CN108024994A

CN108024994A - 治疗与血管发生和新血管形成相关的病症的方法

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Publication number: CN108024994A
Application number: CN201680042066.4A
Authority: CN
Inventors: G.布里安; W.格林; K.多恩布什
Original assignee: Eko Nick Medical Ltd By Share Ltd
Current assignee: Eko Nick Medical Ltd By Share Ltd; Iconic Therapeutics Inc
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2016-07-22
Publication date: 2018-05-11
Also published as: WO2017015582A1; MX2018000869A; RU2018106348A; CA2990837A1; AU2016297178A1; EP3324960A1; US20210236649A1; JP2018524391A; BR112018001275A2; KR20180034518A; EP3324960A4; US20180207292A1

Abstract

本文提供的是用于与血管发生和新血管形成相关的疾病的治疗的方法和免疫缀合物二聚体组合物。一方面，本发明涉及治疗有此需要的患者的眼中湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)的方法。所述方法包括在多个给药期间向患者施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的组合物，其中二聚体的单体亚基各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白。

Description

治疗与血管发生和新血管形成相关的病症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年7月22日提交的美国临时申请序列号62/195,709的权益，其通过引用以其整体并入本文。

有关序列表的声明

与本申请相关联的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并特此通过引用并入说明书。含有序列表的文本文件的名称为ICTH_001_01WO.txt。该文本文件为24KB，创建于2016年7月18日，并通过EFS-Web以电子方式提交。

发明背景

年龄相关性黄斑变性(AMD)指导致中央视觉丢失的黄斑的慢性，进行性退行性病理学。根据黄斑视觉研究基金会和国家眼科研究所，美国有多达一千五百万人患有某种形式的AMD，在欧洲和其他大陆也有类似的数字。新生血管性AMD(也称为渗出性或“湿性”AMD)是工业化世界五十岁以上老年患者中严重视力丢失和失明的主要原因。仅在美国，就有超过150万人患有湿性AMD。预计随着人口老龄化，AMD的发病率和流行率将进一步增加，因此导致美国和世界范围内患有湿性AMD的患者数量显著增加。

组织因子(TF)是存在于血管内皮细胞上的细胞因子受体。它是完整的膜糖蛋白，具有胞内末端域、跨膜域，和对于因子VII(FVII)和因子VIIa(FVIIa)的细胞外结合域。TF参与血管发生过程和细胞因子释放的炎症级联反应，两者都是在新生血管性AMD和某些癌症的发病机制中的过程。

脉络膜新血管形成(CNV)是其中新的血管在眼睛的脉络膜层中生长的过程，并且与湿性AMD相关。靶向血管内皮生长因子(VEGF)的疗法目前是用于湿性AMD临床护理的标准。然而，由于脉络膜新血管形成与AMD发病机制的多面性，仅靶向VEGF很可能不足以阻止疾病向晚期CNV相关退行性过程的进展。

对于脉络膜新血管形成和年龄相关性黄斑变性的新的治疗策略存在未满足的医学需求。本发明解决了该需求和其他需求。

发明概述

一方面，本发明提供了治疗有此需要的患者的眼中湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)的方法，其包括在包含多个给药期间的给药方案中向患者施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的药物组合物，所述免疫缀合物二聚体包含单体亚基，其各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)片段可结晶(FC)区域或其部分缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白。在一个实施方案中，突变的人fVIIa蛋白经由IgG1的铰链区与人IgG1缀合。在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体是同二聚体。在另一实施方案中，免疫缀合物二聚体是异二聚体。在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体由SEQ ID NO:1,4,或5编码。

在治疗湿性(AMD)的方法的一个实施方案中，每个给药期间包含药物组合物的眼内注射(如玻璃体内注射)。在另一实施方案中，每个给药期间包含药物组合物的局部施用(例如经由滴眼剂)。

在一个实施方案中，多个给药期间包含2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，或5个或更多个给药期间。在进一步的实施方案中，每个给药期间间隔约10天至约50天，或约10天至约40天，或约10天至约30天或约10天至约20天。在进一步的实施方案中，多个给药期间包括每14天一次、每28天一次或每30天一次的药物组合物的玻璃体内注射。

在一个实施方案中，治疗湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)的方法包括施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的药物组合物，其中单体亚基的一个或两者包含具有丙氨酸取代赖氨酸-341(如SEQ ID NO:2的蛋白质)的或丙氨酸取代丝氨酸-344(如SEQ ID NO:3的蛋白质)的突变的人因子VIIa。

在治疗有此需要的患者的眼中湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)方法的一个实施方案中，与多个给药期间之前患者的最佳矫正视力(BCVA)测量相比，患者在多个给药期间之后基本维持他或她的视力，如通过BCVA测量中丢失少于15个字母来测量。在进一步的实施方案中，BCVA中少于15个字母的丢失在治疗方案结束后持续至少约10天、至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天或至少约100天或至少1年。在另一实施方案中，与多个给药期间之前患者的最佳矫正视力(BCVA)相比，患者在多个给药期间之后经历视力改善，如通过BCVA测量中获得15个字母来测量。在进一步的实施方案中，BCVA的改善在治疗方案结束后持续至少约10天、至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天或至少约100天或至少1年。

在治疗湿性AMD的方法的一个实施方案中，与多个给药期间之前或者一个或多个给药期间之前的CNV面积(例如通过荧光素血管造影术测量)相比，多个给药期间之后或者一个或多个给药期间之后，患者眼中CNV面积是减小的。在进一步的实施方案中，与多个给药期间之前或者一个或多个给药期间之前的CNV面积相比，CNV面积减小至少约10％、至少约20％或至少约30％、至少约40％或至少约50％。

在有此需要的患者的眼中治疗湿性AMD的方法的一个实施方案中，与多个给药期间之前或其子集(subset)(例如第一给药期间，第一和第二给药期间等)之前的眼视网膜厚度相比，多个给药期间之后或其子集(subset)之后，如通过光学相干断层扫描术(OCT)测量的患者眼视网膜厚度是减少的。在一个实施方案中，视网膜厚度减小至少约50μm、至少约100μm、至少约150μm、至少约175μm、至少约200μm、至少约225μm、至少约250μm、至少约275μm或至少约300μm。在一个实施方案中，与多个给药期间之前或其子集之前的眼视网膜厚度相比，视网膜厚度减少至少约10％、至少约20％或至少约30％。在一个实施方案中的减少的视网膜厚度是减少的中央视网膜亚区厚度(CST)、减少的中央点厚度(CPT)，或减少的中央凹厚度(CFT)。

在一个实施方案中，治疗期间或治疗完成时，患者眼睛的新血管形成(如脉络膜新血管形成)是逆转的。在另一实施方案中，治疗方案期间或治疗方案结束后至少约10天、至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天或至少约100天，患者眼睛的新血管形成(如脉络膜新血管形成)是抑制的。在一个实施方案中，需要治疗的患者以前没有进行湿性AMD或脉络膜新血管形成治疗。然而，在另一实施方案中，患者之前接受过脉络膜血管生成或湿性AMD治疗。在进一步的实施方案中，患者对之前的治疗是无响应的，或没有适当地响应。在进一步的实施方案中，针对脉络膜新血管形成或湿性AMD的之前的治疗包括抗血管内皮生长因子(VEGF)疗法、激光疗法或手术。

在一个实施方案中，治疗湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)的方法还包括向患者施用新血管形成抑制剂和/或血管发生抑制剂。在一个实施方案中，新血管形成抑制剂和/或血管发生抑制剂与有效量的免疫缀合物二聚体存在于相同组合物中。然而，在另一实施方案中，新血管形成抑制剂和/或血管发生抑制剂与有效量的免疫缀合物二聚体存在于不同组合物中。在一个实施方案中，新血管形成抑制剂和/或血管发生抑制剂是血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、VEGF受体抑制剂、血小板衍生生长因子(PDGF)抑制剂或PDGF受体抑制剂。

治疗湿性AMD的又一实施方案包括在含有多个玻璃体内给药期间的给药方案中，向受试者施用包含有效量的免疫缀合物的药物组合物，所述免疫缀合物包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)片段可结晶(Fc)区域或其部分缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白，以及在每次玻璃体内注射之前和之后通过例如张力测定法测量患者眼睛中的眼内压(IOP)。在进一步的实施方案中，该方法包括每次玻璃体内注射后约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约1小时测量患者眼中的IOP。

另一方面，本发明提供了抑制、预防或逆转有此需要的患者眼中的眼新血管形成的方法，其包括在包含多个给药期间的给药方案中向患者施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的药物组合物，所述免疫缀合物二聚体包含单体亚基，其各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)片段可结晶(Fc)区域或其部分缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白。在本方面的一个实施方案中，突变的人因子VIIa包含丙氨酸取代赖氨酸-341或丙氨酸取代丝氨酸-344(如SEQ ID NO:2的免疫缀合物)。在另一实施方案中，眼新血管形成与以下相关(或继发于以下)：增殖性糖尿病视网膜病变、湿性AMD、早产儿视网膜病(ROP)或新生血管性青光眼。在进一步的实施方案中，眼新血管形成是脉络膜新血管形成。

在方法的一个实施方案中，在药物组合物的至少一个给药期间之后，在所述至少一个给药期间后脉络膜新血管形成被抑制至少约10天、至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天或至少约100天。

在抑制、预防或逆转眼新血管形成的方法中，可以使用组合物的多个给药期间。例如，在一个实施方案中将包含免疫缀合物二聚体的药物组合物向有此需要的患者施用2或更多次、3或更多次、4或更多次或5或更多次。在进一步的实施方案中，每个给药期间之间的时间是约10天至约50天、约10天至约40天、约10天至约30天或约10天至约20天。在进一步的实施方案中，多个给药期间包括每14天、每28天或每30天一次的玻璃体内注射药物组合物。

在一个实施方案中，抑制、预防或逆转眼新血管形成的方法包括施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的药物组合物，其中突变的人因子VIIa包含丙氨酸取代赖氨酸-341(例如SEQ ID NO:2的蛋白质)或丙氨酸取代丝氨酸-344(例如SEQ ID NO:3的蛋白质)。在一个实施方案中，免疫缀合物由包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的多核苷酸序列编码。

在抑制、预防或逆转眼新血管形成的方法的一个实施方案中，与治疗之前患者的最佳矫正视力(BCVA)测量相比，患者在多个给药期间(即至少一个给药期间)之后基本维持他或她的视力，如通过BCVA测量中丢失少于15个字母来测量。在进一步的实施方案中，BCVA中少于15个字母的丢失在治疗方案(即至少一个给药期间)结束后持续至少约10天、至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天或至少约100天或至少1年。在另一实施方案中，与开始治疗之前患者的最佳矫正视力(BCVA)相比，患者在多个给药期间之后经历视力改善，如通过BCVA测量中获得15个字母来测量。在进一步的实施方案中，BCVA的改善在治疗方案(即至少一个给药期间)结束后持续至少约10天、至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天或至少约100天或至少1年。

在抑制、预防或逆转眼新血管形成方法的另一个实施方案中，与开始治疗之前的CNV面积相比，施用药物组合物后，如通过荧光素血管造影术测量的患者眼中的CNV面积是减小的。在治疗有此需要的患者眼中湿性AMD的方法的一个实施方案中，与用药物组合物开始治疗之前的视网膜厚度相比，至少一个给药期间之后，如通过光学相干断层扫描术(OCT)测量的患者眼的视网膜厚度是减少的。在一个实施方案中的减少的视网膜厚度是减少的中央视网膜亚区厚度(CST)、减少的中央点厚度(CPT)，或减少的中央凹厚度(CFT)。

在一些实施方案中，施用免疫缀合物包括静脉内施用或肿瘤内注射。

在一个实施方案中，每个给药期间包括施用约200μg至约400μg的免疫缀合物二聚体。在进一步的实施方案中，每个给药期间包括施用300μg的免疫缀合物二聚体。

在一个实施方案中，包含免疫缀合物二聚体的组合物(其中二聚体的单体亚基各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白)，其用于治疗有此需要的患者眼中湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)的用途，其中在多次给药期间内向患者施用所述组合物。在进一步的实施方案中，组合物进一步用于治疗湿性AMD，其包括在需要治疗的患者眼中预防、抑制或逆转脉络膜新血管形成。

在一个实施方案中，包含免疫缀合物二聚体的组合物(其中二聚体的单体亚基各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白)，其用于预防、抑制或逆转有此需要的患者眼中眼新血管形成的用途，其中在多个给药期间内向患者施用所述组合物。

在一个实施方案中，包含免疫缀合物二聚体的组合物(其中二聚体的单体亚基各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白)，其用于在有此需要的患者中逆转肿瘤新血管形成的用途，其中在多个给药期间内向患者施用所述组合物。

附图简述

图1是本发明的一般性免疫缀合物实施方案的非限制性图。

图2是作为时间的函数的内在因子Xase复合物(intrinsic factor Xasecomplex)(Fxase)水解速率(在405nm处的吸光度增加-mOD/min)的图。

