KR20150066404A - 각막 이식 거부 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라니비주맙의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식 거부 억제용 결막하주사 조성물, 각막 이식에 의한 부종 억제용 결막하주사 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식 거부 억제용 결막하주사, 각막 이식에 의한 부종 억제용, 혈관신생 억제용, 각막 이식에 의한 각막 혼탁 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 각막이식 거부 및 각막이식 수술에 의해 발생하는 다양한 부작용의 발생을 현저히 감소시켜 각막이식 수술용 결막하 주사제 제조에 효과적이다.

Description

각막 이식 거부 억제용 조성물{Composition for preventing for corneal graft rejection}

본 발명은 라니비주맙의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식 거부 억제용 결막하주사 조성물, 각막 이식에 의한 부종 억제용 결막하주사 조성물에 관한 것이다.

각막이식이란 각막의 여러 가지 질환으로 인한 혼탁을 제거하기 위해 혼탁된 각막을 일부 혹은 전부 떼어내어 공여자의 각막으로 대치, 이식하는 수술을 말한다. 각막은 안구의 가장 앞부분에 위치하며 빛을 통한 상이 눈에 맺힐 때 일차적으로 통과하는 창문과 같은 역할을 하며, 이와 같은 각막이 투명하지 못하면 시축을 통화하는 상이 선명하게 보이지 않게 된다. 이를 수정하기 위하여 각막 이식 수술을 하게 된다. 각막이식 수술은 혼탁된 병변의 침범정도에 따라 전층의 각막을 이식하는 경우(전층각막이식술, penetrating keratoplasty)와 일부분만을 이식하는 경우(층판각막이식술, lamellar keratoplasty)가 있다.

각막이식술 후 수여자의 면역반응에 의해 발생하는 거부반응은 각막이식 실패의 가장 큰 원인이 된다. 각막이식의 동종이식 거부반응에 대한 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았으나 동종이식 거부반응에 있어서 세포매개 면역반응이 중요한 역할을 한다고 믿어지며, T 림프구가 effector cell로서 역할을 한다는 사실도 잘 알려져 있다. 각막이식의 거부반응 억제를 위한 합성약물로는 아직 허가받은 치료제가 없으며, 거부반응을 줄이기 위해서 지금까지 스테로이드, 면역억제제 등을 일반적으로 사용하고 있으나, 이러한 약제들의 장기 사용은 많은 부작용을 유발하여 심각한 문제가 발생하기도 한다.

따라서 각막이식 수술에 따른 거부반응 및 각종 부작용을 줄이기 위한 새로운 방법의 개발이 시급한 실정이다.

라니비주맙(ranibizumab)은 루센티스(Lucentis)라는 상품명으로 판매중인 vascular endothelial growth factor A (VEGF-A)에 특이적으로 결합하는 단클론항체의 단편이다. 라니비주맙은 신생혈관성 (습성) 연령관련 황반변성의 치료, 당뇨병성 황반부종에 의한 시력 손상의 치료, 망막정맥폐쇄성 황반부종에 의한 시력 손상의 치료를 위하여 유리체내 주사제로만 사용되고 있다.

이에 본 발명자들은 라니비주맙을 결막하 주사하는 경우 각막이식 거부 반응인 부종, 신생혈관 생성, 각막불투명이 현저히 감소하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식 거부 억제용 결막하주사 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 부종 억제용 결막하주사 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 혈관신생 억제용 결막하주사 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 혼탁 억제용 결막하주사 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 라니비주맙 및 주사용수를 포함하는 각막 이식 수술용 결막하 주사제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식 거부 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 부종 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 혈관신생 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 각막 혼탁 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 라니비주맙 및 주사용수를 포함하는 각막 이식 수술용 결막하 주사제를 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물은 라니비주맙을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

라니비주맙(ranibizumab)은 루센티스(Lucentis)라는 상품명으로 판매중인 vascular endothelial growth factor A (VEGF-A)에 특이적으로 결합하는 단클론항체의 단편이다. 라니비주맙에 관하여는 미국특허 6,407,213호를 참조할 수 있다.

본 발명의 라니비주맙(ranibizumab)은 상업적으로 판매하는 것을 구입하여 사용할 수 있으며, 공지의 항체 제조방법에 의해 제조하여 사용할 수 있다.

