХ. Ділянка утворення тромбу може бути пов'язана з хірургічною операцією, мікрохірургією, пластичною операцією на судинах або травмою. і9)

Винахід також стосується способу запобігання або мінімізації ураження міокарду, пов'язаного з постішемічною реперфузією пацієнта, включаючи введення пацієнтові композиції, яка включає фармакологічно прийнятний Фактор МІЇ, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, яка суттєво інгібує со зо здатність модифікованого Фактора МІ! до активації Фактора плазми Х або ІХ.

Винахід також стосується способу поліпшення у пацієнта регіонального кровотоку у міокарді під час о постішемічної реперфузії, яка включає введення пацієнтові композиції, яка включає фармакологічно прийнятний со

Фактор МІЇ, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора МІ! до активації Фактора плазми Х або ІХ. со

В оптимальному варіанті втілення винаходу модифікація Фактора МІЇ включає реакцію Фактора МІ з Ге) інгібітором серинової протеази. Більшу перевагу віддають варіантові у якому інгібітором протеази є органофосфорна сполука, сульфанілфторид, пептидний галометилкетон або азапептид. Ще більшу перевагу віддають варіантові, у якому інгібітором протеази є пептидний галометилкетон, вибраний з-поміж «

Дансил-Рпе-Рго-Агуд хлорметилкетон, Дансил-с1|Ш-сїІу-Агд хлорметилкетон, Дансил-РПе-Рпе-Агд хлорметилкетон та Рпе-Рпе-Агуд хлорметилкетон, Рпе-Рпе-Агуд хлорметилкетон є оптимальним. - с Винахід також стосується використання Фактора МІІ, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному ц центрі, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора МІ! до активації Фактора плазми Х або ІХ, для "» виготовлення композиції для запобігання або мінімізації ураження міокарду, пов'язаного з постішемічною реперфузією. Винахід також стосується використання Фактора МІ, що має у каталітичному центрі принаймні одну модифікацію, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора МІ! до активації Фактора плазми Х або

Ге») ЇХ, для виготовлення композиції для поліпшення регіонального кровотоку у міокарді під час постішемічної со реперфузії.

Даний винахід пропонує способи та композиції для інгібування шкідливих процесів, пов'язаних з ішемічною оз реперфузією. Сильна ішемія тканини, органу або кінцівки може бути зумовлена зниженням кровотоку й може бути пов'язана з травмою, хірургічною операцією або зниженим кров'яним тиском. Одним з ускладнень, о пов'язаних з сильною ішемією, є зростання тканинного фактора (ТЕ) в артеріальній системі. Вважається, що ця с» підвищена експресія тканинного фактора стимулює прокоагулянтну реакцію, насамперед у капілярному руслі, таким чином ініціюючи та/або підтримуючи утворення внутрішньосудинного тромбу. Крім того, повторний синтез

ТЕ під час реперфузії серця після ішемії за допомогою ендотеліальних клітин у коронарних судинах може привести до зниження коронарного кровотоку під час реперфузії і, таким чином, впливає на долю ішемічного міокарду, який зрештою відмирає. Антигенна та прокоагулянтна активність ТЕ зростає у атеректомічних зразках,

Ф, отриманих від пацієнтів з нестабільною стенокардією, порівняно з пацієнтами зі стабільною стенокардією. Таким ко чином, вважається, що у цих пацієнтів виникнення нестабільної стенокардії може бути прискорене через дію ТЕ у субендотеліальній тканині великої епікардіальної коронарної артерії в результаті пошкодження бляшок. Це бо Зрештою сприяє утворенню внутрішньокоронарного тромбу з наступним абсолютним зниженням коронарного кровотоку.

ТЕ може також впливати на коронарний кровотік і іншим чином. Після реперфузії ішемічної тканини можуть утворюватися тромби, які можуть бути і закупорюючими, і не закупорюючими. Утворення тромбів в артеріальному руслі та відкладення тромбоцитів уздовж тромбу призводять до вторинного утворення ішемії у 65 тканині. Потім утворення тромбів та присутність тромбоцитів можуть викликати утворення та вивільнення багатьох біоактивних факторів, включаючи й ті, що утворюються під час коагуляційного каскаду, такі як тромбін та Фактор Х, а також фактори, що вивільнюються з активованих тромбоцитів. У свою Чергу, ці фактори можуть викликати утворення додаткових факторів ендотеліальними клітинами та клітинами гладенького м'язу, що лежать під ними, або прилеглими моноцитами, такими як ТМЕ-альфа та 1І-1. Ці Фактори, у свою чергу, можуть активувати ендотеліальні клітини, що веде до позитивної регуляції різних адгезивних молекул, пов'язаних зі зв'язуванням моноцитів та нейтрофілів. Як правило, ендотеліальні клітини, контактуючи з циркулюючою кров'ю, не виявляють помітної активності ТЕ. За певних обставин ендотеліальні клітини можуть активно сприяти коагуляції через експресію ТЕ-подібної прокоакулянтної активності. Зокрема, і екзогенно, і ендогенно утворені безкисневі радикали (ОЕК) можуть стимулювати ендотеліальні клітини у системі коронарних судин з метою 7/0 бинтезу та експресії значних кількостей ТЕ. ОЕРК є високореактивними видами молекул, які можуть атакувати різні компоненти клітин. Спалах утворення ОЕК відбувається після відновлення кровотоку після періоду ішемії, і ці зразки оксидантів можуть бути відповідальними за конкретні форми опосередкованого реперфузією пошкодження тканини, що супроводжує пероксидацію ліпідів та інші необоротні зміни компонентів клітин. ОЕК також значною мірою знижують активність інгібітора шляху тканинного Фактора (ТЕРІ), протеїну Кипії2-типу, /5 синтезованого ендотеліальними клітинами, який інгібує зовнішній шлях коагуляції. Цей подвійний ефект ОЕК (експресія ТЕ ендотеліальними клітинами та зниження активності ТЕРІ) може зсунути природні антикоагулюючі властивості нормального ендотелію у напрямку прокоагулянтного стану, сприяючи таким чином небажаній внутрішньосудинній активації коагуляції. Отже, опосередкована ОЕК експресія ТЕ у межах коронарної циркуляції призводить до значного зниження коронарного кровотоку під час 2о постішемічної реперфузі. Ця опосередкована ОРК експресія ТЕ, що супроводжується активацією зовнішнього шляху коагуляції, має важливі наслідки, оскільки цей феномен впливає на патофізіологію постішемічної реперфузії, особливо у пацієнтів з гострим інфарктом міокарду, яких піддають коронарному тромболізу.

Цей феномен непрохідності, тобто відсутність рівномірного кровопостачання мікросудин тканини, що зазнала ішемії, було вперше описано Кругом (Кгид еї а1.), (Сіго. Кез. 1966; 19:57-62). Найважливішими чинниками, які сч г Можуть вплинути на долю ішемічного міокарду, вважаються кількість колатерального кровотоку під час ішемії, розмір площі ризику та потреба міокарду у кисні. і)

В останні десятиріччя спостерігався інтенсивний інтерес до ідеї лікування пацієнтів з гострим інфарктом міокарду через реперфузію, включаючи коронарний тромболіз, первинну реконструкцію судин, або і те, й інше.

Однак, жодне з досліджень не продемонструвало поліпшення у функціонуванні лівого шлуночка після с зо реканалізації артерії, пов'язаної з інфарктом. У цей момент значна кількість пацієнтів виявляє стан "низької циркуляції" у коронарному колі обігу, пов'язаному з інфарктом. Цей стан пов'язаний з майже повною відсутністю о поліпшення, принаймні стосовно морального стану. Вважається, що цей стан низької циркуляції спричинюється, с принаймні частково, нездатністю крові знову заповнити усі судини міокарду, який зазнав ішемії. Тепер же несподівано виявилося, що ЕМііаї впливає, у бік підвищення, на регіональний кровотік у міокарді під час со реперфузії. Також несподівано виявилося, що ЕМіІаі викликає значне зниження у непрохідній ділянці. «о

Зв'язування та переміщення моноцитів та нейтрофілів, вивільнення біоактивних сполук цими клітинами, включаючи утворення без кисневих радикалів, може посилити рівень активації ендотеліальних клітин та ступінь їхнього пошкодження. Зрештою, якщо цей каскад етапів відбувається без перешкод, це може призвести до систематичних ускладнень і може сприяти дисфункції багатьох органів. Через блокування тканинного фактора « шляхом введення конкретного інгібітора для зв'язування тканинного фактора/Фактора МІ! (наприклад, ЕЕК-ЕМІа), з с а, отже, й блокування початку зовнішнього шляху коагуляції, можна запобігти початку каскаду етапів, таким чином модулюючи міру несприятливих етапів, пов'язаних з ішемією/реперфузією, наприклад, виключаючи або ;» мінімізуючи ураження міокарду або некроз.

Короткий опис Фігур

Фіг.1 показує конструкцію експресійного вектора ДНК-послідовності Зегзл«ФАІа-модифікованого Фактора МІ.

Ге» Серед застосованих символів: 0-1 - 0-1 послідовність одиниць карти аденовірусу 5; Е - 5М40 енхансер; МІ Р - головний останній промотор аденовірусу 2; 55 - набір зрощених сайтів; рА - сигнал поліаденілювання ЗМ40 в со останньому положенні. 2) Фіг.2 показує вплив болюсної ін'єкції ОЕСК-Фактора Ма на утворення тромбу (осадження тромбоцитів) в 5ор аорті підданого ендартеректомії бабуїна порівняно з обробленим фізіологічним розчином контролем. Артерії о вимірювали протягом 60 хвилин. ОЕСК-Фактор Мііа значно стримував розвиток багатих на тромбоцити тромбів у сю цього примата з гострим ураженням судин.

ФігЗ показує результати, отримані при інкубації клітин гладенького м'яза бабуїна з підвищенням концентрації ЕМіІїа (відкритий бокс), або ОЕСМК-ЕМіІІа у присутності постійної кількості ЕМПа (5 нМ) (закритий бокс). Відразу після цього визначали рівень активації ЕХ з використанням хромогенного субстрату 5-2222. Дані представлені як амідолітична активність у відсотках від активності, яка генерується у присутності лише 5 нм іФ) ЕМПа. ка Фіг.4 описує розмір площі внутрішньої оболонки судин бабуїна після ендартеректомії сонної артерії та лікування за допомогою ОЕСК-Фактора Мііа протягом 7 або З0 днів у порівнянні з контрольними тваринами. во Фіг.5 показує співвідношення площі внутрішньої оболонки до суми площ внутрішньої (інтими) та середньої вистілок стегнової артерії бабуїна після здуття та лікування ОЕСК-Фактором Мііа, коли контрольна група включає 5 судин, при 7-денному лікуванні досліджували 11 судин, при ЗО-денному лікуванні досліджували 2 судини (п- кількість досліджених судин).

Фіг.6 показує експериментальний протокол вимірювання розміру інфаркту (ІЗ), непрохідності (МК), площі 65 ризику (АК), протромбінового часу (РТ) та часу активованого часткового тромбопластину (аР ТТ).

Фіг.7 показує діаграму розміру інфаркту наприкінці періоду реперфузії (5), виражені у відсотках площі ризику інфаркту в трьох групах пацієнтів, причому три групи пацієнтів складалися з тварин, яких лікували відповідно ЕЕК-Фактором Мііа, Фактором Мііа та фізіологічним розчином. Кожна колонка представляє середній показник для восьми тварин х 50.

Фіг.8 показує діаграму площі непрохідності (МК) наприкінці періоду реперфузії, виражену у відсотках площі ризику інфаркту (тварини, яких лікували відповідно Фактором Мііа та фізіологічним розчином). Кожна колонка представляє середній показник для восьми тварин х 50.

Фіг.9 показує співвідношення між очікуваною непрохідністю, розрахованою (у відсотках від лівого шлуночка,

ЇМ) для кожної тварини за допомогою кількох лінійних рівнянь регресії та непрохідності, яка реально 7/о бпостерігалася (як відсоток від ІМ).

Фіг.10 показує діаграму регіонального кровотоку у міокарді (КМВЕ) для ішемічного міокарду, вимірюваного протягом 20 хв ішемії та через 10 хв та 2 год з початку реперфузії.

Фіг.11 показує вплив ЕЕК-Фактора Ма та Фактора Ма на протромбіновий час (РТ) та час активованого часткового тромбопластину (аР ТТ).

Опис конкретних варіантів втілення винаходу

Модифікований Фактор МІ може мати форму зимогена (тобто одноланцюгової молекули) або може бути розщеплений у сайті активації. Таким чином, поняття "модифікований фактор Мі" включає молекули модифікованого Фактора МІ та модифікованого Фактора Мііа, які зв'язують тканинний фактор та інгібують активацію Факторів ІХ до ІХа та Фактора Х до Ха. Послідовність Фактора МІ! має принаймні одну амінокислотну 2о Модифікацію, причому модифікація вибирається така, що суттєво знижує здатність активованого Фактора каталізувати активацію Факторів плазми Х або ІХ і, таким чином, є здатною до інгібування коагулятивної активності. Модифікований Фактор МІ має активний сайт, модифікований принаймні однією амінокислотною заміною, і у цій модифікованій формі здатен на зв'язування тканинного Фактора. Композиції модифікованого

Фактора МІІ, як правило, перебувають у практично чистій формі. сч

В оптимальних варіантах Фактора МІ людини та великої рогатої худоби залишок активного сайту Зегзлля Є модифікованим, заміненим на Су, Меї, Тиг або, ще краще, Аа. Така заміна може бути здійснена окремо або (8) разом із заміною(ами) в інших сайтах у каталітичній тріаді, яка включає Нівзлоз та Аврод».

Композиції модифікованого Фактора МІ придатні для введення різним ссавцям, зокрема, людині, для інгібування каскаду коагуляції. Модифікований Фактор МІЇ може бути введений пацієнтові разом з іншими с зо антикоагулянтними сполуками або замість них. Як правило, призначені для введення людині фармацевтичні композиції включають модифікований протеїн Фактора МІ людини та фармацевтично прийнятні носії та буфери. о

Фактор МІ! відіграє важливу роль у каскаді коагуляції, особливо у тому, що включає зовнішній шлях. с

Присутній у циркулюючій плазмі у вигляді неактивного одноланцюгового зимогенного протеїну, Фактор МіІа після активації, разом із тканинним Фактором та іонами кальцію, активує Фактор Х до Ха і активує Фактор ІХ до Їха з со можливістю утворення фібринового згустку. «о

Протеїни Фактора МІ мають каталітичний сайт, який є модифікованим для зниження каталітичної активності

Фактора Мііа, тоді як молекула зберігає здатність до зв'язування тканинного фактора. Молекули модифікованого

Фактора МІ конкурують із природним Фактором МІ! та/або Ма для зв'язування з тканинним фактором. В результаті цього стримується активація Факторів Х та ІХ. «

Модифікований Фактор МІ! може бути кодований полінуклеотидною молекулою, яка включає дві з с функціонально з'єднані кодуючі послідовності області, що кодують, відповідно, пре-пропептид та діа-домен . залежного від вітаміну К протеїну плазми та протеїн Фактора МІЇ без діа-домену, у яких після експресії и?» вищезгаданий полінуклеотид кодує молекулу модифікованого Фактора МІІ, яка не може значною мірою активувати Фактори плазми Х або ІХ і здатна зв'язувати тканинний фактор. Молекула модифікованого Фактора

МІЇ, експресована цим полінуклеотидом, є біологічно активним антикоагулянтом, тобто здатна інгібувати каскад

Ге» коагуляції, а, отже, й утворення фібринового осаду або тромбу. Для експресії модифікованого Фактора МІ! молекулу полінуклеотиду трансфектують у клітинні лінії ссавців, наприклад, у клітинні лінії ВНК, ВНК 570 або

Со 293. 2) Каталітична активність Фактора Мііа може бути інгібована хімічною дериватизацією каталітичного центру або 5о тріади. Дериватизація може здійснюватися через реакцію Фактора МІ! з необоротним інгібітором, таким, як о органофосфорна сполука, сульфонілфторид, пептидгалометилкетон або азапептид, або, наприклад, 4) ацилюванням. Перевагу віддають пептидгалометилкетонам, які включають РРАСК (0-РПпе-Рго-Ага хлорметилкетон: (див. Патент США Мо4 318 904, на який у тексті робиться посилання), О-Рпе-Рпе-Ага та

Рпе-Рпе-Агуд хлорметилкетон (ЕЕК-сткК); та ОЕБОКсК (дансил-СіІШ-СіІу-Агд хлорметилкетон).

Каталітична активність Фактора Ма може також інгібуватися шляхом заміни, введення або видалення амінокислот. В оптимальних варіантах амінокислотні заміни здійснюють в амінокислотній послідовності

Ф) каталітичної тріади Фактора МІЇ, визначеної нами як області, що містять амінокислоти, які беруть участь у ка каталітичному сайті Фактора МІ. Заміни, введення або видалення у каталітичній тріаді здійснюються, як правило, в амінокислотах, які утворюють каталітичний сайт, або у сусідніх з ними. У протеїнах Фактора МІ! бо людини або великої рогатої худоби, амінокислотами, які утворюють каталітичну "тріаду", є Зегз4л, Авродо та

Нівглчоз (цифри нижнього індексу позначають позицію у послідовності). Каталітичні сайти у Факторі МІ! інших видів ссавців можуть бути визначені з застосуванням доступних на даний час способів, включаючи, серед інших, ізоляцію протеїну та аналіз амінокислотної послідовності. Каталітичні сайти можуть бути визначені також через зіставлення послідовності з послідовністю інших серинових протеаз, зокрема, хімотрипсину, активний сайт якого 65 було визначено раніше (5ідіег еї аї, У. Мої. Віо! 35:143-164 (1968), робота, на яку нами робиться посилання), а, отже, й визначення на основі вищезгаданого зіставлення аналогічних залишків активного сайту.

Заміни, введення або видалення амінокислот здійснюються для запобігання або інгібування активації

Фактором Мііа Факторів Х та/або їх. Модифікований таким чином Фактор МІЇ, однак, має зберігати здатність конкурувати з аутентичним Фактором МІ! та/або Фактором Мііа для зв'язування з тканинним Фактором у каскаді коагуляції. Така конкуренція може бути легко визначена, наприклад, через описаний нами аналіз коагуляції або аналіз конкурентного зв'язування з використанням лінії клітин, що має тканинний фактор поверхні клітин, наприклад, лінії клітин карциноми міхура людини 982 (ЗаКаї ей аї. 9. Віої. Спет. 264: 9980-9958 (1989), робота, на яку нами робиться посилання).

Амінокислоти, які утворюють каталітичний сайт у Факторі МІ, такі як Зег зля, Авродо та Нівлчоз У Факторі МІ! /0 людини або великої рогатої худоби, можуть бути або замінені, або видалені. У межах даного винаходу перевага віддається заміні лише однієї амінокислоти, що мінімізує, таким чином, ймовірність зростання антигенності молекули або інгібування її здатності до зв'язування тканинного фактора, однак можуть бути здійснені дві або кілька амінокислотних замін (замін, додавань або видалень) та комбінацій замін, додавань та видалень. В оптимальному варіанті втілення винаходу для Фактора МІ! людини та великої рогатої худоби Зегз44 замінюється /5 на Аа, але можуть бути замінені Су, Меї, Тиг або інші амінокислоти. Перевагу віддають заміні Азр на Сіш та

Ніз на Гуз або Аго. Взагалі, заміни здійснюють для якомога меншого переривання третинної структури протеїну.

Допомогти у виборі інших амінокислотних замін може модель Дейгоффа (ЮОаупоїй еї аЇ.,, АМаз ої Ргоїевіп

Зігисіцге 1978. Маї! Віотейд. Кев. Рошпа., М/азпіпдіоп, О.С.), на яку нами робиться посилання. Можна замінити залишок, як було описано вище, у каталітичному сайті відповідної послідовності Фактора МІЇ людини, великої рогатої худоби або інших видів і протестувати отриманий в результаті протеїн на належний рівень інгібування каталітичної активності та описану нами антикоагулюючу активність. Для модифікованого Фактора МІіЇ каталітична активність суттєво знижується, як правило, і є меншою приблизно 5905 від каталітичної активності природного Фактора МІ! відповідних видів, краще - меншою приблизно 195.