图3是正常合并血浆中，作为时间的函数的由已知凝血抑制剂，活性位点抑制的FVIIa(FVIIai))所产生的凝血酶(thrombin)的图。

图4是正常合并血浆中，作为时间的函数的由hI-con1生成的凝血酶的图。

图5是在缺乏FVII的血浆中，作为时间的函数的由人因子VIIa和hI-con1生成的凝血酶的图。

图6是在兔血浆中，作为时间的函数的由hI-con1生成的凝血酶的图。

图7是在离心的兔血浆中，作为时间的函数的由hI-con1生成的凝血酶的图。

图8的图显示了作为玻璃体内hI-con1剂量的函数的猪中CNV百分比。在第10天将hI-con1溶液(0.25,0.5,1.0和2.0mg/mL)的玻璃体内注射剂注射到迷你猪的双眼中(100μL/眼)；对照动物接受100μL的配方缓冲液。第14天处死动物并确定％CNV。

图9的图显示了作为hI-con1的100kDa片段的玻璃体内剂量的函数的猪中CNV百分比。在第10天将hI-con1溶液(0.25,0.5,1.0和2.0mg/mL)的玻璃体内注射剂注射到迷你猪的双眼中(100μL/眼)；对照动物接受100μL的配方缓冲液。第14天处死动物并确定％CNV。

发明详述

术语“一(a)”或“一(an)”可以指一个或多个该实体，即可以指复数指示物。同样地，术语“一(a)”或“一(an)”，“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。此外，除非上下文明确要求存在一个且仅一个要素，由不定冠词“一”或“一个”引用的“一个要素”并不排除存在多于一个要素的可能性。

整个说明书中对“一个实施方案”，“实施方案”，“一方面”或“方面”的引用意指结合该实施方案描述的特定特征，结构或特性包含于本公开的至少一个实施方案中。因此，整个说明书中各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”并不一定都指相同的实施方案。此外，可以以任何合适的方式在一个或多个实施方案中组合特定特征、结构或特性。

如本文所用，在具体实施方案中，当在数值之前时，术语“约(about)”或“大约(approximately)”表示该值加或减10％的范围。

如本文所用，“典型性CNV(classic CNV)”意指导致视力在20/250和20/400之间，但可能比20/800更差的定义明确的CNV面积。

如本文所用，“隐匿性CNV”意指展示出比典型性CNV较少渗漏(leakage)并导致视力在20/80和20/200之间的不良划分的CNV面积。

血管发生

在各种疾病中观察到病理性血管发生(从周围组织中的血管诱导现有血管的生长)，其通常由血管内皮细胞特异性生长因子的释放引发。病理性血管发生可导致新血管形成，即创造新的血管，使实体瘤生长和转移、导致眼部病症中的视觉障碍、促进炎性病症中的白细胞外渗，和/或影响心血管疾病(如动脉粥样硬化)的结果。

在本发明的一方面，提供了治疗患有与新血管形成和/或血管发生相关的疾病的患者的方法，所述疾病诸如癌症、类风湿关节炎、渗出性(“湿性”)形式的黄斑变性，和/或动脉粥样硬化。如本文描述，取决于疗法中涉及的病理状态类型，施用可以是局部性的或全身性的。如本文所用，术语“患者”包括人和其他物种(包括其他哺乳动物物种)两者。因此，本发明具有医疗和兽医应用。在兽医组合物和治疗中，使用来源于相应物种的靶向和效应结构域来构建免疫缀合物。

本发明部分基于这样的观察，即与在某些疾病状态下形成的新血管形成(诸如脉络膜新血管形成或血管发生活性状态中生长的肿瘤)相对照，正常的成年哺乳动物脉管系统一般处于静息状态(除了某些过程，如女性生殖周期和伤口愈合)。因此，静息和增殖血管内皮细胞之间的分子差异可以作为病理性血管系统的靶物。静息和增殖血管内皮细胞之间的一个分子差异在于后者在VEGF与其对应细胞表面受体结合后表达组织因子。组织因子是结合血浆因子VII/VIIa以启动血液凝集的跨膜受体。由于只有已经结合VEGF的血管内皮细胞表达组织因子的，活化血管系统(如肿瘤血管系统)的推定靶物是在内皮细胞上表达的组织因子。

在本文提供的一方面，提供了治疗患者与血管发生和/或新血管形成有关的疾病的方法。在一个实施方案中，与新血管形成和/或血管发生相关的疾病是湿性AMD。在另一实施方案中，与新血管形成和/或血管发生相关的疾病是癌症。

如本文所用，“免疫缀合物”指如ICON-1的缀合蛋白质。在一些实施方案中，免疫缀合物具有作为效应域的免疫球蛋白Fc结构域，并且所述效应域与包含突变形式的人因子VII的靶向域相缀合。在一些实施方案中，免疫缀合物包含与含有突变形式的因子VII的靶向域缀合的人IgG1免疫球蛋白Fc结构域，该突变形式的因子VII包含选自S344A和/或K341A的一个或两个突变，其中所述免疫缀合物蛋白结合组织因子。在一些实施方案中，本公开的免疫缀合物包括美国专利7,858,092；8,388,974,8,071,104；7,887,809；和6,924,359中描述的免疫缀合物。

在本文提供的一方面，提供了包含融合蛋白的组合物，该融合蛋白包含与人IgG1Fc结构域(效应域)缀合的突变的FVII蛋白(靶向域)。图1提供了可通过本文提供的方法施用的免疫缀合物的一个实施方案的概括结构。本文提供的方面中的突变的因子VIIa结构域(也称为TF靶向域)以高亲和力和特异性结合组织因子，但不启动通常与组织因子结合相关的凝血，或使凝血最小化。IgG1Fc结构域(也称为效应域)通过自然杀伤(NK)细胞和补体途径启动针对结合免疫缀合物的细胞的细胞溶解应答。在一个实施方案中，IgG1Fc效应域包含IgG1Fc区域的CH2和CH3区域两者。

表1：序列说明

FVIIa和TF之间的反应是物种特异性的(Janson et al.,1984；Schreiber etal.,2005；Peterson et al.,2005)：鼠FVII似乎在包括兔、猪和人的许多异源物种中有活性，而人类FVIIa仅在人类，狗，兔和猪中具有可感知的活性。相反，人IgG Fc结构域在人类和小鼠中均有活性。因此，根据患者，使用源自相应物种或来自已知在患者中有活性的物种的靶向域和效应域来构建免疫缀合物。例如，在本文提供的人类治疗方法中，突变的组织因子靶向域源自与包含人IgG1免疫球蛋白Fc区域的效应域缀合的人因子VIIa。例如，在一个实施方案中，免疫缀合物是SEQ ID NO:2的蛋白质。在进一步的实施方案中，免疫缀合物是SEQ ID NO:3的蛋白质。在一个实施方案中，免疫缀合物由SEQ ID NO:1,4或5的mRNA序列编码。

在一个实施方案中，本文描述的免疫缀合物包含两个蛋白链，其各自包含经由接头或铰链区结合至效应域的靶向域。在进一步的实施方案中，接头或铰链区是天然存在的，并且在一个实施方案中是人源的。在一个实施方案中，IgG1免疫球蛋白的铰链区(例如人IgG1免疫球蛋白的铰链区)用于将靶向域连接至效应域。在一个实施方案中，IgG1的铰链区包含在两个单体链之间形成一个或多个二硫键的半胱氨酸氨基酸(如图1所示)。

在一个实施方案中，免疫缀合物是同二聚体。然而，在另一实施方案中，免疫缀合物是异二聚体，例如包含两个单体的免疫缀合物，所述单体各自具有不同的氨基酸序列的靶向域但具有相同的效应域。在一个实施方案中，两个靶向域的氨基酸序列相差1个氨基酸，2个或多个氨基酸，3个或多个氨基酸或5个或多个氨基酸。在一个实施方案中，单体亚基各自包含连接免疫缀合物的靶向区域和效应区域的IgG1铰链区，并且免疫缀合物异二聚体或免疫缀合物同二聚体的单体亚基经由IgG1铰链区之间的二硫键相连接。

在一个实施方案中，本文提供的免疫缀合物的分子量为约150kDa至约200kDa。在另一实施方案中，免疫缀合物的分子量约为157kDa或157kDa。例如，在一个实施方案中的免疫缀合物是具有如SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的免疫缀合物，并在本文中称为“hI-con1”或“ICON-1”。在另一实施方案中，免疫缀合物具有如SEQ ID NO:3中所列的氨基酸序列。

如通篇所述，在本文所述实施方案中，提供了包含组织因子靶向域的免疫缀合物，该靶向域包含突变的因子VIIa结构域。靶向域包含突变的因子VIIa，其已突变以抑制凝血途径的启动而不降低对组织因子的结合亲和力。在一个实施方案中，因子VIIa中的突变是在残基341处的单点突变。在进一步的实施方案中，突变是从Lys341突变为Ala341。然而本文提供的免疫缀合物涵盖抑制凝血途径的其它突变。在一个实施方案中，本文提供的免疫缀合物的效应域介导补体和自然杀伤(NK)细胞细胞毒性途径。

免疫缀合物生产

在一些实施方案中，生产免疫缀合物的方法包括在哺乳动物细胞(如BHK细胞)中表达。在进一步的实施方案中，细胞系可以包括HEK 293、CHO、和SP2/0。可以通过表达构建体的哺乳动物表达来产生免疫缀合物。在一些实施方案中，免疫缀合物作为融合蛋白质(FVII-Fc)生产或作为化学缀合物生产。

在一些实施方案中，免疫缀合物是翻译后修饰的。翻译后修饰包括：豆蔻酰化(myristoylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、棕榈酰化、异戊烯化、脂化、酰化、烃化、丁酰化、gamma-羧化、糖基化(N-糖基化、O-糖基化、岩藻糖基化和甘露糖基化)、丙酰化、琥珀酰化和硫酸盐化。

施用免疫缀合物

本文提供的方法所涵盖的施用方法包括玻璃体内注射、脉络膜上注射、局部施用(如滴眼剂)、静脉内和肿瘤内施用。在另一实施方案中，经由以下施用：静脉内、肌内、肿瘤内、皮下、滑膜内、眼内、斑块内，或皮内注射免疫缀合物，或注射携带编码免疫缀合物的分泌形式的cDNA的复制缺陷型腺病毒载体，或其他病毒载体。在一个实施方案中，经由玻璃体内，静脉内或肿瘤内注射，或在其他位点处注射一种或多种免疫缀合物蛋白来向需要治疗的患者施用一种或多种免疫缀合物二聚体。或者，在一个实施方案中，经由静脉内或肿瘤内注射或在其他位点处注射携带编码本文提供的一种或多种免疫缀合物二聚体的分泌形式的cDNA的一种或多种表达载体来向需要治疗的患者施用一种或多种免疫缀合物二聚体。在一些实施方案中，通过静脉内或肿瘤内注射有效量的携带编码一种或多种类型的免疫缀合物蛋白的分泌形式的cDNA的一种或多种复制缺陷腺病毒载体或一种或多种腺相关病毒载体来治疗患者。

如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”意指治疗本公开的病患或疾病所需的治疗剂的水平或量，或者在施用治疗剂的受试者中产生治疗反应或所需效果的治疗剂的水平或量；其中治疗剂是本公开的免疫缀合物。因此，治疗有效量的治疗剂(如本公开的免疫缀合物)是有效减少血管发生和/或新血管形成以及各种形式的AMD的一种或多种症状的量。

如本文所用，“药物组合物”意指包含治疗剂的组合物。

如本文所用，“治疗”、“处理”等意指以下活动：(i)预防可能易患该疾病或病症但尚未被诊断为患有该疾病或病症的受试者中的特定疾病或病症；(ii)治愈、治疗或抑制疾病，即阻止其发展；或(iii)通过减少或消除症状、病患和/或通过引起疾病消退来缓解疾病。

在一个实施方案中，采用玻璃体内注射方法。在进一步的实施方案中，当制备用于注射的免疫缀合物二聚体时采用无菌技术，例如经由使用无菌手套、无菌盖布(drape)和无菌眼睑窥镜(或等效物)。在一个实施方案中，在注射之前患者经受麻醉和广谱杀微生物剂。

在一个实施方案中，通过附接至1-cc结核菌素注射器的5微米，19号过滤器针头抽出(withdraw)免疫缀合物二聚体组合物溶液的小瓶内容物来制备本文提供的一种或多种免疫缀合物二聚体(例如SEQ ID NO:2的免疫缀合物二聚体)的玻璃体内注射物(intravitreai injection)。在进一步的实施方案中，然后丢弃过滤器针头并用无菌30号x1/2英寸针头用于玻璃体内注射。排出小瓶的内容物直到柱塞尖端与注射器上的标记适当递送剂量的线对齐。

