CZ394698A3 - Způsob zabránění tvorby krevní sraženiny a použití Faktoru VII - Google Patents
Způsob zabránění tvorby krevní sraženiny a použití Faktoru VII Download PDFInfo
- Publication number
- CZ394698A3 CZ394698A3 CZ983946A CZ394698A CZ394698A3 CZ 394698 A3 CZ394698 A3 CZ 394698A3 CZ 983946 A CZ983946 A CZ 983946A CZ 394698 A CZ394698 A CZ 394698A CZ 394698 A3 CZ394698 A3 CZ 394698A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- factor
- phe
- factor vii
- blood
- dansyl
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 85
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims abstract description 171
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims abstract description 170
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims abstract description 170
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 claims abstract description 58
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 38
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims abstract description 35
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 208000037891 myocardial injury Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 39
- 230000035602 clotting Effects 0.000 claims description 36
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 claims description 29
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 26
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 claims description 23
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 19
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 19
- -1 halomethyl ketone Chemical class 0.000 claims description 18
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 18
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 17
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 claims description 14
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 12
- UFXAQJOOAQICNE-HKBOAZHASA-N (2r)-2-amino-n-[(2s)-2-[[(3s)-1-chloro-6-(diaminomethylideneamino)-2-oxohexan-3-yl]amino]-3-phenylpropanoyl]-3-phenylpropanamide Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)CCl)C1=CC=CC=C1 UFXAQJOOAQICNE-HKBOAZHASA-N 0.000 claims description 10
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 claims description 10
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 9
- LDMSFLLWFAFZAF-OALUTQOASA-N (4s)-5-[[2-[[(3s)-1-chloro-6-(diaminomethylideneamino)-2-oxohexan-3-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-[[5-(dimethylamino)naphthalen-1-yl]sulfonylamino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(=O)(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)CCl LDMSFLLWFAFZAF-OALUTQOASA-N 0.000 claims description 7
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 7
- BHBIPLOIWQSVID-UHFFFAOYSA-N thiohypofluorous acid Chemical compound SF BHBIPLOIWQSVID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 6
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 230000008338 local blood flow Effects 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 1
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 abstract description 52
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 abstract description 40
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 abstract description 22
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 92
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 79
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 79
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 72
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 42
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 33
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 33
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 28
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 26
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 25
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 23
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 23
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 22
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 22
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 19
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 19
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 19
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 18
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 17
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 16
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 16
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 241000282322 Panthera Species 0.000 description 15
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 15
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 15
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 15
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 15
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 14
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 14
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 14
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 14
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 12
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 12
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 11
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 10
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 10
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010011086 Coronary artery occlusion Diseases 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 9
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 9
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 9
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 9
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 9
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 8
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 8
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 8
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 8
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 8
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 7
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 7
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 7
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 7
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 description 7
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 210000005246 left atrium Anatomy 0.000 description 7
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 7
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 7
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 7
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N (4s)-4-[[(2s,3s)-2-benzamido-3-methylpentanoyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.N([C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 6
- 108010031969 benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide Proteins 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 6
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 6
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 6
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 5
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 5
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 5
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 5
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 229940099816 human factor vii Drugs 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 5
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 5
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KWPACVJPAFGBEQ-IKGGRYGDSA-N (2s)-1-[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]-n-[(3s)-1-chloro-6-(diaminomethylideneamino)-2-oxohexan-3-yl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)CCl)C1=CC=CC=C1 KWPACVJPAFGBEQ-IKGGRYGDSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 4
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 4
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 4
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 4
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 208000001778 Coronary Occlusion Diseases 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 241000393496 Electra Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 3
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 description 3
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 108010065972 tick anticoagulant peptide Proteins 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 3
- PBVBFKPJZFNFNY-UHFFFAOYSA-N 3,4-dichlorobenzene-1,2-diamine Chemical compound NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1N PBVBFKPJZFNFNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WFFZGYRTVIPBFN-UHFFFAOYSA-N 3h-indene-1,2-dione Chemical class C1=CC=C2C(=O)C(=O)CC2=C1 WFFZGYRTVIPBFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 206010003162 Arterial injury Diseases 0.000 description 2
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- LCNXZQROPKFGQK-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LCNXZQROPKFGQK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N His-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 PDSUIXMZYNURGI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 2
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 2
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 2
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 2
- WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N Thr-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 WXVIGTAUZBUDPZ-DTLFHODZSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002506 anticoagulant protein Substances 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 210000002302 brachial artery Anatomy 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- XQGZSYKGWHUSDH-UHFFFAOYSA-N dazoxiben Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1OCCN1C=NC=C1 XQGZSYKGWHUSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950008000 dazoxiben Drugs 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008345 muscle blood flow Effects 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M sodium;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OCC(N)(CO)CO ILXAOQAXSHVHTM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 229940072358 xylocaine Drugs 0.000 description 2
- XHTORJWGZKCDGL-GRGSLBFTSA-N (2s)-1-[(2r,3r)-2-amino-3-methylpentanoyl]-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound CC[C@@H](C)[C@@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XHTORJWGZKCDGL-GRGSLBFTSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N Ala-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NWVVKQZOVSTDBQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DHONNEYAZPNGSG-UBHSHLNASA-N Ala-Val-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 DHONNEYAZPNGSG-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N Arg-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N WVRUNFYJIHNFKD-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DFCIPNHFKOQAME-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFCIPNHFKOQAME-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RWWPBOUMKFBHAL-FXQIFTODSA-N Arg-Asn-Cys Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O RWWPBOUMKFBHAL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- OANWAFQRNQEDSY-DCAQKATOSA-N Arg-Cys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N OANWAFQRNQEDSY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NYZGVTGOMPHSJW-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N NYZGVTGOMPHSJW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KRQSPVKUISQQFS-FJXKBIBVSA-N Arg-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KRQSPVKUISQQFS-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N Arg-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PAPSMOYMQDWIOR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N Arg-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N Arg-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CPTXATAOUQJQRO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- XWGJDUSDTRPQRK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O XWGJDUSDTRPQRK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BZWRLDPIWKOVKB-ZPFDUUQYSA-N Asn-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BZWRLDPIWKOVKB-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- AXXCUABIFZPKPM-BQBZGAKWSA-N Asp-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O AXXCUABIFZPKPM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N Asp-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RKNIUWSZIAUEPK-PBCZWWQYSA-N Asp-His-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O RKNIUWSZIAUEPK-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- HJCGDIGVVWETRO-ZPFDUUQYSA-N Asp-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(O)=O HJCGDIGVVWETRO-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- FIAKNCXQFFKSSI-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FIAKNCXQFFKSSI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N Asp-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- HMVFITKXZCNKSS-UHFFFAOYSA-N CN(C)CCOC Chemical compound CN(C)CCOC HMVFITKXZCNKSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100008044 Caenorhabditis elegans cut-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000001432 Calendula officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005881 Calendula officinalis Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- PRXCTTWKGJAPMT-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PRXCTTWKGJAPMT-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N Cys-Arg Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RGTVXXNMOGHRAY-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N Cys-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N DZSICRGTVPDCRN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LVNMAAGSAUGNIC-BQBZGAKWSA-N Cys-His Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 LVNMAAGSAUGNIC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- CIVXDCMSSFGWAL-YUMQZZPRSA-N Cys-Lys-Gly Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N CIVXDCMSSFGWAL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DTFJUSWYECELTM-BPUTZDHNSA-N Cys-Pro-Trp Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O DTFJUSWYECELTM-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- RJPKQCFHEPPTGL-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RJPKQCFHEPPTGL-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JRZMCSIUYGSJKP-ZKWXMUAHSA-N Cys-Val-Asn Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JRZMCSIUYGSJKP-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 description 1
- SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N Glu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- CKRUHITYRFNUKW-WDSKDSINSA-N Glu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O CKRUHITYRFNUKW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- ZJFNRQHUIHKZJF-GUBZILKMSA-N Glu-His-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZJFNRQHUIHKZJF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SJJHXJDSNQJMMW-SRVKXCTJSA-N Glu-Lys-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O SJJHXJDSNQJMMW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DDXZHOHEABQXSE-NKIYYHGXSA-N Glu-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O DDXZHOHEABQXSE-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 1
- KXRORHJIRAOQPG-SOUVJXGZSA-N Glu-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O KXRORHJIRAOQPG-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OCQUNKSFDYDXBG-QXEWZRGKSA-N Gly-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OCQUNKSFDYDXBG-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- GVVKYKCOFMMTKZ-WHFBIAKZSA-N Gly-Cys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CN GVVKYKCOFMMTKZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XXGQRGQPGFYECI-WDSKDSINSA-N Gly-Cys-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O XXGQRGQPGFYECI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZZWUYQXMIFTIIY-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- PYFIQROSWQERAS-LBPRGKRZSA-N Gly-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 PYFIQROSWQERAS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N His-Asp-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ZJSMFRTVYSLKQU-DJFWLOJKSA-N His-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N ZJSMFRTVYSLKQU-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 1
- MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N His-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- TVTIDSMADMIHEU-KKUMJFAQSA-N His-Cys-Phe Chemical compound N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O TVTIDSMADMIHEU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BSVLMPMIXPQNKC-KBPBESRZSA-N His-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O BSVLMPMIXPQNKC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- DRKZDEFADVYTLU-AVGNSLFASA-N His-Val-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DRKZDEFADVYTLU-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- NCSIQAFSIPHVAN-IUKAMOBKSA-N Ile-Asn-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N NCSIQAFSIPHVAN-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N Leu-Ala-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JUWJEAPUNARGCF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N Leu-Asp-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKNBJXOJTURHCU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N Leu-Ser-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- XZNJZXJZBMBGGS-NHCYSSNCSA-N Leu-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XZNJZXJZBMBGGS-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VKVDRTGWLVZJOM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JBRWKVANRYPCAF-XIRDDKMYSA-N Lys-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JBRWKVANRYPCAF-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- NRQRKMYZONPCTM-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NRQRKMYZONPCTM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N Lys-Gly-Glu Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC([O-])=O LCMWVZLBCUVDAZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- AHZNUGRZHMZGFL-GUBZILKMSA-N Met-Arg-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CCCNC(N)=N AHZNUGRZHMZGFL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GFDBWMDLBKCLQH-IHRRRGAJSA-N Met-Phe-Cys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N GFDBWMDLBKCLQH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N Met-Thr Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C([O-])=O KAKJTZWHIUWTTD-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- LBSWWNKMVPAXOI-GUBZILKMSA-N Met-Val-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LBSWWNKMVPAXOI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101710094503 Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OQTDZEJJWWAGJT-KKUMJFAQSA-N Phe-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OQTDZEJJWWAGJT-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 208000004550 Postoperative Pain Diseases 0.000 description 1
- 108010051508 Preconativ Proteins 0.000 description 1
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XWYXZPHPYKRYPA-GMOBBJLQSA-N Pro-Asn-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O XWYXZPHPYKRYPA-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- PEYNRYREGPAOAK-LSJOCFKGSA-N Pro-His-Ala Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C([O-])=O)NC(=O)[C@H]1[NH2+]CCC1)C1=CN=CN1 PEYNRYREGPAOAK-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- VZKBJNBZMZHKRC-XUXIUFHCSA-N Pro-Ile-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VZKBJNBZMZHKRC-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- NFLNBHLMLYALOO-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NFLNBHLMLYALOO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZVEQWRWMRFIVSD-HRCADAONSA-N Pro-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)N3CCC[C@@H]3C(=O)O ZVEQWRWMRFIVSD-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- KWMZPPWYBVZIER-XGEHTFHBSA-N Pro-Ser-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KWMZPPWYBVZIER-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- CXGLFEOYCJFKPR-RCWTZXSCSA-N Pro-Thr-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O CXGLFEOYCJFKPR-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010038563 Reocclusion Diseases 0.000 description 1
- 208000005074 Retroviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N Ser-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MPPHJZYXDVDGOF-BWBBJGPYSA-N Ser-Cys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CO MPPHJZYXDVDGOF-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- CXBFHZLODKPIJY-AAEUAGOBSA-N Ser-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N CXBFHZLODKPIJY-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- BCAVNDNYOGTQMQ-AAEUAGOBSA-N Ser-Trp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)NCC(O)=O BCAVNDNYOGTQMQ-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000007718 Stable Angina Diseases 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010066902 Surgical failure Diseases 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N Thr-Glu-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LKEKWDJCJSPXNI-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- IMULJHHGAUZZFE-MBLNEYKQSA-N Thr-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IMULJHHGAUZZFE-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- YDWLCDQXLCILCZ-BWAGICSOSA-N Thr-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YDWLCDQXLCILCZ-BWAGICSOSA-N 0.000 description 1
- ABWNZPOIUJMNKT-IXOXFDKPSA-N Thr-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ABWNZPOIUJMNKT-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- AAZOYLQUEQRUMZ-GSSVUCPTSA-N Thr-Thr-Asn Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O AAZOYLQUEQRUMZ-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N Thr-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- DVLHKUWLNKDINO-PMVMPFDFSA-N Trp-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DVLHKUWLNKDINO-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- MXKUGFHWYYKVDV-SZMVWBNQSA-N Trp-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1c[nH]c2ccccc12)C(C)C)C(O)=O MXKUGFHWYYKVDV-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- ZAGPDPNPWYPEIR-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZAGPDPNPWYPEIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ILTXFANLDMJWPR-SIUGBPQLSA-N Tyr-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N ILTXFANLDMJWPR-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 1
- DLYOEFGPYTZVSP-AEJSXWLSSA-N Val-Cys-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DLYOEFGPYTZVSP-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- VHRLUTIMTDOVCG-PEDHHIEDSA-N Val-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHRLUTIMTDOVCG-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 1
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- SJRUJQFQVLMZFW-WPRPVWTQSA-N Val-Pro-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O SJRUJQFQVLMZFW-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N Val-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 206010047163 Vasospasm Diseases 0.000 description 1
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 108010070944 alanylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 229940006612 barium citrate Drugs 0.000 description 1
- PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H barium(2+);2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Ba+2].[Ba+2].[Ba+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 229940021722 caseins Drugs 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003109 clavicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol monododecyl ether Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCO SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000002980 germ line cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPAIKDPJURGQLN-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-histidyl-L-phenylalanine Natural products C=1C=CC=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 HPAIKDPJURGQLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010084264 glycyl-glycyl-cysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002977 hyperthermial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003601 intercostal effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000008069 intimal proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013038 irreversible inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010075079 isoleucyl-prolyl-arginine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005248 left atrial appendage Anatomy 0.000 description 1
- 108010076756 leucyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 229940071308 lidocaine 10 mg/ml Drugs 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013206 minimal dilution Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 229940105631 nembutal Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 108010025221 plasma protein Z Proteins 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000020971 positive regulation of blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 108010071808 prepro-factor VII Proteins 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 229940068953 recombinant fviia Drugs 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 235000020254 sheep milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- OBTWBSRJZRCYQV-UHFFFAOYSA-N sulfuryl difluoride Chemical compound FS(F)(=O)=O OBTWBSRJZRCYQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940072651 tylenol Drugs 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229940072690 valium Drugs 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 208000003663 ventricular fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- A61K38/166—Streptokinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
Description
Oblast techniky t
Uváděný vynález se týká nových způsobů léčby a nového použití modifikovaných forem Faktoru VII, který zamezuje tvorbě krevních sraženin, udržuje nebo zlepšuje cévní průchodnost, zlepšuje průtok krve v oblasti myokardu a zmírňuje poškození myokardu při obnovení průtoku krve po ischemii.
Dosavadní stav techniky
Tvorba krevních sraženin je proces, který se skládá ze složitého vzájemného působení různých složek krve, nebo faktorů, které nakonec dá vznik fibrinové sraženině. Obecně, krevní komponenty, které se účastní procesu, popsanému jako koagulační „kaskáda“ jsou proenzymy nebo zymogeny, enzymaticky neaktivní proteiny, které jsou přeměněny v -proteolytické enzymy působením aktivátoru, který sám je aktivovaným srážecím faktorem. Koagulační faktory, které prodělaly takovouto změnu jsou obecně řazeny k „aktivním faktorům“ a jsou v textu označeny příponou malého „a“ (např. Faktor Vila).