라니비주맙은 노화 관련 시력 상실의 일반적 형태인 습식 연력 관련 황반 변성, 망막정맥폐쇄성 황반부종 치료제 또는 당노병성 황반 부종에 의한 시력손상 치료제로 사용되고 있다. 허가받은 상기 질환을 치료를 위해서는 수정체 아래의 유리체 내에 주사하는 것을 필요로 하고 있으며, 현재 루센티스는 유리체 내 투여 용도로만 허가되어 있다.

그러나 본 발명의 라니비주맙을 각막이식 과정에서 유리체가 아닌 결막하에 주사하는 경우 각막이식거부 억제, 각막이식에 의한 부종 억제 및 각막이식에 의한 혈관신생억제 효능이 우수하다. 이와 같은 효능은 본 발명에서 최초로 공개되는 것이다.

본 명세서의 혈관신생은, 조직내부로 혈관의 새로 성장 및/또는 발달에 관여하는 조직의 혈관화 과정이다. 혈관신생 과정은 혈관이 종래의 혈관으로부터 뻗어나오는 경우, 혈관의 새로운 발달이 전구세포로부터 발생하는 경우 및 존재하는 작은 혈관의 직경이 확장되는 경우가 있다.

부종은 각막의 수분량이 어떤 원인에 의해서 증가된 상태를 말한다.

각막혼탁은 투명한 각막에 뿌옇게 혼탁이 와 투명도가 사라지는 것을 말한다.

따라서 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식 거부 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 부종 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 혈관신생 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 각막 혼탁 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 쥐의 각막을 이식하며, 본 발명의 라니비주맙 또는 대조군을 결막하에 주사하고 부종, 혈관신생, 각막혼탁의 여부를 확인하였다.

그 결과 본 발명의 조성물을 주사한 군의 경우 대조군에 비하여 부종, 혈관신생 및 각막 혼탁이 현저히 감소한 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 쥐의 각막 이식 후 14일 이 지난 시점에서 각막이식 거부율을 측정하였다.

그 결과 본 발명의 조성물을 주사한 군은 각막이식 거부율이 현저히 감소한 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 라니비주맙을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 “약학적으로 유효한 양”이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 각막이식에 따른 부작용인 부종발생, 혈관신생, 각막 혼탁, 또는 각막이식 거부 반응을 억제하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명의 라니비주맙의 약학적으로 유효한 투여량은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기에서 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 바람직하게는 결막하주사되는 것이 바람직하며, 따라서 본 발명은 라니비주맙을 유효성분으로 포함하는 각막이식 수술용 결막하 주사제를 제공한다.

본 발명의 주사제는 결막하에 주사되는 것을 특징으로하며, 결막하에 주사하는 경우 각막이식에 의한 부조, 혈관신생, 각막 혼탁을 억제하고, 각막이식거부 율을 감소시킨다.

본 발명의 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 것으로 바람직하게는 pH 7.0에서 7.5이며 0.9% NaCl이 포함된 멸균 증류수이며 구체예로서, 글루코스 주사, 자일리톨 주사, D-만니톨 주사, 프룩토스 주사, 생리식염수, 덱스트란 40 주사, 덱스트란 70 주사, 아미노산 주사, 링거액, 락트산-링거액 등일 수 있다.

본 발명의 주사제는 바람직하게는 주사용수 100 중량부 당 라니비주맙을 0.1 내지 10 중량부의 비율로 포함할 수 있다.