Модифікований Фактор МН може вироблятися шляхом використання технологій рекомбінантної ДНК. Взагалі, сч ов Клоновану ДНК-послідовність природного Фактора МІ! видозмінюють для кодування потрібного протеїну. Після цього цю модифіковану послідовність вводять в експресійний вектор, який, у свою чергу, трансформують або і) трансфектують у клітини-хазяї. Як клітинам-хазяям, перевагу віддають вищим еукаріотним клітинам, зокрема, культивованим клітинам ссавців. Відомі повні нуклеотидні та амінокислотні послідовності для Фактора МІІ. Див.

Патент США Мо4 784 950, на який нами робиться посилання і у якому описано клонування та експресію с зо рекомбінантного Фактора МІ! людини. Послідовність Фактора МІ! великої рогатої худоби описано у роботі Такеуа еї а1., У.Віої, Спет, 263:14868-14872 (1988), на яку нами робиться посилання. і

Зміна амінокислотної послідовності може здійснюватися різними способами. Модифікація ДНК-послідовності с може бути у формі сайт-специфічного мутагенезу. Способи сайт-специфічного мутагенезу добре відомі спеціалістам і описуються, наприклад, Цоллером та Смітом (20Пег апа тій (ОМА 3:479-488, 1984)). Таким со

Зв чином, використовуючи нуклеотидні та амінокислотні послідовності Фактора МІЇ, можна здійснювати зміни на «о вибір.

Фактор МІІ, модифікований відповідним чином, включає протеїни, в яких амінний кінець (діа-домен) замінено на діа-домен одного з залежних від вітаміну К протеїнів плазми, Фактора ІХ, Фактора Х, протромбіну, протеїну

С, протеїну З або протеїну 7. Сіа-домени залежних від вітаміну К протеїнів плазми характеризуються « присутністю залишків гамма-карбоксиглутамінової кислоти і, як правило, мають довжину від приблизно ЗО до пл) с приблизно 40 амінокислот з С-кінцями, які відповідають позиціям межі екзон-інтрон у відповідних генах.

Способи вироблення Фактора МІ! за допомогою гетерологічного діа-домену описано у Патенті США Мо4 784 950, ;» на який нами робиться посилання.

ДНК-послідовності для використання при виробленні модифікованого Фактора МІІ, як правило, кодують пре-пропептид на амінному кінці протеїну Фактора МІ! для належного посттрансляційного процесингу (наприклад,

Ге» гамма-карбоксилювання залишків глутамінових кислот) та виділення з клітини-хазяїна. Пре-пропептид може належати до Фактора МІ! або іншого залежного від вітаміну К протеїну плазми, такого як Фактор ІХ, Фактор Х, со протромбін, протеїн С або протеїн 5. Як стане зрозуміло спеціалістам, існує можливість додаткових модифікацій 2) в амінокислотній послідовності модифікованого Фактора МІ причому ці модифікації не дуже послаблюють здатність протеїну діяти як антикоагулянт. Наприклад, Фактор МІЇ, модифікований у каталітичній тріаді, може о також бути модифікований в активаторному сайті розщеплення для інгібування перетворення зимогенного 4) Фактора МІ! на його активовану дволанцюгову форму, як описується у загальній формі в Патенті США Мо 5 288 629, на який нами робиться посилання.

Експресійні вектори для використання при експресії модифікованого Фактора Ма включають промотор, здатний на спрямування транскрипції клонованого гена або кКДНК. Перевагу при використанні у культивованих клітинах ссавців віддають вірусним промоторам та клітинним промоторам. Вірусні промотори включають 540

Ф) промотор (З!иргатапі ей аїЇ.,, Мої. СеїЇ. ВіоЇї. 1:854-864, 1981) та СММ опромотор (Возпагй еї аї., Сеї ка 1141:521-530, 1985). Особливу перевагу серед вірусних промоторів віддають головному останньому промотору аденовірусу 2 (Каштап апа Зпагр, Мої. Сеї. Віо!Ї. 2:1304-1319. 1982). Клітинні промотори включають промотор бо Каппа-гена миші (Вегдтап еї а!., Ргос. Май, 81:7041-7045, 1983) та Мн промотор миші (Гой еї а), СМ 33:85-93, 1983). Особливу перевагу серед клітинних промоторів віддають металотіонеїн-І-промоторові миші (Раїтйцег еї аІм,, Зсіепсе. 222:809-814, 1983). Експресійні вектори можуть також містити набір РНК-сплайсових сайтів, розташованих за промотором і перед інсерційним сайтом для самої послідовності Фактора МІЇ. Оптимальні

РНК-сплайсові сайти можуть бути отримані з генів аденовірусу та/або імуноглобуліну. В експресійних векторах б5 також міститься сигнал поліаденілювання, який розміщується після інсерційного сайту. Сигнали поліаденілювання, яким віддають особливу перевагу, включають ранній або останній сигнал поліаденілювання з

ЗМ40 (Кашїтап апа Зпагр, іріа)), сигнал поліаденілювання з ЕІб-ділянки аденовірусу 5, термінатора гена гормону росту людини (ОемМоїйо еї аЇ. Мис. Асідз Кев. 9:3719-3730, 1981) або сигналу поліаденілювання з гена

Фактора МІІ людини або гена Фактора МІ! великої рогатої худоби. Експресійні вектори можуть також включати некодуючу вірусну лідерну послідовність, таку як потрійний лідер аденовірусу 2, розміщений між промотором та

РНК сплайсовим сайтом; а також енхансерні послідовності, такі як ЗМ40 енхансер.

Клоновані ДНК-послідовності вводять у культивовані клітини ссавців, наприклад, шляхом опосередкованої фосфатом кальцію трансфекції (М/ідтег еї аі,, СМ 14:725-732, 1978; Согзаго апа Реаггоп, Зотаїйіс СеїЇ Сепейісв 7:603-616, 1981: Стапат апа Мап дег ЕБ, Мігоїосду 524:456-467, 1973) або електропорації (Метапп еї аІ., ЕМВО 70). 1:841-845, 1982). Для розпізнавання та відбору клітин, які експресують екзогенні ДНК, як правило, разом з потрібним геном або кДНК у клітини вводять ген, який забезпечує селектабельний фенотип (селектабельний маркер). Оптимальні селектабельні маркери включають гени, які забезпечують резистентність проти медикаментів, таких як неоміцин, гідроміцин та метотрексат. Селектабельним маркером може бути здатний до ампліфікації селектабельний маркер. Серед здатних до ампліфікації селектабельних маркерів перевагу віддають 7/5 послідовності дигідрофолатредуктази (ОНЕК). Селектабельні маркери розглядаються Тіллі (ТИШу) у роботі

Маттаїйап Се! Теспподпау Вийепгмопй Рибіїзпйеге, Зіопепат, МА, на яку нами робиться посилання. Вибір селектабельних маркерів серед спеціалістів вважається традиційною процедурою.

Селектабельні маркери можуть бути введені у клітину на окремій плазміді водночас із потрібним геном, або ж вони можуть бути введені у ту саму плазміду. Якщо у тій самій плазміді селектабельний маркер та потрібний го ген можуть бути під контролем різних промоторів або одного промотору, то таке розташування створює дицистронний сигнал. Послідовності цього типу відомі спеціалістам (наприклад, Патент США Мо4 713 339, виданий Левінсону та Сімонсену). Добрий результат дає також додавання ДНК, відомої як "носій ДНК," до суміші, яку вводять у клітини.

Після забирання клітинами ДНК вони розвиваються у відповідному поживному середовищі, як правило, 1-2 сч дні, для того, що розпочати експресію потрібного гена. Вжитий нами термін "відповідне поживне середовище" означає середовище, яке містить поживні речовини та інші компоненти, необхідні для розвитку клітин та (8) експресії гена модифікованого Фактора МІІ. Ці середовища, як правило, включають вуглецеву основу, азотну основу, основні амінокислоти, основні цукри, вітаміни, солі, фосфоліпіди, протеїни та фактори росту. Для створення гамма-карбоксильованого модифікованого Фактора МІ! середовище має містити вітамін К, краще - у с зо Концентрації приблизно від 0,1мг/мл до приблизно 5мг/мл. Після цього застосовується селекція препаратів з метою відбору для розвитку клітин, які експресують селектабельний маркер у стабільному режимі. Для клітин, о які були трансфектовані з селектабельним маркером, що піддається ампліфікації, концентрація препарату може с бути підвищена з метою відбору для збільшення числа копій клонованих послідовностей, збільшуючи таким чином рівні експресії. Клони стабільно трансфектованих клітин після цього відсортовують для експресії со модифікованого Фактора МІ. «о

Оптимальні клітинні лінії ссавців включають лінії клітин СО5-1 (АТСС СКІ 1650), нирок новонародженого хом'яка (ВНК) та 293 (АТСС СКІ 1573: Сгапат еї аїЇ, 9У.Сеп. МегоїЇ. 36:59-72, 1977). Оптимальною клітинною лінією ВНК є клітинна лінія ІК" ї513 ВНК (У/аеспіег апа Вазегда, Ргос. Маї). Асайд. сі. ОБА 79:1106-1110 1962, « робота, на яку нами робиться посилання), далі - під назвою клітин ВНК 570. Клітинна лінія ВНК 570 була депонована в Американському зібранні типових культур (Атегісап Тип Сийиге СоІесіоп, 12301 Рагкіамлл Ог., - с КосКміОе, МО 20852), під номером доступу АТСОС СК. 10314. Клітинну лінію ІК 513 ВНК також можна отримати в а АТСС під номером доступу СК! 1632. Крім того, можуть використовуватися багато інших клітинних ліній, "» включаючи Каї Нер І (Гепатоми щура; АТСС СК 1600), Каї Нер ІІ (Гепатоми щура; АТСС СКІ 1548), ТСМК (АТСС СС 139), легенів людини (АТСС НВ 8065), МСТС 1469 (АТСС СС 9.1), СНО (АТСС СС 61) та клітини

БВИиКХ (гіаць апа Спнавзіп, Ргос. Маїй). Асад. Зсі ОБА 77:4216-4220,1980). (о) Технологія трансгенних тварин може бути застосована для вироблення модифікованого Фактора МІ. бо Перевагу віддають виробленню протеїнів у молочних залозах самиці ссавця. Експресія у молочній залозі та наступне виділення потрібного протеїну у молоко дозволяє подолати багато труднощів, які трапляються при (95) виділенні протеїнів з інших джерел. Молоко легко збирається, воно доступне у великих кількостях і має добрі с 50 біохімічні характеристики. Крім того, основні протеїни присутні у молоці у високих концентраціях (як правило, приблизно від 1 до 15г/л). сю З комерційної точки зору явну перевагу віддають використанню як хазяїв таких видів, які виробляють велику кількість молока. Водночас із використанням дрібних тварин, таких як миші та щури (і їм віддається перевага на принциповій стадії), перевагу віддають використанню домашніх тварин, включаючи, крім інших, свиней, кіз, овець та велику рогату худобу. Особливу перевагу віддають вівцям через такі чинники, як попередня історія о трансгенезису цих видів, вироблення молока, низька ціна та доступність обладнання для отримання овечого молока. Див. Публікацію УМІРО МУО 88/00239 для порівняння чинників, які впливають на вибір видів-хазяїв. іме) Взагалі, бажано вибирати молочні породи тварин-хазяїв, такі як східнофрисляндська вівця, або ж пізніше вводити молочне поголів'я шляхом розведення трансгенних ліній. У будь-якому разі, слід використовувати 60 тварин з добрим, надійним станом здоров'я.

Для досягнення експресії у молочній залозі використовують транскрипційний промотор з гена протеїну молока. Гени протеїну молока включають гени, що кодують казеїни (див. Патент США Мо5 304 489, на який нами робиться посилання), бета-лактоглобулін, а-лактоальбумін, та кислотний протеїн сироватки. Перевагу віддають промоторові бета-лактоглобуліну (ВІ). У випадку з геном овечого бета-лактоглобуліну, як правило, 65 використовують ділянку принаймні з найближчих 406 п. н. 5' фланкуючої послідовності гена, хоча перевагу віддають більшим ділянкам 5' фланкуючої послідовності, приблизно до 5 т. п. н., наприклад, ДНК-сегмент 4,25 т. п. н., який охоплює 5 фланкуючий промотор та некодуючу ділянку гена бета-лактоглобуліну. Див. УУпіеїам еї а!., Віоспет .). 286; 31-39 (1992), Підходящими є також подібні фрагменти промоторної ДНК з інших видів.

Інші ділянки гена бета-лактоглобуліну можуть також бути введені у послідовності, як і геномні ділянки

Гена, що має бути експресований. Взагалі, серед спеціалістів вважається, що послідовності, у яких не вистачає інтронів, наприклад, слабо експресуються порівняно з тими, які містять такі ДНК-послідовності (див. Вгіпеїег еї а, Ргос. Май. Асай. ОБА 85: 836-840 (1988); РаїЇтіег ей а). Ргос Май. Асай. Ба. О5БА 88: 478-482 (1991): М/піеіам еї ам, Трансгенний Кев. 1:3-13 (1991); МО 89/01343; та МО 91/02318) на кожну з робіт нами робиться посилання). У цьому зв'язку перевагу там, де це можливо, віддають використанню геномних 70 послідовностей, які містять усі або деякі з природних інтронів гена, що кодує потрібний протеїн або поліпептид, і таким чином, перевагу віддають включенню принаймні деяких інтронів, наприклад, з гена бета-лактоглобуліну. Однією з таких ділянок є сегмент ДНК, який забезпечує сплайсинг інтронів та поліаденілювання РНК з 3 некодуючої ділянки гена бета-лактоглобуліну вівці. Замінений на природні 3 некодуючі послідовності гена, цей сегмент бета-лактоглобуліну вівці може і підвищувати, й стабілізувати рівні /5 експресії потрібного протеїну або поліпептиду. В інших варіантах ділянка, що оточує АТО ініціації послідовності модифікованого Фактора МІЇ, замінюється на відповідні послідовності гена специфічного протеїну молока. Така заміна забезпечує передбачуване середовище для тканинно-специфічної ініціації для посилення експресії. Добре зарекомендувала себе повна заміна модифікованих пре-про- та 5' некодуючих послідовностей

Фактора МІ! послідовності, наприклад, ВІ С-гена, хоча можуть бути замінені й менші ділянки.

Для експресії модифікованого Фактора МІ у трансгенних тварин сегмент ДНК, що кодує модифікований

Фактор МІІ, функціонально з'єднується з додатковими сегментами ДНК, необхідними для експресії з метою вироблення експресійних одиниць. Такі додаткові сегменти включають вищезгаданий промотор, а також послідовності, які забезпечують термінацію транскрипції та поліаденілювання мРНК. Експресійні одиниці також включають сегмент ДНК, який кодує секреторну сигнальну послідовність, функціонально з'єднану з сегментом, сч ов ЩО кодує модифікований Фактор МІІ. Секреторною сигнальною послідовністю може бути секреторна сигнальна послідовність природного Фактора МІ або може бути послідовність іншого протеїну, такого як протеїн молока. і)

Див., наприклад, моп Неїпіе, Мис. Асідз Кев. 14: 4683-4690 (1986); апа Меаде еї аІ., Патент США Мо4 73 316, роботи, на які нами робиться посилання.

Побудову експресійних одиниць для використання у трансгенних тваринах зручно здійснювати через со зо введення послідовності модифікованого Фактора МІЇ у плазмідний або фаговий вектор, що містить додаткові сегменти ДНК, хоча експресійна одиниця може бути побудована практично будь-якою послідовністю лігувань. о

Особливу перевагу віддають застосуванню вектора, що містить сегмент ДНК, який кодує протеїн молока, та с заміні кодуючої послідовності протеїну молока на послідовність поліпептиду модифікованого Фактора МІЇ, що створює злиття генів, яке включає послідовності, що контролюють експресію гена протеїну молока. У будь-якому со разі, клонування експресійних одиниць у плазмідах або інших векторах забезпечує ампліфікацію послідовності «о модифікованого Фактора МІ. Ампліфікацію краще здійснювати у бактеріальних (наприклад, БЕ. с«соїї) клітинах-хазяях, щоб вектори, таким чином, включали джерело реплікації та селектабельний маркер, що функціонує у бактеріальних клітинах-хазяях.

Експресійну одиницю після цього вводять у запліднені яйцеклітини (включаючи ембріони на ранній стадії) « вибраних видів-хазяїв. Введення гетерологічної ДНК може здійснюватись одним з кількох шляхів, включаючи з с мікроін'єкцію (див., наприклад, Патент США Мо4 873 191), ретровірусну інфекцію (Чаепізсі, Зсіепсе 240: . 1468-1474 (1988)) або сайт-спрямовану інтеграцію з використанням клітин первинної стеблинки зародку (Е5) и?» (розглянуто Вгадіеу еї а!., Віо/ГесппоІоду 10: 534-539 (1992)). Після цього яйця імплантують у яйцеводи або матки псевдовагітних самиць і дають розвинутися до кінця. Потомство, що несе введену ДНК у лінії зародкових

КЛлітин, може передавати ДНК своєму потомству звичайним способом за Менделем, що забезпечувало розвиток б трансгенного стада.

Загальні процеси створення трансгенних тварин відомі спеціалістам. Див., наприклад, Нодап еї аї, со Мапіршіайпуд (пе Моийзе Етргуо: А Іарогаїгу МапиаЇ, Соїй Зргіпд Нагрог І арогаїогу, 1986; Зітопв еї аї., 2) Віо/Гесппоіоду б: 179-183 (1988): УМаї! еї аїЇ, ВіоЇ.Керго4 32: 645-651 (1985); ВийпіІег еї аїЇ. Віо/Лесппоіодм 8: 5о 140-143 (1990): Ереп еї а!., Віо/Тесппоїюду 9: 835-838 (1991): Кгітрепіогі еї а!., Віо/Тесппоіїоду 9: 844-847 о (1991): УУаї! еї аІ.0). Віоспет. 49: 113-120 (1992); Патенти США МомМо.4 873 191 та 4 873 316; Публікації УМРО МО 4) 88/00239, МО 90/05188, МО 92/11757; та В 87/00458, роботи, на які нами робиться посилання. Способи введення чужорідних ДНК-послідовностей у ссавців та їхні зародкові клітини спочатку були розроблені на мишах.

Див., наприклад, Согдоп еї аї., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 77: 7360-7384 (1980); богдоп апа Киааїе, 5взепсе. дво 214: 1244-1246 (1981); Раїтйег апа Вгіпвіег Сей 41: 343-345 (1985): Вгіпвіег еї а. Ргос. Май. Асад.

Зсі. ОА 82: 4438-4442 (1985); та Нодап еї аї. (іріа.). Ці способи були згодом пристосовані для використання (Ф) з білошими тваринами, включаючи домашні види (див., наприклад, публікації УЛРО УУО 88/00239, УМО 90/05188, ка та УМО 92/11757; та Зітопз еї аї., Віо/Гесппоіоду 6: 179-183 (1988). Словом, найефективнішим шляхом, який застосовується на даний момент для отримання генерації трансгенних мишей або домашніх тварин, кілька бо сотень лінійних молекул потрібної ДНК вводять в один з пронуклеусів заплідненої яйцеклітини згідно з прийнятими способами. Може також бути застосоване введення ДНК у цитоплазму зиготи.

Може бути застосоване також вироблення у трансгенних рослинах. Експресія може бути як загальною, так і орієнтованою на конкретний орган, такий як бульба. Див. Ніай, Маїйге. 344:469-479 (1990); ЕдеІрашт еї аї.,

У, Іпіепегоп Кев. 12:449-453 (1992); бБі|топе сеї аї. Віо/Гесппоїоду 8:217-221 (1990); та Публікацію 65 Європейського патентного бюро ЕР 255 378.