在眼部注射(玻璃体内或脉络膜上注射)的一种方法中，注射之前和/或之后，监测患者眼内压(IOP)的升高。例如，在一个实施方案中，眼部注射之前和/或之后，使用张力测定法监测患者IOP的升高。在另一实施方案中，通过注射后立即检查视神经头的灌注来检测患者IOP的增加。在一个实施方案中，眼部注射本文提供的免疫缀合物二聚体之一前，例如眼部注射之前约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约1小时监视患者的IOP升高。在另一实施方案中，眼部注射本文提供的免疫缀合物二聚体之一后，例如眼部注射之后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约1小时监视患者的IOP升高。在一个实施方案中，与眼内注射免疫缀合物二聚体之后相比，在眼内注射免疫缀合物二聚体之前患者的IOP基本相同。在一个实施方案中，与眼内注射(如玻璃体内注射)之前相比，眼内注射后患者的IPO变化不超过10％、不超过20％或不超过30％。

在一个实施方案中，本文提供的治疗方法包括本文提供的免疫缀合物二聚体(如SEQ ID NO:2或3的免疫缀合物)之一的单次施用。然而，在另一实施方案中，本文提供的治疗方法包括多个给药期间。在进一步的实施方案中，多个给药期间是本文所述免疫缀合物二聚体之一的多次眼内注射。在一个实施方案中，多个给药期间包括两个或多个、三个或多个、四个或多个或五个或多个给药期间。在进一步的实施方案中，每个给药期间包括眼内注射本文所述的免疫缀合物之一或瘤内注射本文所述的免疫缀合物之一(即，作为表达的蛋白质或通过编码可溶性免疫缀合物的载体)。

在一个实施方案中，使用从约2个至约24个给药期间，例如从约2个至约24个眼内给药期间(例如玻璃体内或脉络膜上注射)。在进一步的实施方案中，使用从约3个至约30个，或从约5个至约30个、或从约7个至约30个、或从约9个至约30个、或从约10个至约30个、或从约12个至约30个或从约12个至约24个给药期间。

在一个实施方案中，其中使用多个给药期间，给药期间间隔从约10天至约60天、或从约10天至约50天、或从约10天至约40天、或从约10天至约30天、或从约10天至约20天。在另一实施方案中，其中使用多个给药期间，给药期间间隔从约20天至约60天、或从约20天至约50天、或从约20天至约40天、或从约20天至约30天。在又一个实施方案中，多个给药期间是双周(如约每14天)、月(如约每30天)，或双月(如约每60天)。在另一实施方案中，给药期间间隔约28天。

在一个实施方案中，多个给药期间包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个给药期间，其中给药期间间隔2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、55天或60天。

本文提供的免疫缀合物适用于其中涉及血管发生和/或新血管形成的任何疾病或病症。例如，一方面，本文提供的免疫缀合物二聚体施用至有需要治疗湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)的患者的眼睛。在一个实施方案中，治疗包括免疫缀合物二聚体的多个给药期间。如全文所提供的，免疫缀合物二聚体包含单体亚基，其各自包含缀合至人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在一个实施方案中，治疗湿性AMD的方法包括在需要治疗的患者的眼中预防、抑制或逆转脉络膜新血管形成。在进一步的实施方案中，与治疗前患者受折磨(afflicted)眼中出现脉络膜新血管形成相比，治疗后脉络膜新血管形成逆转至少约10％、至少约20％、至少约30％或至少约40％。

可用本文提供的免疫缀合物和方法治疗与眼新血管形成相关的其他眼部病症。在一个实施方案中，眼新血管形成是脉络膜新血管形成。在另一个实施方案中，眼新血管形成是视网膜新血管形成。在另一个实施方案中，眼新血管形成是角膜新血管形成。因此，在一个实施方案中，可通过本文提供的一种或多种方法治疗与脉络膜、视网膜或角膜新血管形成相关的眼部病症。在进一步的实施方案中，方法包括向有此需要的患者眼中施用本文描述的免疫缀合物二聚体之一。在进一步的实施方案中，治疗包括免疫缀合物二聚体的多个给药期间。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。在再进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

例如，在一个实施方案中，用本文提供的免疫缀合物之一，例如经由玻璃体内注射、脉络膜上注射或局部施用(例如经由滴眼剂)免疫缀合物至受影响的眼睛来治疗患者，所述患者需要增殖性糖尿病视网膜病变、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病(ROP)，或新生血管性青光眼的治疗。一个实施方案中的治疗发生在多个给药期间。关于上述病症，认为眼新血管形成与相应病症“相关的”或“继发于(secondary to)”相应病症。

在一个实施方案中，通过本文提供的免疫缀合物二聚体之一来治疗患者，所述患者需要视网膜静脉阻塞(RVO)后的黄斑水肿的治疗。在一个实施方案中，方法包括给患者施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的组合物，其中所述二聚体的单体亚基各自包含缀合至人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域的突变的因子VIIa(fVIIa)蛋白。在进一步的实施方案中，突变的fVIIa蛋白是人突变的fVIIa蛋白并且经由IgG1的铰链区连接至IgG1Fc结构域。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。在另一实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体在多个给药期间施用至患者，例如在每个给药期间经由玻璃体内施用。

在另一实施方案中，通过本文提供的免疫缀合物二聚体之一来治疗需要治疗糖尿病性黄斑水肿(DME)的患者。在一个实施方案中，方法包括向患者施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的组合物，其中二聚体的单体亚基各自包含缀合至人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域的突变的因子VIIa(fVIIa)蛋白。在进一步的实施方案中，突变的fVIIa蛋白是人突变的fVIIa蛋白并且经由IgG1的铰链区与IgG1Fc结构域连接。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。在另一实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一个实施方案中，在多个给药期间将免疫缀合物二聚体施用至患者。在进一步的实施方案中，在每个给药期间玻璃体内施用免疫缀合物二聚体。

在另一个实施方案中，在有此需要的患者(例如患有DME的患者)中，经由本文提供的免疫缀合物之一来治疗糖尿病性视网膜病变。在一个实施方案中，方法包括向患者(例如DME患者)施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的组合物，其中二聚体的单体亚基各自包含缀合至人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域的突变的因子VIIa(fVIIa)蛋白。在进一步的实施方案中，突变的fVIIa蛋白是人突变的fVIIa蛋白并且经由IgG1铰链区连接至IgG1Fc结构域。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。在又一实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体在多个给药期间施用至患者。在进一步的实施方案中，例如经由在每个给药期间的玻璃体内施用，在多个给药期间将免疫缀合物二聚体施用至患者。

在本发明的一个实施方案中，本文提供的一种或多种免疫缀合物用于治疗有此需要的患者(如癌症患者)中与肿瘤新血管形成相关的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，方法包括向患者施用(例如经由肿瘤内或静脉内注射)包含有效量的免疫缀合物二聚体的组合物，其中二聚体的单体亚基各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域缀合的突变的因子VIIa(fVIIa)蛋白。在进一步的实施方案中，突变的fVIIa是人突变的fVIIa蛋白并且经由IgG1的铰链区连接至IgG1Fc结构域。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。在又一实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体在多个给药期间施用至患者。

在癌症治疗中，免疫缀合物二聚体用于治疗多种癌症，特别是原发性或转移性实体瘤，包括黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑癌、神经母细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和肺癌。在一个实施方案中，癌症是妇科癌症。在进一步的实施方案中，妇科癌症是浆液性，透明细胞，子宫内膜癌或未分化的卵巢癌。在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体用于靶向肿瘤血管系统，特别是血管内皮细胞和/或肿瘤细胞。不希望受理论束缚，使用一种或多种本文所述的免疫缀合物二聚体靶向肿瘤血管系统的癌症免疫治疗提供了如下优点：(i)包括组织因子在内的一些血管靶物应该对于所有的肿瘤都是相同的；(ii)靶向血管系统的免疫缀合物不必为了到达其靶物而浸润肿瘤块；(iii)靶向肿瘤血管系统应产生放大的治疗反应，因为每个血管滋养了许多肿瘤细胞，这些细胞的活性依赖于血管功能完整性；以及(iv)血管系统不可能对免疫缀合物形成抗性，因为这需要修饰内衬血管的整个内皮层。与先前描述的抑制新血管生长的抗血管生成方法不同，本文提供的免疫缀合物二聚体引起新血管系统的细胞溶解反应。

在另一实施方案中，本文描述的一种或多种免疫缀合物用于治疗动脉粥样硬化或类风湿性关节炎的方法中。在一个实施方案中，方法包括向需要治疗的患者施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的组合物，其中所述二聚体的单体亚基各自包含缀合至人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域的突变的因子VIIa(fVIIa)蛋白。在进一步的实施方案中，突变的fVIIa蛋白是人突变的fVIIa蛋白并且经由IgG1的铰链区连接至IgG1Fc结构域。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。在又一实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，免疫缀合物二聚体具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体在多个给药期间施用至患者。

在用免疫缀合物二聚体治疗眼部病症例如治疗湿性AMD、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿或继发于眼部病症的脉络膜新血管形成(如湿性AMD)的方法的一个实施方案中，与经历治疗前患者的最佳矫正视力(BCVA)相比，经受治疗方法的患者在治疗后(例如单个给药期间或多个给药期间)基本上保持他或她的视力，如通过BCVA测量中丢失少于15个字母来测量。在进一步的实施方案中，与经历治疗前患者的BCVA相比，在BCVA测量中患者丢失少于10个字母、少于8个字母、少于6个字母或少于5个字母。

在一些实施方案中，与经历治疗前患者的BCVA测量相比，已施用本发明免疫缀合物的患者在BCVA测量中丢失少于10个、9个、8个、7个、6个或5个字母。在一些实施方案中，与经历治疗前患者的BCVA测量相比，患者在BCVA测量中丢失少于约10个、约9个、约8个、约7个、约6个或约5个字母字母。

在一些实施方案中，已施用本发明免疫缀合物的患者在BCVA测量中丢失少于15个和5个之间、15个和6个之间、15个和7个之间、15个和8个之间、15个和9个之间、15个和10个之间、10个和5个之间、10个和6个之间、10个和7个之间、10个和8个之间、10个和9个之间、9个和5个之间、9个和6个之间、9个和7个之间、9个和8个之间、8个和5个之间、8个和6个之间、8个和7个之间、7个和5个之间、7个和6个之间或6个和5个之间的字母。

在一些实施方案中，已施用本发明免疫缀合物的患者在BCVA测量中丢失少于约15个和约5个之间、约15个和约6个之间、约15个和约7个之间、约15个和约8个之间、约15个和约9个之间、约15个和约10个之间、约10个和约5个之间、约10个和约6个之间、约10个和约7个之间、约10个和约8个之间、约10个和约9个之间、约9个和约5个之间、约9个和约6个之间、约9个和约7个之间、约9个和约8个之间、约8个和约5个之间、约8个和约6个之间、约8个和约7个之间、约7个和约5个之间、约7个和约6个之间或约6个和约5个之间的字母。

在用免疫缀合物二聚体治疗眼部病症的方法(例如治疗湿性AMD、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿或继发于眼部病症的脉络膜新血管形成(如湿性AMD)的方法)的另一个实施方案中，经受治疗方法的患者在治疗后(如单个给药期间或多个给药期间)基本上保持他或她的视力，如BCVA测量法所测量。

在一些实施方案中，与治疗前患者的BCVA相比，已施用本发明免疫缀合物的患者在治疗后恢复他或她的视力，如通过在最佳矫正视力(BCVA)测量中获得5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或25个或更多个字母来测量。在一些实施方案中，与治疗前患者的BCVA相比，已施用本发明免疫缀合物的患者在治疗后恢复他或她的视力，如通过在最佳矫正视力(BCVA)测量中获得约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约15个、约20个或约25个或更多个字母来测量。

在一些实施方案中，与治疗前患者的BCVA相比，已施用本发明免疫缀合物的患者在治疗后恢复他或她的视力，如通过在BCVA测量中获得多于5个和25个之间、5个和20个之间、5个和15个之间、5个和10个之间、5个和9个之间、5个和8个之间、5个和7个之间、5个和6个之间、6个和25个之间、6个和20个之间、6个和15个之间、6个和10个之间、6个和9个之间、6个和8个之间、6个和7个之间、7个和25个之间、7个和20个之间、7个和15个之间、7个和10个之间、7个和9个之间、7个和8个之间、8个和25个之间、8个和20个之间、8个和15个之间、8个和10个之间、8个和9个之间、9个和25个之间、9个和20个之间、9个和15个之间、9个和10个之间、10个和25个之间、10个和20个之间、10个和15个之间、15个和25个之间、15个和20个之间或20个和25个或更多个字母来测量。