본 발명의 주사제는 각막이식 부작용을 감소시키는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있으며, 바람직하게는 혈관신생 억제 효능이 있는 화합물과 병행하여 투여할 수 있다. 본 발명과 함께 사용할 수 있는 그외 혈관신생 억제 인자의 예로는, 소판 인자 4; 프로타민 설페이트; 황화(Sulphated) 키틴 유도체(퀸크랩 껍질로부터 제조); 황화 다당류 펩티도글리칸 복합체(SP-PG)(이 화합물의 기능은 에스트로겐과 같은 스테로이드 및 타목시펜 사이트레이트의 존재에 의해 강화될 수 있음); 스타우로스포린(Staurosporine); 매트릭스 대사의 모듈레이터, 예컨대 프롤린 유사체, 시스하이드록시프롤린, d,L-3,4-데하이드로프롤린, 티아프롤린, α,α-디피리딜, 아미노프로피오니트릴 퓨마레이트; 4-프로필-5-(4-피리디닐)-2(3H)-옥사졸론; 메토트렉세이트; 미톡잔트론; 헤파린; 인터페론; 2 마크로글로불린-혈청; ChIMP-3; 키모스타틴; 사이클로덱스트린 테트라데카설페이트; 에포네마이신; 캄프토테신; 푸마길린(Fumagillin); 골드 소듐 티오말레이트(Gold Sodium Thiomalate); 항-콜라게나제-혈청; α2-항플라스민(antiplasmin); 비산트렌(Bisantrene)(National Cancer Institute); 로벤자릿 디소듐(Lobenzarit disodium)(N-(2)-카르복시페닐-4-클로로안트로닐산 디소듐); 탈리도미드(Thalidomide); 안고스타트 스테로이드(Angostaticsteroid); AGM-1470; 카르복시아미노이미다졸; 및, BB94와 같은 메탈로프로테나제 저해제가 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식 거부 억제용 결막하주사, 각막 이식에 의한 부종 억제용, 혈관신생 억제용, 각막 이식에 의한 각막 혼탁 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 각막이식 거부 및 각막이식 수술에 의해 발생하는 다양한 부작용의 발생을 현저히 감소시켜 각막이식 수술용 결막하 주사제 제조에 효과적이다.

도 1은 각막 이식 전 피부이식 사진(A: 동종이식 그룹에서 BN 쥐로부터 수득한 피부를 SD쥐에 이식함; B:피부를 4개의 단속봉합으로 고정시킴; C: 이식 거부된 이식편이 비적합으로 떨어짐).
도 2는 각막 이식 후 평가 결과 그래프이다(A: 부종 스코어; B: 혼탁도 스코어; C: 혈관신생 스코어).
도 3은 각 처리 그룹의 대표적인 사례 사진이다(A: 그룹 1의 신생혈관이 발생한 맑은 각막 이식 사례; B: 그룹 2의 임상 스코어 최고점의 각막 이식 거부 사례; C: 그룹 3의 적은 수의 신생혈관이 발생한 맑은 각막 이식 사례; 노란 화살표(위쪽 화살표): 산동제를 사용하여 확대된 동공; 녹색 화살표(아래쪽 화살표): 신생혈관).
도 4는 각막의 헤마톡실린, 에오신 염색에 의한 조직학적 관찰 사진이다(A: 이식거부된 각막. 수용부 각막(A2, A4)에 비하여 뚜렷한 부종(A3)을 보이며, 염증세포의 침투(A5) 및 신생혈관(A6)이 이식된 각막 경계면(A1)에 나타난다. ; B: 이식거부되지 않은 각막. 이식된 각막에 부종은 보이지 아니하며(B3), 염증세포의 침투는 거의 보이지 아니하며 신생혈관(B6)은 주로 이식면(B1)에서 관찰된다).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

피부 이식을 통한 선감작 후 각막 이식술

8 주령된 브라운 노르웨이(BN) 암컷 쥐와 Spraque 돌리(SD) 암컷 쥐를 찰스 리버 연구소(요코하마, 일본)에서 얻었다. SD쥐를 125㎎/kg 케타민 클로로하이드레이트(UVA , 이브 리 쉬르 센, 프랑스)와 5㎎/㎏ 클로르프로마진(Specia RhPoulenc, 파리, 프랑스)의 혼합물로 마취 하였다. 각 동물은 시험 및/또는 실험전 체계적으로 무게를 달았다. 체중변화는 시간포인트간의 평균체중을 ManneWhitney 테스트를 통하여 비교하는 방법으로 평가하였다.

그 결과 연구 초기 각 그룹의 쥐 평균체중은 그룹 1, 2, 3이 각각 241.4, 252.8, 244.3g으로 조사되었다. 처리 그룹의 평균체중은 연구기간 동안 유의적인 차이를 보이지 않았다(p > 0.1).

SD 쥐는 3개의 상이한 처치 그룹으로 무작위로 배정되었다.