Aktivovaný Faktor X („Xa“) je vyžadován pro přeměnu protrombinu na trombin, který následně způsobí změnu fibrinogenu na fibrin, která je poslední fází tvorby fibrinové sraženiny. Existují dva způsoby, nebo cesty, které podporují aktivaci Faktoru X. Jako „vnitřní biochemická dráha“ se označují ty reakce, které vedou ke tvorbě trombinu pomocí využití faktorů přítomných pouze v plazmě. Série proteázami zprostředkovaných aktivací vede nakonec k vytvoření Faktoru IXa, který, ve spojěňrs Faktorem Vlila rozštěpí Faktor X na Xa. Identická proteolýza je výsledkem působení Faktoru Vila a jeho kofaktoru, tkáňového faktoru, ve „vnější biochemické dráze“ srážení krve. Tkáňový protein je protein, vázaný k povrchu membrán, který za normálních podmínek necirkuluje v plazmě. Ovšem při protržení cévy se může spojit s Faktorem Vila a tím katalyzovat aktivaci Faktoru X, nebo aktivaci Faktoru IX za přítomnosti Ca a fosfolipidu (Nemerson a Gentry, Biochem. 25:4020-4033 (1986)). Zatímco relativní důležitost dvou způsobů koagulace při zastavení krvácení není jasná, v posledních letech se ukázalo, že Faktor Vila a tkáňový faktor hrají klíčovou roli v regulaci krevní srážlivosti.
•0 0000
0· ι>· « 000« ·
0«·
0 0 0
Faktor VII je plazmový glykoprotein, který cirkuluje ve stopovém množství v krvi ve formě jednořetězcového zymogenu. Zymogen je katalyticky neaktivní (Williams a kol., J, Biol. Chem. 264: 7536-7543 (1989); Rao a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 85:6687-6691 (1988)). Jed no řetězcový Faktor Vil může být převeden ve dvouřetězcový Faktor Vila působením Faktoru Xa, Faktoru XIla, Faktoru IXa nebo trombinu in vitro. Má se za to, že Faktor Xa je hlavním fysiologickým aktivátorem Faktoru VII. Jako u několika dalších plasmatických proteinů účastnících se zastavení krvácení, je aktivita Faktoru VII závislá na přítomnosti vitaminu K, který je nutný pro g-karboxylaci mnoha zbytků glutamové kyseliny, které jsou nahromaděny na amino-konci proteinu. Tyto gkarboxylované glutamové kyseliny jsou nutné pro asociaci Faktoru Vil s fosfolipidy za přítomnosti kovu.
.....--Přeměna zymogenu Faktoru VII v aktivovanou dvouřetězcovou-molekulu se děje rozštěpením vnitřní peptidové vazby umístěné přibližně ve středu molekuly. V lidském Faktoru VII je aktivační štěpící místo je mezi Arg152-lle153 (Hagen a kol., Proč, Nati. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416 (1986); Thim a kol., Biochem. 27: 7785-7793 (1988) obě citace jsou zde zahrnuty mezi referencemi). Hovězí Faktor VII je aktivován rozštěpením analogické vazby Arg152-lle153 (Takeya a kol., J. Biol. Chem. 263: 14868-14877, 1988). V přítomnosti tkáňového faktoru, fosfolipidů a vápenatých iontů dvouřetězcový Faktor Vila rychle aktivuje Faktor X nebo Faktor IX pomocí omezené proteoiýzy.
Často je nezbytné u pacienta selektivně zablokovat koagulační kaskádu. Mohou být použity antikoagulační faktory jako heparin, kumarin, deriváty kumarinu, deriváty indandionu, nebo mohou být použita další činidla, např. během dialýzy ledvin, nebo při -léčbě—hluboké—žilní—trombózy.,—roztroušené—nitrocévní—srážlivosti—(DIC-),—nebo_při. množství dalších zdravotních poruch. Např. léčba heparinem nebo mimotění aplikace citrátových iontů (U,S. Patent No. 4,500,309) mohou být použity při dialýze k prevenci srážlivosti během léčby. Heparin se také používá k prevenci hluboké žilní trombózy u pacientů, kteří podstoupili chirurgický zákrok.
Léčba heparinem a ostatními antikoagulačními prostředky však může mít nežádoucí vedlejší účinky. Dostupné antikoagulačními prostředky obecně působí v rámci celého těla, spíše než aby působily specificky v místech, kde dochází ke tvorbě sraženiny. Např. heparin může způsobit těžké krvácení. Navíc se svým poločasem eliminace 80 min. je heparin velmi rychle odbouráván z krve, takže je nezbytné jeho časté podávání. Protože heparin působí jako kofaktor antitrombinu lil (ATIII), a AT III je velmi rychle odčerpáván při léčbě DIC, je často náročné udržovat odpovídající dávku • » • · ·
*.1 α .
• fl · fl fl fl íí fl fl flflfl· · fl t
fl.
fc, fl heparinu, a je nezbytné nepřetržitě monitorovat hladiny AT III a heparinu. Heparin je také neefektivní v případě, že je odčerpávání AT III extréme rychlé. Navíc dlouhé užívání heparinu může také zvýšit shlukování krevních destiček a snížit jejich množství, je také zahrnut mezi faktory podporující rozvoj osteoporózy. Deriváty indandionu mohou také mít toxické vedlejší účinky.
Kromě antikoagulačních faktorů stručně popsaných dříve, bylo objeveno několik přirozeně se vyskytujících proteinů s antikoagulační aktivitou. Např. Reutelingsperger (U.S. Patent No. 4,736,018) isoloval antikoagulační proteiny z hovězí aorty a cév lidské pupečníkové šňůry... Maki a. kol. (U.S. Patent No. 4,732,891) objevil lidské antikoagulační proteiny produkované placentou. Navíc, AT III byl také navržen za léčebný antikoagulační prostředek (Schipper a kol., Lancet-1 (8069): 854-856 (1978); Jordán; U.S? patent No. 4,386,025; Bock a kol.;U:S. Patent No 4,517,294).' ' - - -·
Proliferace buněk hladké svaloviny (SMCs) v cévní stěně je důležitým okamžikem při vzniku cévních poškození při ateroskleróze, po cévní rekonstrukci nebo jako důsledek jiných cévních poranění. Např. léčba aterosklerózy často zahrnuje čištění zablokovaných cév angioplastií, chirurgickým otevřením cév nebo redukční aterektomií, nebo přemostěním pomocí štěpu (bypass), což jsou chirurgické zákroky, při kterých jsou aterosklerotické pláty redukovány nebo odstraněny katetrizací (angioplastie), sloupnutím ze stěny tepny odříznutím (chirurgické otevření cév), nebo přemostěním za použití přirozených nebo syntetických štěpů. Tyto zákroky odstraní žilní endotel, poruší podkladovou vnitřní vrstvu (intima) a vedou k odumření SMCs střední vrstvy. Po těchto zraněních následuje proliferace buněk SMC střední vrstvy a jejich migrace do vnitřní -vrstv-y-(-intipa.),-které-se-běžně-objevují-v-několika-prvních-týdnech-až-šesti-měsících-pozranění a'jsou ukončeny tehdy, když je obnovena krycí endoteliální vrstva. U lidí jsou tato poškození tvořena přibližně ve 20 % z buněk a v 80 % z mimobuněčné hmoty.
U přibližně 30 % nebo více pacientů léčených angioplastií, chirurgickým otevřením cév nebo redukční aterektomií, nebo přemostěním pomocí štěpu, způsobuje trombosa anebo proliferace SMC v intimě opětovné uzavření cévy a následkem toho dochází k neúspěchu tohoto chirurgického zákroku. Tento uzávěr cévy, následující po chirurgickém zákroku je označován jako restenosa.
V tomto oboru je neustálá potřeba dokonalejších prostředků s antikoagulační aktivitou, které mohou být podávány v relativně nízkých dávkách a nemají nežádoucí vedlejší účinky, které mají tradiční antikoagulační prostředky. Tento patent uspokojuje ♦ · fcfc* *
tyto potřeby tím, že poskytuje antikoagulanty, které působí specificky v místech zranění a poskytuje ještě další výhody.