在一些实施方案中，与治疗前患者的BCVA相比，已施用本发明免疫缀合物的患者在治疗后恢复他或她的视力，如通过在BCVA测量中获得多于约5个和约25个之间、约5个和约20个之间、约5个和约15个之间、约5个和约10个之间、约5个和约9个之间、约5个和约8个之间、约5个和约7个之间、约5个和约6个之间、约6个和约25个之间、约6个和约20个之间、约6个和约15个之间、约6个和约10个之间、约6个和约9个之间、约6个和约8个之间、约6个和约7个之间、约7个和约25个之间、约7个和约20个之间、约7个和约15个之间、约7个和约10个之间、约7个和约9个之间、约7个和约8个之间、约8个和约25个之间、约8个和约20个之间、约8个和约15个之间、约8个和约10个之间、约8个和约9个之间、约9个和约25个之间、约9个和约20个之间、约9个和约15个之间、约9个和约10个之间、约10个和约25个之间、约10个和约20个之间、约10个和约15个之间、约15个和约25个之间、约15个和约20个之间或约20个和约25个或更多个字母来测量。

在用免疫缀合物二聚体治疗眼部病症的方法(例如治疗湿性AMD、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿或继发于眼部病症的脉络膜新血管形成(如湿性AMD)的方法)的一个实施方案中，与治疗前眼新血管形成区域(如CNV面积)相比，患者眼中的眼新血管形成区域(如脉络膜新血管形成区域)是减少的。如本文提供，在一个实施方案中，治疗可以包括一个给药期间或多个给药期间，并且在单个给药期间之后或多个给药期间之后评估眼新血管形成区域(如CNV面积)的减少。在进一步的实施方案中，如通过荧光素血管造影所测量的，眼新血管形成区域(如CNV面积)减少至少约5％、或至少约10％、或至少约15％、或至少约20％、或至少约25％、或至少约30％、或至少约35％、或至少约40％、或至少约45％、或至少约50％。

在用免疫缀合物二聚体治疗眼部病症的方法(例如治疗湿性AMD、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿或继发于眼部病症的脉络膜新血管形成(如湿性AMD)的方法)的一个实施方案中，与治疗前的视网膜厚度相比，患者眼中治疗后眼睛的视网膜厚度是减少的，所述视网膜厚度如通过光学相干断层扫描术(OCT)来测量。如本文提供的，治疗可以包括一个给药期间或多个给药期间，并且在一个实施方案中，在单个给药期间之后或多个给药期间之后评估了视网膜厚度的减少。在进一步的实施方案中，如通过OCT测量的，视网膜厚度减少至少约5％、或至少约10％、或至少约15％、或至少约20％、或至少约25％、或至少约30％、或至少约35％、或至少约40％、或至少约45％、或至少约50％。在进一步的实施方案中，降低的视网膜厚度是降低的中央视网膜亚区厚度(CST)、降低的中央点厚度(CPT)，或降低的中央凹厚度(CFT)。

在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体以溶液或悬浮液施用。在一个实施方案中，免疫缀合物组合物包含精氨酸或蛋白质A(protein A)。在进一步的实施方案中，免疫缀合物组合物包含精氨酸。在甚至进一步的实施方案中，精氨酸以约20mM至约40mM(如以25mM)存在于组合物中。在一个实施方案中，组合物的其他组分包括HEPES、氯化钠、聚山梨酯80、氯化钙或其组合。

在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体以以下剂量施用：10μg和500μg之间、10μg和400μg之间、10μg和300μg之间、10μg和200μg之间、10μg和100μg之间、10μg和50μg之间、50μg和500μg之间、50μg和400μg之间、50μg和300μg之间、50μg和200μg之间、50μg和100μg之间、100μg和500μg之间、100μg和400μg之间、100μg和300μg之间、100μg和200μg之间、200μg和500μg之间、200μg和400μg之间、200μg和300μg之间、300μg和500μg之间、300μg和400μg之间或400μg和500μg之间。

在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体以以下剂量施用：约10μg和约500μg之间、约10μg和约400μg之间、约10μg和约300μg之间、约10μg和约200μg之间、约10μg和约100μg之间、约10μg和约50μg之间、约50μg和约500μg之间、约50μg和约400μg之间、约50μg和约300μg之间、约50μg和约200μg之间、约50μg和约100μg之间、约100μg和约500μg之间、约100μg和约400μg之间、约100μg和约300μg之间、约100μg和约200μg之间、约200μg和约500μg之间、约200μg和约400μg之间、约200μg和约300μg之间、约300μg和约500μg之间、约300μg和约400μg之间或约400μg和约500μg之间。

在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体以由以下组成的剂量施用：约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约125μg、约150μg、约175μg、约200μg、约225μg、约250μg、约275μg、约300μg、约325μg、约350μg、约375μg、约400μg、约425μg、约450μg、约475μg、约500μg、约525μg、约550μg、约575μg、约600μg、约625μg、约650μg、约675μg，或约700μg。

在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体在以下溶质体积中施用：10μL和200μL之间、10μL和180μL之间、10μL和160μL之间、10μL和140μL之间、10μL和120μL之间、10μL和100μL之间、10μL和80μL之间、10μL和60μL之间、10μL和40μL之间、10μL和20μL之间、10μL和15μL之间、20μL和200μL之间、20μL和180μL之间、20μL和160μL之间、20μL和140μL之间、20μL和120μL之间、20μL和100μL之间、20μL和80μL之间、20μL和60μL之间、20μL和40μL之间、40μL和200μL之间、40μL和180μL之间、40μL和160μL之间、40μL和140μL之间、40μL和120μL之间、40μL和100μL之间、40μL和80μL之间、40μL和60μL之间、60μL和200μL之间、60μL和180μL之间、60μL和160μL之间、60μL和140μL之间、60μL和120μL之间、60μL和100μL之间、60μL和80μL之间、80μL和200μL之间、80μL和180μL之间、80μL和160μL之间、80μL和140μL之间、80μL和120μL之间、80μL和100μL之间、100μL和200μL之间、100μL和180μL之间、100μL和160μL之间、100μL和140μL之间、100μL和120μL之间、120μL和200μL之间、120μL和180μL之间、120μL和160μL之间、120μL和140μL之间、140μL和200μL之间、140μL和180μL之间、140μL和160μL之间、160μL和200μL之间、160μL和180μL之间，或180μL和200μL之间。

在一个实施方案中，免疫缀合物二聚体在由以下组成的溶质体积中施用：约10μL、约15μL、约20μL、约25μL、约30μL、约35μL、约40μL、约45μL、约50μL、约55μL、约60μL、约65μL、约70μL、约75μL、约80μL、约85μL、约90μL、约95μL或约100μL。

下表2中提供了本发明的一个示例性组合物。

联合治疗施用

在一个实施方案中，以联合治疗方案施用本文描述的免疫缀合物二聚体以治疗患者的上述疾病或病症之一，例如以治疗湿性AMD或与血管发生或新血管形成相关的其他眼部疾病。在一个实施方案中，第二活性药剂在与免疫缀合物二聚体相同的组合物中施用。然而，在另一实施方案中，免疫缀合物二聚体在分开的组合物中施用。在一个实施方案中，第二活性药剂是新血管形成抑制剂或血管发生抑制剂。

在一个实施方案中，血管发生或新血管形成抑制剂是血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、VEGF受体抑制剂、血小板衍生生长因子(PDGF)抑制剂或PDGF受体抑制剂。

在另一实施方案中，新血管形成抑制剂是整联蛋白拮抗剂、选择素拮抗剂、粘附分子拮抗剂(如以下的拮抗剂：细胞间粘附分子(ICAM)-1、ICAM-2、ICAM-3、血小板内皮细胞粘附分子(PCAM)、血管细胞粘附分子(VCAM)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1))、碱性成纤维细胞生长因子拮抗剂、血管内皮生长因子(VEGF)调节剂或血小板衍生生长因子(PDGF)调节剂(如PDGF拮抗剂)。在确定受试者是否倾向于应答整联蛋白拮抗剂的一个实施方案中，整联蛋白拮抗剂是小分子整联蛋白拮抗剂，例如Paolillo等人(Mini Rev Med Chem,2009,volume 12,pp.1439-1446,incorporated by reference in its entirety)中描述的拮抗剂，或者如美国专利号6,524,581中描述的诱导白细胞粘附的细胞因子或生长因子拮抗剂(如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和血管内皮生长因子(VEGF))，其通过引用以其整体并入本文。

在另一实施方案中，新血管形成抑制剂是一种或多种以下血管发生抑制剂：干扰素gamma 1β、干扰素gamma 1β与吡非尼酮、ACUHTR028、αVβ5、氨基苯甲酸钾、淀粉样P(amyloid P)、ANG1122、ANG1170、ANG3062、ANG3281、ANG3298、ANG4011，抗-CTGFRNAi、Aplidin、黄芪、膜荚黄芪(membranaceus)提取物与丹参，五味子、动脉粥样硬化斑块阻滞剂、Azol、AZX100、BB3、结缔组织生长因子抗体、CT140、达那唑、Esbriet、EXC001、EXC002、EXC003、EXC004、EXC005、F647、FG3019、Fibrocorin、卵泡抑素、FT011、半乳凝素-3抑制剂、GKT137831、GMCT01、GMCT02、GRMD01、GRMD02、GRN510、Heberon Alfa R、干扰素α-2β、ITMN520、JKB119、JKB121、JKB122、KRX168、LPA1受体拮抗剂、MGN4220、MIA2、microRNA29a寡核苷酸、MMI0100、诺斯卡品、PBI4050、PBI4419、PDGFR抑制剂、PF-06473871、PGN0052、Pirespa、Pirfenex、吡非尼酮、plitidepsin、PRM151、Px102、PYN17、PYN22与PYN17、Relivergen、rhPTX2融合蛋白、RXI109、分泌素、STX100、TGF-β抑制剂、转化生长因子、β-受体2寡核苷酸、VA999260、XV615或其组合。

在另一实施方案中，新血管形成抑制剂是内源性血管发生抑制剂。在进一步的实施方案中，内源性血管发生抑制剂是内皮抑素、源自XVIII型胶原的20kDa C末端片段、血管抑素(纤溶酶的38kDa片段)，或血小板反应蛋白(TSP)家族成员。在进一步的实施方案中，血管发生抑制剂是TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4和TSP-5。也提供了确定对一种或多种以下血管发生抑制剂的响应的可能性的方法：可溶性VEGF受体，如可溶性VEGFR-1和神经毡蛋白1(NPR1)、血管生成素-1、血管生成素-2、vasostatin、钙网蛋白、血小板因子-4、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)(如TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4)、软骨衍生的血管发生抑制剂(例如肽肌钙蛋白I和chrondomodulin I)、解旋酶和具有血小板反应蛋白基序1的金属蛋白酶、干扰素(IFN)(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、趋化因子，如具有C-X-C基序的趋化因子(如，CXCL10，也称为干扰素gamma诱导的蛋白10或小的可诱导型细胞因子B10)、白介素细胞因子(如IL-4、IL-12、IL-18)、凝血酶原、抗凝血酶III片段、催乳素、由TNFSF15基因编码的蛋白质、骨桥蛋白、maspin、canstatin、增殖素相关蛋白。

在一个实施方案中，一种或多种以下新血管形成抑制剂与本文所述的免疫缀合物一起施用：血管生成素-1、血管生成素-2、血管抑素、内皮抑素、vasostatin、血小板反应素(thrombospondin)、钙网蛋白、血小板因子-4、TIMP、CDAI、干扰素α、干扰素β、血管内皮生长因子抑制剂(VEGI)meth-1、meth-2、催乳素、VEGI、SPARC、骨桥蛋白、maspin、canstatin、增殖素相关蛋白(PRP)、restin、TSP-1、TSP-2、干扰素gamma 1β、ACUHTR028、αVβ5、氨基苯甲酸钾、amyloid P、ANG1122、ANG1170、ANG3062、ANG3281、ANG3298、ANG4011、抗CTGF RNAi、Aplidin、膜荚黄芪(membranaceus)提取物与丹参，五味子、动脉粥样硬化斑块阻滞剂、Azol、AZX100、BB3、结缔组织生长因子抗体、CT140、达那唑、Esbriet、EXC001、EXC002、EXC003、EXC004、EXC005、F647、FG3019、Fibrocorin、卵泡抑素、FT011、半乳糖凝集素-3抑制剂、GKT137831、GMCT01、GMCT02、GRMD01、GRMD02、GRN510、Heberon Alfa R、干扰素α-2β、ITMN520、JKB119、JKB121、JKB122、KRX168、LPA1受体拮抗剂、MGN4220、MIA2、microRNA 29a寡核苷酸、MMI0100、诺斯卡品、PBI4050、PBI4419、PDGFR抑制剂、PF-06473871、PGN0052、Pirespa、Pirfenex、吡非尼酮、plitidepsin、PRM151、Px102、PYN17、PYN22与PYN17、Relivergen、rhPTX2融合蛋白、RXI109、分泌素、STX100、TGF-β抑制剂、转化生长因子、β受体2寡核苷酸、VA999260、XV615或其组合。