Модифікований Фактор МІЇ може бути очищений за допомогою афінної хроматографії на колонці з антитілом антифактора МІІ. Особливу перевагу віддають використанню залежних від кальцію моноклональних антитіл, як описано у роботах УУаКарауазні еї аї., 9. Віої. Спет. 261:11097-11108, (1986) та Тпіт еї аї!., Віоспет. 27: 7785-7793, (1988), на які нами робиться посилання. Додаткове очищення може досягатися традиційними засобами хімічного очищення, такими як рідинна хроматографія з високою роздільною здатністю.

Спеціалістам відомі й інші способи очищення, включаючи осадження цитратом барію, які можуть бути застосовані для очищення описаного нами нового модифікованого Фактора МІ! (див. Зсорев, К, Ргоїеїп

Ригійсайоп. Зргіпдег-Мепад, М.М., 1982). Перевагу у фармацевтичному використанні віддають практично чистому модифікованому Факторові МІЇ, що має гомогенність принаймні близько 90-9595, найкраще - 98-9995 або 70 більше. Очищений частково або до потрібної гомогенності, модифікований Фактор МІ може після цього використовуватися терапевтично.

Модифікований Фактор МІ розщеплюють у його активаторному сайті для перетворення на його дволанцюгову форму. Активація може бути здійснена згідно з традиційними процедурами, такими як описана у роботах Озіегцй, еї а!., Віоспетівігу 11:2853-2857 (1972): Тпотаз, Патент США Мо4 456 591; Неадпегапа Ківзіе!, 75 3. Сп. Іпмеві 71:1836-1841 (1983); або Кізі! апа РцііКажа, Вейгіпу Іпеі Мій. 73:29-42 (1983), на які нами робиться посилання. Отриману в результаті молекулу після цього формулюють і вводять, як описано нижче.

Композиції

Сполуки, як правило, вводять приблизно за 24 години до втручання і на 7 або більше днів після нього.

Введення для запобігання або мінімізації ураження міокарду може здійснюватися різними шляхами, які описані нами нижче. Сполуки можуть також бути введені локально у ділянки судин, схильні до утворення тромбів, наприклад, на ділянках анастомозу, або локально у ділянки судин, схильні до зниження прохідності.

У профілактиці або лікуванні ураження міокарду доза модифікованого Фактора МІ! становить приблизно від

Б5Омг до 50Омг/день, краще - від 1мг до 200мг/день, найкраще - від 10мг до приблизно 175мг/день на 7Окг маси сч г пацієнта як дози насичення та підтримуючі дози, залежно від маси пацієнта та складності його стану.

Фармацевтичні композиції для лікування пошкоджень міокарду призначені для парентерального введення і) для профілактичного та/або терапевтичного лікування. В оптимальному варіанті фармацевтичні композиції вводяться парентерально, тобто внутрішньовенно, підшкірно, або внутрішньом'язово. Композиції для парентерального введення включають розчин молекул модифікованого Фактора МІЇ, розчинених у прийнятному (се зо носії, в оптимальному варіанті - водному носії. Можуть використовуватися різні водні носії, наприклад, вода, буферована вода, 0,490 фізіологічний розчин, 0,395 гліцин та ін. Молекули модифікованого Фактора МІ! також о можуть бути формульовані у ліпосомні препарати для подачі або спрямування у пошкоджені ділянки. Ліпосомні с препарати в цілому описуються, наприклад, у патентах США МоМо4 837 028, 4 501 728 та 4 975 282, на які нами робиться посилання. Композиції можуть бути стерилізовані традиційними, добре відомими способами со стерилізації. Отримані в результаті водні розчини можуть бути запаковані для використання або відфільтровані «о в асептичних умовах і ліофілізовані, ліофілізований препарат поєднується зі стерильним водним розчином перед введенням. Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, необхідні для наближення до фізіологічних умов, такі як регулюючі рН та буферні агенти, агенти, що регулюють концентрацію агенти та ін., наприклад, ацетат натрію, лактат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію тощо. Концентрація « Модифікованого Фактора МІЇ у цих формулах може бути дуже різною, тобто, від кількості менше 0,596, частіше - пт») с не менше приблизно 195, і до 15 або 2095 за масою, і вибирається, насамперед, згідно з об'ємом рідини, в'язкістю та ін. залежно від конкретного вибраного режиму введення. ;» Таким чином, типова фармацевтична композиція для внутрішньовенного введення може містити 250мл стерильного розчину Рингера та 10мг модифікованого Фактора МІІ. Конкретні способи приготування сполуки для парентерального введення є відомими або очевидними для спеціалістів і описуються більш детально,

Ге» наприклад, у роботі Кетіпдіоп'є Рпаптасеціїса! 29 16 ед., Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Еазіоп, РА (1982), на яку нами робиться посилання. со Композиції, що містять молекули модифікованого Фактора МІІ, можуть вводитися для профілактичного та/або 2) терапевтичного лікування. При терапевтичному застосуванні композиції вводять пацієнтові, який вже страждає

Від хвороби, як описано вище, у кількості, достатній для лікування або принаймні часткового стримування і хвороби або її ускладнень. Кількість, яка є адекватною для цього, визначається як "терапевтично ефективна 4) доза." Кількості, ефективні для такого використання, залежать від тяжкості хвороби або пошкодження і маси та загального стану пацієнта, але, як правило, становлять приблизно від 0,05мг до приблизно 500мг модифікованого Фактора МІ на день на 7Окг маси пацієнта, причому найчастіше використовуються дози приблизно від 1,0мг до приблизно 200мг модифікованого Фактора МІ на день. Слід пам'ятати, що матеріали згідно з даним винаходом взагалі можуть застосовуватися при серйозних захворюваннях або ураженнях, тобто у (Ф, ситуаціях, які загрожують життю або містять таку потенційну загрозу. У таких випадках з метою зведення до ка мінімуму чужорідних речовин та загального браку імуногенності модифікованого Фактора МІ людини у людей, є можливим і може бути бажано, щоб лікар вводив значно підвищену кількість цих композицій модифікованого бо Фактора МІ.

При профілактичному застосуванні композиції, що містять модифікований Фактор МІ! вводять пацієнтові, схильному до хвороби або який перебуває під загрозою хвороби або пошкодження, з метою підвищення антикоагуляційної здатності пацієнта. Така кількість визначається як "профілактично ефективна доза." У цьому разі точна кількість знову залежать від стану здоров'я пацієнта та його маси, але, як правило, становить 65 приблизно від 0,05мг до приблизно 500мг на 7Окг маси пацієнта, частіше - від приблизно 1,0мг до приблизно 200мг на 7Окг маси тіла.

Одноразове або багаторазове введення композицій може здійснюватися у дозах та у режимі, визначених лікарем. Для амбулаторних пацієнтів, які потребують щоденних підтримуючих доз, модифікований Фактор МІЇ може вводитися шляхом безперервної інфузії з використанням, наприклад, переносної системи нагнітання.

Локальне введення модифікованого Фактора МІЇ, таке, як, наприклад, місцеве застосування модифікованого

Фактора МІ! щодо ділянок судин, схильних до утворення тромбу, (наприклад, ділянок анастомозу) або щодо ділянок судин, схильних до зниження прохідності, може здійснюватися, наприклад, шляхом розпилення, перфузії, за допомогою подвійних катетерів-балонів, стентів, з'єднаних з судинними шунтами або стентами, гідрогелей, використовуваних для покриття катетерів-балонів, або іншими способами, які добре себе /о зарекомендували. У будь-якому разі, фармацевтичні розробки мають забезпечувати кількість модифікованого

Фактора МІ! згідно з даним винаходом, достатню для ефективного лікування пацієнта.

Поданими нижче прикладами винахід лише ілюструється, але не обмежується.

ПРИКЛАДИ

Приклад

Експресія Зегз/дЯАїазлл Фактора МІЇ

Для одержання мутанта з активним сайтом 5егз44бАїазлі Фактора МІ! плазміду ЕМІ(565-2463Уурох (Патент

США Мо4 784 950, на який нами робиться посилання; депонована в Американському зібранні типових культур під номером доступу 40205) розщеплювали за допомогою Ха І та Крп І і виділяли отриманий в результаті 0,6 т. п. н. фрагмент, що містив кодуючу ділянку для серину 344. Цей фрагмент клонували у Хба І, розщеплену Крп М'Зтр!19, як показано на Фігурі. Цю обробку та наступні етапи, описані нижче, в цілому здійснювали згідно зі стандартними протоколами (як описано, наприклад, у роботі Мапіаїїв еї а!Ї., МоїІесшаг Сіопіпуд. А І арогайгу

Мапиаї!. Соїа 5ргіпд Нагброг І арогаїюгу Ргезз, Соїй Зргіпд Нагброг, М.У. (1982), на яку нами робиться посилання).

Мутагенез здійснювали на М13 матриці згідно з вищезгаданими способами Цоллера та Сміта (7гоПег апа

Зтіфй), використовуючи мутагенний олігонуклеотид 7С1656 (5 То сс сс ос ото ССС ст 3) та сч "універсальний" вторинний праймер 27С87 (5 ТСС САС ТСА СОА СОТ 3). Продукти реакції піддавали скринінгу, використовуючи кіназовану 221656. Позитивні бляшки збирали і приготовляли матричну ДНК, секвенували від і)

Рвї І-сайту 1077 до Крп І-сайту 1213. Аналіз послідовності підтвердив наявність потрібної мутації. Мутантний клон отримав номер 1656.

Після цього будували експресійний вектор, використовуючи клон 1656. Мутагеновану послідовність виділяли с зо З МІ1З вектору як 50,14 т. п. н. Рві І-Крп І-фрагмент. Цей фрагмент приєднували до 1,7 т. п. н. Ніпа П-Хра

І-фрагменту з ЕМІ(565-2463)рОХ, до 0,5 т. п. н. Хба І-Рві І-фрагменту з ЕМІ(565-2463УрОХ та 4,3 т. п. н. о

Крпо І-Ніпа П-фрагменту з РМІ(565-2463УрОХ, як показано на Фігурі. Присутність потрібної мутантної с послідовності була підтверджена розщепленням мутантних та природних клонів за допомогою Рвеї | та введенням мутантного Фактора МІ у М13 за допомогою Крп І та Хбра І, приготуванням Саузерн-блотів со розщепленої ДНК та зондування блотів радіоактивно міченим 2С1656. «о

Клітинну лінію ВНК 570 з нирок новонароджених хом'яків (в Американському зібранні типових культур під номером доступу 10314) трансфікували двома ізолятами (під номерами 544 та 545) 1656-експресійного вектору.

Клітини приготовляли шляхом розведення суцільного шару ВНК 570 клітин у 10см чашці у співвідношенні 1:10 у п'ять 10см чашок у неселективному середовищі (Модифіковане Дульбекко середовище Ігла (ОМЕМІ, що містить « 109 сироватки плоду великої рогатої худоби та 195 РБМ антибіотичної суміші |(ЗІВСО І Мйе Тесппоіодіев, пт) с Сайпетгериго, МОЇ). Через 24 години, коли клітини досягали утворення 20-3095 суцільного шару, їх заново . трансфікували одним з ізолятів експресійного вектору, що кодував мутацію у 1656, плазмідою р4і86 (яка включає а 5 огі Аденовірусу, енхансер 5М40, головний останній промотор Аденовірусу 2, трьеохкомпонентну лідерну послідовність Аденовірусу 2, 5 та 3 сайти сплайсингу, КДНК ОНЕК!' та сигнал поліаденілювання 5М40 у рМі -1 5 (ШивКу та Воїснап, Маїшге 293: 79-81, (1981)) та 10мг ДНК-носія (ДНК сперми лосося обробляли ультразвуком),

Ге») як показано в Таблиці 1. Додавали ДНК до 15мл пробірки, тоді додавали 0,5мл 2Х Нерез (25г Нерез, 40г масі, со 1,8г КСІ, 0,757 МаНРОХх2НьЬО 5г декстрози розводили до 2,5л дистильованою водою та рН підводили до рНб,95-7,0) та пробірки змішували. ДНК в кожній пробірці осаджували додаванням 0О,5мл 0,25М Сасі», в той (95) час як повітря продували крізь розчин ДНК/Нерез пастеровскою піпеткою. Тоді пробірки перемішували вихровими рухами, інкубували при кімнатній температурі протягом 15 хвилин і знову перемішували вихровими о рухами. Суміші ДНК потім додавали краплинами піпеткою у чашки з клітинами. Чашки піддавали круговим рухам сю й інкубували при 377"С протягом 4-6 годин. Після інкубації до кожної чашки додавали 2мл 20905 гліцеролу, розведеному в Трис-фізіологічному розчині (0,375г КСІ, 0,71г Ма»НРО, 8,1г Масі, З,Ог Трис-НСІ, 0,5г цукрози, розводили в загальному об'ємі 1 літру та рН підводили до рН7,9). Чашки перемішували вихровими рухами та залишали при кімнатній температурі протягом двох хвилин. Потім середовище видаляли з чашок та замінювали з 2мл Трис-фізіологічного розчину. Чашки залишали при кімнатній температурі протягом 2 хвилин, потім

ІФ) Трис-фізіологічний розчин видаляли і замінювали з їОмл неселективного середовища. Чашки інкубували при ко 37"С протягом двох днів. во вм | вав (ля контродь|вяв Контроль,

Ззаду 10000 клнвмо ват 20 ям вв вен |з 0200000 рі8б6 1,Б5мл /1,5мл - -

клон 544: 0,7мг/мл: клон 545: 0,Змг/мл; рі86: 1,49мг/мл.

За два дні інкубації клітини розводили в селекційному середовищі (ОМЕМ, що містить 1095 діалізованої сироватки плоду великої рогатої худоби, 195 суміш антибіотиків РОМ та 150НМ метотрексату) й висаджували при розведеннях 1:100, 1:250 та 1:500 в максимальні чашки. Чашки інкубували при 377С протягом одного тижня. За 70 тиждень середовище змінювали та замінювали на селекційне середовище і чашки перевіряли на утворення колоній.

Вісім днів по тому після утворення колоній дванадцять колоній випадково вибирали з чашок 1:500 розведення Мо544 та Мо545 трансфекційних чашок. Кожний клон висаджували в одну лунку б-лункового планшету й вирощували в селекційному середовищі. За сім днів в лунках утворювався суцільний шар культури 75 такожний клон розподіляли у 10см чашки в селекційному середовищі.

Вищеописані клони та контрольні клітини трансфікували для експресії Фактора МІ! дикого-типу, метаболічно міченого сумішшю для мічення протеїнів 325-Метонін-Цистеіїном (МЕМ ЮиРопі Віоїесппоіоду Зувіетв, УМітіпдіюп, є).

Клони вирощували та готували для експерименту з імпульсної міткою в селективному середовищі. Клітини промивали фізіологічним розчином з фосфатним буфером (5ідта, 51. І оців, МО) та мітили протягом чотирьох годин в 20мКи/мл 355-Метіонін-Цистеїні. За чотири години збирали супернатанти та клітини. Клітини лізували, головним чином, як описано у ГепК та Рептап (Сеї! 16: 289-302, (1979)) і 40б0мл кожного лізату попередньо очищували 5Омл віарі А (5ідта, 5. І оців, МО).

Зразки метаболічно мічених клітин піддавали радіоімунопреципітації (ВІР), інкубуючи спочатку зразкизбмл СМ поліклональної антисироватки до Фактора МІ! протягом чотирьох годин. До кожного зразка додавали шістдесят о мікролітрів промитого протеїну стафілокока і зразки трясли протягом 1,5 години при 4"С. Зразки центрифугували і видаляли супернатант. Осади промивали двічі в 0,7М КІРА буфер (10мММ Трис, рН7,4, 195 деоксихолевої кислоти ІСаІріоспет Согр., І а доїа, САЇ, 1956 Тритон Х-100, 0,196 ДСН, 5мМ ЕДТА, 0,7М Масі|) та один раз у 015М

ВІРА буфері (10мМ Трис, рН7,4, 195 деоксихолевої кислоти (СаІріоепет Согр., Га Чоа, СА), 196 Тритон Х-100, ФО 0,1 ДСН, 5ММ ЕДТА, 0,15М МасІі). До кожного зразка додавали 100мкл 1х ДСН барвника (50мМ Трис-НСЇІ, рнб,8, со 100мММ дитіотреїтол, 295 ДСН, 0,190 бромфенол синій, 1095 гліцерол) і зразки кип'ятили протягом 5 хвилин, після чого центрифугували для видалення протеїну А. П'ятдесят мкл кожного зразка пропускали через 10905 о поліакриламідний гель. Результати показали, що 9 з 10 клонів секретували модифікований Фактор МІ. со

Приклад ІІ 3 Антикоагулянтна активність модифікованого Фактора МІ! |се)

Здатність протеїну модифікованого Фактора МІ! інгібувати згортання вимірювали у одноетапному тесті на згортання, використовуючи дикий тип Фактора МІ! як контроль. Рекомбінантні протеїни приготовляли, головним чином, як описано вище, з клітин, що культивували в середовищі, яке містило бмг/мл вітаміну К. Різні « кількості модифікованого Фактора МІ! (клон 544) або рекомбінантний дикий тип Фактора МІЇ розводили в Х0ММ

Трис рН7,5, 0,195 БСА (бичачий сиворотковий альбумін) до 17ООмл. Суміші інкубували з 1700мл плазми, т с дефіцитної на Фактор МІ! (Сеогде Кіпод Віо-Медіса! Іпс., Омепапа Рагк, К5), і 200мл тромбопластину С (Оаде, "з Міаті, РІ; містить тромбопластин мозку кролика та 11,8мМ Са""). Тест на згортання виконували з автоматичним " таймером коагуляці (МА ЕЇІесіга 800, Медіса! І арогаїогу Айіотаїйоп Іпс., РіеазапіміІМе, ММ) і час згортання переводили у одиниці активності Фактора МІІ, використовуючи стандартну криву, побудовану з від 1:5 до 1:640 розведень зібраної за звичайних умов плазми людини (передбачається вміст однієї одиниці активності Фактора іа МІЇ на мл; що приготовляли зливанням цитратної сироватки здорових донорів). При використанні цього тесту

Го) препарати модифікованого Фактора МІ не мали коагулянтної активності, що можна було виявити. Таблиця 2 показує результати тесту в термінах згортання для контрольного (нетрансфікованого) ВНК середовища для о клітин (т/- вітамін К), Фактора МІ! дикого типу та двох ізолятів клітин, що експресували модифікований Фактор

Га 20 У, Активність Фактора МІЇ показана як зниження у часі згортання у порівнянні з контрольними зразками. с» зв нн Ес ІН НЕ У о пн Ес НЕ У т тв во нн ит НН

Для визначення впливу модифікованого Фактора МІ на субстрати плазменого фактора препарати бо модифікованого Фактора МІЇ та рекомбінантного Фактора МІ дикого або природнього типу інкубували як з

Фактором Х або Фактором ІХ, і їх активацію визначали тестами на згортання або електрофорезом у поліакриламідному гелі.

Приклад ІІ

Здатність модифікованого Фактора МІ! зв'язувати тканинний фактор

Здатність модифікованого Фактора МІ конкурувати із Фактором МІЇ дикого типу за тканинний фактор й інгібувати його активність згортати кров перевіряли одноетапним тестом на згортання в присутності обмеженої кількості тканинного фактора (тромбопластину).

Час згортання визначали в тому ж одноетапному тесті, що описаний в Прикладі І. В експериментах по змішуванню використовували обмежену кількість тканинного фактора, постійну кількість Фактора МІ! дикого типу 7/0 | підвищені кількості модифікованого Фактора МІЇ. Інгібування прокоагулянтної активності Фактора МІ/ЛМІа було б видно як підвищення в часі згортання в тестах, що містили збільшені кількості модифікованого Фактора

МІ.