Molekuly modifikovaného Faktoru Vil mohou být zvláště užitečné pro podávání lidem při léčbě různých stavů včetně nitrocévního krevního srážení. Např. ačkoli hlubokou žilní trombózu a plicní embólii lze léčit běžnými antikoagulanty, zde popsaný modifikovaný Faktor VII může být použit pro prevenci vzniku tromboembolických komplikací u určitých vysoce rizikových pacientů, jako např. těch, kteří podstoupili chirurgický zákrok nebo pacientů s městnavým srdečním selháním. Navíc, modifikovaný Faktor VII může působit jako inhibitor tkáňovým faktorem indukovaného krevního srážení, čímž zamezuje tvorbě trombinu a následnému ukládání fibrinu. Jako takový může být modifikovaný Faktor VII užitečný pro inhibici ..aktivity tkáňového . ...faktoru,· což-má za následek např. inhibici krevního srážení,· trombózu nebo ukládání.....
krevních destiček.
Molekuly modifikovaného Faktoru Vil mohou být zvláště užitečné při léčení hyperplasie vnitřní vrstvy nebo opětného uzavření cévy způsobené akutním cévním, poraněním. Akutní cévní poranění jsou taková, která se objeví náhle (tj. během dnů až. měsíců), na rozdíl od chronických cévních poranění (např. aterosklerosy), která se rozvíjí v průběhu celého života. Akutní cévní poranění často vznikají v důsledku chirurgických zákroků, jako např. rekonstrukce cév při angioplastice, chirurgickém otevření cév„ aterektomii, umístění cévního štěpu a podobných zákrocích.
Hyperplasie může také vzniknout jako opožděná odpověď např. na umístění štěpu nebo transplantaci orgánu. Vzhledem k tomu, že modifikovaný Faktor Vil působí _ selektivněji než heparin, obecně váže jen ten tkáňový faktor, který se ukázal v místě poranění a protože modifikovaný Faktor VII neničí ostatní koagulační proteiny, bude , efektivnější a bude s menší pravděpodobností než heparin vyvolávat nežádoucí vedlejší účinky jako např. krvácení, pokud bude používán profylakticky při prevenci * hluboké cévní trombosy.
Nedávné pokroky v léčbě onemocnění věnčitých cév zahrnují použití mechanických zákroků k odstranění nebo přemístění překážejícího plátu aterosklerotického materiálu, aby byl obnoven normální průtok krve koronárními tepnami. Navzdory používání různých forem mechanických zákroků, včetně balónkové angioplastie, redukční aterektomie, umístění cévních stentů, léčby laserem nebo rotoblatorem, efektivita těchto postupů zůstává omezena přibližně na 40 % opětovného zúžení průsvitu cévy v průběhu 6 měsíců po léčbě.
.3.
V fefefe fe » · H β 4 « 4 «1 ♦.
« » B ff t fefe r li « fe « «I tl * » b «11 6 fe . ff řfefe fe ff • fe fe 4 « fe t fe o fe t fe fefefe 41 4 fe μ/ς ίο*Opětovné,zúžení:průsvitů cévy jétpravděpodobně výsledkem složitých, interakcí biologických pročěsů;.;včetně ukládání.krevních :destičék.a’tvorby krevních rsraženin, vylučovánírchemotáktickýchda; mitogeňních faktorů,*ymigrace a< proliferace buněk hladkých .cévních svalů do intimý. cévních .úseků: rozšířeňých.chirurgickým zákrokem.Viá
MjíÉŽámezeňříshlukdvápí krevních' destiček.v místech mechanického poranění může omezitivžnik' opětovného zúžení--cév ;u; lidí.* Léčebné:použití monoklonálníchípřotilátek :prótrGpl!b/llla*krevních„déstičěk.je^schopnoÍOmezit. úroveň, výskytu1 opětovného'zúžení cév;U;lidí fCaliff,a,koí.? N. Eríql.^J? Med/ 330:956-961((.1994))'. Protilátka1)©· schopna’se navázatinaoreceptóbGpllb/lIIa.ínarpovrchu krevníchtdestičekďaitírriczabránit’.jejich '3;' shlukování; 'Jytocvýslědkyhnážňačujfcžé'· zamezení shlukování! krevních «destiček- ná místě mechafTickéhorpoškozerihvěnčitýdh’tepen·· ϋílidí je přínosné pró i.celkové zhojení;
.. Protože) akumúlácétkfévníchidestičeklnastává-VímístéčhS-akútníčhveéyřiíchHporaněníř·;^ tvorba tromb.ihu v těchto· mlstech může být odpovědná zá aktivací křevn ích· destičekfa. jejich následné· shlukování, iv ’·^·,/4 *4^. '·’ -W?
fty Jaku ůkazújía následující'· príkladý.y;modifikovanývFaktoruVIIS připravený podle tohoto patentu-má schopnost se; navázat na tkáňový -faktor na povrchu buněk. Např,DEGR-Faktor VNa se navazuje na tkáňový;faktor na-povrchu·buněk se-stejnou nebo větší afinitou než původní Faktor Vila. Ačkoli DEGR-Faktor· Vila > nemá žádnou enzymatickou; aktivitu, · přesto1, j© schopen navázat-se·! na . tkáňový' faktor a·* působí;jako .kompěťitivňí;, inhibitor··původního* FaktoruTVIla· a tím unhibuje 1 následné)stupně.h,.vnější biochemické dráhy,; krevní hóísrážení) která vede kehvorbě trombinu it ny tPA Mť* ^Molekuly í modifikovaného? Faktoru pVtl^ktěrétsí zachovávají ^schopnost ivázat tkáňov.ý faktor,-zamezují shlukování krevních destiček v rriístech cévního poraněnLtím; že brání tvorbě trombinu a následnému ukládání fibrinu. ·ν · .' : Vzhledem ke schopnosti DEGR-Faktoru VII blokovat tvorbu trombinu · a omezovat ukládání krevních destiček v místech náhlého cévního poranění, molekuly modifikovaného Faktoru VII, které si zachovávají schopnost vázat tkáňový faktor, ale na rozdíl od Faktoru Vila nejsou enzymaticky aktivní, mohou být použity k zamezení opětovného zúžení· průsvitu cév.
Prostředky obsahující modifikovaný Faktor VII jsou zvláště užitečné při léčení pacientů pokud‘jsoú .zakomponovány do. farmaceutických prostředků a mohou být podávány jedincům, kteří trpí řadou nemocí; a léčit tak stavy souvisící se srážením krve? Takové modifikované molekuly Faktoru «,VH;< schopné vázat, tkáňový faktor ; ale mající; velmi)sníženou schopnost katalyzovat aktivaci dalších faktorů účastnících se
4« 4 ·4 4« « 4 4 4 4 4 4 ·<·4
444 4 4 · · « « «4 4 « 4 444444
4 4 4 4 4 4 4 «4444 44 «44 44 44 procesu srážení krve, mohou mít delší eliminační poločas v plazmě a proto odpovídající delší období antikoagulační aktivity ve srovnání s ostatními antikoagulanty. Mezi indikace pro podávání těchto prostředků patří ty, které jsou běžně léčeny antikoagulanty, jako např. hluboká žilní trombóza, plicní embolie, mrtvice, roztroušená nitrocévní srážlivost (DIC), ukládání fibrinu v plicích a ledvinách spojené s gramnegativní endotoxikózou a infarkt myokardu. Prostředky lze použít k odvrácení opětovného zúžení průsvitu cév, které se objevuje po mechanických poraněních cév, jako jsou např. poranění způsobené balónkovou angioplastii, chirurgickým otevřením cév, redukční aterektomií, umístěním stentů, léčbou laserem nebo rotoblatorem nebo taková, která se objeví druhotně po použití cévních štěpů, stentů, přemostění pomocí štěpu nebo transplantaci orgánu. Prostředky mohou být také použity k zabránění
- -.....— - ukládání krevních-destiček a Souvisících poruch? Tento způsob-léčby, zabraňující např.
koagulaci, opětovnému zúžení průsvitu cév nebo ukládání krevních destiček, obsahuje podáváni takových přípravků pacientovi, které obsahují modifikovaný Faktor VII, jako jsou ty, které mají alespoň jednu aminokyselinovou záměnu v katalytické trojici Ser^, Asp242 a His-193 a to v množství, které je schopno efektivně zabránit koagulaci, opětovnému zúžení průsvitu cév nebo ukládání krevních destiček. Metody najdou využití také při léčbě náhlého ucpání věnčité tepny u pacientů (např. při akutním infarktu myokardu), což zahrnuje podávání modifikovaného Faktoru Vil, který obsahuje DEGR-Fakt-or VII a FFR-Faktor VII, ve spojení s aktivátorem tkáňového plasminogenu nebo streptokinasou, a může urychlit rozpad krevních sraženin, indukovaný tPA, Modifikovaný' Faktor VII je doporučeno podávat'před, současně s nebo krátce po podání trorpbolytických činidel, jako je např. aktivátor tkáňového plasminogenu.