而另一联合疗法实施方案包括将本文所述的免疫缀合物之一与以下的一种或多种施用：帕唑帕尼(Votrient)、舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nexavar)、阿西替尼(Inlyta)、普纳替尼(Iclusig)、凡德他尼(Caprelsa)、卡博替尼(Cometrig)、贝伐单抗(阿瓦斯汀)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)(Cyramza)、瑞戈非尼(regorafenib)(Stivarga)、ziv-aflibercept(Zaltrap)或其组合。在又一实施方案中，血管发生抑制剂是VEGF抑制剂。在进一步的实施方案中，VEGF抑制剂是阿西替尼、卡博替尼、阿柏西普、布立尼布、tivozanib、雷莫芦单抗或莫特沙尼。

在一个实施方案中，血管发生抑制剂是兰尼单抗或贝伐单抗。在进一步的实施方案中，血管发生抑制剂是兰尼单抗。在甚至进一步的实施方案中，兰尼单抗以每个给药期间0.5mg或0.3mg的剂量施用，并且按照LUCENTIS的处方信息中的指示施用。

在一个实施方案中，联合疗法包括施用血小板衍生生长因子(PDGF)家族成员的拮抗剂，例如抑制、减少或调节信号通路和/或PDGF-受体活性(PDGFR)的药物。例如，在一个实施方案中，PDGF拮抗剂是抗PDGF适配子、抗PDGF抗体或其片段、抗PDGFR抗体或其片段，或小分子拮抗剂。在一个实施方案中，PDGF拮抗剂是PDGFR-α或PDGFR-β的拮抗剂。在一个实施方案中，PDGF拮抗剂是抗PDGF-β适配子E10030、舒尼替尼、阿西替尼、索拉非尼、伊马替尼、甲磺酸伊马替尼、尼达尼布、盐酸帕唑帕尼、普纳替尼、MK-2461、多韦替尼、帕唑帕尼、克莱拉尼、PP-121、拉帕替尼、伊马替尼、KRN 633、CP 673451、TSU-68、Ki8751、amuvatinib、tivozanib、马赛替尼、莫特沙尼二磷酸/盐、多韦替尼二乳酸、利尼伐尼(ABT-869)。

治疗结果

在一个实施方案中，在患者或患者群体中确定BCVA字母得分，其中将患者分组为：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，BCVA字母得分在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月重复。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，评估BVCA字母得分作为末次观测值结转(last observation carried forward)(LOCF)方法测定。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者获得BCVA字母得分中超过5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个，或40个字母。在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后患者获得BCVA字母得分中超过约5个、约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个，或约40个字母。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中确定眼中央视网膜亚区厚度，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月重复中央视网膜亚区厚度测量。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，评估中央视网膜亚区厚度作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。在一个实施方案中，利用sdOCT来测定中央视网膜亚区厚度。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示中央视网膜亚区厚度增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示中央视网膜亚区厚度增加或减少至少5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，本文呈现的患者表现出的眼组织和/或区域的中央视网膜亚区厚度的增加或减少是增加或减少至少约10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约125μm、约150μm、约175μm、约200μm、约225μm、约250μm、约275μm、约300μm、约325μm、约350μm、约375μm、约400μm、约425μm、约450μm、约475μm、约500μm、约525μm、约550μm、约575μm、约600μm、约625μm、约650μm、约675μm，或约700μm。

在一个实施方案中，本文呈现的眼组织和/或区域厚度的量度是增加或降低至少10μm、20μm,30μm,40μm,50μm,60μm,70μm,80μm,90μm,100μm,125μm,150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、325μm、350μm、375μm、400μm、425μm、450μm、475μm、500μm、525μm、550μm、575μm、600μm、625μm、650μm、675μm或700μm。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中采取CNV面积的量度，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月重复CNV面积测量。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，测量CNV面积发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出CNV面积降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出CNV面积降低至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中采取渗漏CNV面积的量度，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月测定CNV渗漏面积。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，测量渗漏CNV面积发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出渗漏CNV面积降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方式中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出渗漏CNV面积降低至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中获取视网膜下液(sub-retinal fluid)的体积的量度，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月测量视网膜下液的体积。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，测量视网膜下液的体积发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出视网膜下液体积降低或增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出视网膜下液体积降低或增加至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中测量中央亚区子视网膜下超反射材料(central subfield subretinal hyper-reflective material)的厚度，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月测量中央亚区子视网膜下超反射材料的厚度。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，测量中央亚区子视网膜下的超反射材料的厚度发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出中央亚区子视网膜下超反射材料的厚度降低或增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出中央亚区子视网膜下的超反射材料的厚度降低或增加至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中测量总视网膜下高反射物质(totalsubretinal hyper-reflective material)量，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月测量总视网膜下高反射物质量。在一些实施方案中，在中央凹下(subfoveal)与非中央凹下(non-subfoveal)存在区别。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，测量总视网膜下高反射物质量发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出总视网膜下高反射物质量降低或增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一些实施方案中，在中央凹下(subfoveal)与非中央凹下(non-subfoveal)存在区别。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出总视网膜下高反射物质量降低或增加至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在一些实施方案中，在中央凹下(subfoveal)与非中央凹下(non-subfoveal)存在区别。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中鉴定以下的存在或不存在：(1)视网膜内液，(2)视网膜下液，(3)视网膜下色素上皮液，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月在所述眼部位置处测定液体的存在或不存在。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，在所述眼部位置处测定液体的存在或不存在发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出以下的存在或不存在：(1)视网膜内液，(2)视网膜下液和/或(3)视网膜下色素上皮液。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中鉴定中央凹下(subfoveal)或非中央凹下(non-subfoveal)囊肿的存在或不存在，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月测定中央凹下或非中央凹下囊肿的存在或不存在。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，测定所述囊肿的存在或不存在发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出中央凹下或非中央凹下囊肿的存在或不存在。在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出中央凹下或非中央凹下囊肿存在的降低。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中对眼睛进行萎缩和/或纤维化的鉴定，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月确定萎缩和/或纤维化的鉴定。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，测定萎缩和/或纤维化的存在发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出眼睛的萎缩和/或纤维化降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出眼睛的萎缩和/或纤维化降低至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中测定降低的自体荧光(autofluorescence)总面积，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月确定降低的自体荧光总面积的测定。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，测定降低的自体荧光总面积发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出眼睛的降低的自体荧光总面积降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出眼睛的降低的自体荧光总面积降低至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中测定眼中不连续自体荧光总面积，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月确定不连续自体荧光总面积的测定。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，测定不连续自体荧光总面积发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出眼睛的降低的不连续自体荧光总面积降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出眼睛的降低的不连续自体荧光总面积降低至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中测定中央子域(central subfield)色素上皮脱离量的测量，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月测定中央子域色素上皮脱离量。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，中央子域色素上皮脱离量发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出中央子域色素上皮脱离量降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出中央子域色素上皮脱离量降低至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，在患者或患者群体中鉴定眼睛的以下完整性：(1)外核层，(2)外界膜(External limiting membrane)，(3)椭圆体区(ellipsoid zone)，和(4)中央凹下(subfoveal)视网膜色素上皮，其中将患者分为以下组：(1)ICON-1单一疗法，(2)兰尼单抗单一疗法，或(3)ICON-1和兰尼单抗疗法治疗组。在一些实施方案中，在0个月、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月确定(1)–(4)的完整性的测定。在一些实施方案中，CNV是典型性CNV。在其他实施方案中，CNV是隐匿性的。在一个实施方案中，确定(1)–(4)的完整性发生作为末次观测值结转(LOCF)方法测量。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出眼睛以下增加的完整性至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％：(1)外核层，(2)外界膜，(3)椭圆体区，和(4)中央凹下视网膜色素上皮。

在一些实施方案中，在开始治疗1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者显示出眼睛以下增加的完整性至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％：(1)外核层，(2)外界膜，(3)椭圆体区，和(4)中央凹下视网膜色素上皮。

实施例

通过参考以下实施例进一步说明本发明。然而，应该注意的是，这些实施例与上述实施方案一样是说明性的且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例1-体外凝血酶生成测定中评价hI-con1

测试了hI-con1(SEQ ID NO:2)在血浆中凝血酶生成测定中的作用。具体来说，使用凝血酶生成图(thrombogram)(CAT-like)测定(Hemker etal.2002.Pathophysiol.Haemost.Thromb.32,pp.249-253；Mann et al.2007.J.ThrombHaemost.5,pp.2055-2061,其各自以所有目的通过引用以其整体并入本文)评价了hI-con1对组织因子引发的反应中血浆中凝血酶生产的影响。对于CAT-like测定，使用了来自健康个体的多供体人柠檬酸血浆、人FVII缺陷血浆和正常兔柠檬酸血浆。凝血酶(也称为因子IIa或活化凝血因子II)生成是用人再脂质化的TF(在人血浆中)或兔再脂质化的TF(在兔血浆中)起始的。

在-70℃下保存hI-con1直至使用。每个样品包括溶于制剂缓冲液(15mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl₂、25mM精氨酸、0.01％吐温80、pH7.4)的3.0mg hI-con1/mL。

溶于50％甘油中的人血浆FVIIa购自Haematologic Technologies,Inc.,57RiverRoad,Essex Junction,VT 05452。将其储存在-20℃直至使用。使用前，将其在配制缓冲液(15mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl₂、25mM精氨酸、0.01％吐温80、pH 7.4)中稀释至10nM。

Spectrozyme FXa(#222)、脂质化的重组人TF试剂(货号#4500L)和脂质化重组兔TF试剂的购自American Diagnostica,Inc.(Stamford,CT)，汇集的(pooled)正常人血浆(批号#IR 11-020711)和兔血浆(批号#26731)购自Innovative Research Novi,MI48377)。先天性FVII缺陷型血浆(货号#0700)购自George King Bio-Medical,Inc.(Overland Park,KS)，并且人因子X(hFX)(#HCX-0050)和Phe-Pro-Arg-氯甲基酮(FPRck；货号#FPRCK-01),玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI；货号#CTI-01)购自HaematologicTechnologies,Inc(Essex Junction,VT,USA)。荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC·HCl购自Bachem(Torrance,CA)，并且乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA；#E5134)，NaCl(#S7653)和HEPES(#H3375)购自Sigma(St.Louis,MO)。HBS缓冲液，pH 7.4含有150mM NaCl,2mM CaCh和20mM HEPES。

活性位点抑制的FVIIa(FVIIai)在内部(in house)生产。1,2-二油-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(PS；#840035)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC；#850375)购自Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,AL,USA)。如Higgins和Mann 1983(出于所有目的通过引用以其整体并入本文)所述制备由25％PS和75％PC组成的磷脂囊泡(PCPS)。

外在FXase

将脂质化的重组人TF(0.1nM)与5nM血浆FVIIa或5nM hI-con1或二者的混合物(各自5nM)以及100μM PCPS在37℃下温育10分钟。在选择的时间点添加FX(4μM)。将10μL反应混合物的等分试样在170μL HBS-0.1％PEG-20mM EDTA中淬灭(quench)。添加20μL的Spectrozyme FXa(0.2mM)，并且以405nm处吸光度的增加(mOD/min)来测量底物水解速率。

凝血酶生成(CAT-like)测定

将玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)以终浓度0.1mg/mL添加至柠檬酸血浆，并且将80μL的该血浆转移到96孔板(Thermo Electron Co.,Waltham MA)。当需要时，以选择的浓度添加hI-con1、血浆FVIIa和FVIIai。将20μL的5pM TF和20μM PCPS混合物(均为终浓度)添加至CTI-血浆并温育3min。通过添加20μL的2.5mM ZGly-Gly-ArgAMC·HCl(在含有0.1MCaCl₂的HBS中)来起始凝血酶生产。底物的终浓度为416μM并且CaCl₂的终浓度为15mM。使用Thrombinoscope BY软件生成凝血酶生成曲线。

结果

hI-con1与外在FXase中的血浆FVIIa的比较

在显色测定中测定了两种形式的FVIIa及其混合物的FXa生成效率。hI-con1比血浆FVIIa活性低。hI-con1的活性是观察到的血浆FVIIa的18％。当两种蛋白质以等摩尔(5nM)浓度加入时，FXa生成速率在观察到的个体蛋白质之间的中间，说明hI-con1与血浆FVIIa竞争有限量的TF(图2)。这些数据还表明，hI-con1与血浆FVIIa具有相似的对TF的亲和力。

正常人血浆中凝血酶的生成：FVIIai的作用

推测由于外在FXase中的hI-con1组织因子(TF)复合物的低活性，hI-con1可以通过结合TF成为低效复合物并阻止血浆FVIIa和TF之间形成有效复合物而起到抑制剂的作用。为了测试该假设，评价了已知的凝血抑制剂(即活性位点抑制的FVIIa(Kjalke etal.1997))对正常人血浆中凝血酶的生成的效果。1nM浓度的FVIIai对脂化的人TF起始的凝血酶生成没有影响(图3)。然而在10nM，FVIIai延长了凝血酶生成的滞后期并且显著抑制了凝血酶生成的最大速率和所产生的凝血酶的最大水平。在没有TF的情况下未观察到凝血酶的生成。