Кількість активності Фактора МІ в тестових зразках підраховували як відсоток від стандартної кривої, що показувала активність Фактора МІ! в зібраній за звичайних умов плазмі. Стандартна крива активності Фактора у75..МІ була побудована, використовуючи послідовні розведення зібраної за звичайних умов плазми в фосфатному буферному розчині (РВ5), що змінювались від 1:5 до 1:640. Було припущено, що плазма за звичайних умов містить приблизно 50Онг/мл Фактора МІЇ, і це вважали одиницею активності. Для вимірювання часу згортання за допомогою автоматичного таймеру МІ А ЕПІесіга 800 використовували суміш 100мл плазми, дефіцитної на Фактор

МІЇ, 100мл розведення плазми та 200мл тромбопластину-С (Оаде, Міаті, РІ). Для побудови стандартної кривої результати наводили як відсоток активності (1:5-:1009о активність) від часу згортання в секундах.

Тест вимагав, щоб середовище, яке містило дикий тип і модифікований Фактор МІЇ, складалося з менше ніж одного відсотку сироватки. Розведення були зроблені в РВ5З так, щоб час згортання попадав вздовж стандартної кривої. Мінімальне розведення 1:2 було типовим. Кінцевий об'єм був 100 мл. Два різні модифіковані Фактори МІЇ

Зегз4(ФАЇїа людини, позначені клони "Мо10" та "Моб" тестували в експерименті. Результати, наведені нижче в с

Таблиці, показують, що як тільки кількість модифікованого Фактора МІ! підвищувалась, відсоток активності

Фактора Мііа знижувався. і) й

Модифіковане (В4А1 (дикий тип) середовище використовували як 10095 активність при 1Омкл/реакцію) со

Зегзда -Аїа Модифіковане середовище кількість | В4ААТ середовище кількість | ВНК контроль" | Відсоток ЕМіІІа активності ють М КИ В ю 11111106 0 ми1ми0110001в со зво000077ю01зм11101100я010001833 Ф 11111110 0 вми011ми110001008 вер 10000019

ПОС ЗННННИ ПОЗИ ПОЛО У ННЯ ПОЛОН НО єв я с 6 117111111011000106 їз» ПОЗИ НО я ПО ННЯ ПОС НО то 6117 я111111010001039 же 1111111лма/|7711111ломи 17116186 є Ве 000111110001111110001 и

Ф Внкюнтольсю| 00010191 и 1000007 й сю 5Для експресії модифікованого Фактора Мі! клітини вирощували в присутності вітаміну К, за винятком прикладів, позначених "(-Ю" 2) 20 Ці експерименти показали, що модифікований Фактор МіІІ, який має бег344 Ф Аа заміщення, конкурував дозозалежним чином з природнім Фактором МІ! та інгібував прокоагулянтну активність природного Фактора с» МІЛ/ЛПа. Таким чином, можна зробити висновок, що БегзлиФАЇїа модифікований Фактор МІЇ людини конкурує з природним Фактором Мііа людини, і, отже, інгібує активацію Фактора Х та/або ІХ в плазмі людини.

Приклад ЇМ 59 Реакція Фактора МІ! з РРАСК

ГФ) Рекомбінантний Фактор МІЇ одержували з трансфікованих клітин нирок новонароджених хом'яків. Протеїн очищали та активували, як описано у Тіт еї аїЇ. (Віоспетівігу 27: 7785-7793, 1988), Вгіпкоив еї аї. (Ргос. о Май.Асайд Зсі. ОБА 86: 1382-1386, 1989) і Віоегп та Тіт їКез. Оівсі. Мо269, 564, 1986), на які нами робиться посилання. Виділяли середовище для культивування клітин, фільтрували та розводили, щоб зменшити 60 концентрацію солі. Середовище розводили, потім розподіляли на фракції аніон-обмінною хроматографією, використовуючи буфер для елюції, що містив СасСі 5». Фракцію Фактора МІЇ виділяли та подалі очищали імунохроматографією, використовуючи кальцій-залежне моноклональне антитіло до Фактора МІІ. Додаткове очищення здійснювали, використовуючи аніон-обмінну хроматографію в два етапи, де Фактор МІЇ елюювали, використовуючи Сасі» та Масі, відповідно. Фактор Мііа виділяли в кінцевому елюаті. бо Рекомбінантний Фактор Мііа (1ММ) в 5О0мМ Трис-НСЇ, 100мМ Масі, 5ммМ Сасі» рн? 4 інкубували з 20мМ РРаск

(О-Фенілаланіл-Проліл-Аргініл Хлорметил кетон, СаіІріоспет, І а доПа, СА) протягом 5, 20 та 60 хвилин. Потім додавали буфер, що містив хромогенний субстрат 52288 (Н-О-ізолейцин-їі -Проліл-ї -Аргінін п-нітроанілід; Кабі

Мігут АВ, Моїіпаа), Зуледеп), для одержання 2,5 разового розведення і кінцевої концентрації О,3мММ 52288.

Утворення п-нітроаніліну вимірювали і порівнювали з результатами, використовуючи чистий Фактор Ма як контроль. Результати показали, що Фактор Ма повністю інактивується Через приблизно 6бО хвилин в цих реакційних умовах.

Приклад М

Утворення ОЕОК-Фактора Ма 70 Рекомбінантний Фактор Ма людини готували, як описано в Прикладі ІМ. Рекомбінантний Фактор Ма людини, в 10мММ гліциновому буфері, рНа,0, 10мМ Сасі») 50мМ Масі розводили до концентрації 1,5мг/мл. До Фактора Ма додавали 10 разовий молярний надлишок Дансил-ї -(зІ0-с1Іу-Агд-Хлорметилкетону, ОЕОКСсК, (Саїіріоспет, г а

ЗоМПа, СА 92037), який розчиняли дистильованою Н 50. За 2 години інкубації при 37"С другий 10 разовий молярний надлишок ОЕСКСсК додавали до суміші та інкубували протягом ще 2 годин при 37"С. Третій 10-разовий молярний надлишок ОЕСКсСК додавали до Фактора Мііа й інкубували протягом приблизно 16 годин при 47с.

Зразок ОБОК-Фактора Мііа потім екстенсивно діалізували при 4"С проти фізіологічного розчину, що містив буфер

Трис (0,05М Трис-НСЇ, 0,1М масі, рнН7,5) для видалення будь-якого вільного ОЕСКСК.

Суміш кінцевого ОЕОК-Фактора Мііа тестували на присутність вільного ОЕОКСК в тесті з Фактором Ха як хромогенним субстратом. Суміш ЮОЕСК-Фактора Ма додавали до очищеного Фактора Ха людини разом з 2о Ххромогенним субстратом 5-2222. Цей субстрат розщеплюється специфічно Фактором Ха, але не Фактором МіІа.

Незв'язаний ОЕСКСК в суміші здатний зв'язуватись з Фактором Ха та, таким чином, інгібувати хромогенну активність Фактора Ха. Безпіковий ОЕСМК-сК у суміші Фактора Ха утворює стандартну криву для визначення концентрації вільного ОЕСКсСК в розчині від інгібування хромогенної активності Фактора Ха. Аналіз суміші рЕСК-Фактора Мііа показав, що співвідношення вільного ОБЕОКСКОЕСК-Фактора Ма менше, ніж 0,590 після с об екстенсивного діалізу, таким чином запевняючи, що інгібування, яке спостерігається за допомогою

РЕСК-Фактора Мііа в різноманітних нижчеописаних тестових системах, відбувається не завдяки присутності і) вільного ОЕОКСК.

Приклад МІ

Утворення Фактора Ха на клітинах гладеньких м'язів щурів с зо Клітини гладеньких м'язів судин аналізували на присутність тканинного фактора на поверхні клітин вимірюванням здатності клітин стимулювати перетворення Фактора Х на Фактор Ха, використовуючи о хромогенний субстрат, тобто специфічний для Фактора Ха. со

Клітини гладеньких м'язів судин щурів (Сіоулев еї аї., 9. Сіїп. Іпмеві. 93:644-651 (1994)) висаджували у 9б-лункові планшети для культивування (Атегісап Зсіепіййс Ргодисів, Спісадо, ІІ.) у кількості 8000 клітин на со зв лункув середовищі для вирощування (Таблиця 4). «о

Таблиця 4 5О0Омл Модифіковане Дульбекко середовище Ігла (ОМЕМ) (СІВСО-ВКІ,, СЗайпегзриго, МО.) 1096 сироватка плоду великої рогатої худоби (Нусіоп, І одап, ОТ.) 1мМ піруват натрію (Іггіпе, Запіа Апа, СА.) « 0,29мг/мл І-глутамін (Нагегоп, І епеха, К5.) з с їх РБМ, (100Х із 5мг/мл пеніцилін, мг/мл стрептоміцин, й 1Омг/мл неоміцин) (СІВСО-ВК.. (зайпегебиго, МО.) «» Після 48 годин інкубації при 37"С середовище замінювали середовищем без сироватки (Таблиця 5).

Таблиця 5 250мл Модифіковане Дульбекко середовище Ігла (ОМЕМ)

Ге»! 250мл Середовище Гама (Нат) Е-12 (Ргед Ниїспіпзоп Сапсег Кезеагсі Сепіег, ЗеаШе, УМА) 1мММ піруват натрію со 0,29мг/мл І-глутамін

Ге) 20мММ трансферин (КН, І епеха, К5.)

Б5ММ інсулін (5ІВСО-ВКГ) о 16нг селен (Аїагісп, Мім'аикее, УМІ.) се» 1мг/мл бичачий сироватковий альбумін (Зідта, 51. І оців, МО)

Клітини інкубували 72 години при 37"С. Після інкубації або РОСЕ-ВВ (1Онг/мл), або 1095 сироватки плоду великої рогатої худоби додавали до клітин, щоб стимулювати експресію тканинного фактора (Тацотап еї а)... Сіїп. Іпмеві. 91:547-552, 1993). Паралельний ряд клітин не отримував ні РОСЕ, ні сироватки для визначення власної активності нестимульованих клітин. Через б годин інкубації рекомбінантний Фактор Ма людини (Ф, додавали до клітин при кінцевій концентрації ЛОНМ. Один ряд клітин не мав Фактора Мііа, що додавали як ко негативний контроль. Клітини інкубували протягом 2 годин при 37"С та промивали буфером НЕРЕ5З (10мММ

НЕРЕЗ5, 137мМ Масі, 4мМ КСІ, 5мМ Сасі», 11мММ глюкози, 0,195 БСА). Після промивання клітини інкубували бо протягом 5 хв з 50 мл на лунку 200 нМ очищеного Фактора Х плазми людини в фізіологічному розчині, що містив

Трис, з 5мМ СасСі». До кожної лунки додавали двадцять п'ять мкл 0,5М ЕДТА та 25мл 800мММ розчину хромогенного субстрату 5-2222 (Карі Ріпагтасіа, Егапкіп, ОН). Чашки інкубували протягом 40хв при кімнатній температурі, тоді аналізували при 405НМ, використовуючи мікропланшетний аналізатор ТНЕКМОМАХ (Моіесшаг

Оемісез, Мепіо Рагк, СА). 65 Таблиця 6 показує підвищення поглинання лунок, в які додавали Фактор Мііа порівняно з контрольними лунками (Фактор МіІІа не додавали). Підвищення поглинання є прямим вимірюванням концентрації Фактора Ха,

що утворився в лунках, із наступним розщепленням хромогенного субстрату, який виділяє хромофор. Дані також показують, що рівень хромогенної активності в клітинах, на які діяли або РОСЕ-ВВ, або 1095 сироваткою плоду великої рогатої худоби, вище, ніж у нестимульованих клітин. о

Ці результати чітко доводять існування Фактор МіІІа-залежної активації Фактора Х у Фактор Ха на поверхні клітини гладеньких м'язів судин.

Приклад МІЇ то Інгібування хромогенної активності ОЕСК-Фактора Мііа на поверхні клітин

Клітини гладеньких м'язів судин щурів висаджували у вищеописані 96-лункові планшети для культивування.

Клітини культивували протягом 72 годин в середовищі без сироватки, як описано вище, та додавали 1095 сироватку плоду великої рогатої худоби протягом б годин, щоб стимулювати експресію тканинного фактора.

Після стимуляції до кожної лунки додавали лише буфер (контроль), ЛОНМ Фактора Ма або 1ОнНМ Фактора

Міа-т100нмМ РЕСК-Фактора Мііа. Клітини інкубували протягом 2 годин при 37"С, тоді промивали буфером НЕРЕЗ.

Після промивання клітини інкубували протягом 5 хвилин 5О0мл 200НМ Фактор Х на лунку в фізіологічному розчині, що містив Трис, з 5ММ Сасі». До кожної лунки додавали двадцять п'ять мкл О,5М ЕДТА і 25мл хромогенного субстрату 5-2222 (800мМ) (Карі Рнаптасіа). Клітини інкубували при кімнатній температурі протягом 40 хвилин. ря Хромогенну активність аналізували при 405НМ, як описано вище. см

Таблиця 7 показує стимуляцію хромогенної активності в лунках з лише Фактором Мііа й інгібування (о) стимуляції, коли ОЕОК-Фактор Мііа коінкубували з Фактором Мііа. Ці результати показують, що ОЕОК-Фактор Мііа діє як конкурентний антагоніст для Фактора Мііа, зв'язуючи таким чином та інгібуючи активацію Фактора Х у

Фактор Ха з наступним розщепленням хромогена 5-2222. с зо не о со з о

Приклад МІЇ

Дозозалежне інгібування ОЕСК-Фактором Мііа хромогенної активності на поверхні клітин гладеньких м'язів « щурів З

Клітини гладеньких м'язів судин щурів висаджували у 96-лункові планшети для культивування по 4000 клітин с на лунку в середовище для вирощування, що містило 195 сироватку плоду великої рогатої худоби (як в Таблиці 4

Із» без 1095 сироватки плоду великої рогатої худоби). За 5 днів середовище видаляли і додавали до клітин або лише підвищені концентрації Фактора Мііа, або 1ОнНМ Фактора Мііа з підвищеними концентраціями ОБЕОК-Фактора

Міга. Клітини інкубували з сумішами Фактора МІ! протягом 2 годин при 37"С Після інкубації, клітини промивали 49 й інкубували з 5Омл 200нМ Фактора Х в Трис-фізіологічному розчині протягом 5 хвилин при кімнатній б температурі. Кожна лунка містила 25мл 0О,5М ЕДТА і 25мл 800мМ 5-2222 (Карі РНпагтасіа), який додавали до

Ге | кожної лунки, і чашки інкубували протягом 40 хвилин при кімнатній температурі. Хромогенну активність аналізували при 405НМ в мікропланшетному аналізаторі, як описано вище. о Таблиця 8 показує дозозалежне підвищення хромогенної активності з підвищенням кількості Фактора Ма, що со 20 додавали до лунок. Коли суміш ОЕСК-Фактора Ма з 100нНМ Фактора МіІа додавали до клітин (Таблиця 9), відбувалося дозозалежне інгібування хромогенної активності. Молярне співвідношення 1:11 ОЕСК-Фактора Мііа : с» Фактора Мііа інгібувало приблизно 9595 хромогенної активності. Ці дані свідчать, що в цьому експерименті

РЕСК-Фактор Ма має значно вищу спорідненість до тканинного фактора клітинної поверхні, ніж природний

Фактор Міїа на поверхні клітин гладеньких м'язів в культурі Якщо ЮОЕСК-Фактор Ма та Фактор Ма мали 29 однакову спорідненість щодо зв'язування тканинного фактора, тоді рівень інгібування, що спостерігався, коли

ГФ) дві молекули додавали до клітин в однаковому молярному співвідношенні, не був би таким високим. т во

Таблиця 9 показує дозозалежне інгібування ОЕСК-Фактором Ма хромогенної активності Фактора Ха на клітинах гладенького м'язу щурів. Підвищені концентрації ОЕСК-Фактора Мііа коїнкубували з Т00нНМ Фактора Мііа, і хромогенну активність Фактора Ха визначали, використовуючи хромогенний субстрат 5-2222. о 75 ПРИКЛАД ІХ

Інгібування утворення Фактора Ха ОБОК-Фактором Мііа в тесті з розчинним тканинним фактором.

Перетворення Фактора Х на Фактор Ха, використовуючи очищений рекомбінантний розчинний тканинний фактор, встановлювали з використанням хромогенного тесту. Тканинний фактор експресували та очищали з

Засспаготусевз сегемівіае (ЗПпідеїпаїви еї аїЇ. 9. Віої. Спет. 267:21329-21337, 1992). Розчинний тканинний фактор очищав та характеризував Ог. МУ. Ківівї (ОпімегейуМем/ Мехісо). Готували реакційну суміш, що містить 65,9 мл розчинного тканинного фактора (2,2мММ), 29,0мл РСРБЗ (1мМ, Зідта, 5. І оців, МО), 29,5мл Фактора Х людини (4,1мМ), 2,77мл буфера Ганка (Напк) (25мМ Трис, рН7,4, 150мМ Масі, 2,7мМ КСІ, 5мММ Сасі», 0,195

БСА). До кожної лунки 96-лункової чашки для мікротитрування додавали 40мкл суміші тканинний фактор/Фактор

Х, 25мл Фактора Ма, розведеного ТВ5, і 25мл ОЕСК-Фактора Ма, розведеного ТВ5. Використовували сч дв Контрольну суміш 40мл тканинного фактора/Фактор Х; 25мл Фактора Мііа, розведеного ТВ5, і 25мл лише ТВ5. До реакційної суміші в лунках додавали 1Омкл хромогенного субстрату 5-2222 (4ММ) й інкубували при кімнатній (о) температурі протягом 2-10 хвилин. Результати аналізували при 4050М в мікропланшетному аналізаторі, як описано вище.

Визначення стандартної кривої активації Фактора Х Фактором Ма проводили, використовуючи підвищені с концентрації Фактора МіІІа, що додавали у відсутності ОЕОК-Фактора МііІа. Результати, наведені в Таблиці 10, показують, що існує дозозалежне підвищення хромогенної активності з підвищенням кількості Фактора Ма, що со додавали до реакційної суміші. Одночасне додавання різних кількості ОЕОК-Фактора Мііа та 100НМ Фактора Мііа с привело до дозозалежного зниження хромогенної активності (Таблиця 11). Ці дані показують, що ОЕОК-Фактор

Мііа діє як конкурентний антагоніст природного Фактора Мііа, зв'язуючись з розчинним тканинним фактором, та с таким чином інгібує утворення Фактора Ха, що вимірювали зниженням хромогенної активності по відношенню до с хромогенного субстрату 5-2222.

З

Зміни в оптичній густині вимірювали, використовуючи хромогенний субстрат 5-2222. з я с їз» з

Ф со са о 50 й природного Фактора Мііа. Зміни оптичної густини вимірювали, використовуючи хромогенний субстрат 5-2222. вв щі юю 59

Приклад Х

Інгібування коагуляції ОЕОК-Фактором Ма 6Е Стандартні тести на згортання для визначення впливу ОЕСК-Фактора Мііа на час згортання готували наступним чином: 100 мл плазми бабуїна за нормальних умов, зібраної за допомогою цитрату натрію як антикоагулянту, додавали до 100мл різних концентрацій ОЕСМК-Фактора Ма, розведеного ТВ5 (20мМ Трис, рн 4, 150мМ Масі). Зразки змішували та короткочасно інкубували при 37"С. Зразки додавали до автоматичного таймера коагуляції ЕІесіга 800 (Меадіса! Іарогайгіез Амціотаїйоп, РіеазапіМіІМе, МУ). Після інкубації до препаратів ОЕСК-Фактора Ма додавали 200мл препарату тканинного фактора, що містив 25мМ Сасі».

Препарат тканинного фактора готували як фізіологічний розчин екстракту мозку бабуїна з свіжемороженої тканини мозку та перевіряли його на здатність ініціювати коагуляцію плазми бабуїна. Відбирали концентрацію тканинного фактора, час згортання якого становив приблизно 40 секунд.