Mezinárodní Aplikace No. WO 92/15686 se týká modifikovaného Faktoru Vila, poíynukieových kyselin a linií savčích buněk, vhodných pro produkci modifikovaného Faktoru Vila a přípravkům obsahujících modifikovaný Faktor Vila pro zabránění srážení krve.
Mezinárodní Aplikace No. WO 94/27631 se týká způsobů léčby, které zabraňují opětovnému zúžení průsvitu cév, aktivitě tkáňového faktoru a ukládání krevních destiček.
Mezinárodní Aplikace No. WO 96/12800 se týká způsobu léčby akutního uzávěru koronární tepny, který zahrnuje podávání přípravku, obsahujícího modifikovaný Faktor Vila ve spojení s aktivátorem tkáňového plasminogenu nebo streptokinásou.
• fl flflflfl • fl flflfl flfl flflfl flfl*
7· « ♦ · · · · •flflfl · flfl flflfl flfl 00
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká způsobu léčby, který brání tvorbě krevních sraženin u pacienta a zahrnuje lokální aplikaci na ta místa cév, která jsou náchylná k jejich tvorbě, terapeuticky účinnou dávkou prostředku, obsahujícího Faktor VII, který má provedenu nejméně jednu modifikaci ve svém katalytickém centru, kterážto modifikace podstatně omezuje schopnost modifikovaného Faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X nebo (X. Místo tvorby krevních sraženin může souviset s místem chirurgického zákroku, mikrochírurgického zákroku, angioplastie nebo úrazu.
Dále se vynález týká způsobu udržení nebo zlepšení průchodnosti cév pacienta, který zahrnuje lokální aplikaci na ta místa cév, která jsou náchylná ke snížení průchodnosti, terapeuticky účinnou dávkou prostředku, obsahujícího Faktor VII, který má provedenu nejméně jednu modifikaci ve svém katalytickém centru, kterážto modifikace podstatně omezuje schopnost modifikovaného Faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X nebo IX. Místo tvorby krevních sraženin může souviset s místem chirurgického zákroku, mikrochírurgického zákroku, angioplastie nebo úrazu.
Dále se vynález týká způsobu prevence nebo nebo minimalizace úrazů myokardu, která jsou spojeny s obnovou průtoku krve po ischemickém záchvatu u »/ pacienta, který zahrnuje podávání prostředku, obsahujícího farmakologický přijatelný Faktor VII, který má provedenu nejméně jednu modifikaci vé svém katalytickém centru, kterážto modifikace podstatně omezuje schopnost modifikovaného Faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X nebo IX.
Dále se vynález týká způsobu léčby, který zlepšuje průtok krve oblastí myokardu během obnovy průtoku krve u pacienta, který zahrnuje podávání prostředku, obsahujícího farmakologický přijatelný Faktor VII, který má provedenu nejméně jednu modifikaci ve svém katalytickém centru, kterážto modifikace podstatně omezuje schopnost modifikovaného Faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X nebo IX.
Ve výhodném provedení, modifikace Faktoru VII zahrnuje reakci Faktoru VII s inhibitorem serin proteasy. Ve výhodnějším případě je inhibitorem proteasy organofosfátová sloučenina, sulfanyl fluorid, halometylketonový peptid, nebo azapeptid. V ještě výhodnějším případě je inhibitorem proteázy některý z těchto halometylketonových peptidových derivátů - Dansyl-Phe-Pro-Arg chlormetylketon, • · · * · · * fcfc···· • · fc · · · * fcfcfc fc fcfc Ofc· fc° ·
Dansyl-Glu-Gly-Arg chlormetylketon, Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormetylketon a Phe-PheArg chlormetylketon, přičemž nejvýhodnější je Phe-Phe-Arg chlormetylketon.
Vynález se dále vztahuje použitím Faktoru VII, který má alespoň jednu modifikaci ve svém katalytickém centru, kterážto modifikace výrazně omezuje schopnost modifikovaného Faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X a IX, pro výrobu prostředku sloužícího k prevenci nebo minimalizaci poškození myokardu, spojeného s obnovou průtoku krve po ischemickém záchvatu. Vynález se dále týká použití Faktoru VII, který má alespoň jednu modifikaci ve svém katalytickém centru, kterážto modifikace výrazně omezuje schopnost modifikovaného faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X a IX, pro výrobu prostředku sloužícího k zlepšení průtoku krve oblastí myokardu během obnovy průtoku krve po ischemickém záchvatu.
- Tento vynález poskytuje způsoby a prostředky pro potlačení zhoubných jevů, spojených s obnovou průtoku krve po ischemickém záchvatu. Vážná ischemie zasahující tkáň, orgán nebo končetinu, může být způsobena poklesem průtoku krve a může být spojena s úrazem, chirurgickým zákrokem nebo sníženým krevním tlakem. Jednou z komplikací, která je spojena s těžkou ischemií je zvýšení hladiny tkáňového faktoru v tepenném systému. Má se za to, že tato zvýšená exprese tkáňového faktoru má za následek stimulaci prokoagulační odpovědi, primárně v kapilárním řečišti a tím iniciuje anebo podporuje tvorbu krevních sraženin v cévách. Dále de novo tvorba TF endoteliálními buňkami uvnitř věnčitého cévního systému v průběhu obnovy průtoku krve po ischemickém záchvatu, může vést ke snížení průtoku krve koronárními tepnami během tohoto období, což může vést k ovlivňování dalšího osudu ischemického myokardu,;který nakonec nekrotizuje. TF antigen a prokoagulační aktivita jsou zvýšeny v aterektomických vzorcích, které byly získány od pacientů s nestabilní angínou pectúris, -v- porovnání s pacienty se stabilní angínou pectoris. Má se tedy zato, že nestabilní angína pectoris u těchto pacientů může být uspíšena objevením se TF v subendoteliální tkáni velké osrdečníkové věnčité tepny, jako důsledek poškození arteriosklerotického plátu. To posléze podnítí vznik krevní sraženiny uvnitř věnčité tepny a následné úplné zamezení průtoku v koronárních cévách.