그룹 1, 피부 자가이식, 각막이식술 및 PBS 결막하주사(n=15)

그룹 2, 피부 동종이식, 각막이식술 및 PBS 결막하주사(n=15)

그룹 3, 피부 동종이식, 각막이식술 및 라니비주맙(ranibizumab, Lucentis; Genentech Inc., South San Francisco, CA, USA) 결막하주사(n=15).

피부이식, 각막이식 및 결막하주사는 하기와 같은 방법으로 진행되었다.

<1-1> 피부 이식: 선감작( presensitization )

쥐를 전술한 바와 같이 마취를 하고, 복부가 위로 오게 하여 멸균된 표면에 두었다.

꼬리는 10% 포비돈 요오드로 문질러 닦고, 이식부위(graft bed)는 10mm 길이, 꼬리의 절반 폭으로 피부 조각을 제거하여 준비하였다(도 1A). 동종이식(allograft) 그룹은, BN쥐로부터 분리된 피부를 SD 쥐에 이식하였다. 자가이식(autograft) 그룹은, SD쥐로부터 분리된 피부를 동일한 쥐에 이식하였다. 피부는 4개의 8-0 Vicryl 단속봉합으로 제 위치에 고정 시켰다(도 1B). 피부 이식은 각막이식 2주 전에 진행되었다.

비호환 이식(incompatible graft)은 주로 10 내지 20일 사이에 거부되어 퇴화되고 탈락된다.

<1-2> 쥐의 각막 이식

각막이식을 위한 각막이식술은 전술한 바와 같이, 한명의 각막외과의(KJC)에 의해 수행되었다(Bourges et al., 2006). 요약하면, 희생된 BN쥐로부터 3.0mm의 원형절제기를 사용하여 각막이식편(corneal buttons)을 수득하여 SD 쥐의 왼쪽 눈 안의 2.5mm의 각막 수용부(corneal bed)에 이식하였다. 천자술은 미드린피(Midrin-P, 산텐 제약 (주), 오사카, 일본)를 점안하여 동공을 최대한 확장한 상태에서 원형절제술을 하기 전에 수행되었으며, 전실은 점탄성 액체 (Healon; Abott Medical Optics, IL, USA)로 채워졌다. 3.0mm 원형절제술은 생검펀치를 이용하여 수행되었으며, Vanas 가위로 마무리 되었다. BN 쥐의 각막이식편은 10-0 나일론 봉합사(Ethicon, Saint Stevens-Woluwe, Belgium)로 고정되었다.

플록사신 연고를 수술 부위에 도포하였다. 코르티코스테로이드는 사용되지 않았다. 각막봉합은 4일 후 제거되었다.

모든 동물의 절차는 한국 가톨릭 대학의 윤리위원회의 승인을 받았으며 실험동물의 캐어 및 사용에 대한 국립보건원의 가이드에 따라 수행되었다(NIH publication No. 80_23).

<1-3> 결막하 주사 처치

피부 이식 거부반응이 일어나지 않은 SD 쥐는 다른 쥐로 교체되었다. 이식된 쥐는 14일째 복강에 펜토바르비탈(Ceva SantAnimal, Libourne, France)의 과다주사하여 희생시켰다.

결막하주사 전에 쥐를 마취시켰다. 결막하주사는 외과적 수술 당일, 3, 6, 9 및 12일 경과후 진행되었다. 결막하주사(2ml)는 30게이지 바늘(Insulin Syringe; Sungshim Medical Co., 부천)로 이식된 눈에 실시하였다. 모든 주사는 광학현미경 하에서 각막 윤부로부터 적어도 2mm이상 떨어진 곳에 수행되었다.

< 실시예 2>

거부 프로세스 평가

<2-1> 시험 프로세스

생체현미경 검사 및 이미징은 수술 3, 7, 11 및 14일 후에 시행되었다.

사진촬영시, 동공은 산동제(Midrin-P)로 확대하였으며, 신생혈관이 더 선명하게 보이게 하기 위하여 망막으로부터 적색반사광을 사용하였다.the button area 및 the recipient에서 부종과 투명성 진행 및 신생혈관 성장은 격리된 두 시험자에 의해 전술한 바와 같이 평가되었다(Holland et al., 1991).