Дані, наведені в Таблиці 12, показують дозозалежне підвищення часу згортання завдяки додаванню 7/0 РЕК -Фактора Мііа. Доза Імг/мл ОЕСК - Фактора Мііа плазми викликала значне підвищення часу згортання. ів юю

Приклад ХІ

Інгібування агрегації тромбоцтів ОЕскК-фактор Мііа

РЕСК-Фактор Мііа аналізували на здатність інгібувати накопичення бляшок на ділянках артеріального сч тромбозу завдяки механічному пошкодженню у нелюдиноподібних приматів. Модель ендартеректомії аорти використовували у бабуїнів, головним чином як описано І утвзаеп еї аї. (Віоса 81:1762-1770 (1993)). Видаляли о сегмент аорти бабуїну довжиною 1-2см, вивертали та зішкрібали для видалення внутрішньої оболонки артерії та приблизно 5095 серединної оболонки. Артерію вивертали знов у первинне положення, вставляли канюлі на обидва кінці і розміщували в екстракорпоральне відведення бабуїна, таким чином подаючи кров у механічно со зо пошкоджену артерію бабуїна через відведення. Відразу ж перед відкриттям відведення до циркулюючої крові, мічені 111|Індієм власні тромбоцити вводились тварині внутрішньовенною ін'єкцією. Рівень накопичення бляшок о на ділянці пошкодженої артерії визначали в реальному часі зображенням гамма-камери. с

Оцінку інгібування агрегації тромбоцитів Фактором МПа проводили, використовуючи болюсні ін'єкції

РЕСК-Фактора Ма або контрольного фізіологічного розчину, що були зроблені відразу перед відкриттям со відведення. Пошкоджені артерії вимірювали безперервно протягом 60 хвилин. Доза 0,005 мг/кг ОЕСК-Фактора «о

Міа інгібувала агрегацію тромбоцитів. При 1,0 мг/кг болюсної ін'єкції приблизно 9095 агрегації тромбоцитів інгібувалося за 1 годину після введення ліків. Ці результати наведені в Фіг. 2.

Ці дані показують, що інгібування тканинного фактора ОЕБОК-Фактором Мііа може сильно інгібувати розвиток тромбів, збагачених на тромбоцити, в моделі гострого пошкодження судин у нелюдиноподібних приматів. «

ПРИКЛАД ХІЇ в с ОЕСК-ЕМІНа інгібує рестеноз судин після пластичної хірургії на судинах з використанням балону в атеросклеротичних кроликів ;» Оцінювали здатність ОЕСК-ЕМІПа модулювати розвиток пошкоджень після пластичної операції на судинах з використанням балону в атеросклеротичних кроликів породи ново-зеландський білий (МАМ). Ця тваринна

Модель була добре описана і виявилась гарною моделлю для оцінки дії антитромбічних сполук на розвиток

Ге» пошкоджень судин (Сітріе еї аїЇ. Сігсціацйоп 86:1536-1546 11992) і Коаовіа еї аїЇ. СігсшШайоп 89:1262-1271 (1994)). Тваринну модель використовували для оцінки ФЕСК-ЕМіІІа, головним чином як описано у Кадозіа, іБіа. со У кроликів викликали анестезію внутрішньом'язовою ін'єкцією мг/кг ксилазину та З5бмг/кг кетаміну. 2) Проксимальні стегнові артерії розтинали зрізами нижче пахової зв'язки з проксимальними та дистальними 5ор Лігатурами. У виділені сегменти вводили канюлі голками 27 розміру. Отвір пробивали голкою. Виділені сегменти о промивали фізіологічним розчином для очищення від залишків крові та висушували продуванням повітря при 4) швидкості ЗОмл/хв протягом 8 хвилин. Після висушування повітрям виділені сегменти знову промивали фізіологічним розчином та видаляли лігатури. Гемостаз підтримували неоклюзивним локальним тиском.

Сегменти відмежовували металічними затискачами. На локальний спазм діяли локально 195 Ксилокаїном. За дв день після операції тварини переходили на дієту із 195 холестеролом та 675 арахісної олії протягом місяця перед пластичною операцією на судинах з використанням балону. Давали тіленол 1Омг/кг орально для полегшення

Ф, постопераційного болю протягом 3-5 днів. Амбіпен їсм? давали після хірургічної процедури протягом від З до ко 5 постопераційних днів.

Тест на поширення ліків для тварин складався з першопочаткової болюсної ін'єкції безпосередньо перед бо пластичною операцією на судинах з використанням балону та потім безперервного систематичного промивання осмотичним насосом через внутрішню яремну вену. Термін промивання складав З дні. Контрольні тварини перед пластичною операцією на судинах з використанням балону отримували гепарин, 150 одиниць/кг ІМ болюсу, після чого промивали фізіологічним розчином. Тварини, на які діяли ОБЄОК-ЕМіІІа, отримували мг/кг болюсної ін'єкції, після чого промивали 5Омг/кг/годину. 65 Для розміщення осмотичних насосів для безперервного систематичного промивання викликали анестезію у тварини, як описано вище, і підтримували протягом процедури додатковими 1М ін'єкціями кетаміну та Ксилазину.

Через серединний розріз шиї виділяли праву внутрішню яремну вену грубим розрізом та перев'язували дистальний кінець. Вводили силастичну пробірку (РЕ-160) у праву внутрішню яремну вену. Створювали підшкірний тунель для проходження силастичної пробірки. Цю пробірку зв'язували з осмотичним насосом.

Осмотичний насос імплантували підшкірно в спину кроля. Виділяли праву звичайну сонну артерію грубим розрізом і перев'язували дистальний кінець. За допомогою скальпеля 5Е пристрій вводу розміщували та просували до сполучення дуги аорти. Кров витягували протягом визначення гемостатичних параметрів, кількості ліків та холестеролу. Двадцять мг ксилокаїну вводились ін'єкцією внутрішньоартеріально. Контрольну аорто-стегнову ангіограму знімали через катетер 5Е Вепгтап, розміщений вище біфуркації аорти, використовуючи 7/0. З-4мл ренографіну, що вводився ін'єкцією протягом З секунд вручну.

Після видалення катетера Вепгтап, 355,б6мкм дріт вводили в низхідну аорту та розміщували вище біфуркації аорти. Із флюороскопічним проводом вводили приблизно підігнаний катетер для пластичної операції на судинах з використанням балону від 2,0 до 2,5мм, просували над дротом та розміщували крізь звуження. Балон накачували до б атмосфер протягом 60 секунд ручним насосом. Три накачування виконували з 60 секундними 7/5 інтервалами між накачуваннями. Цю процедуру виконували в обох стегнових артеріях кожної тварини.

Після розширення балону катетер для пластичної операції на судинах виймали та катетер Вегтап знову вводили у положення на Зсм вище біфуркації аорти. Для зменшення спазму давали 20мг лідокаїну внутрішньоартеріально. Ангіограму після процедури знімали, як описано вище. Для підрахування справжнього діаметру 1см решітку розміщували на рівні стегнової артерії. Потім видаляли катетер. Праву сонну артерію 2о перев'язували шовковою ниткою розміром 3-0 і рану зашивали пошарово. Амбіпен та ацетамінофен давали, як згадано вище.

Час перетворення протромбіну та концентрацію ОЕСК-ЕМІа в крові визначали при миттєвій преболюсній ін'єкції тестової сполуки, за 71 годину після болюсної ін'єкції й на З день наприкінці безперервного промивання. Одержували один або два мл цитратної плазми, визначали час перетворення протромбіну й сч ов Кількість антигена.

Стандартний тест на згортання використовували для визначення часу перетворення протромбіну в контролі і) та тваринах, які отримували ОЕСК-РМііа, таким чином. Двадцять п'ять мкл плазми тестових кролів, яку збирали з цитратом натрію як антикоагулянтом, додавали до 150мл ТВ5 (20мММ Трис, рН7,4, 150мМ Масі), зразки змішували і додавали до автоматичного таймеру коагуляції ЕІесіга 800 (Медаіса! І арогаюгіез Аціотаїйоп, с зо Ріеазапімійе, МУ). Після інкубації до препарату плазми додавали 200 мл препарату тромбопластину (Зідта

Спетісаї), що містить 25мМ Сасі». Відбирали концентрацію тромбопластину, при якій час згортання становив о приблизно 20 секунд в контрольній плазмі кроля. с

Тест ЕГІЗА (ферментативний імуносорбентний тест) використовували для визначення концентрації

РЕСК-РМІІа в плазмі зразків контролю та кроликів, які отримували ОБОК-ЕМііа, Тест включав перше розведення со антитіла до моноклонального антитіла людини ЕМіїа (Ог. МУ. Ківівї О.Мемж/ Мехісо) до 2,0мг/мл у 01М «о карбонатному буфері рное,6 і додавання 100мл/лунку до 96-лункових планшетів. Потім планшети інкубували при 47"С протягом доби та згодом промивали дві години, використовуючи буфер для промивання (РВ5, рН7,4, з 0,05956 Тм'ееп 20). Блокування неспецифічних сайтів зв'язування досягали додаванням 200 мл блокуючого буферу на лунку (РВ5, рН7,4, з 0,0596 Тмееп 20 та 195 БСА), інкубували при 37"С протягом 2 годин, після чого « промивали, використовуючи буфер для промивання. з с Після блокування додавали серії стандартних розведень ОЕЄСК-ЕМііа від 20-0,027 нг/мл разом з серіями розведень плазми тестових кролів (1:100 до 1:4000 у буфері для блокування) об'ємом 100Омл/лунку. Неімунну ;» плазму кроля використовували як негативний контроль. Чашки потім інкубували протягом 1 години при 37"С, після чого чотири рази промивали буфером для промивання.

РЕСК-ЕМІа виявляли додаванням 100 мл/лунку 1:1000 розведення антитіл кроля до моноклонального

Ге» антитіла людини РМІЇ (Ог. Ківієї, Ю. Мем Мехісо) в буфері для блокування. Чашки інкубували протягом 1 години при 37"С, після чого п'ять разів промивали буфером для промивання. Специфічне зв'язування антитіла со виявляли, використовуючи 100 мл/лунку 1:2000 розведення антитіл козла до кон'югату дО антитіла кроля з 2) пероксидазою (Тадо, Іпс.). Планшети інкубували протягом 1 години при 37"С й промивали шість годин буфером 5р для промивання. Зрештою додавали 100мл розчину субстрату (0,42мг/мл о-фенілендіамін дигідрохлорид (ОРОЇ о в 0,2М цитратному буфері, рН5.О, з 0,395Н2О»2). Після 1-3хв при кімнатній температурі кольорову реакцію 4) зупиняли додаванням 1ООмл/лунку 1М Н 2550, і планшети аналізували при 490нм на Мікропланшетному спектрофотометрі. Концентрацію ЮОЕСК-ЕМіІїа в плазмі зразків визначали порівнянням невідомих значень зі значеннями стандартної кривої ОЕСК-ЕМІІа.

Аналіз зразків плазми на час перетворення протромбіну і кількість антигена ОБЄСК-РМііа наведено в Таблиці 13 та Таблиці 14, відповідно. Дані наведені по кожній окремій тварині. Таблиця 15 показує суму середнього

Ф) часу згортання. В усіх випадках тварини, які отримували ОЕСК-ЕМіІІа, мали підвищений час перетворення ка протромбіну за 1 годину після введення болюсної ін'єкції, який повернувся до приблизно тих значень, що були до лікування за З дні. Аналіз кількості ОЕСМК-ЕМІа антигена також показав високу кількість ОЄСК-ЕМіІа в во плазмі за 1 годину, що становила від 2-бмг/мл в плазмі, з набагато меншою кількістю за З дні. Кількості

РЕСК-РМіІіа вимірювали за 1 годину відповідно до передбачуваного підвищення часу перетворення протромбіну, який визначали додаванням нормальної плазми кроля до ОЕСОМК-ЕМіІа іп міго, й визначенням часу перетворення протромбіну в тесті зі стандартними розведеннями тромбопластину. б5

Вимірювання часу перетворення протромбіну

100 озон вві ' во (рводєма 00010050 ї5 вв (бвовяма МА 00010 мА 0 вводів сч пис І нини ЕНН СТ о тв | юю 00101011 мА 8 вка 0010900 МАЯ не зо ле | кю 00101010 о юка 00060000. 7800 Контоль 00036001 о ям | юю 01800016 во со

Ся бвовямя 00900320 о» з5 Ф во бвовямв, 0019 яваз вв 5 (рвсятую 85000004 пт « з т рвсякую 109 2взю зов, як с ;»

Таблиця 15

Статистичне резюме часу згортання плазми (е)) Непарний І-Тест Х РКБЕ-ВІЕЕО оо Ступінь свободи Непарне Езначення Вірогідність. (2-їаїї): 12 112 0,2852 (95) Група Підрахунок Середнє значення Середньоквадратичне відхилення Середньоквадратична похибка о Контроль 8 24,15 1,64 0,58

Фе» рЕСК-Міа 6 23,2 1,48 0,60

Непарний Тест Х 1 НГРОБЗТ АМОСІО

Ступінь свободи Непарне Езначення Вірогідність. (2-їаїї): 10 -Б,АА 0,0003

Ге! Група: Підрахунок Середнє значення Середньоквадратичне відхилення Середньоквадратична похибка ке Контроль 6 24,5 3,35 1,37 рЕСК-Міа 6 40,8 6,53 2,67 6о Непарний І-Тест Х З Сауз РОТ АМОСІО

Ступінь свободи Непарне Езначення Вірогідність. (2-їаїї): 13 -2,04 0,0622

Група Підрахунок Середнє значення Середньоквадратичне відхилення Середньоквадратична похибка

Контроль 8 19,54 1,53 0,54 6БЕ рЕСК-Міа 7 21,06 1,53 0,50

За три тижні після пластичної операції на судинах ангіограму повторювали, як описано вище, через ліву сонну артерію безпосередньо перед забиттям. Через вертикальний нижній абдомінальний розріз виділяли дистальну аорту, проксимально перев'язували і вставляли канюлю для промивання вище біфуркації аорти.

Дистальну аорту промивали 5Ол фізіологічного розчину, після чого фіксували іп мімо 5Х0Омл розчину Нівіоспоісе (АМКЕБСО, БоЇоп, ОН) вливанням протягом 15 хвилин під тиском 120мм ртутного стовпчика. Як тільки промивання починалось, тваринам надавали надвелику дозу нембуталу (Змл фенобарбіталу натрію ІМ, б5мг/мл).

Вирізали білатеріально 5см сегменту стегнової артерії. Тканину зберігали в розчині Нізіоспоіїсе для світлової мікроскопії. 70 Для визначення розвитку пошкоджень внутрішнього шару на ділянці, де проводили пластичну операцію на судинах з використанням балону, вирізані стегнові артерії різали на послідовні Змм сегменти, занурювали в парафін, та нарізували зрізи з багаточисельних ділянок кожної артерії. Зрізи закріплювали на покривні скельця та скельця фарбували гематоксиліном, еозином та барвниками Мап Сіетзоп. Морфометричний аналіз виконували за допомогою Віодцапі Ргодгат для одержання вимірів площі просвіту внутрішньої та середньої оболонки судин. Морфометричний аналіз зрізів тканин із пошкоджених артерій проводили, вимірюючи загальну площу просвіту; площу внутрішньої оболонки судин визначали вимірюванням площі всередині внутрішнього еластичного шару, віднімаючи відповідну площу просвіту з кожного зрізу тканини; та площу середнього шару, яку визначали вимірюванням площі всередині зовнішнього еластичного шару, віднімаючи площу всередині внутрішнього еластичного шару. Вимірювання пошкоджень внутрішньої оболонки судин у стегновій артерії в Контролі та у тварин, які отримували ОЕСК-ЕМіІа, показало, що існує значне зниження розміру внутрішньої оболонки судин у тварин, які отримували ОБОК-ЕРМіІІа (Таблиця 16). Вимірювання середньої площі не показали значної різниці між двома групами. сч ; на яких проводилипластичну операцію на судинах з використанням балону Ге) бвсвтувно 000б4 00000000» о »

Фо бЕСвєМа о! 7711о3а11111111омов 111111 с

Дані ангіографічних вимірювань наведені в Таблиці 17 як середнє значення діаметру протоки (МІ 0) ж/- с з середньоквадратичне відхилення контролю та ОЕБЄСБК-ЕРМіІа у тварин, які отримували його, протягом всіх трьох с термінів; безпосередньо перед пластичною операцією на судинах, відразу після пластичної операції на судинах й за 21 день після пластичної операції на судинах. Не виявили значної різниці в МГО між контролем та тваринами, які отримували ОЕСК-ЕМІа, при вимірюванні перед або відразу після пластичної операції на судинах. Значне підвищення в МІ О спостерігали, однак, у тварин, які отримували ОБОК-ЕМіІа, при вимірюванні « 20 за 21 день після пластичної операції на судинах. -в - х»

Фо бесятуної лав00100000000090100 со с о бввятуа то 0ля00010000000ол000010

Не

Есе Уцаної зом (Ф; ПРИКЛАД ХІІ!

Ге Інгібування ОБОК-ЕРМІІа утворення Факторз Ха на поверхні клітин

Проводили хромогенний тест на поверхні клітин, головним чином як описано вище у Прикладі МІ, для во вимірювання ефективності ФОЕСК-ЕМІа блокувати ЕМіІіа, зв'язуючись з тканинним фактором на поверхні клітин, та наступним перетворенням Фактора Х на Фактор Ха на моношарі клітин гладенького м'язу бабуїна (ЗМСз5). Цей спосіб є модифікацією тих, що описані Закаї ей а у. Віб. Спет. 264:9980-9988 (1989) та УУПадоовзе еї аї.,

Рос. Май. Асай. сі. ОБА. 87:7290-7294 (1990). 5МСв бабуїна одержували з Вашингтонського університету,

Сієтл, штат Вашингтон, та культивували з експлантантів аорти. ЗМО бабуїна висаджували у 96-лункові планшети для культивування при концентрації 8000 клітин/лунку в 200мл/лунку середовища для культивування б5 ОМЕМ, що містило 1095 сироватку плоду великої рогатої худоби, і утримували в цьому середовищі протягом 4 днів при 37"С в 595 СО». Під час тесту видаляли 110мл Середовища для культивування і додавали до лунок підвищені концентрації ЕМІа або ЕМПа разом з ОБОК-ЕМіІа. Будували стандартну криву концентрації ЕМііа від 5НМ до 0,04нМ. Для вимірювання |інгібіторної активності ОЕСМК-ЕМІПа щодо активності ЕМіІа, підвищені концентрації ОЕЄСК-ЕМПа додавали до тестових лунок у присутності постійної кількості ЕМПа (5НМ). Як ЕМіІа, такі ОЕСК-РМІа розводили буфером НЕРЕЗ (10 мМ НЕРЕ5, 137мМ Масі, 4мМ КСІ, 5мМ Сасі», 11 мМ глюкоза, 0,195 БСА) і до клітин додавали 1Омл 10х маточних розчинів. Клітини інкубували з тестовими сполуками протягом 2 годин при 37"С. Потім промивали З години буфером НЕРЕ5. Потім додавали до кожної лунки п'ятдесят мкл 200 НМ розчину Фактора Х в Трис-буфері (25мМ Трис, рН7 4, 150мМ Масі, 2,7мМ КСІ, 5мМ Сасі», 7/0 9,196 БСА). За 4 хвилини при кімнатній температурі додавали 25мл 0,5М ЕДТА для зупинення перетворення

Фактора Х у Ха. Додавали двадцять п'ять мкл на лунку 0,8мММ 5-2222 Фактор Ха-специфічного хромогенного субстрату в Трис буфері й аналізували поглинання при 405нНМ за 60 хвилин в мікропланшетному аналізаторі

Твпегтотах (МоїІесшаг Оемісез Согр., Мепіо РагК, СА).