TF může také ovlivňovat průtok koronárními tepnami i jinak. Po obnovení průtoku krve v ischemické tkání se mohou tvořit krevní sraženiny, které bud mohou nebo nemusí uzavřít cévy, Tvorba krevních sraženin v tepenném řečišti a ukládání krevních destiček na krevní sraženinu, vede k druhotnému vzniku ischemie v tkáni. Tvorba krevních sraženin a přítomnost krevních destiček může pak způsobit vznik a ·* ·♦·· 44 * · · 4 4 4 • 4 · · 4 4 · 444··· • · 4 4 4 · · *44« « 44 44· ·· ·· uvolnění mnoha bioaktivních faktorů, včetně těch, které jsou produkovány při koagulaci, jako např. trombin a Faktor X, stejně jako faktory uvolňované aktivovanými krevními destičkami. Tyto faktory ovšem mohou indukovat tvorbu faktorů dalších, které jsou produkovány buňkami podložní endoteliální vrstvy a buňkami hladké svaloviny nebo přilehlými mononukleárními buňkami, jako jsou např. TNF-alfa a IL-1. Tyto faktory mohou na oplátku aktivovat endoteliální buňky, což vede ke zvýšení hladin různých adhezních molekul spojených s vazbou monocytů a neutrofilů. Za normálních okolností nevykazují endoteliální buňky, které jsou v kontaktu s cirkulující krví, žádnou patrnou TF aktivitu. Za určitých okolností mohou endoteliální buňky aktivně vyvolat koagulaci 1 · reakcí, která je podobná prokoagulační aktivitě TF. Obzvláště bezkyslíkové radikály (oxygen free radicals - OFRs), vytvářené jak exogenné, tak i endogenně, mohou stimulovat endoteliální buňky věnčitého cévního systému k tvorbě-a vylučování· výrazného množství TF. OFRs jsou vysoce reaktivní druhy molekul, které mohou napadnout různé buněčné složky. Zvýšení tvorby OFRs následuje po obnovení průtoku krve po prodělané ischemii a tyto druhy oxidantů mohou být odpovědné za specifickou formu poranění tkáně způsobenou při obnovování průtoku krve, dále za peroxidaci tuků a jiné nevratné změny buněčných složek. OFRs také dramaticky snižují aktivitu inhibitoru tkáňového faktoru (tissue factor paíhway inhibitor - TFPI), což je protein Kunitzova typu, který je syntetizován endoteliálnímí buňkami a který inhibuje vnější biochemickou dráhu srážení krve. Tento dvojitý efekt OFRs (produkce TF .endoteliálnímí. buňkami a snížení aktivity TFPI) může posunout přirozené antikoagulační vlastnosti normálního endotelia do prokoagulačního stavu a tím napomáhá, aktivaci nežádoucího nitrocévního srážení krve. Tedy exprese TF ve věnčitém -systému, která je zprostředkována OFR, má za následek znatelné snížení • průtoku krve věnčitým systémem v průběhu obnovy průtoku krve po ischemickém záchvatu. Tato exprese TF, zprostředkovaná OFR a doprovázená aktivací vnější biochemické dráhy srážení krve, má významné důsledky, neboť tento jev má vliv na patofysioloogii obnovy průtoku krve po ischemickém záchvatu, zvláště u pacientů s akutním infarktem myokardu, kteří trpí rozpadem krevních sražením ve věnčitých tepnách.
Stav, kdy nedojde k obnovení průtoku krve (non-refiow phenomenon), což jest ztráta stejnoměrného krevního zásobování v soustavě mikrocévek v tkáni, která byla předtím postižena ischemii, byl poprvé popsán Krugem a kol. (Circ. Res. 1966; 19:5762). Má se zato, že nejdůležitější činitelé, které mohou ovlivňovat osud ischemického ft 1 ft « ft t tt ft i tf tv tt ·· « · <· f: ft· (i « «' <i i1 ft t ft- ii<
« ft
I, ft 0: *' * ♦ *' myokardu jsou velikost postranního .proudění krve během ischemie, velikost rizikové oblasti á požadavek myokardu ňa kyslík. ! ,
V posledním* ! desetiletí bylo vhodně’ pozornosti věnováno postupům léčby pacientů trpících*’ákutnírň infarktem myokardu.technikami, obnovujícími průtok krve, včetně koronárnl· trombolyšý; primární'angioplástrie,*nebo robou.;'Přesto1 ne všechny studie'prokázaly zlepšení 'funkce;levé kómoiypo zhovLÍzprůchqdnění:tépný,postižené infarktem; V současné době. značný počet pacientů vykazuje stav nízkého průtoku krve v cévním řečišti, které' byíóí postižěnó. infarktem. ' Tento ,stav znamená:téměř:úplnou ztrátu výhod'získaných chirurgickým zákrokem, alespoň co;se týká.úmrtnosti;“U těchto
- 4—----stávů^riízkého~průtokcikrVe“'sé'’pré'dpORrá'dá7’žě’'rjŠou'alespoň cáďtečně “způsobený í
neschopnostík krve znovu vstoupit - do celého · cévního i systému l myokardu dříve
......-3......... ...... -postiženého- infárktem?Nyníse překvapivě ukázalo/že FVIIai ovlivňujera zvyšuje krevní průtok'oblasthímýókardu· v průběhu obnovování-průtoku.krve?Dále bylo ukázáno, že
FVIIai-způsobuje přěkvapivé výrazné zmenšení oblasti,· kde nedojde k obnově průtoku -krve. fi1 1 ϋ ΐ · -..-:- < . ~t, v.
Vazba a přemisťování monocytů a neutrofylů,-uvolňování bioaktivních sloučenin těmito buňkami,-včetně tvorby bezkyšlíkatých radikálů, může zhoršit úroveň aktivace endoteliálních buněk a vede k poškození. SouhrnněTečeno, pokud kaskáda procesů probíhá nekontrolované, může vést tento stav k systémovým komplikacím a je možnost, fže' vyvolá-‘selhání rozmanitých orgánů·?. Zablokováním tkáňového faktoru-podáním specifického 'inhibitorů- vazby- tkáňový faktor/Faktor VII (např. FFR-FVIIa) a tedy zablokováním iniciace vnější biochemické'dráhy srážení krve, lze zabránit započetí kaskády tqchto reakcí a zmírnit tak rozsah škodlivých jevů, spojených s isčhémií a obnovou krevního průtoku, jako je např. odstranění· nebo výrazné zmenšení poškození * myokardu nebo nekrózy.
Modifikovaný faktor se může vyskytovat buď ve formé zymogenu (t.j. 4 jednořetězcová molekula) nebo může být rozštěpen ve svém aktivačním místě. Proto pojmem „modifikovaný Faktor VIl„ jsou míněny jak molekuly modifikovaného Faktoru VII, tak molekuly modifikovaného Faktoru Vila, které váží tkáňový faktor a zabraňují aktivaci Faktoru IX na-IXa a aktivaci Faktoru X na Xa. Sekvence Faktoru VII má nejméně‘ jednu modifikaci aminokyseliny, kterážto modifikace je zvolena tak, aby podstatně snižovala schopnost aktivovaného Faktoru VII katalyzovat aktivaci plazmátickýčh Faktorů X nebo IX a tím je schopna zabránit tvorbě krevních sraženin. Modifikovaný Faktor VII má aktivní místo modifikováno nejméně jednou · · · · * · ·
I i ··«· · · *·· ·· ·· aminokyselinovou substitucí a ve své modifikované formě má schopnost vázat tkáňový faktor. Sloučeniny modifikovaného Faktoru VII jsou obyčejně ve značně Čisté formě.
Ve výhodném provedení modifikace lidského a hovězího Faktoru VII, je aminokyselinový zbytek aktivního místa Ser344, změněn, a to tak, že je nahrazen Gly, Met, Thr nebo ještě výhodněji Ala. Takovou substituci lze udělat samostatně nebo v kombinaci se substitucí (nebo substitucemi) v dalších místech katalytické triády, která ještě zahrnuje Kis193 a Asp242Prostředky obsahující modifikovaný Faktor VII jsou vhodné pro podávání rozličným druhům savců, hlavně lidem, k zablokování kaskády srážení krve. Modifikovaný Faktor VII lze podávat pacientům ve spojení nebo namísto ostatních antikoagulačních sloučenin. Prostředky určené pro podávání lidem obyčejně obsahují modifikovanou bílkovinu lidského Faktoru Vll-a-farmaceuticky přijatelné nosiče a pufry.
Faktor VII hraje důležitou roli v procesech srážlivosti, hlavně těch, které jsou součástí vnější biochemické dráhy srážení krve. Je přítomen v cirkulující plazmě jako neaktivní jednořetězcový zymogen, pokud však dojde k jeho aktivaci, Faktor Vila ve spojení s tkáňovým faktorem a vápenatými ionty aktivuje Faktor X na Xa a Faktor IX na IXa, přičemž konečným výsledkem těchto procesů je vytvoření fibrinové sraženiny.