<2-2> 평가기준

각막 투명성은 0: 투명 각막(clear cornea); 1: 약간 불투명(slight opacity); 2: 홍체의 세밀함을 볼 수 있는 약한 불투명(mild opacity with iris details visible); 3: 중간, 홍체의 세밀함을 볼 수 없음(moderate, iris details not visible); 4: 백색 각막(white cornea)의 기준으로 평가되었다.

부종은 0: 부종 없음(no edema); 1: 약한 부종(slight edema); 2: 확산 및 중간 기질적 부종(diffuse and moderate stromal edema); 3: 확산 및 두드러진 기질적 부종(diffuse marked stromal edema)의 기준으로 평가되었다.

신생혈관은 0: 관찰되는 신생혈관 없음(no observable growth of new vessels); 1: 신생혈관이 수용부의 1/3 이하를 침범(new vessels invading less than one-third of the recipient bed); 2: 신생혈관이 수용부의 2/3 이하를 침범(new vessels invading less than two-thirds of the recipient bed); 3: 신생혈관이 이식부 주변까지 성장(new vessels growing up to the limiting ring of the graft); 4: 신생혈관이 이식부를 침범(new vessels invading the graft)의 기준으로 평가되었다.

이식은 불투명도 3에서 거부반응이 나타났으며(Holland et al., 1991), 이러한 불투명도는 동종이식에서 나타나는 불투명도보다 큰 것이다(Figueiredo et al., 2002).

거부반응 점수, 평균 임상 점수 및 신생혈관 영역은 ManneWhitney nonparametric test를 사용하여 비교하였다. 각 처리 그룹은 분석전반에 걸쳐 각 그룹의 컨트롤과 비교하였다. 모든 분석은 <0.05 수준을 유의한 것으로 분석하였다. 통계 시험은 SPSS 버전 18(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었다.

<2-3> 거부 프로세스 평가 결과

각 그룹간 각막이식에 대한 예후를 비교 분석 하였다.

피부 동종이식(allograft)군은 89.7%의 이식이 거부되었다. 수술 3, 7, 11 및 14일 후의 불투명도, 부종, 혈관신생 및 각막의 총 점수는 도 2에 기재되었다.

3일째 평균 부종 점수는 그룹 1과 그룹 2 사이(p=0.653) 및 그룹 1과 그룹 3 사이(p=1.0)에 유의적 차이가 없었다. 또한 그룹 2와 그룹 3 사이에도 큰 차이가 없었다(p=0.775, 도 2A).

평균 불투명도 점수는 그룹 1과 그룹2 사이(p=0.935) 및 그룹 1과 그룹 3 사이(p=0.595)에 유의적인 차이가 없었다. 또한 그룹 2와 그룹 3 사이에도 큰 차이가 없었다(p=0.713, 도 2B).

평균 신생혈관 점수는 그룹 1과 그룹 2 사이(p=0.775) 및 그룹 1과 그룹 3 사이(p=0.486)에 유의적인 차이가 없었다. 또한 그룹 2와 그룹 3 사이에도 큰 차이가 없었다(p=0.534, 도 2C).

7일째

평균 부종 점수는 그룹 1과 그룹 2 사이(p=0.074) 및 그룹 1과 그룹 3 사이(p=0.870)에 유의적 차이가 없었다. 그러나 그룹 3은 그룹 2에 비교하여 부종점수가 약간 낮게 평가되었다(p=0.045, 도 2A).

평균 불투명도 점수는 그룹 2가 그룹 1 또는 그룹 3에 비하여 유의적으로 크게 높았다(각각 p=0.002 및 0.002). 그러나 그룹 1과 3 사이에는 유의적인 차이가 없었다(p=0.838, 도 2B).

평균 신생혈관 점수는 그룹 2가 그룹 3에 비하여 유의적으로 크게 높았다(p=0.016). 그러나 그룹 1에 비하여는 별 차이가 없었다(p=0.116). 그룹 1과 그룹2간에는 유의적인 차이가 없었다(p=0.367, 도 2C).

11일째

평균 부종 점수는 그룹 2가 그룹 1 및 그룹 3에 비하여 유의적으로 크게 높았다(각각 p=0.007 및 p<0.001). 또한 그룹 1은 그룹 3에 비하여 유의적으로 높았다(p=0.009, 도 2A).