Результати, наведені в Фіг.3, показують дозозалежне підвищення в амідолітичній активності для лунок, на 7/5 Які діяли ЕМІа (білі квадрати). Підвищення поглинання є прямим вимірюванням Фактора Ха, що утворився в лунках, й наступного розщеплення хромогенного субстрату. Додавання підвищеної кількості ОЕСК-ЕМіІІа з постійною кількістю ЕМІа (5НМ) показало дозозалежне зниження в амідолітичний активності з підвищеними кількостями ОЕСК-ЕМІа (чорні квадрати). Рівне молярне співвідношення ОЕСК-ЕМІа до ЕМіІа здатне інгібувати 29095 хромогенної активності. Навіть при 10-разовому зменшенні кількості ОЕОК-ЕМіІІа відбувається 409о інгібування хромогенної активності Фактора Ха. Ці результати підтверджують висновок, що ОЕБЄСК-ЕМіІа є надзвичайно потенційним антагоністом активації Фактора Х у Ха за допомогою ЕМііа на поверхні інтактних клітинних моношарів ЗМО.

Приклад ХІМ

Вплив ОЕСК-Фактора Мііа на утворення тромбозу судин та утворення пошкоджень судин у бабуїнів сч

РЕСК-Фактор Ма людини тестували на здатність інгібувати тканинний фактор (ТЕ) та опосередковане активованим Фактором МІ! (ЕМІПа) утворення пошкоджень судин (МІР), що викликаються механічним і) пошкодженням судин у нелюдиноподібних приматів.

Починаючи відразу перед створенням механічних пошкоджень судин у бабуїнів, ОЕСК-Фактор Ма вводили внутрішньовенно протягом 7 днів (5 тварин) або З0 днів (1 тварина). Вимірювання утворення пошкодження судин с зо Виконували на ЗО день. Результати 5 тварин, на які діяли ОЕСК-Фактором Мііа, порівнювали з одночасними результатами 5 контрольних тварин, яким вводили буфер. і,

Вимірювання основних показників тварин проводили за: со а) підрахунком тромбоцитів, нейтрофілів, моноцитів та еритроцитів; б) кількістю фібриногену плазми; со в) рівнем активності факторів коагуляції плазми МІЇ, Ма, Х та М, також як і кількістю антигена ЕМІЇ; та «о г) основною кількістю антитіл зразків плазми до Фактора Ма.

При анестезії галотаном та стерильних операційних умовах, тварини, мічені власними тромбоцитами, що містили И1Індій, отримували внутрішньовенні промивання ОЕСВ-ЕМіа, використовуючи прикріплену систему « для безперервного внутрішньовенного введення (першопочаткова болюсна ін'єкція мг/кг, після якої проводили 70 безперервне внутрішньовенне промивання 5Омг/кг/годину). Тваринам проводили хірургічну ендартеректомію - с сонних артерій, пластичну хірургію бронхових артерій або стегнових артерій з використанням балонного ц катетера Фогарті (Годапу). "» РЕСК-ЕМНа вводили протягом від 7 або ЗО днів безперервними промиваннями через венозний катетер, використовуючи прикріплену систему. За тридцять днів після операції тварин піддавали анестезії галотаном та іп ви промиванням під тиском з фіксацією протягом ЗОхв 495 параформальдегідом, що містить 0,190 глутарового

Ге») альдегіду. Водночас сегменти судин (що містять попередньо пошкоджені місця) збирали, використовуючи способи по НаїгКег еї аї., СігсШайоп 83:41-44 (1991) та Напзоп еї аї., Нурепепзіоп 18:1170-1176 (1991). со Потім зразки фіксували іп міо (495 параформальдегідом, що містить 0,195 глутаровий альдегід), заморожували о та обробляли під час аналізу ступеня морфометричних пошкоджень.

Вивчали одинадцять нормальних статевозрілих бабуїнів (Раїо апибіз). Шість тварин отримували промивання о РЕСК-ЕМІа (5Омг/кг/годину) та ті п'ять, що залишились, були контрольними тваринами, що не отримували с» РЕСК-ЕМПа. Тварин виліковували від паразитів кишково-шлункового тракту та проводили обстеження на будь-які хвороби протягом трьох місяців перед використанням. Всі процедури схвалені Інститутом догляду за тваринами та комітетом з їх використання і відповідають процедурам та способам, зазначеним у провідних принципах МІН для догляду та використання лабораторних тварин, також як і діяльністю, спрямованою на добробут тварин, й подібними інституційними закладами. Процедури вторгнення виконувались при анестезії

Ф, галотаном після індукції кетаміном (1Омг/кг внутрішньом'язово) та валіумом (0,5мг/кг внутрішньовенно). Для ко наступної короткотривалої іммобілізації при виконанні експериментальних процедур після операції використовували гідрохлорид кетаміну (5-20мг/кг внутрішньом'язово). во Ендартеректомію сонної артерії виконували через серединний розріз шиї, використовуючи спосіб по Напзоп еї аї., Мурзгіепвісо 18:1170-1-1476 (1991) та КгиреКі еї аї., Сігсціайоп 84:1749-1757 (1991), на який нами робиться посилання. Ендартеректомію використовували як модель пошкодження судин завдяки Її клінічній доречності та тому, що було показано, що МІ Е, яка викликається ендартеректомією нормальних артерій, здатна відтворюватись. Кількома словами, звичайна сонна артерія, відділена від оточуючих тканин від ключиці 65 проксимально до біфуркації сонної артерії. Звичайну сонну артерію затискували, використовуючи травматичні затискувачі для судин, розміщені на кожному кінці відрізаної судини, за три хвилини після болюсної ін'єкції сульфату гепарину (100Ш/кг внутрішньовенно: ЕїІКіпз-Зітт Іпс., Спегту НІЇЇ, МУ), й розрізали 1см проксимально до дистального стискача. Проксимальний сегмент артерії тоді вивертали навиворіт через зігнутий пінцет. Після того, як одержували максимальне вивертання, пару ниток для накладання швів, зміцнених поліпропіленом (розмір 7-0), розміщували на кожному боці проксимально та другу пару розміщували дистально у сегменті з відкритим просвітом. Потім виконували ендартеректомію, починаючи з 1см від розділеного вивернутого сегменту судини, і продовжували протягом 1см вимірюваної відстані. Ці процедури створювали механічне видалення нормальної внутрішньої оболонки судин та частково товщини серединної оболонки, використовуючи пінцет та хірургічний мікроскоп (збільшення у 32 рази). Після ендартерєктомії судину повертали до ЇЇ нормального 7/0 положення і кінець кінцем анастомоз виконували поліпропіленовими нитками розміру 7-О для накладання швів безперервно під 2,5-разовим збільшенням і зашивали рану пошарово.

Для морфометричного аналізу МІ Е зрізи занурювали у парафін та фарбували компоненти сполучної тканини (колаген, еластін), і за допомогою гематоксиліну-еозину оцінювали, використовуючи 7еїзз РПоіозсоре, з'єднаний з системою аналізу зображення (ТПотаз Оріїса! Меазигетепі Зувіетв, Соіштрив, СА), що складається з ССО 7/5 фотокамери-мікроскопу високої роздільної здатності (580 пев), з'єднаної з монітором високої роздільної здатності (700 Ііпев), комп'ютером з чіпом ІВМ 386, 80 МВ з високою роздільною здатністю цифрової графіки для створення зображення та зберігання. Кількісний аналіз зображення виконували, використовуючи морфометричний програмний драйвер (Оріїтаз, Віозсап, Іпс., Едтопаз, МУА). Поперечні зрізи артерії аналізували за відношенням загальної площі проліферативних пошкоджень нового внутрішнього шару та Відповідної площі серединного шару. Для статистичного аналізу робили порівняння між групами, використовуючи і-критерій Стьюдента (2-іаійед) для парних та непарних даних.

Результати показали, що площа внутрішнього шару значно знижена у тварин, які отримували ОЕОК-Фактор

ММІа протягом семи днів та вивчались на 30 день порівняно з контрольними тваринами, які мали ті ж пошкодження судин, але не отримували ОЕОК-Фактора Мііа (Фіг.4). Однакові результати спостерігали у тварин, сч ов які отримували ОБО -Фактор Ма протягом З0 днів, та перевірялися на З0 день.

Попередні дослідження моделі ангіографії плечової артерії з використанням балону свідчили про відсутність і) істотної користі терапії ОБЕОМК-Фактора Мііа. Ця модель, проте, не створювалась у бабуїнів як протромбічна модель, в який тканинний фактор грає ключову роль.

Дослідження пошкоджень стегнової артерії з використанням балону у бабуїнів не виявили статистично с зо значної користі ОЕСР -Фактора Мііа порівняно з контролем, як показано на Фіг.5.

Приклад ХМ і

Вплив ОЕСК-Фактора Мііа на викликаний ІРА тромболіз с

Утворення тромбів коронарнарних судин під час гострого інфаркту міокарду насамперед опосередковується тканинним фактором (ТЕ) в комплексі з Фактором Мііа через зовнішній шлях коагуляції. Визначали вплив со зв додаткового каскаду інгібування коагуляції на різних етапах зовнішнього шляху на ефективність активатора «о тканинного плазміногена (ТРА) при тромболізі.

Тридцяти шести собакам з електрично викликаним коронарним тромбом, підданим тромболізу ІРА (мг/кг за 20хв), надавали від 1 до 4 додаткових лікувань: 9 отримували антикоагулянтні пептиди кліща (ТАР), селективний інгібітор Фактора Ха при ЗОмг/кг/хвилину протягом 90 хвилин. Комплекс ТЕ-Фактора Мііа інгібували інгібітором « шляху рекомбінантного тканинного фактора (ТЕРІ) (100-15Омг/кг/хв протягом 90 хвилин) у У собакта ОБО МПа ств) с (1-2мг/кг болюс), як конкурентним антагоністом активованого Фактора Мііа у 9 собак. Дев'ять собак отримували фізіологічний розчин як контроль. Собак обстежували протягом 120 хвилин після тромболізу на повторну ;» непрохідність. Вплив цих агентів на ефективність тромболізу наведено нижче в Таблиці 18 (дані як середнє значення 5503). 7 (22) со 0 ооолопаих роми |овоютма | ті | тв. с й о со

Ці дані показують, що зовнішній шлях інгібування або Фактором Ха, або блокадою ТЕ-Фактора Ма ОЕСЕ Мііа або ТЕРІ, прискорюють (РА-викликаний тромболіз. Селективне інгібування Фактора Ха більш ефективно (Ф) підтримувало розширений стан артерії після вдалої реперфузії.

Ге Приклад ХМІ

Модифікований Фактор Мііа інгібує внутрішньосудинне утворення тромбу, не впливаючи на системну коагуляцію 60 й о, о, й

Для визначення того, чи є наслідком інгібування зв'язування Фактора МІ! з ТЕ антитромбічні ефекти, зміни циклічного потоку (СЕМ5) завдяки зворотному утворенню тромбу були викликані розміщенням зовнішнього звужувача навколо пошкодженого ендотелію сонних артерій кроля (модель Фотса (Роїів)). Потік крові сонної артерії вимірювали безперервно зондом Доплера (ЮОорріег) для вимірювання потоку, який розміщували проксимально до звужувача. Після розташування звужувача навколо артерії, СЕМ85 розвивалися з середнім б5 значенням частоти 11-42 циклів/годину у 6б кроликів, де швидкість потоку крові сонної артерії в середньому становила 54295 базових значень при найнижчому СЕМе. Після того, як СЕМе спостерігали протягом ЗОхв, тварини отримували промивання рекомбінантним Фактором Мііа (ЕМііаї) людини з блокованим активним сайтом (Рпе-Рпе-Агуд хлорметилкетон) (0,1мг/кг/хв протягом 1Охв). Фактор МІіаї повністю зупинив СЕМ5 у 66 тварини (СЕМ частота-0 циклів/годину: р«е0,05; швидкість потоку крові сонної артерії-106,995 базових значень, р-М5 від базового). Через тридцять хвилин після інгібування СЕМ5 рекомбінантний ЕМПа людини вводили при дозах

О,Тмг/кг/хв протягом 1О0хв. Промивання Фактора Мііа відновлювало СЕМз в усіх тваринах, таким чином показуючи, що Фактор МПа конкурентно зв'язується з ТЕ. Час перетворення протромбіну, активований частково час перетворення тромбопластину та агрегації тромбоцитів ех уш у відповідь на АДФ та тромбін, не відрізнявся 7/0 після промивання РМііаі, порівняно з базовими значеннями. Таким чином, ЕМІІ-МІа відіграє важливу роль в ініціюванні утворення тромбу іп уїхсі Введення Фактора Мііаі підсилює потенційний антитромбічний вплив в цій моделі без впливу на системну коагуляцію.

Приклад ХМІЇ

Інгібування мікро артеріального тромбозу місцевим введенням модифікованого Фактора Ма

У хірургії судин, мікросудинній реконструктивній хірургії або реплантаційній хірургії найбільш звичною причиною невдачі є тромбоз у анастоматичних місцях. Ризик утворення непрохідного тромбу дуже підвищений, коли судини зазнають травми, виявляють патологічні зміни або коли використовуються міжпозиційні пересадження вен. Отже, часто використовується антитромбічне вторгнення в контексті з хірургічною операцією.

Речовини, які нині є та використовуються при цьому, вводяться парентерально (гепарин, декстран) або орально (АЗА), всі пов'язані з геморагічними побічними ефектами. Більш того, гепарин та особливо АЗА, є лише частково ефективними у запобіганні утворення тромбу (артеріального). Завдяки цим недолікам, існує потреба запобігти тромбозу у хірургії судин, використовуючи агент, що зв'язується та є ефективним у анастоматичних ділянках та місцях травми судин завдяки речовині, що може бути перенесена локально, таким чином уникаючи небажаних систематичних побічних ефектів. В цьому Прикладі місцеве введення Фактора Мііа із інактивованим активним сч г сайтом у місцях артеріальних травм використовували для створення антитромбічного ефекту без викликання тенденції підвищення кровотечі або інших гемостатичних дефектів. і)

Методи

Кролики породи "Змедівзй Ісор" обох статей, що важили приблизно 3З,5кг, мали стандартну гранульовану дієту та необмежену кількість води. За ними спостерігали на предмет наявності хвороби в лабораторії протягом с зо принаймні одного тижня перед використанням.

В бічну вену вуха вставляли канюлю та викликали анестезію фенобарбіталом натрію 18мг/кг, й підтримували о ін'єкціями, що повторювались. с

Шматки шкіри підрізали на обох вухах і приготовляли сегменти центральної артерії завдовжки Зсм (зовнішній діаметр мм). Всі відгалуження перев'язували ниткою розміру 10-0 для накладання швів та відрізали. со

Оперативне поле надмірно промивали ізотонічним фізіологічним розчином та покривали тонкими пластиковими «о плівками. Щоб утримати потік крові високим та постійним та протидіяти вазоспазму, тварин розміщували на підложки з підігріванням та підтримували легку гіпертермію при температурі тіла приблизно 39,57С (нормальна температура тіла приблизно 38,57), і три краплини лідокаїну 1Омг/мл застосовували місцево на судини після операції (після реперфузії та після тестування відкритого стану судин за 30 хвилин після реперфузії). «

Судини на обох боках одночасно розміщували у подвійні мікросудинні затискачі (581 2М, 581 Магкейпд пт) с ца. Мешпацйзеп, Зу/ігепапа), таким чином виділяючи 7мМ сегменти артерії між затискачами. Готували поздовжні . артеріотоми (7мММ), після чого затискачі зближували, судини переміщували та просвіт судин вивертали і и?» вирівнювали у площині, оголюючи глибокі шари оболонки. Артеріотоми зшивали безперервною 10-0 одноволокнистою нейлоновою ниткою для накладання швів (ЕПіоп 10-0 ВМ-75-3, Е(Пісоп Ца., Едіпригой, О.К).

Всі хірургічні процедури виконувались одним хірургом, використовуючи високоякісний операційний мікроскоп

Ге» (МПа М-650, І еіса-Неегргида, Неегьгидо, Зм йгепапа),

Одночасно проводили реперфузію судин, відкриваючи затискачі судин. Вони швидко вкривалися со просоченими фізіологічним розчином марлевими прокладками і перевірялися раз на хвилину. Записували час оо доти, доки артеріотомічна кровотеча не була повністю зупинена.

На 30 та 120Охв. після реперфузії перевіряли відкритий стан судин, використовуючи стандартний о мікрохірургічний тест з опорожнення/наповнення: судини легко перетискували дистально до місця травми парою 4) мікропінцетів та відкривали нижче іншою парою пінцетів. Після вивільнення першої пари пінцетів наповнену судину перевіряли та судини класифікували як відкриті або непрохідні. Непрохідні судини знову не наповнювались, в той час як відкриті судини швидко або повільно наповнювались, останні вважалися тими, які дв мають "зменшений відкритий стан". Після кінцевого тесту на відкритий стан судини вирізали та відкривали поздовжньо, після чого тромбічний матеріал видаляли та зважували.

Ф) Сполуки: ка Рекомбінантний хімічно-інактивований Фактор Мііа (Міїаї) людини при концентрації З,мг/мл або носій зберігали як 200мл аліквоти у закодованих пляшках. 60 Експериментальний протокол:

Двадцять кроликів піддавали дії таким чином навмання, кожний кролик вважався і контролем: Після виконання глибокої артеріальної травми, як описано вище у розділі "Способи", оголене місце травми на одному вусі надмірно промивали протягом 5 хвилин розчином Мііаі (загалом О,5мг) й на іншому вусі носієм. Надмірно промите місця травми інкубували з розчинами протягом додаткових 5 хвилин, після чого весь надлишок розчину 65 Вимивався ізотонічним фізіологічним розчином. Артеріотоми потім зшивали та проводили реперфузію судин.

Статистичні методи:

Порівнювали результати відкритого стану, використовуючи критерій знаків та вагу тромбів, й дані кровотечі артеріотомів порівнювали за критерієм Вілкінсона (УмМісохоп). Наведені двобічні р-значення.

Результати:

Введення МііІаі дало чіткий антитромбічний ефект, що вимірювали ступенем відкритого стану. У групі МіІаї відкритий стан судин складав 8595 за 30 хвилин та 7595 за 120 хвилин після реперфузії. Відповідні значення в групі носія складали 4095 та 3095, відповідно, Різниця є статистично значною (р-0,008 та р-0,004, відповідно).

Середня вага тромбу складала 0,Змг в групі МІІаї та О,бмг в групі носія, хоча ця різниця не була значною (р-0,19). Середній час кровотечі артеріотоми складав 1,5 хвилин у групі МІїаі та 2 хвилини в групі носія. 7/0 Групи є такими, що статистично не відрізняються (р-1).

Цей Приклад показує, що місцеве введення Мііаі в місцях травми артерії, створює антитромбічний ефект без викликання підвищення кровотечі. Це представляє дуже приваблюючий тип лікування для запобігання тромбічних ускладнень завдяки хірургії, мікрохірургії на кровоносних судинах, пластичній операції на судинах або при інших травмах.

Приклад ХМ

Локальне застосування РМііаі зменшує вагу тромбу та покращує відкритий стан

Цей Приклад показує, що локальне застосування хімічно інактивованого ЕМііа (ЕМІІаї) зменшує вагу тромбу та покращує відкритий стан судин.

Двадцять кроликів піддавали анестезії й використовували в цьому Прикладі. Виділяли яремні вени та 10мм 2о сегмент виділяли між затискачами.

Тромб вводили комбінацією хімічної (ацетоксисклерол) деструкції ендотелію виділених сегментів, та напівобмежуючу лігатуру розміщували каудально від сегменту. При виборі навмання на одну частину діяли 0,5мг хімічно інактивованого Еміїа (ЕМіІаї) та на іншу - буфером. Тестові речовини вводили ін'єкцією у виділений сегмент та інкубували протягом 1Охв. після хімічної деструкції. За ЗО та 120хв. відкритий стан перевіряли сч ге тестом опорожнення/наповнення. Можливий тромб зважували після забиття. о 7 бередня маса тому |Далазо мас томов р значення зохе. відкритий стан|р значення п 2оха. відкритий стані р значення буфер. /лезмг | обеме | ББЖ вою со 3о Результати показали, що локальне застосування інактивованного ЕМПа значно зменшило масу тромбу та Ге) покращило відкритий стан у моделі венозного тромбозу.