Bílkoviny Faktoru VII mají katalytická místa, která jsou změněna tak, aby se snížila katalytická aktivita Faktoru Vila, zatímco molekula si uchová schopnost vázat se k tkáňovému faktoru. Molekuly modifikovaného Faktoru VII soutěží s přirozeným Faktorem VII anebo s Faktorem Vila o navázání na tkáňový faktor. Výsledkem toho je, že dojde k inhibování aktivace Faktorů X a IX,
Modifikovaný faktor může být kódován polynukleotidovou molekulou, obsahující dvě operativně spojené kódující oblasti, které kódují pre-pro peptid a gla doménu plazmatické bílkoviny, jejíž funkce je závislá na přítomnosti vitamínu K, a dále bílkovinu Faktoru Vil bez gla domény. Při expresi tento polynukleotid kóduje molekuly modifikovaného Faktoru Vil, který neaktivuje významně plazmatické Faktory X a IX, a je schopen vazby ke tkáňovému faktoru. Molekuly modifikovaného Faktoru VII, které jsou exprimované tímto polynukleotidem jsou biologicky účinným antíkoagulantem, což znamená, že jsou jsou schopné inhibovat procesy srážení krve a tedy tvorbu fibrinových ložisek nebo sraženin. Aby došlo k expresi modifikovaného faktoru, je molekula polynukleotidu vnesena do linií savčích buček, jako jsou např. buněčné linie BHK, BHK 570 nebo 230.
• fl «flflfl
• · « flflfl· • fl · fl · ··« flflfl • flfl flfl • fl flflfl fl* flfl
Katalytická aktivita Faktoru Vila může být omezena chemickými obměnami katalytického centra, neboli triady. Obměna může být provedena reakcí Faktoru VII s nevratným inhibitorem, jakým může být např. organofosfátová sloučenina, sulfonyl fluorid, halometylketonový derivát peptidu nebo azapeptid, nebo k ní může dojít např. acylací. Výhodné haiometylketonové deriváty peptidů jsou mimo jiné PPACK (D-PhePro-Arg chlormetylketon; (viz. U.S. Patent No. 4,318,904, uvedený zde jako reference), D-Phe-Phe-Arg a Phe-Phe-Arg chlormetylketon (FFR-cmk); a DEGRck (dansyl-GluGlu-Arg chlormethylketon).
Katalytickou aktivitu Faktoru Vila lze také potlačit substitucí, inzercí nebo delecí aminokyselin. Ve výhodném provedení jsou záměny aminokyselin uskutečněny v ..sekvenci katalytické triády aminokyselin Faktoru VII, definované zde jako oblasti, které obsahují aminokyseliny, přispívající ke katalytickému .místu' Faktoru Vila. Substituce, ínserce nebo delece v oblasti katalytické triády jsou obvykle přímo v místě nebo v okolí místa, kde se nacházejí aminokyseliny, tvořící katalytické místo. V lidských a hovězích bílkovinách Faktoru VII, tvoří katalytickou triádu aminokyseliny Ser344, AspZ42 a His193 (index určuje, umístění v sekvenci). Katalytická místa ve Faktoru VII u jiných savčích druhů lze určit pomocí dnes dostupných technik jako jsou mimo jiné izolace bílkovin a -analýza sekvence aminokyselin. Katalytická místa mohou být určena také porovnáním sekvence se sekvencemi dalších serinových proteáz, zvláště chemotrypsinu, jehož aktivní místo bylo již dříve určeno (Sigler et al., TMol.Biol., 35.Ί43-164 (1968), uvedeno zde jako reference). Pomocí zmíněného porovnání lze určit aminokyselinové zbytky obdobných aktivních míst.
Aminokyselinové substituce, inserce nebo delece aminokyselin jsou prováděny tak, aby zabránily, nebo. jinak potlačily aktivaci Faktorů X anebo IX Faktorem Vila. Takto modifikovaný Faktor VI! by si ovšem měl zachovat schopnost soutěžit se skutečným Faktorem VII anebo Faktorem Vila o navázání na tkáňový faktor ve srážecím procesu. Takovou kompetici lze snadno odhalit např. zde popsanou zkouškou srážlivosti, nebo kompetičním vazebným testem, za použití např. linií buněk, které mají na svém povrchu tkáňový faktor, jako jsou buňky např. nádorové buňky linie J82 z močového měchýře člověka (Sakai a kol. JBiol Chem. 264: 9980-9988 (1989), uvedený zde jako reference).
Aminokyseliny, které tvoří katalytické místo Faktoru VII, jako jsou Ser344, Asp242 a Hisi93 u lidského a hovězího Faktoru Vil, mohou být bud zaměněny nebo odstraněny. V tomto vynálezu je dávána přednost záměně pouze jedné aminokyseliny, čímž se »» ··«* ·ί · t* ·· « « · «»· · · · · • · · · · * · · · • · · · · · · ·>···· » · · · · · ···« * ·« ··· ·· *· minimalizuje pravděpodobnost zvýšené antigenicity molekuly, nebo omezení jejich schopnosti vázat tkáňový faktor. I přesto je možné provést dvě nebo více záměn aminokyselin (substitucemi, adicemi nebo delecemi), rovněž je možno také provést kombinace substituce (substitucí), adice (adicí) a delece (delecí). Ve výhodném provedení je u lidského a hovězího Faktoru VII Ser344 přednostně nahrazován Ala, ale pro záměnu mohou být použity i Gly, Met, Thr nebo další aminokyseliny. Je výhodné zaměnit Asp za Glu a zaměnit His za Lys nebo Arg. Záměny jsou obecně vybrány tak, aby došlo k co nejmenšímu porušení terciální bílkovinné struktury. Model popsaný Dayhoffem a kol. (v Atlas of Protein Structure 1978, Naťl Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), uveden zde jako reference; může být použit jako návod při výběru dalších substitucí aminokyselin. Lze provést záměny-zbytků aminokyselin,-jak-byly -popsány výše, v katalytickém.místě sekvence příslušnéhoFaktoru VII člověka', skotu nebo dalších druhů a testovat u výsledných bílkovin požadovanou hladinu inhibice katalytické aktivity a výslednou prot i sráží i vou aktivitu, jak zde bylo popsáno. U. modifikovaného Faktoru VII bude katalytická aktivita významně omezena, katalytická aktivita bude obecně nižší než 5 % aktivity původního Faktoru VII odpovídajících druhů, v lepším případě méně než 1 %.
Modifikovaný Faktor VII lze produkovat použitím technik rekombinantní DNA. Obecně je klonovaná sekvence DNA z původního Faktoru Vil modifikována tak, aby kódovala požadovanou bílkovinu. Tato modifikovaná sekvence je pak zabudována do expresního vektoru, který je použit k transformaci, neboli je vnesen do hostitelské ' μ buňky. Jako 'hostitelské buňky jsou přednostně používány vyšší eukaryotické buňky, hlavně kultivované savčí buňky. Jsou známy kompletní nukleotidové a aminokyselinové sekvenceíidského Faktoru Vil. Viz U.S. Patent No. 4,784,950, který je zde uveden jako reference, kde je popsáno klonování a exprese rekombinantního lidského Faktoru VII. Sekvence hovězího Faktoru Vil popsal Takeya a kol., J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988), který je zde uveden jako reference.
Změny v sekvenci aminokyselin lze provést různými postupy. Změny v sekvenci DNA lze docílit pomocí místně-specifické mutageneze. Techniky místně-specifické mutageneze jsou v oboru dobře známy a jsou popsány např. v Zoiler and Smith (DNA 3:479-488, 1984). Tedy, při použití nukleotidových a aminokyselinových sekvencí Faktoru Vil, může každý provést změnu (změny) podle vlastní volby.
Faktor VII modifikovaný tímto postupem zahrnuje takové proteiny, které obsahují amino-koncovou oblast (gla doménu) zaměněnou za gla doménu jednoho z
• fc • fc | ··«♦ fcfc • « | • | • fcfc | fcfc ·· • · · « |
fc | fc fcfc | • | • | • fcfc· fcfcfc |
* | fc · | • | • | fc fc |
• fcfcfc | fc fcfc | ♦ ·· | • fc fcfc |
plazmatických proteinů, závislých na přítomnosti vitaminu K - Faktoru IX, Faktoru X, prothrombinu, bílkoviny C, bílkoviny S nebo bílkoviny Z. Gla domény plazmatických proteinů závislých na vitaminu K jsou charakterizovány přítomností zbytků gammakarboxy glutamové kyseliny a jsou obecně dlouhé od 30 do 40 aminokyselin s C-konci odpovídajícími pozicím rozhraní exon-intron v odpovídajících genech. Způsoby pro vytvoření Faktoru VII s heterologní gla-doménou jsou uveřejněny v U.S. No. 4,784,950, uvedeném zde jako reference.