평균 불투명도 점수는 그룹 2가 그룹 1 또는 그룹 3에 비하여 유의적으로 크게 높았다(각각 p=0.045 및 0.001). 그러나 그룹 1과 3 사이에는 유의적인 차이가 없었다(p=0.202, 도 2B).

평균 신생혈관 점수는 그룹 3이 그룹 1 및 그룹 2에 비하여 유의적으로 크게 낮았다(각각 p=0.005, p<0.001). 그룹 1과 그룹 2사이에는 유의적인 차이가 없았다(p=0.217, 도 2C).

14일째

평균 부종 점수는 그룹 2가 그룹 1 및 그룹 3에 비하여 유의적으로 크게 높았다(각각 p=0.004 및 p<0.001). 또한 그룹 1은 그룹 3에 비하여 유의적으로 높았다(p=0.033, 도 2A).

평균 불투명도 점수는 그룹 2가 그룹 3에 비하여 유의적으로 크게 높았다(각각 p=0.002). 그러나 그룹 1과 2 또는 그룹 1과 3 사이에는 유의적인 차이가 없었다(각각 p=0.106, p=0.174, 도 2B).

평균 신생혈관 점수는 그룹 3이 그룹 1 및 그룹 2에 비하여 유의적으로 크게 낮았다(각각 p=0.021, p<0.001). 그룹 1과 그룹 2사이에는 유의적인 차이가 없았다(p=0.775, 도 2C).

이와 같이 라니비주맙을 결막하주사한 그룹의 경우 다른 그룹에 비하여 각막 이식 후 이식거부반응인 부종, 각막 불투명, 신생혈관 생성이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.

<2-3> 각막이식 거부율 측정

14일째 이식 거부된 각막의 수와 불투명도 점수 3의 수를 측정하였다.

그 결과 그룹 1은 6/15(40%), 그룹 2는 13/15(86.7%)이며, 그룹 3은 4/15(26.7%)으로 조사되었다. 이로서 라니비주맙을 각막이식 과정에서 결막하에 주사하는 경우 각막이식 거부율이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.

도 3은 각 처리 그룹의 대표적인 사례를 나타낸다.

< 실시예 3>

조직학적 검사

14일째 쥐를 희생시켜 21개(그룹당 7개)의 이식된 눈을 적출하여 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 모든 절편(6mm 두께)은 각막의 중심에서 구해졌으며, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었다.

그 결과 조직학적 관찰은 임상 점수에 의해 얻어진 결과와 유사하게 나타났다. 각 그룹의 7개의 각막이 조사되었다.

그룹 2의 경우, 이식 거부된 모든 경우 뚜렷한 이식 각막의 두께 증가와 함께 현저한 염증 세포의 이식 각막으로의 침투를 동반하였다. 이들의 경우 신생혈관이 수용부, 이식부 모든 이식 각막층에 침투하였다(도 4A).

그룹 3의 모든 거부되지 않은 이식각막은 염증세포가 수용부와 이식부 사이의 접촉면에만 침투하였다. 신생혈관은 이식부 각막에서는 발견되지 않았다. 이 경우 이식편의 두께는 변화가 없었다(도 4B).

따라서, 이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식 거부 억제용 결막하주사, 각막 이식에 의한 부종 억제용, 혈관신생 억제용, 각막 이식에 의한 각막 혼탁 억제용 결막하주사 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 각막이식 거부 및 각막이식 수술에 의해 발생하는 다양한 부작용의 발생을 현저히 감소시켜 각막이식 수술용 결막하 주사제 제조에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (7)

1. 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식 거부 억제용 결막하주사 조성물.
   
2. 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 부종 억제용 결막하주사 조성물.
   
3. 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 혈관신생 억제용 결막하주사 조성물.
   
4. 라니비주맙(ranibizumab)을 유효성분으로 포함하는 각막 이식에 의한 각막 혼탁 억제용 결막하주사 조성물.
   
5. 라니비주맙 및 주사용수를 포함하는 각막 이식 수술용 결막하 주사제.
   
6. 제5항의 주사제는 혈관신생 억제 효능이 있는 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 주사제.
   
7. 제2항의 주사제는 주사용수 100 중량부 당 라니비주맙을 0.1 내지 10 중량부의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 주사제.

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