Приклад ХІХ Шк

Застосування ЕМііаії зменшує площу ризику та покращує реперфузію (се)

Методи

Експериментальне приготування ї-о

Досліджували двадцять вісім новозеландських білих кроликів обох статей (3,2-3,8кг). Коротко, тварин піддавали анестезії сумішшю кетаміну (ЗбБмг/кг) та ксилазину (бмг/кг), яку вводили внутрішньом'язово, інгібували та піддавали вентиляції респіратором з постійним об'ємом (Нагмага Аррагайиз Со., Сатбгідде, МА). « дю Поліетиленові катетери розміщували в аорті через ліву сонну артерію та у яремну вену для спостереження за -о артеріальним тиском та введення ліків, відповідно. Торакотомію виконували через п'ятий лівий міжреберний с простір та відкривали перикард. Поліетиленовий катетер розміщували у лівому промитий міокард :з» (флуоресцентний) потім легко розділяли та відділяли від ішемічного міокарду (нефлуоресцентний) згідно з розповсюдженням тіофлавіну. Ці зони також переводились на прозорі пластикові листи. Зрізи потім інкубували у 2906 розчині хлориду трифенілтетразолію (ТС, Зідта СпетісаіІ5) протягом 10хв при 37"С для візуалізації площі б» 15 некрозів. Прозорий пластиковий лист знову використовували для переведення контурів нормального міокарду (ТТО-позитивний), та інфарктної частини (ТТС-негативний). (ее) Підраховували такі змінні: о 1) площа ризику інфаркту, як відсоток площі лівого шлуночка, що перевіряли наприкінці терміну реперфузії (розповсюдженням монастрального блакитного) (АК): (95) 50 2) розмір інфаркту (І5), як відсоток площі ризику, що дійсно включена у некроз фарбуванням ТС; со З) відсоток площі ризику, що не отримував потоку крові наприкінці періоду реперфузії (феномен "закупорки", МК).

Вимірювання регіонального кровотоку у міокарді.

Регіональний кровотік у міокарді (КМВЕ) вимірювали в усіх кроликів при кожній групі лікування. 59 Різнокольорові пластикові мікросфери (блакитні, червоні, та жовті, їпййоп іесппоіоду, зап Оіедо, СА)

ГФ) використовували для визначення КМВЕ за 20Охв після створення непрохідності та 1Охв, та 5 годин після 7 реперфузії.

Мікросфери були 15:51мкм в розмірі та суспендовані у 1095 розчині декстрану з 0,0195 ПТуееп 80. Для забезпечення достатньої дисперсії мікросфери оброблялися ультразвуком в ультразвуковій ванночці протягом бо Ббхв безпосередньо перед використанням. Приблизно 500000 мікросфер вводили ін'єкцією (0,5-1,0мл загальний об'єм) у лівий передсердний катетер. За хвилину перед ін'єкцією мікросфер починали брати відповідний артеріальний потік крові та продовжували протягом хв після ін'єкції. Відбирали зразки тканин (від 100 до

ЗООмг) від центру ішемічних зон та від неішемічних зон згідно з фарбуванням ТТС. Потім мікросфери виділяли з тканин розщепленням у розчині 4М КОН при 72"С протягом З годин та від відповідних зразків крові бо розщепленням у 16М КОН при кімнатній температурі протягом Згод та наступною мікрофільтрацією, згідно з інструкціями, що були надані виробником. Барвники тоді виділяли із сфер відомим об'ємом розчинника (диметилформамід) та їх концентрації визначали спектрофотометрично при оптимальних довжинах хвиль для кожного барвника згідно з інструкціями виробника. Складний спектр розчину кожного барвника розкладали на складові спектру за допомогою способу обурення матриць. Потік крові до кожного міокардиального зразку підраховували по формулі: КМВЕ-Егх Ат/Аг, де КМВЕ - кровотік у міокарді в мл/хв, АМ - поглинання в зразку міокарду, та АК - поглинання в певних зразках кроці. Кровотік у міокарді поділяли на сиру масу зразку та виражали як мл/хв/г.

Дослідження коагуляції 70 Для визначення впливу введення ЕМіїаі та ЕМіІІа на системну коагуляцію, час перетворення протромбіну (РТ) та частково активований час перетворення тромбопластину (аРТТ) вимірювали при базовому рівні та ЗО хвилин після введення ліків. Зразки крові (4,5мл) збирали з 0,5мл цитрату натрію (3,895) та центрифугували при 20009 протягом 1Охв при 4"С для розділення плазми. РТ та аРТТ вимірювали два рази протягом 2 годин від часу збирання крові.

Статистичні аналізи

Результати виражали як середнє значення ї- 50 середнього значення. Аналіз дисперсії використовували для багаточисельних порівнянь серед груп. Відмінності для окремих груп тестували і-критеріем Стьюдента для непарних спостережень з поправкою Бонфероні (Вопіеггопі). Для порівнянь гемодинамічних змінних величин, а також регіонального кровотоку у міокарді серед груп, використовували двофакторний аналіз дисперсії з розрахунком для повторних вимірювань.

Результати

Двадцять вісім кроликів піддавали хірургічним процедурам: дві тварини померли від непрохідності коронарних судин під час фібриляції шлуночка перед розподіленням групи для лікування та ще два кролики померли під час реперфузії (один в контролі та один у групі, що отримувала ЕМііа). Ці тварини були виключені с

З наступного статистичного аналізу. Таким чином, вісім тварин в кожній лікувальній групі були включені у дослідження. і)

Вимірювання гемодинаміки:

У всіх груп, що лікувалися, коронарна непрохідність викликала легке зниження частоти серцевих скорочень та середнього значення артеріального тиску. Серед трьох груп ніякої різниці у частоті серцевих скорочень та со зо середньому значенні артеріального тиску під час експериментів не виявляли (Таблиця 1).

Оцінка площі ризику, розміру інфаркту та феномену відсутності зворотного току і.

Непрохідність коронарних судин викликала зону ризику інфаркту, що перевіряли ін'єкцією монастрального со блакитного наприкінці експерименту, який був однаковим в трьох групах лікування (31,626,3, 28,254,1, та 29,25,3905 лівого шлуночка в контролі, ЕМіІаі, та ЕМІІа тварин, відповідно, р-М5). со

Після ЗОхв коронарної непрохідності та 5,5 годин реперфузії, величина зони при ризику, що включає некроз («о в середньому 59,8-12,8956 в контрольній групі (Фіг.7). Введення ЕМііаї значно зменшує розмір інфаркту до 28,1-11,395 площі при ризику р«0,01 АМОМА, Фіг.1), в той час як введення ЕМіІа пов'язане зі значним підвищенням розміру інфаркту до 80,1-13,195 площі ризику (р«0,01 від контролю та ЕМіІаі-кроликів, Фіг.7).

У контрольних кроликів, 24,4-2,7906 площі ризику виявили дефект перфузії, що визначали розповсюдженням « тіофлавіну 5 наприкінці експерименту (феномен непрохідності). Величина площі з відсутнім зворотним током у с значно зменшилась під дією ЕМііаії та значно підвищилась під дією ЕМПЦа до 11,1-6,1 та 61,9-13,895 площі й ризику, відповідно (р«еО0,01, Фіг.8). и? Попередні дослідження встановили, що кількість тканини міокарду, яка виявляє дефект перфузії під час постішемічної реперфузії, стосується багатьох параметрів: найбільш важливим є величина площі ризику, значення розмірів інфаркту та кількість залишкового другорядного потоку під час закупорки. Контроль цих

Ге»! змінних дозволяє більш точно оцінити вплив втручань на феномен закупорки. У цьому дослідженні, коли площу відсутнього зворотного потоку у контрольних кроликів корелювали з цими параметрами, спостерігали тісний бо зв'язок, що узгоджується з рівнянням множинної лінійної регресії; МАК (90 лівого шлуночка | М1)- -14,620,75

Ге) (АК)О,07(13)-3,69 (КМВРЕ); г2 - 0,98: Е тесту - 109,3, (0,37Х0,3)(3,69), де МК - це площа з відсутнім 5ор повторним потоком, АК - це площа при ризику та КМВЕ - це другорядний потік крові (у мл/хв/г). Кількість у о дужках показує коефіцієнт стандартних похибок. З г2 значенням 0,98 ця модель відповідає за 29595 змін площі, се» де відсутній повторній потік, що спостерігали у контрольних тварин 8 цьому дослідженні.

Коефіцієнти рівняння, що отримували з даних контрольних кроликів у рівнянні множинної лінійної регресії, використовували для підрахування очікуваних площ, де відсутній повторній потік для окремої тварини всередині 5Б Кожної групи (Фіг.9). Площі, де відсутній повторній потік, дійсно спостерігали у кроликів, що отримували

ЕМііаі, та значно менші, ніж очікувані, що підраховували, застосовуючи рівняння, яке одержували з аналізу (Ф, множинної регресії. Справді, у кроликів, на яких діяли ЕМііаії, для будь-якої взятої очікуваної зони ко закупорки, дійсне значення, що спостерігали, було менше, тому що всі тварини в цій групі розмістилися нижче лінії регресії, яку одержували для контрольних тварин (Фіг.9). Навпаки, у кроликів, на які діяли ЕМІЇа, виявилось бо протилежне, тобто, для будь-якої взятої очікуваної зони закупорки, дійсне значення, що спостерігали, було більше, оскільки всі тварини в цій групі розмістилися нижче лінії регресії, яку одержували для контрольних тварин (Фіг.9). Разом ці дані показують, що зниження феномену відсутнього повторного потоку спостерігали у тварин, які отримували ЕМііІаії, не повністю відповідають за зниження розміру інфаркту, та свідчать, що активація зовнішнього каскаду коагуляції під час постішемічної реперфузії бере участь у створенні феномену 65 Відсутнього повторного потоку.

Вимірювання регіонального кровотоку міокарду;

У контрольних тварин під час дослідження КМВЕ неішемічного міокарду становила в середньому 1,20мл/хв/г тканини (дані не наведено). В тій же групі тварин КМВЕ ішемічного міокарду становила 0,08:20,02, 1,43:2-0,28, та 0,9820,19мл/хв/г тканини за 20 хвилин після закупорки коронарних судин та 1Охв, та 5год після перфузії, відповідно. Різноманітне лікування ліками, що використовуються в цьому дослідженні, значно не змінило КМВЕ протягом експериментального періоду як в нормальному, так і в ішемічному міокарді, порівняно з контрольними тваринами (Фіг.10).

Дослідження коагуляції

Для вивчення можливого системного впливу ЕМііаі, який може привести до підвищення ризику кровотечі, 7/0 Вимірювали РТ та арт» у зразках крові, які збирали за ЗО хвилин СЕМ» та після введення ЕМіІаі та ЕМІа.

Наприкінці З0-хвилиного періоду СЕМ5, РТв та аРТТ5 становили в середньому 8,220,6 секунд та 25:53 секунд, відповідно. Легке підвищення у РТ до 10,1-40,6 секунд спостерігали після введення ЕМііаі (Фіг.11). Це підвищення, однак, не стало статистично значущим (р-0,09 АМОМА та і-критерієм Стьюдента з поправкою

Бонфероні). АРТТ значно не змінився після введення ЕМііаі (Фіг.10). Введення ЕМІа призвело до значного 7/5 бкорочення як РтТз, так і аРТТ5 лише по відношенню до значень, які одержували після введення ЕМііаї (Фіг.11). ю 0000 | алтея сч о с зо 00000ви | тво ти отв т о вв ввмобвио тоб о зтедна вва бля ля со з5 Ф « - є

Регіональний кровотік у міокарді з

Гея | маг | вв в

Ф со с

Фо

Не

Приклад ХІХ

Застосування ЕміІІаі зменшує розмір інфаркту та плщу при ризику інфаркту (Ф) Вивільнення тканинного фактора відбувається під час реперфузії постішемічних сердець в системі ко коронарних судин, що веде до зниження коронарного кровотоку.

Щоб оцінити участь тканинного фактора в ураженні міокарду через активацію коагуляції та зниження бо Коронарного кровотоку під час постішемічної реперфузії, кроликам породи "МАЛ/" робили 30 - хвилинну закупорку коронарних судин, після чого 5,5 годин проводили реперфузію. При реперфузії тварини навмання отримували: фізіологічний розчин (п-8): рекомбінантний Фактор Ма людини з блокованим активним сайтом (ЕМііаі, 10Онг/кг/хв протягом 10 хвилин у ліве передсердя, п-8) або рекомбінантний активований Фактор МіІІа людини (ЕМіїа, 100 мкг/кг/хв у ліве передсердя, п-8). Регіональний кровотік у міокарді (КМВЕ) вимірювали, в5 Використовуючи кольорові мікросфери при 20 хвилин ішемії та 10 хв, та 2 години після реперфузії. Площу при ризику інфаркту (АК), розмір інфаркту (ІЗ) та площу з відсутнім повторним потоком (МК) визначали наприкінці експерименту розповсюдженням монастрального блакитного та тіофлавіну, та фарбуванням ТС. ЕМііаі призвів до значного зниження як ІЗ, так і МК стосовно контролю (28,1-411,3 9Уо та 11,1-6,1956 АК від 59,8-12,8905 та 24,4-8,295 АК, відповідно, р«О,01), в той час як ЕМІа призвів до значного підвищення як ІЗ, такі МК до 80,1-13,1956 та 61,9-13,895 АК, відповідно, р«0,01 від контролю. Ніякої різниці не спостерігали серед груп у кров'яному тиску, частоті серцевих скорочень, АК та КМВЕ при 20хв ішемії. КМВЕ був значно вищий при 2 години реперфузії у тварин, які отримували ЕМііаі, в той час як він був нижчим у кроликів, які отримували

ЕМііа. Таким чином, ТЕ-опосередкована активація при коагуляції робить важливий внесок в ураження міокарду під час постішемічної реперфузі. й С мая 01700 онтольдяу 1000 тладя т Хоча вищезгаданий винахід був описаний в деяких деталях шляхом ілюстрації та прикладу з метою роз'яснення та розуміння, буде очевидним, що певні зміни та модифікації можуть бути втілені в об'ємі доданих формул.

Список ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ: () ПОДАВЕЦЬ: 7утодепейісв,

Момо МогаїзкК А/5 (ї) НАЗВА ВИНАХОДУ: Модифікований Фактор МІ! (її) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 4 (їм) АДРЕСА ДЛЯ КОРЕСПОНДЕНЦІЙ: (А) АДРЕСАТ: Момо МогаїзК А/5, Согрога(е Раїепів сч 29 (Б)ВУЛИЦЯ: похоаїє о (В) МІСТО: ЮОК-2880 Вадзуаега (Г) КРАЇНА: Данія (М) ФОРМА ЗЧИТУВАННЯ НА КОМП'ЮТЕРІ: (А) ТИП НОСІЯ: дискета о 3о (Б) КОМП'ЮТЕР: ІВМ РС со (В) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: РО-Б0О5/М85-605 (Г) ПРОГРАМА: Раїепіїп Кеїеазе Мо1,24 со (мі) ПОТОЧНІ ДАНІ ЗАЯВКИ: (се) (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: 35 (Б) ДАТА РЕЄСТРАЦІЇ: ї-о (В) КЛАСИФІКАЦІЯ: (мі) ПОПЕРЕДНІ ДАНІ ЗАЯВКИ: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: 08/475 845 « дю (Б) ДАТА РЕЄСТРАЦІЇ: 07-ЧЕР-1995 -о (В) КЛАСИФІКАЦІЯ: с (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО 5ЕО ІО МО: 1: :з» () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 2422 пари нуклеотидів (Б) ТИП: нуклеїнова кислота р 15 (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ее) (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК о (ії) ІППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (м) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає с» 7 (х) ОСОБЛИВОСТІ: с» (А ) НАЗВАЖЛЮЧ: СО5 (Б) РОЗМІЩЕННЯ: 28. .1420 (Г) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /кодон старт-28 55 /продукт-"Фактор МІЇ" о (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО Ір МО: 1: г) ССТССОСАСА АТАСАСОСОС АССАСТОСАЄ АСАТТТСАТС АТ сто ТосС СА СОС 55 мес Ууаї Зек б1іп Аа

І -38 -15 60 сте дос сто сто тосостт сто стт бсо стт о сАЯ сосотосС ста ОСТ ссА 103

Те Ахя Гей цеч Сув Пед пец Пеш б1іу Геї сій с1у Сув цеч Аза Віа -30 -25 -20 зо й .

СТО ТТС СТА АССОСАС САб САА бос САС бос сто сто САС сво сбое сс 151

Маю Ре Маї Так біп бум б1ч Аїа Нів б1іу уаї Пец Нії Аку Аго Аху б5 -15 -0 -в

СОС СС ААС обо ТТС сто сао бас Сто соб соб бос ТоС Сто САб Ас 199

Ах Аза Ап Аза Ре Пец січ б1ш Пец Ахя Рго с1у бех Пец сій Ак 1 5 10 15 5 ва ТОС ААС САС САС САС Тос ТоОС ТТ ОА бло бос со Або АТО ТТ 247 б1м Сув цув бій Січ Сіп Сує бех Рпа бід Сіп Аза Ак сій Т1е Ре 20 25 30

АЛС САС СОС САС Або АС АД СТО То ТосС АТТ ТСТ ТАС АсСТ САТ обо 295

Був АБр Аїа бі Агу Тйї цув Беш Ре Тур І1е бек тух 5ек двр сС1у 35 40 45

САС САС ТСТ ОСС ТСА АСТОССА ТОС САС ААТ ОСб бо То ТОС ААб о сАС 343

ВЗвр о б1іп Суб А1а Зехк бег Рхо Суз біп Азп 01Уу ву Бех Суз Пцув Ар 5О 55 во

САС СТО САС ОТОС ТАТ АТО ТосСоттТо тТосС сто ост осос тто сао обо соо 381 15 сіп цем сСіп Бех Тук І1їе Суб Рпе Сує Цей Рко Аза Ре сти Сіу Атд 65 7 75 29

АВС ТОТ СВО АСС САС АЛ САТ САС САС СТО АТС ТОТ СТО АВС ОСАб ААСО 0439

Авп Сув біц Тк Нів цув Авр АБр біп Пе І1е Сув Маї Ап сій Авп во 85 о 95 бос СОС тост САЗ САС ТАС ТС АОТ ОАС САС АС бос АСС Ада сос тес 487 біу б1у Сує Сід біп Тук Суя Бех Авр Ніз Тік С1іу Так Був йка Бек 100 105 110 тост ссо ТоС САС САС соС ТАС ТТ Сто Сто ссА САС бос стос тос тТос 535 сСув Ага Суз нів б1іц б1у Тук Бех Тем Пец Аїа Авр сіу Маї бег Сує сі 115 120 125

АСК СОС АСА СТТ бАА ТАТ ССА ТСТ СОВА ААА АТА ССТ АТТ СТА САА ААА 583

Тахо Рго Тйх Маї 010 Тухг Рко Сув б1у Гув І1е Рго І1є Пей б1ч цув 130 135 140

АСА ВАТ ОСС АБС ААА СОС САА СОС СА АТТ Ста боб ССС ААС сто Тео 531 со

Ага Ар оА1а век Цув Ро Сіп С1у Аку І16 Маї біу б1у цув Маї Сув 30 145 -5О 155 со 5

ССС АдДА Осо бдп о ТстТ ССА Тоо САЗ То Сто ТІ тТтТо сто ДАТ бод ост 613 Гео)

РКО Гук пй)у іш Сув Рго Ттр Зіп Маї Пед ей ей Маї АБО біу Аз 160 165 170 175 (ее) 35 10 сао тт тот боо соб АС Сто АТС ВАС АСС АТО Таб сто сто тео обо 0727 І«о) біп реч Суз біу с1у Так зе І1є АБй Те ІЗе Тгтр Уаї Угі Век А1а 180 185 190

СОС САС ТТ ТТС САС ААА ДТС ААС ДАС ОТО АБО ААс сто АТС бо сто 715 « 15 віа нів Сув Ріе Авр пуз ч1є Гуз Ав Тер Ахя Авп Пем 116 Аза Хаї 195 299 205 -о с сте бос бАб САС САС СТС АС САЯ САС САС боб САТ Сас Сьс дос Соб 823

Тез біу Фі Нівз Агро Гео Бех Сім Ні Авр б1у Авр сім 010 бек Аху в! з» 20 210 215 220 п обо стТЗ Осо САЄ СТО АТС АТС СОС Лос дСо ТАС сто ССО бо СС АС 0 В71

Ах Маї Лів б1іп Маї 116 116 Рго Бек Тих Тух уаї Рхо 41у Тут ТЕ 225 230 235 (о) зв

Го) ВВС САС САС АТС бос СТО СТО СоС СТО САС о саз Сос сто сто сто АСТ 919 лвпоНів Авр Її18 Ліз Печ без Аку Гей Нів бій рго Уа! Маї рем Таж 4 1250 245 250 255 с 50 З0 бАСосСАТ сто Ста СОС Сто тес сто СОС ОАА СОС АС ТС ІСТ ОСАЄ ВОС 967 дер Нів Маї Уаї Бго Пец Сув їечц Рхо Сіп Ако Трах Рпе бек біц Ах с» 260 265 270 са сто бос ттС сто оС ттс тТсА тто сто Абс бос Таб СОС САС СТО 1015

Тік Гей Аза Рпе Маї Ака Рре бек це) Уа! Бех с1у Тгр б1у біп пе 275 180 285 5 сто АС сот ос ссс АсСе со сто бло сто лто сто СТО лЛАС сто СОС о 0 1063 тем Авр Агу сіу Аїа ТБк Аза Пец б)м Пец Мес уні Пед Взп Ма! Рго 290 295 320

ССО СТО АТО АСС САС САС ТОС СТО САФ САС ТОА СОб ААС СТО БА САС 111 Агу цей мес Ток біп Азр Суб цей біп сід Хек Аху Був Уаї 61у дар 305 330 за5

ТОС ССА ААТ АТС АСО САС ТАС АТО ТТС тот бос бос ТАС ТСО САТ ОС 01159

Бех Рко деп І1е Трх біс Тух Мес РВе Сук А18 з1у туг Бех Азр С1уУ з2о 325 330 335

ВСС АЛО САС ТОС ТОС ААС соб ЗАС ЛОТ СОА ФС ССА САТ СС АСО САС 1207

Бек цу дер бек Сує цув б1у Ар Бех сіу Ф1іу рхо нів вів Тих Зів 15 зо 345 350 20 .