正常人血浆中凝血酶的生成：hI-con1的作用

将hI-con1滴定至用TF起始以生成凝血酶的正常人血浆中。使用了各种浓度的hI-con1，然而即使在极高的hI-con1浓度下(1μM)，没有观察到凝血酶生成的抑制(图4)。

先天性FVII缺陷型人血浆中凝血酶的生成

将脂化的人TF添加到先天性FVII缺陷型血浆后，未观察到凝血酶生成，这说明血浆中没有可检测到的功能性FVIIa(图5)。一并添加0.1nM血浆FVIIa和TF产生的凝血酶生成谱(profile)略低于正常人血浆中观察到的生成谱。在TF存在下单独添加0.1nM的hI-con1导致开始生成凝血酶，然而该过程显著被延迟和抑制(图5)。这一结果与外在FXase中观察到的低hI-con1活性相一致。在等摩尔浓度(0.1nM)下添加血浆FVIIa和hI-con1两者并不损害仅用血浆FVIIa引发的凝血酶生成。

正常兔血浆中凝血酶生成

用脂质化的兔TF起始兔血浆中的凝血酶生成。向该血浆中添加1nM的hI-con1对凝血酶生成没有显著影响(图6)。类似地，当添加10nM FVIIai时没有观察到显著影响。在更高hI-con1浓度(10-1000nM)下，观察到一些凝血酶生成抑制。然而未添加TF的对照实验导致凝血酶生成，说明TF的内源性存在。

离心的兔血浆中的凝血酶生成

对兔血浆离心后，内源性凝血酶生成活性并未完全消失，但显著降低(图7)。当添加10nM FVIIai时，没有观察到TF-引发的凝血酶生成的抑制。类似地，当添加1-100nM的hI-con1时没有观察到抑制，并且当添加高浓度(1μM)的hI-con1时仅观察到凝血酶生成的有限降低(图7)。这些数据说明在生理上相关的浓度下，hI-con1不与兔FVIIa竞争兔TF。

结论

在柠檬酸血浆环境中hI-con1不与血浆FVIIa竞争TF。在用人TF起始的人血浆中或在用兔TF起始的兔血浆中，hI-con1对凝血酶生成没有显著影响(如果有影响的话)。hl-conl不太可能导致出血或血栓形成并发症。

实施例2-hI-con1治疗猪中脉络膜新血管形成的作用

在本研究中，研究了猪湿性AMD模型(Kiilgaard et al.,2005.Acta.Ophthalmol.Scand.83,pp.697-704,出于所有目的通过引用以其整体并入本文)中hI-con1的活性和该活性的最佳剂量。此外，确定了通过玻璃体内注射施用时hI-con1的安全性。

在本研究中，证明了hI-con1的玻璃体内注射导致了在该猪模型中已建立的激光诱导的CNV的破坏。hI-con1注射是良好耐受的并且效果与剂量有关，其中ED₅₀为13.5μg/剂量。测试了hI-con1(100kDa)的主要分解产物，并且也是良好耐受和有效的，其中ED₅₀为16.2μg/剂量。

测试物品(Test Articles)

hI-con1

hI-con1由Laureate Pharma Inc.,201E.College Ave,Princeton,NJ,0854提供。hI-con1在-70℃保持冷冻直至使用：Lot PURIC1 080402(SEC Fr10-14)，两个小瓶，其各自含有200μL在配置缓冲液(15mM HEPES,150mM NaCl,5mM CaCl₂,25mM精氨酸,0.01％吐温80,pH 7.4)中的2.0mg/mL,1.0mg/mL,0.5mg/mL和0.25mg/mL。

hI-con1的100kD片段

以下hI-con1的100kD片段的样品由Laureate Pharma Inc.201E.College Ave,Princeton,NJ,08540提供。该片段在-70℃保持冷冻直到使用：Lot PURIC1 080402(SEC Fr15)，两个小瓶，其各自含有200μL在配置缓冲液(15mM HEPES,150mM NaCl,5mM CaCl₂,25mM精氨酸,0.01％吐温80,pH 7.4)中的2.0mg/mL,1.0mg/mL,0.5mg/mL和0.25mg/mL。

对照物品

将配置缓冲液(15mM HEPES,150mM NaCl,5mM CaCl₂,25mM精氨酸,0.01％吐温80,pH 7.4)用作媒介物对照。

测试动物

进行了两项研究，各自具有5个组(每个测试物品一个组)，尤卡坦(Yucatan)小型猪(野猪)，10–12周龄，每头重约20公斤，购自Professional Veterinary Research(Brownstown,IN,USA)。

饲养

每头猪在容纳四头猪的公共环境内的隔开的笼子中饲养。照明由电脑控制，并设置为上午6点至下午6点的周期。温度平均值为70-72°F，其中变化为+/-1度。湿度保持在30-70％，其中平均湿度等于33％。动物由大型动物饲养监督员和持照兽医技术人员在抵达时进行评估并且由持照兽医技师每周一次进行评估，直到将它们安乐死。兽医对动物进行评估以确定是否有任何异常或担忧。实验前将动物隔离约1周。

饲料和水

每日向微型猪提供饲料和水。将它们安置在作为饲料补充物的干草上。饲料为Purina#5084，实验室猪饲养生长物膳食，由Purina Mills,LLC,555Maryville UniversityDrive,Suite 500,St.Louis,Missouri 63141生产，并以每天2％的体重喂食。水是0.5微米过滤的自来水。除了水务公司外，并没有对污染物进行常规分析，并且报告每年进行审查。

物种的理由

hI-con1具有有限的跨物种活性并且猪是少数实验室动物种类中hI-con1在其中具有活性的一种。猪的玻璃体腔约3mL，允许玻璃体内注射合理量的测试物品。除了与人类黄斑类似的视网膜的几个视锥主要区域之外，猪眼具有与人类视网膜血管相似性。

方法

激光诱导的脉络膜新血管形成

在全身麻醉下，用1％托品酰胺和2.5％去氧肾上腺素扩张动物的瞳孔。使用双频YAG激光(532nm)的间接检眼镜以使用2.2D镜头和以下激光参数每眼递送74个点(spot)：激光功率1000–1500mW、持续时间0.1秒和重复率500毫秒。将激光治疗设计为产生布鲁赫膜的微破裂(microrupture)，在两周内在60-70％的激光点生成CNV(Bora et al.,2003,出于所有目的通过引用以其整体并入本文)。

实验设计

在下表3中总结了实验设计。

在第0天，在两个组每组5头猪的双眼中诱导脉络膜新血管形成。在第10天，如表3所示，将0.25、0.5、1.0或2.0mg/mL的hI-con1的100μL溶液(研究1)或者其100kD片段的100μL溶液(研究2)通过玻璃体内注射施用至猪的双眼中。在第10天，将100μL配置缓冲液通过玻璃体内注射施用至对照猪的双眼中。

测试和对照物品施用

用氯胺酮盐酸盐(40mg/kg)和甲苯噻嗪盐酸盐(10mg/kg)的混合物麻醉动物。使用严格的无菌技术施用注射，所示技术涉及用5％聚乙烯吡咯烷酮-碘溶液擦洗盖子，并用无菌眼罩覆盖该区域。施用无菌盖窥器来保持暴露注射部位。使用于1mL结核菌素注射器上的30号针头，从穿过睫状体平坦部的缘(limbus)2mm处进行所有注射。注射后，将2％环戊通的滴剂和抗生素软膏置于眼中。每天检查动物以下征兆：结膜注射、增加的眼内压、前葡萄膜炎玻璃体炎，或眼内炎，并且在第14天处死动物。

终点程序

在第14天，将猪用氯胺酮和甲苯噻嗪的8:1混合物麻醉并用10mL含有3mg/mL荧光素标记的葡聚糖(具有平均分子量2x 10⁶)(Sigma,St.Louis,MO,USA)的PBS通过耳静脉灌注。摘下眼睛并且在睫状体平坦部(pars plana)制造四个刺伤切口，接着在4％多聚甲醛中4℃下固定12小时。移除角膜和晶状体，并且从眼罩(eyecup)解剖神经感觉视网膜并且从眼罩边缘到赤道(equator)四个径向切口。从巩膜分离脉络膜-视网膜色素上皮(RPE)复合物，并将其平放在Aquamount中的载玻片上，使内表面(RPE)朝上。用针对弹性蛋白的单克隆抗体(Sigma)和Cy3-缀合的的二抗(Sigma)染色平坦底座(flat mounts)并用共聚焦显微镜(Zeiss LSM510,Thornwood,NY,USA)检查。充满葡聚糖缀合的荧光素的血管系统染为绿色，并且鲁赫膜中的弹性蛋白染为红色。通过使用在激光点处和周围收集的一系列z-堆叠图像内的强烈的红色信号的共聚焦显微镜来确定鲁赫膜的水平。鲁赫膜平面以上的分支线性绿色信号表明CNV的存在。在非常严格的标准下将CNV缺乏定义为在所述点中血管中完全缺乏绿色荧光(参见Tezel et al.,2007.Ocular Immunol Inflamm15,pp.3-10)。

统计分析

用卡方检验比较不同剂量的hI-con1或其100kD片段的CNV激光点的百分比。将结果与hI-con1剂量作图以得出最佳拟合曲线，将其用于计算使CNV激光点的分数降低50％的hI-con1的剂量(ED50)。p<0.05的置信水平认为是统计学显著的。

结果

用hI-con1玻璃体腔内治疗对CNV的作用

对照眼中71.9±5.8％的激光点发展出脉络膜新血管形成。在猪眼中第10天单次hI-con1玻璃体内注射(每个剂量n＝2)，在第14天在所有测试的剂量下(即25-200μg)显著减少了视网膜下CNV(表4，图8)。hI-con1的抑制作用与5参数Sigmoidal Weibull曲线良好拟合。导致CNV产生下降50％的剂量(ED50)为13.5μg。

用hI-con1的100kD片段玻璃体内治疗对CNV的作用

对照眼中激光点的85.6±4.1％发展为脉络膜新血管形成。在猪眼中第10天单次玻璃体内注射hI-con1的100kDa片段(每个剂量n＝2)，在第14天在所有测试的剂量下(即25-200μg)显著减少了视网膜下CNV表4，图9)。hI-con1的抑制作用与5参数SigmoidalWeibull曲线良好拟合。导致CNV产生下降50％的剂量(ED50)为16.2μg。

在25-200μg的剂量下玻璃体内注射hI-con1及其100kD片段引起注射施用后4天预先存在的激光诱导的CNV的显著消退。病变对注射的响应明显是剂量相关的，其分别具有13.5和16.2μg的ED₅₀剂量。这些结果表明hI-con1的100kD片段的比活性与完整分子的比活性的相似。大于100μg的剂量具有非常小的CNV的额外降低；因此该模型中的有效剂量为≤100μg。

实施例3-使用正常人组织的hI-con1的组织交叉反应性研究

本研究中，在标准的组织交叉反应性(TCR)研究中，使用标准免疫组化(IHC)技术评估hI-con1与正常人组织的结合。利用单批次的生物素化的hI-con1对正常人类组织以及阳性和阴性对照人类组织进行IHC染色来进行该研究。阳性染色结果指示与将hI-con1体内施用至人类相关的潜在毒性。

本研究中，仅在阳性对照结肠癌肿瘤中观察到组织染色。所有其他正常人体组织均未显示免疫反应性。这些发现表明h1-con1结合是特异于异常组织的，其中没有观察到与正常组织的结合。

实施例4-评估hI-con1与脂质化的组织因子的结合

为了允许跨物种比较，进行了hI-con1和hFVIIa与人脂质化的TF(hTF)和兔脂质化的TF(rTF)结合的动力学Biacore研究。

如下面详细描述的，hI-con1和hFVIIa两者以高亲和力地且大致相等的亲和力地与脂质化的hTF结合。

材料和方法

脂质化的兔组织因子(rTF；产品号#4520L；批号#051017)购自AmericanDiagnostica。脂质化的人组织因子(hTF；Lot FIL105HO1)由Marin BiologicalLaboratories,378Bel Marin Keys,Novato,CA 94949提供。

hI-con1；1ml；100μg/ml；MW 157kDa

人FVIIa；批号#A09050525(Fitzgerald)；1.01mg/ml；40μL/小瓶；MW 50kDa

仪器：Biacore 3000；CM5传感器芯片

使用蛋白脂质体固定化(胺偶联)方案的GE程序以在流动池2上包被PS/PC/rTF，并且在流动池3上包被PS/PC/hTF。用运行缓冲液(15mM Hepes,150mM NaCl,5mM CaCl₂,25mM精氨酸,0.01％吐温80,pH7.4)以5μL/min的流动速率平衡流动池。通过在传感器芯片上平行地连续流过溶于运行缓冲液(15mM Hepes,150mM NaCl,5mM CaCl₂,25mM精氨酸,0.01％吐温80,pH7.4)中增加的浓度的每种分析物(0-10nM)5分钟，然后以30μL/min的流动速率10分钟解离时间，来在37℃下进行动力学分析。

通过从流动池2和3中减去参考流动池1中记录的RU值来确定分析物与脂质化的TF的结合。实时监测分析物与TF的结合以获得结合(ka)和解离(kd)速率。从观察到的ka和kd计算平衡解离常数(KD)。

用溶于HEPES缓冲液(20mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4)中的10mM EDTA脉冲芯片3分钟来再生芯片。

将rTF捕获到芯片上-通过胺偶联用兔TF(>共振单位[RU]10,000)包被流动池2。通过胺偶联用人TF(>RU 8,000)包被流动池3。

测定待捕获在芯片上测试配体(RL)的量

本实验中，用于测量配体-分析物相互作用的期望水平的R_Max基于通过以下测量的值：先前的实验中以10,000个共振单位(“RU”)捕获的rTF给出hI-con1与15RU的R_Max的结合以及以8,000RU捕获的hTF给出hI-con1与10RU的R_Max。芯片上捕获的分析物的量取决于相互作用蛋白质的分子量。其由以下公式确定：

R_Max＝MW_A/MW_L·R_L

MW_A是分析物的分子量(对于hI-con1为157kDa，对于hFVIIa为50kDa，以及对于IgG1为150kDa)。

MW_L是配体的分子量，在本测定中，预计会非常大(35kDa的倍数)。

抗体溶液的流动速率

用于捕获配体的流动速率为10μL/min。

对于动力学分析，使用30μL/min的流动速率。

动力学分析

基于分析物的饱和浓度，使用对于兔TF的0-500nM的饱和分析物浓度以及对于人TF的0-50nM的饱和分析物浓度进行结合分析。在实际的传感图与计算的结合和解离速率之间进行卡方(χ²)分析以确定分析的准确性。

认为χ²值直到2是显著的(精确的)并且低于1是高度显著的(高度精确的)。

结果

下表6提供了Biacore测定结果。

如下表7所示，hI-con1和hFVIIa两者都对脂质化的hTF具有高且近似相等的亲和力。两种配体还以低约10倍的亲和力与脂质化的rTF结合。

实施例5-评价患有年龄相关性黄斑变性继发性CNV的患者中评价hI-con1的随机、双盲、多中心、活性对照(active-control)研究

本研究中，评估了与患有年龄相关性黄斑变性(AMD)继发性脉络膜新血管形成(CNV)患者中兰尼单抗(LUCENTIS)单一疗法相比，作为单一疗法施用玻璃体内注射hI-con1或将其与兰尼单抗组合的安全性。

另外，评估了与兰尼单抗单一疗法相比，作为单一疗法或与兰尼单抗(LUCENTIS)组合的hI-con1的生物学活性和药效学作用。

呈现于本实施例中的研究是随机、双盲、多中心、活性对照的研究。本实验中入组的患者对CNV的治疗是初始的。将患者以1：1：1的比率随机分配到选定研究眼中的以下三个治疗组之一：

●hI-con1单一疗法(0.3mg)+假注射

●兰尼单抗单一疗法(0.5mg)+假注射

●hI-con1(0.3mg)+兰尼单抗(0.5mg)组合疗法

通过研究的眼睛中基线处的最佳矫正视力(BCVA)字母得分(≤54字母对(versus)≥55字母)和通过研究位点来随机分级(stratified)。

每次注射访视(visit)患者最多可接受两次玻璃体内注射。为了维持治疗组之间的研究遮蔽(study mask)，对接受单一疗法的患者采用假注射。

患者在第0、1和2个月在研究的眼睛中每四周一次施用玻璃体内注射。自第3个月起(在第3、4和5个月)，基于患者个体观察到的治疗反应，根据患者分配的治疗组再治疗(retreat)治疗患者。受遮蔽的(masked)研究者使用以下再治疗标准(基于个体患者的反应种类)来确定在这些访视中是否需要治疗：

●与之前预定访视相比，由于AMD而丢失≥5个BCVA的字母。

●与之前预定访视相比，独立于BCVA改变的CNV活性增加的任何解剖学证据(如新的或增加的液体和/或渗漏、出血)。

●与基线(访视2)相比没有BCVA变化，但存在持续CNV活性的解剖学证据(例如与基线相比的相同的持续性液体和CST)。

如果出现以下状况之一，则在6个月治疗期间的任何时间以及后续期间向研究的眼睛施用0.5mg兰尼单抗的抢救性治疗作为附加疗法：

●与基线(访视2)相比由于AMD而丢失≥15个BCVA的字母。

●由于两次连续访视确定的AMD而从BCVA基线(访视2)丢失≥10个字母。要求相较于基线的丢失≥10个字母的患者在7天内或者尽快返回以在不定期的访视中进一步跟进。

受遮蔽的医师将根据上述标准作出是否需要抢救治疗的决定。

如果在定期注射访视期间向研究的眼睛施用抢救治疗以确保维持研究遮蔽，则未遮蔽的医师施用抢救疗法以及患者的定期研究治疗/再治疗如下：

●hI-con1单一疗法组：hI-con1(0.3mg)+抢救疗法(0.5mg兰尼单抗)。

●兰尼单抗单一疗法组：兰尼单抗(0.5mg)+假注射。

●组合疗法：hI-con1(0.3mg)+兰尼单抗(0.5mg)。

如果在不定期的访视中对研究的眼睛进行抢救治疗，则需要未受遮蔽的医师施用抢救治疗。

如果向研究的眼睛施用抢救治疗，根据所分配的随机组，病人按照方案继续进行下次访视的研究访视计划并继续接受研究治疗。

通过追踪以下不良事件来评价安全性：临床实验室检查(血清化学，血液学和凝血)、生命体征测量、简短的检查、裂隙灯生物显微镜、眼内压(IOP)和扩张的眼底镜检查。依靠BCVA手段，通过ETDRS视力表、谱域光学相干断层扫描术(sdOCT)、彩色眼底摄影(CFP)、眼底荧光血管造影(FA)、眼底自体荧光(FAF)、对比敏感度和微视野来测量药效学和生物学活性。通过测量hI-con1和抗药物抗体的血浆浓度的手段来评价药代动力学(PK)和免疫原性。

*********

尽管已经参考其具体实施方案描述了所描述的发明，本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以用等同物替代。另外，可以对所描述的发明的客观精神和范围进行许多修改以采用特定情况、材料、物质组成、工艺、工艺步骤或步骤。所有这些修改意图在所附权利要求的范围内。

出于所有目的，本文引用的专利、专利申请、专利申请公开物，期刊文章和方案通过引用以其整体并入。

序列表

<110> 埃科尼克医疗股份有限公司

Burian, Gabriela

Greene, William

Dornbush, Kirk

<120> 治疗与血管发生和新血管形成相关的病症的方法

<130> ICTH-001/01WO

<150> US 62/195,709

<151> 2015-07-22

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2072

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人因子VII活性位点突变体免疫缀合物mRNA，

完整cds

<400> 1

aagctttgca gagatttcat catggtctcc caggccctca ggctcctctg ccttctgctt 60

gggcttcagg gctgcctggc tgcagtcttc gtaacccagg aggaagccca cggcgtcctg 120

caccggcgcc ggcgcgccaa cgcgttcctg gaggagctgc ggccgggctc cctggagagg 180

gagtgcaagg aggagcagtg ctccttcgag gaggcccggg agatcttcaa ggacgcggag 240

aggacgaagc tgttctggat ttcttacagt gatggtgacc agtgtgcctc aagtccatgc 300

cagaatgggg gctcctgcaa ggaccagctc cagtcctata tctgcttctg cctccctgcc 360

ttcgagggcc ggaactgtga gacgcacaag gatgaccagc tgatctgtgt gaacgagaac 420

ggcggctgtg agcagtactg cagtgaccac acgggcacca agcgctcctg tcggtgccac 480

gaggggtact ctctgctggc agacggggtg tcctgcacac ccacagttga atatccatgt 540

ggaaaaatac ctattctaga aaaaagaaat gccagcaagc cccaagggcg aattgtgggg 600

ggcaaggtgt gccccaaagg ggagtgtcca tggcaggtcc tgttgttggt gaatggagct 660

cagttgtgtg gggggaccct gatcaacacc atctgggtgg tctccgcggc ccactgtttc 720

gacaaaatca agaactggag gaacctgatc gcggtgctcg gggagcacga cctcagcgag 780

cacgacgggg atgagcagag ccggcgggtg gcgcaggtca tcatccccag cacgtacgtc 840

ccgggcacca ccaaccacga catcgcgctg ctccgcctgc accagcccgt ggtcctcact 900

gaccatgtgg tgcccctctg cctgcccgaa cggacgttct ctgagaggac gctggccttc 960

gtgcgcttct cattggtcag cggctggggc cagctgctgg accgtggcgc cacggccctg 1020

gagctcatgg tcctcaacgt gccccggctg atgacccagg actgcctgca gcagtcacgg 1080

aaggtgggag actccccaaa tatcacggag tacatgttct gtgccggcta ctcggatggc 1140

agcaaggact cctgcgcggg ggacagtgga ggcccacatg ccacccacta ccggggcacg 1200

tggtacctga cgggcatcgt cagctggggc cagggctgcg caaccgtggg ccactttggg 1260

gtgtacacca gggtctccca gtacatcgag tggctgcaaa agctcatgcg ctcagagcca 1320

cgcccaggag tcctcctgcg agccccattt cccggatccg cagagcccaa atcttgtgac 1380

aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 1440

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1500

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1560

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1620

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1680

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1740

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1800

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1860

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1920

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1980

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 2040

tccctgtctc cgggtaaatg ataagcggcc gc 2072

<210> 2

<211> 641

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人因子VII突变体免疫缀合物AA序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> May be glutamic acid or a post translationally modified gamma

carboxy-glutamic acid (GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (25)..(25)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (26)..(26)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (29)..(29)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (52)..(52)

<223> 可能是O-糖基化的位点

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (60)..(60)

<223> 可能是O-糖基化的位点

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (145)..(145)

<223> 可能是N-糖基化的位点

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (322)..(322)

<223> 可能是N-糖基化的位点

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (491)..(491)

<223> 可能是N-糖基化的位点

<400> 2

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys

20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp

35 40 45

Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln

50 55 60

Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly

85 90 95

Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys

100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr

115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg

130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro

145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln

165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala

180 185 190

His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu

195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg

210 215 220

Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn

225 230 235 240

His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp

245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr

260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu

275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg

290 295 300

Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser

305 310 315 320

Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser

325 330 335

Lys Asp Ser Cys Ala Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr

340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys

355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile

370 375 380

Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu

385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

405 410 415

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

420 425 430

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

435 440 445

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

450 455 460

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

465 470 475 480

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

485 490 495

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

500 505 510

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

515 520 525

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

530 535 540

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

545 550 555 560

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

565 570 575

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

580 585 590

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

595 600 605

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

610 615 620

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

625 630 635 640

Lys

<210> 3

<211> 641

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人因子VII突变体免疫缀合物AA序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (19)..(19)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)..(20)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (25)..(25)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (26)..(26)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (29)..(29)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (34)..(34)

<223> 可能是谷氨酸或后转录修饰的gamma羧基-谷氨酸(GLA)

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (52)..(52)

<223> 可能是O-糖基化的位点

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (60)..(60)

<223> 可能是O-糖基化的位点

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (145)..(145)

<223> 可能是N-糖基化的位点

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (322)..(322)

<223> 可能是N-糖基化的位点

<220>

<221> CARBOHYD

<222> (491)..(491)

<223> 可能是N-糖基化的位点

<400> 3

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys

20 25 30

Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp

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Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln

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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly

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Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys

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Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr

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Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg

130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro

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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln

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Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala

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His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu

195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg

210 215 220

Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn

225 230 235 240

His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp

245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr

260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu

275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg

290 295 300

Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser

305 310 315 320

Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser

325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr

340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys

355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile

370 375 380

Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu

385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

405 410 415

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

420 425 430

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

450 455 460

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

465 470 475 480

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

485 490 495

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

500 505 510

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

515 520 525

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

530 535 540

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

545 550 555 560

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

565 570 575

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

580 585 590

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

595 600 605

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

610 615 620

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

625 630 635 640

Lys

<210> 4

<211> 2057

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人因子VII突变体免疫缀合物AA序列的编码序列

<400> 4

ggatccacca tggtgtcaca agccctccgc ctgctctgcc tccttctcgg acttcaagga 60

tgtctggccg cagtgttcgt gactcaagaa gaggcccacg gggtgctgca ccggaggcgc 120

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ggaactctga tcaacaccat ctgggtggtg tcggcagctc actgctttga taagattaag 720

aactggcgga acctgatcgc ggtgcttggc gaacatgacc tgtccgaaca cgacggggac 780

gagcagtccc ggagagtggc ccaggtcatc attccatcca cctacgtgcc ggggaccaca 840

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ccgctctgcc tgcccgagcg cacctttagc gagcgcaccc tggccttcgt gcgcttctcc 960

ctggtgtccg gctggggaca gctgctggac agaggcgcca ccgccctgga actgatggtg 1020

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ggtattgtgt cctggggaca gggctgcgcc accgtgggac atttcggcgt gtacacaagg 1260

gtgtcacagt acatcgaatg gttgcagaag ctcatgcgca gcgaacctcg cccgggagtg 1320

ctcctgaggg cccctttccc cggaagcgct gagcctaaga gctgcgacaa gacccacact 1380

tgtccgccat gccccgcgcc cgaactgctg ggtggcccat ccgtgttcct gttcccgcct 1440

aagcccaagg acaccctgat gatttcgcgg acccccgaag tgacttgcgt ggtggtggac 1500

gtcagccacg aagatccgga agtcaagttc aattggtacg tggatggcgt cgaagtccat 1560

aacgccaaga ccaagccccg cgaggagcag tacaattcca cttaccgggt ggtgtccgtg 1620

ttgaccgtgt tgcaccagga ctggctgaac ggaaaggaat acaagtgcaa agtgtcgaat 1680

aaggccctcc cggccccgat cgagaaaacg atctccaagg ccaagggcca gcctcgggag 1740

ccccaggtct acaccttgcc gccgtcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtgtcactc 1800

acctgtctcg tcaaggggtt ctacccttcc gacatcgccg tggaatggga gtcgaacggg 1860

cagccggaaa acaattacaa gaccactcct cctgtcctgg attccgacgg gtcattcttc 1920

ctgtactcaa agctgaccgt ggacaagagc agatggcaac agggcaacgt gttcagctgc 1980

tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctctctccc 2040

ggaaaatgag cggccgc 2057

<210> 5

<211> 2057

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人因子VII突变体免疫缀合物AA序列的编码序列

<400> 5

tctagaccac catggtgtca caagccctcc gcctgctctg cctccttctc ggacttcaag 60

gatgtctggc cgcagtgttc gtgactcaag aagaggccca cggggtgctg caccggaggc 120

gccgcgcgaa cgcctttctg gaggagctgc ggccaggctc gctggaaaga gagtgcaaag 180

aggagcaatg ctccttcgag gaggccagag aaattttcaa ggacgccgaa cggactaagc 240

tgttttggat ctcatacagc gacggcgacc agtgtgccag cagcccgtgc cagaacggcg 300

gttcgtgcaa ggaccagctg cagtcctaca tttgtttctg cctgccggcg ttcgaaggaa 360

gaaactgtga aacccacaag gatgaccagc tgatctgcgt gaacgagaac ggaggctgcg 420

aacagtactg ctccgaccac acggggacta agaggagctg cagatgccat gagggctata 480

gcctgctggc cgacggggtg tcctgcactc cgactgtgga atacccgtgc ggaaagatcc 540

ccatcctgga gaagcggaac gcatccaagc cccaaggacg aattgtcggc ggaaaggtct 600

gccctaaggg agagtgtcct tggcaagtgc tcctcttggt gaacggagcg cagctttgcg 660

gcggaactct gatcaacacc atctgggtgg tgtcggcagc tcactgcttt gataagatta 720

agaactggcg gaacctgatc gcggtgcttg gcgaacatga cctgtccgaa cacgacgggg 780

acgagcagtc ccggagagtg gcccaggtca tcattccatc cacctacgtg ccggggacca 840

caaaccacga catcgccttg ctgcggctgc accagccggt ggtccttacc gatcacgtcg 900

tgccgctctg cctgcccgag cgcaccttta gcgagcgcac cctggccttc gtgcgcttct 960

ccctggtgtc cggctgggga cagctgctgg acagaggcgc caccgccctg gaactgatgg 1020

tgctgaacgt gccacggctc atgacccaag attgtctgca gcagtcgcgc aaagtcgggg 1080

attcaccgaa catcaccgag tacatgttct gcgccggtta ctccgatgga tcgaaggact 1140

cgtgcgctgg agactccggt ggaccccatg ctacccatta tcgcggtact tggtacctga 1200

ctggtattgt gtcctgggga cagggctgcg ccaccgtggg acatttcggc gtgtacacaa 1260

gggtgtcaca gtacatcgaa tggttgcaga agctcatgcg cagcgaacct cgcccgggag 1320

tgctcctgag ggcccctttc cccggaagcg ctgagcctaa gagctgcgac aagacccaca 1380

cttgtccgcc atgccccgcg cccgaactgc tgggtggccc atccgtgttc ctgttcccgc 1440

ctaagcccaa ggacaccctg atgatttcgc ggacccccga agtgacttgc gtggtggtgg 1500

acgtcagcca cgaagatccg gaagtcaagt tcaattggta cgtggatggc gtcgaagtcc 1560

ataacgccaa gaccaagccc cgcgaggagc agtacaattc cacttaccgg gtggtgtccg 1620

tgttgaccgt gttgcaccag gactggctga acggaaagga atacaagtgc aaagtgtcga 1680

ataaggccct cccggccccg atcgagaaaa cgatctccaa ggccaagggc cagcctcggg 1740

agccccaggt ctacaccttg ccgccgtccc gggatgagct gaccaagaac caggtgtcac 1800

tcacctgtct cgtcaagggg ttctaccctt ccgacatcgc cgtggaatgg gagtcgaacg 1860

ggcagccgga aaacaattac aagaccactc ctcctgtcct ggattccgac gggtcattct 1920

tcctgtactc aaagctgacc gtggacaaga gcagatggca acagggcaac gtgttcagct 1980

gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg tccctctctc 2040

ccggaaaatg aaccggt 2057

Claims

1.治疗有此需要的患者的眼中湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)的方法，其包括在多个给药期间向所述患者施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的组合物，其中所述二聚体的单体亚基各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白。

2.权利要求1的方法，其中治疗所述湿性AMD包括预防、抑制或逆转需要治疗的患者的眼中的脉络膜新血管形成。

3.预防、抑制或逆转有此需要的患者的眼中的眼新血管形成的方法，其包括在多个给药期间向所述患者施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的组合物，其中所述二聚体的单体亚基各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白。

4.在有此需要的患者中逆转肿瘤新血管形成的方法，其包括在多个给药期间向所述患者施用包含有效量的免疫缀合物二聚体的组合物，其中所述二聚体的单体亚基各自包含与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc结构域缀合的突变的人因子VIIa(fVIIa)蛋白。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述免疫缀合物二聚体是同二聚体。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述免疫缀合物二聚体是异二聚体。

7.权利要求5或6的方法，其中所述免疫缀合物的至少一个单体亚基包含含有在Lys341或Ser344处的单点突变的突变的人fVIIa结构域。

8.权利要求7的方法，其中所述单点突变是突变为Ala残基。

9.权利要求8的方法，其中所述单点突变是Lys341突变为Ala341。

10.权利要求8的方法，其中所述单点突变是Ser344突变为Ala344。

11.权利要求3和5-10的方法，其中所述眼新血管形成与以下相关：增殖性糖尿病视网膜病变、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病(ROP)，或新生血管性青光眼。

12.权利要求3和5-10中任一项的方法，其中所述眼新血管形成是增殖性糖尿病视网膜病变、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病(ROP)，或新生血管性青光眼继发性的。

13.权利要求3和5-10中任一项的方法，其中所述眼新血管形成是脉络膜新血管形成。

14.权利要求13的方法，其中所述患者以前曾被诊断为患有眼中的湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)。

15.权利要求13的方法，其中所述脉络膜新血管形成是湿性AMD继发性的。

16.权利要求14或15的方法，其中所述患者的眼以前没有进行脉络膜新血管形成或湿性AMD的治疗。

17.权利要求14或15的方法，其中所述患者以前已经用抗血管内皮生长因子(VEGF)疗法、激光疗法或手术治疗脉络膜血管形成。

18.权利要求1-3和5-17中任一项的方法，其中施用包括在每个给药期间玻璃体内注射所述组合物。

19.权利要求1-3和5-17中任一项的方法，其中施用包括在每个给药期间脉络膜上注射所述组合物。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述多个给药期间包含2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个给药期间。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中每个给药期间间隔约20天至约50天、或约20天至约40天、或约20天至约30天。

22.权利要求20或21中任一项的方法，其中所述多个给药期间包含12至24个给药期间。

23.权利要求20-22中任一项的方法，其中施用包括每28天、每30天或每35天将所述组合物玻璃体内注射到所述患者的眼中。

24.权利要求1-5和7-23中任一项的方法，其中所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。

25.权利要求24的方法，其中所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

26.权利要求24的方法，其中所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

27.权利要求24的方法，其中所述免疫缀合物由包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列编码。

28.权利要求24的方法，其中所述免疫缀合物由包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列编码。

29.权利要求4-10和20-28中任一项的方法，其中施用包括静脉内施用。

30.权利要求4-10和20-28中任一项的方法，其中施用包括肿瘤内注射。

31.权利要求1-3和5-28中任一项的方法，其中与所述多个给药期间之前所述患者的最佳矫正视力(BCVA)测量相比，所述患者在多个给药期间之后基本维持他或她的视力，如通过BCVA测量中丢失少于15个字母测量的。

32.权利要求1-3和5-28中任一项的方法，其中与所述多个给药期间之前所述患者的最佳矫正视力(BCVA)相比，所述患者在多个给药期间之后经历视力改善，如通过BCVA测量中获得15个字母测量的。

33.权利要求1-3、5-28和31-32中任一项的方法，其中与开始治疗之前的CNV面积相比，在所述多个给药期间之后或者一个或多个给药期间之后，所述患者的眼中的CNV面积是减少的，如通过荧光素血管造影术或光学相干断层扫描术测量的。

34.权利要求33的方法，其中所述CNV面积减小至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。

35.权利要求1-3、5-28和31-34中任一项的方法，其中与开始治疗之前的眼视网膜厚度相比，所述多个给药期间或其子集(subset)之后，所述患者的眼视网膜厚度是减少的。

36.权利要求34的方法，其中所述视网膜厚度减少至少约50μm、至少约100μm、至少约150μm、至少约175μm、至少约200μm、至少约225μm或至少约250μm。

37.权利要求34的方法，其中所述视网膜厚度减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。

38.权利要求35-37中任一项的方法，其中减少的视网膜厚度是减少的中央视网膜亚区厚度(CST)、减少的中央点厚度(CPT)、或减少的中央凹厚度(CFT)。

39.权利要求18-28和31-38中任一项的方法，其还包括在每次玻璃体内或脉络膜上注射之前测量所述患者眼内的眼内压(IOP)。

40.权利要求18-28和31-39中任一项的方法，其还包括在每次玻璃体内或脉络膜上注射后约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约1小时测量所述患者眼内的IOP。

41.权利要求39的方法，包括在每次玻璃体内或脉络膜上注射之前约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约1小时测量所述患者眼内的IOP。

42.权利要求39-41中任一项的方法，其中通过张力测定法(tonometry)测量所述IPO。

43.权利要求1-42中任一项的方法，其还包括向所述患者施用有效量的新血管形成抑制剂或血管发生抑制剂。

44.权利要求43的方法，其中所述新血管形成抑制剂或所述血管发生抑制剂与有效量的所述免疫缀合物存在于相同组合物中。

45.权利要求43的方法，其中所述新血管形成抑制剂或所述血管发生抑制剂与有效量的所述免疫缀合物存在于不同组合物中。

46.权利要求43-45中任一项的方法，其中所述新血管形成抑制剂是血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、VEGF受体抑制剂、血小板衍生生长因子(PDGF)抑制剂或PDGF受体抑制剂。

47.权利要求46的方法，其中所述新血管形成抑制剂是雷珠单抗(ranibizumab)。

48.权利要求47的方法，其中所述雷珠单抗的剂量为约0.2mg至约1mg。

49.权利要求47或48的方法，其中所述雷珠单抗的剂量为0.3mg或0.5mg。

50.权利要求7-49中任一项的方法，其中经由玻璃体内注射将雷珠单抗施用至所述患者的眼睛。

51.权利要求43-50中任一项的方法，其中将包含有效量的所述新血管形成抑制剂或所述血管发生抑制剂的所述组合物经由玻璃体内注射施用至所述患者的眼睛。

52.权利要求51的方法，其中在所述多个给药期间的每个施用包含有效量的所述新血管形成抑制剂的组合物。

53.权利要求18-22中任一项的方法，其中每个给药期间包括施用约200μg至约400μg的所述免疫缀合物二聚体。

54.权利要求53的方法，其中施用约300μg的所述免疫缀合物二聚体。