ТАС Сов бос АСо тоб ТАС СТО ЛОСЯ СОС АТС сто вес тоб бос сАб бас о 1255

Тук Ах с1іу Тпж ТгроТук їец тах сіу Ії Маї бак Тер с1у бід З1уУ 355 зво з65 25 тес ось АСС сто ОбС САС ОТТТ ОО СТО ТАС ОАСС АС СТО ТС САС ТАС 1303

Сув Аїа ТНІ Уаї с1іу Ні Рпе сбі-у Уві Тук Тпк Ак Маї Бек сіп Тук 370 зт зво

МТС САС Тос СТО САА ВАС СТС АТО СОС ТОА АБ ССА СОС ССА ббА Ятс о 1351

Ле сім Тер Тем біп пу Пец Мес Дкд бек бід Рко Ак Рко щу Маї за 390 395 сем

СтС Ста СА СОС ССА ТТТ СОС О ТАС С СсАоСАвССС тосостотоб 1396 Ге)

Вед ем Атс А1а реко Ре Ро 405 405

МОМОВАМОСС АВООСТОСОТ ОСААСТСТОС ТООСАССАЛА ТСССАТАТАТ ТСТТСТОСАС 1456 30 ТТААТССОСТ АСАССАПОСС АТСОСАСССА СОЯЛСАССТО СОСЛССПАСА САСАСАСАСА 1516 5 ААСДСАОАСА САСАСАСАСА САСЛЯЛСАСТ СЛЯЗОЛЯЦСА СТСТОАССАС АТОСАПАСАЄ 1576

АСТСАААСАб АСТССААСАТ ТСАААСАСАС ТААТАСАСАС АСАСАСАТОС ААТАСАЛАВЯ 1636

АТЗАСАБССА САСОСАСАСА О9СОСТОСАС АЯЛОСоОСАЄ ОССАСТОССА лОсТТотТОСТ 1656 350 (Се)

СолСссАСЬС ЛОСССАССТО АСССТОСТТА ССТСОСТТСА СССААСССОС АССТОСАССТ 1756

САТСТОСТОВ СССТСАБОСТ ОСТОСТСТОС СТТСАТІОСТ ССАСАСАСТА САСОСАТОдА 1816 15 САСАСАТОСА ТЕСАСАСАСА САСАСООСАА ТОСАСАСАСА САСАСАТАТО САСАСАСАСС 1876 с

САТОСАСАСА САСАТОСТСА САСАСАСАТА СОСАВАСАСА ССОДТОСАСА СОСАСАТАСА 1936

САТАТОСЛСА СЛОРЛОЛТОСА САСАСАСАТА ТАСЛОЛТОСА ТОСАСССАСА ТОССААТОСА 1996 "з 20 п

СОСАСАСАТС АСТОСАСАЄЯ САТОСАСАСА ЗАТАТССАСА САСССАТОТО СОСАСАСАСА 2056

СХТАТОСАСА САСАТОБАТС АССАСАСАСА САССАДСТОС ССАСАСАСАЄС СОАТСТАСАЄ 2116 б) 25 АСАСАСАТОС АСАСАСМСАТ ССАСАСАСАС ОСАТОСТЕАС ТОСАТОТОТО СТОТОСТСТО 2176 бо ВАССОСТІТС ТТТАССТСТО АСТТТТСТОС ТІСТТАТОСА ТТАТОМІСТТ САСТТСАСАС 2236 со ААТТСАСАВО САТСВССАТО САТОСТОССЯ ААТОСССССА ЛАСТСТОССС САЛАТОТАТТ 2296 с» 7 Ш

ТСТСССтТОС СТОССТОССс СОСТОСАСАЄ АСТАТТОСОС АССТОСТРСС САПСТТСВСА 2356 « АТАААСООСТ ОСОТСТОСТО СОСАСАССТЯ ТОЯТОССТОС САСОСВАВАА ААВААААВАА 2416 35 ААААЛА 2422

ГФ) () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: () ДОВЖИНА: 44 амінокислоти (Б) ТИП: амінокислота (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна 6о (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: протеїн (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО МО: 2:

Мес Уаї бек с1іп А1їа Пец Ак тем еп Тер Пец Пец їв біу пец б1іп -3В -35 -30 -25 15 с1у Суз рей діа А1а уві Ре уві Тих біл Сі Січ А1а Нів сіу уаї -20 -15 -10 їві ів Аку Ак Агу Ак Аза Авп діа Ре цем сій бі Пец Аку хо -5 1 5 10 20 сіу Бек цей біц Ак бій Сув пу бім бій біп Сув бек Рре біз біч 70 15 20 25

Віа вх сі їзїе вде цув АвБр діа біль та ТОх пуб ем Рпе ттр т11е 25 зо 35 «0

Бек Тук бек Авр с1у АБр біп Сує Ліз бек бег Рго Суя б1іп Аєп 01У 15 1 во 55

З0 б1у бек Сув пув Азр біп реп біп бек Тук І12 сСув Рпе Суб Пец рРко во 65 70

Кіа Рпе сіш 01у Акд Аєп Сув б1ц Твг о Нів Був Вер Азр Ссіп теп І12 15 8 20 о 85 зо 35

Сув Маї АБп б1іц Авп о С1іу б1іу Су біц біп Тук Суб бек Авр Нів Тік 95 100 105 сіу Тих цув Аку бек о Сув Аху Сув Нів сій с1у тТук Бех ем пед Аза с і 25 5 119 115 120 Ге)

Авр б1іу Уаї Зех Сув Тік Рко ТпПк Уаї б1іч Тук рРго Сув біу Був І11єе 125 130 135 Рхо те цез біц Був Ако Авп Аза бек Гув Рго біп сіу Акад т16 Маї 30 140 145 150 со біу сіу був Уаї Суб Рко Пуз б1у бій Сув Рго Тур біп Маї цей печ Гео) 155 160 й 165 170 1 г) їез уаї Авп біу Аза біп пе) Су Сіу біу Тк Тео І11е Авп о Трх І11е 35 175 180 185 со,

Ттр Уаї Маї Бех Аза Аїа Нів Сув Рве Авр Тув І1е цув Авп Тур Аг 1980 155 200 «

Авп рем І1с Азїа Уаі Меп б1іу сім Нів Авр Ів бет біц Нія Авр біу - 40 205 210 215 и 25 Авр б)ч4 б1п бек ду Ага Ма) Аіїв біп уаї Ї1є І16 Рко Бех Тк Тух и т 220 225 230

Маі Рко бу Тіт Трг Авп Ніз Азр Гі Ата Пец тей Акд цем Нів біп 45 235 240 225 250 (22) зо

Ркго Маї Уаї йец Тпх Авр Нів Уа! Уві Ркго Гей Сув цем Рхо 01 Акд 255 260 265

Тпх Рре бег сім Акад тТрх Гео Аїа Рре уаї Ату Ре бек рей Ма1ї ВЗек

ОО 20 35 270 275 2во 60 бо

СсЬу Ткр біу сіп Ппеп Гей Авр Ахо 41у Аза Трх діа їеза 03 Тем Мес 285 290 295 УМаї Пец АБп о Уаї Рго АкФ ем Меє Ту сід Азр Суз цей біп біп бег 5 зоо зо5 зо

Ага Пув Маї б1у Авр бек Рго Авп І1е Трх б1ім Тук Мей РБе Сув діа 315 320 325 ззо то с1у Тук Бет Авр б1у бек цув Анр бек Суб ув с1у дер бек С1у бі1у зз5 зао 345

Бко нів Аза Тпк Ніє Тук Аку с1у ТЬх Тер Тук цем Тах с1у Іїє Маї 350 355 зво

Век Ткр с1у біп с1у Сув Аза Твк Маї біу Ні РБе сіу маї Туг Тс 15 "з65 370 315 Ака Маї беу біп Туг ї1е бій Тер Пец біп цув Пец Меї Аг бех 01Ш зво за5 390 20 Бго Ак Рго б1у Уаї Ту Тец Аку Аа Бко Рре рго 395 400 405 (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ЗЕО ІО МО: 3: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: 25 (А) ДОВЖИНА: 21 пара нуклеотидів сч (Б) ТИП: нуклеїнова кислота о (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одиночна (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: КДНК со зо (ії) ППОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає (м) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає со (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЗЕО ІЮ МО: 3: ТОСОССТоСОо сСОТСССССТт т 21 со (2) ІНФОРМАЦІЯ ПРО ЗЕО ІО МО: 4: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: г о) (А) ДОВЖИНА: 15 пар нуклеотидів с (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одиночна (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ТИП МОЛЕКУЛИ: кДНК (ії) ГІ ПОТЕТИЧНІ ВАРІАНТИ: немає « (м) АНТИСМИСЛОВІ ПОСЛІДОВНОСТІ: немає з то (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО ІО МО: 4: с ТОССАСТСАСОСАСОТ15 ;» (о) (ог) (65) о 50 сб» (Ф, ко 60 б5

І о Фіг. 1 т геВі що Кізпрів й фактор Ті ко

З І мі Кр нір РА

Е я - 04

РИЦ5Б5 2463 РОХ 10 І

Бей Хе у фа МИ кто, Км! 0 щу 4

Гей І

КІР

15 Кофщ/Е и 0 ті о Є РИ уд, ІІ

ЦО юр 20 ці ру ай

Ківа щі -бЕ їх (я

ЕМПОБ5 оби рОХ се 25 | (о) 6 рЕСВ-КЕУПа 30 З й КОНТРОЛЬ) со шо 4

Ге) - 3 . о й. ,0.005. мг/кг 14) со 82 . (Се)

Е

Зо Е 1 мг, Кі ті сд--- 9 0.05 мг/кг (3)

В а--- 4-10 мг/кг (8) я 040203 40 50 60 « " ЧАС (ХВ) | - ет 5 2 «С « ю ЗО с . Фіг. 2 «» .

ФІГ. З (е))

ХРОМОГЕННА АКТИВНІСТЬ 5МС БАБУЇНА бо А 120

Фо с 50 Е 100 Я 5

Фо щ й о я я - - РМ

Е 60 99 8 -- ОБСЯ. Ра ш

Е

ІФ) І 40 т 5

Ге

Е Й - «5 270 бо Е

Е | ! я Ге! м « 01 К ' 10 100

ЕМа 5 СЕСВ-ЕМа Сопс, (пм) 65

ФІГ. 4

ЕНДАРТЕРЕКТОМІЯ СОННОЇ АРТЕРІЇ

5 і х й з тра ко і. Р-0045

Ї кі че; щу, ан Ше. о Же пе ще не т ти Як

Же ТЕХ а

Же т о п: т що

Ко Я В. . 0 іже -- Я ТЕ: контРОЛЬ 7 ЗО ножа ай с

Лікування о

ОЕСВ-ЕМНа

ЗДУТТЯ СТЕГНОВОЇ АРТЕРІЇ БАБУЇНА со й со - 20 пн - вес ШИ о

Ф 5 70 рен плен зі їх

Ге КК УЕкини и"? З КОНТРОЛЬ 7 304 інплмпіни вна сив олваь міння пит нвтннан вино

Лікування рЕав-єУпа

Ф со

ФІГ. 5. о се 70 с» т бо б5

ПРОТОКОЛ ЕКСПЕРИМЕНТУ

9 ЗАКУПОРЮВАННЯ РЕПЕРФУЗІЯ ТА ЗАБИТТЯ 7

КОРОНАРНИХ / МЕДИКАМЕНТОЗНЕ

СУДИН ЛІКУВАННЯ ХЛОРИСТИЙ 2,3,5-ТРИФЕНІЛТЕТРАЗОЛ

ХІРУРГІЧНЕ (РОЗМІР ІНФАРКТУ)

ПРИГОТУВАННЯ зо Б, код ТОФЛАВІН (НЕПРОХІДНІСТЬ)

І | | . МОНАСТРАЛЬНИЙ БЛАКИТНИЙ й (ПЛОША РИЗИКУ) 10 . :

ПРОТРОМБІН та

ТРОМБОПЛАСТИН

15

Фіг. 6 20 100 ж 25 росся о меня х Мине

ГІ панна роко

В Васиння во 60 . Боя

ЕЇ ння 2 ня

Б ! х век і, ч 0 нини 30 в Кене кеннене со х г ми - де винен милим

Фо 70 ; о Фо нини

Манн у кю . ДА пееннно со о . А рою

КОНТРОЛЬ ЕМПаї ЕМіа «я

Фіг, 7

І 60

ЖЖ « 40. - с г; нвннаня 5 кивенене

ГЯ миня канав - п кавову о. ре ит Е мине

ЕЙ мис 2 Бики е нивннн

В . Ка

Е Ко

В - пн ля пннннне іа шо 70 ій ння й . меми ний. кивНенню і : нення (о) сс . їв Меннвин - ре пошоннн нний о Я ши о їй НВ (95) : КОНТРОЛЬ ЕУПаї ЕМПНа

Фе й

Фіг. 8 . 60 65

20 я й .

Б. що" !

Е: 5 15 ш 52 щі

І: є 5 и шо в х 5 104 жи щ в х е- З КОНТРОЛЬНІ

Ве А 70 шо А РМИаї

БЕ 5 А в А ш ЕУпПа нк о уз о А о 5 10 15 20 15 ОЧІКУВАНА НЕПРОХІДНІСТЬ (95 ВІД ЛІВОГО ШЛУНОЧКА)

Фіг. 9 щ- 20 Ішемія 10' Реперфузія 20 Гу 2 2 год. Реперфузія щ г -

З

- За

Е КК г Ж ; ЩА що сч х Кк ЕЕ З 25 5 Я о

Е 1 о ї Б. ж мов п: й. м КАС о. сежвя ж КО ро ро

Е ше КО ВО в КО С. о со зо З о М о 5 АВ нен КА со : 5 щи: Щи. я ія шо ная о ! КОНТРОЛЬ ЕМНаї ЕМПНа (ее)

Фіг. 10 325 | ДІ час певетвореєНння пРОТРОМБІНУ шо

ЧАС ПЕРЕТВОРЕННЯ ТРОМБОПЛАСТИНУ

35 « зо 40 25 о З ех й го

СС по | ї

ЖЕ

І» й 15 г " Г Ж

Б і

Ф о Ж А ши

КОНТРОЛЬ ЕМнНаї ЕМПа , (ее) : (95) ФІГ. 11 (95) сю»

Claims (14)

Формула винаходу

1. Спосіб запобігання або мінімізації ураження міокарду, пов'язаного з постішемічною реперфузією, який передбачає введення пацієнтові композиції, яка включає фармакологічно активну сполуку та фармакологічно прийнятний носій, який відрізняється тим, що композиція містить ефективну кількість фармакологічно о прийнятного Фактора МІЇ, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, яка суттєво інгібує ко здатність модифікованого Фактора МІ! до активації Фактора плазми Х або ІХ.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що модифікація передбачає реакцію Фактора МІ! з інгібітором 60о серинової протеази.

З. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що інгібітором протеази є органофосфорна сполука, сульфанілфторид, пептидний галометилкетон або азапептид.

4. Спосіб за п. З, який відрізняється тим, що інгібітором протеази є пептидний галометилкетон, вибраний з-поміж Дансил-РПпе-Рго-Агд-хлорметилкетону, 65 Дансил-СІШ-СІу-Ага-хлорметилкетону, Дансил-Рпе-РПпе-Агд-хлорметилкетону та Рпе-Рпе-Аго-хлорметилкетону.

5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що ураженням міокарду є некроз міокарду.

6. Спосіб поліпшення регіонального кровотоку у міокарді під час постішемічної реперфузії, який передбачає введення пацієнтові композиції, що включає фармакологічно активну сполуку та фармакологічно прийнятний носій, який відрізняється тим, що вводять композицію, яка як активну сполуку включає фармакологічно прийнятний Фактор МІ в ефективній кількості і має принаймні одну модифікацію в його каталітичному центрі, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора МІ! до активації Фактора плазми Х або ІХ.

7. Спосіб за п. б, який відрізняється тим, що модифікація включає реакцію Фактора МІ! з інгібітором серинової протеази.

8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що інгібітором протеази є органофосфорна сполука, 7/0 сульфанілфторид, пептидний галометилкетон або азапептид.

9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що інгібітором протеази є пептидний галометилкетон, вибраний з-поміж Дансил-РПпе-Рго-Агд-хлорметилкетону, Дансил-СІШ-сІу-Агд-хлорметилкетону, Дансил-Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетону та Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетону.

10. Спосіб інгібування процесів ураження тканини внаслідок ішемічної реперфузії, який передбачає введення /5 пацієнтові композиції, що включає фармакологічно активну сполуку та фармацевтично прийнятний носій, який відрізняється тим, що вводять композицію, яка включає ефективну кількість фармакологічно прийнятного Фактора МІЇ, що має принаймні одну модифікацію у каталітичному центрі, яка суттєво інгібує здатність модифікованого Фактора МІ! до активації Фактора плазми Х або ІХ.

11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що модифікація включає реакцію Фактора МІ! з інгібітором 2о серинової протеази.

12. Спосіб за п. 171, який відрізняється тим, що інгібітором протеази є органофосфорна сполука, сульфанілфторид, пептидний галометилкетон або азапептид.

13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що інгібітором протеази є пептидний галометилкетон, вибраний з-поміж Дансил-РПпе-Рго-Агд-хлорметилкетону, сч дв Дансил-СіІн-сіу-Агд-хлорметилкетону, Дансил-Рпе-Рпе-Аго-хлорметилкетону та Рпе-Рпе-Аго-хлорметилкетону.

14. Спосіб за пп.10-13, який відрізняється тим, що ураженням тканини є некроз. і) Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 8, 15.08.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і с науки України. (зе) (зе) (ее) (Се)

- . и? (о) (ее) (95) (95) сю» іме) 60 б5