DNA sekvence používající se při vytváření modifikovaného Faktoru VII obyčejně kódují pre-pro- peptid na amino-konci proteinu Faktoru VII, aby byla dosaženo patřičné post-translační zpracování (např. gama karboxylace zbytků kyseliny glutamové) a sekrece z hostitelské buňky. Pre-pro- peptid může pocházet z Faktoru VII nebo jiného, vitamin-K-dependentního plazmatického proteinu, jako jsou Faktor IX, Faktor X, protrombin, protein C nebo protein S.. Pracovníci se zkušenostmi v oboru zjistí, že v aminokyselinové sekvenci modifikovaného Faktoru VII lze provést další změny, které nepoškodí významně schopnost proteinu fungovat jako antikoagulant. Např. Faktor VII, modifikovaný ve své katalytické trojici aminokyselin, může být také modifikován v aktivačním štěpícím místě, čímž se zabrání přeměně inaktivní formy (zymogenu) Faktoru VII do jeho aktivní dvouřetězcové formy, jak je obecně popsáno v U.S. Patent 5,288,629, uvedeném zde jako reference.
Expresní vektory používané pro exprimování modifikovaného Faktoru Vila budou obsahovat promotor, schopný řízení transkripce klonovaného genu nebo cDNA. Promotory výhodné pro použití v kulturách savčích buněk jsou virové promotory a buněčné promotory. Virové promotory zahrnují SV40 promotor (Subramaní a kol., Mol. Cell. Biol: 1: 854-864, 1981) a CMV promotor (Boshart a kol., Cell 41.521-530, 1985). Zvláště výhodný virový promotor je velký pozdní promotor z adenoviru 2 (Kaufman a Sharp, Mol.Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982). Buněčné promotory zahrnují promotor myšího genu kappa (Bergman a kol., Proč, Nati. Acad. Sci, USA 81:7041-7045, 1983) a myší VH promotor (Loh a kol., Cell 33:85-93, 1983). Obzvláště výhodný je myší promotor pro metalothionein-l (Pálmiter a kol., Science 222:809-814, 1983). Expresní vektory také mohou obsahovat soubor míst pro sestřih RNA, umístěný za promotorem po směru exprese genu a proti směru exprese genu od místa, kde je vklonována vlastní sekvence pro Faktor VII, Výhodná místa pro sestřih RNA lze získat z adenoviru nebo z imunoglobulinových genů. Dále je v expresních vektorech obsažen signál pro polyadenylaci, umístěný po směru exprese genu od inzerčního místa. Zvláště výhodné • to to»*· ·· · ·· ·· » to · *· «to · to to to *· ··« β · « · • to ·· · « * ······ . _ »· '··· ·· ···· · ·· ··· ·* ·· polyadenylační signály jsou časný anebo pozdní polyadenylační signál z viru SV40 (Kaufman a Sharp, tamtéž), polyadenylační signál z oblasti Elb adenoviru 5, terminátor lidského genu pro růstový hormon (DeNoto a kol., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) nebo polyadenylační signál z lidského genu pro Faktor VII nebo hovězího genu pro Faktor VII. Expresní vektory také mohou obsahovat nekódující leader sekvenci, jako např. tripartitě leader sekvence adenoviru 2, umístěná mezi promotor a místa pro sestřih RNA; sekvence pro zesílení transkripce, jako např. sekvence pro zesílení transkripce z viru SV40.
Klonované DNA sekvence jsou vneseny do buněk tkáňových kultur savčích buněk např. transfekci zprostředkovanou fosfátem vápenatým {Wigler a kol., Celí 14:725-732, 1978; Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genetic 7: 603-616, 1981; Graham a Van der-Eb, Virology 52d:456-467. 1973). nebo elektroporaci (Neumann a kol., EMBO J. 1:841-845, 1982). Pro vyhledání a selekci buněk, které exprimují exogenní DNA, jsou obecně do buněk spolu se žádaným genem či cDNA vnášeny i geny, které buňkám propůjčují selektovatelný fenotyp (selekční markéry). Výhodné selekční.’ markéry jsou geny, které buňkám propůjčují resistenci k léčivům jako je neomycin, hygromycin a methotrexát. Selekční markér může být také množivý selekční markér. Výhodný množivý selekční markér je sekvence dihydrofolát reduktázy (DHFR). Selekční markéry jsou přehledně uvedeny v práci Thillyho (Mammalian Cell Technology? Butterworth Publishers, Stoneham, MA, uvedené zde jako reference). Výběr selekčních markérů závisí na úrovni zkušenosti v oboru.
Selekční markéry mohou být vneseny do buněk na zvláštním plazmidu současně se žádaným genem, nebo mohou být umístěny na témže plazmidu. Pokud jsou na témže plazmidu, selekční markér a žádaný gen mohou být pod kontrolou různých promotorů nebo téhož promotoru, v tomto druhém uspořádání je produkována dicistronická mRNA. Konstrukty tohoto typu jsou v oboru známy (např. Levinson a Simonsen, U.S. Patent 4,713,339). Může být také výhodné přidat další DNA, známou jako „nosičové DNA,, ke směsi, jež je vnášena do buněk.
Poté co buňky přijmou DNA, jsou pěstovány ve vhodném růstovém médiu, obyčejně 1 až 2 dny, aby začaly exprimovat žádaný gen. Zde použitý termín „vhodné růstové médium,, znamená médium obsahující živiny a jiné složky, vyžadované pro růst buněk a expresi genu modifikovaného Faktoru VII. Média obyčejně obsahují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, esenciální aminokyseliny, esenciální cukry, vitamíny, soli, fosfolipidy, proteiny a růstové faktory. Pro tvorbu gama-karboxylovaného *«>ι ·· • · · 9 · 4 • · · * • · 9 9 · • * · * ·· »· • ♦ * * 9 9 9 • 499 99«
9 *4 4« modifikovaného Faktoru VII, médium bude obsahovat vitamin K, přednostně v koncentraci 0,1 až 5 mg/ml. Pak je uplatněna selekce léčivy, která umožní růst buňkám, exprimujícím selekční markér ve stabilní formě. U buněk, které byly transfekovány množivým selekčním markérem, se koncentrace selekčního léčiva může zvyšovat, aby se selektoval zvýšený počet kopií klonovaných sekvencí, tedy i zvyšující se hladiny exprese. Klony stabilně transfekovaných buněk se pak testují na expresi modifikovaného Faktoru VII.
Výhodné savčí buněčné linie jsou COS-1 (ATCC CRL 1650), buněčná linie z ledvin novorozených křečků (BHK) a buněčná linie 293 (ATCC CRL 1573; Graham a kol., J, Gen, Virol. 36:59-72, 1977). Výhodná BHK buněčná linie je tk' ťs13 BHK linie (Waechter a Baserga, Proč. Nati, Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, uvedená zde jako reference), dále zde označovaná jako buňky BHK 570. Buněčná liníe BHK 570 byla uložena v Americké typové sbírce kultur (American Type Culture Collection), 12301 Parklawn Dr., Rockwille, MD 20852, pod ATCC přístupovým číslem CRL 10314. Tato tk' ts13 BHK linie je také dostupná v ATCC pod přístupovým číslem CRL 1632. Navíc lze použít řadu jiných buněčných linií včetně Rat Hep I (krysí hepatom; ATCC
CRL 1600), Rat Hep II (krysí hepatom; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CRL 139), buněčná linie z lidských plic - Human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) a buňky DUKX (Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci, USA 77:4216-4220, 1980).
Pro produkci modifikovaného Faktoru VII lze použít technologii transgenních zvířat. Je výhodné produkovat bílkoviny v mléčných žlázách hostitelské savčí samice. Exprese v ,mléčných žlázách a následná sekrece žádané bílkoviny do mléka obchází mnoho potíží, se kterými se setkáváme při izolaci bílkovin z jiných zdrojů. Mléko se snadno shromažďuje, je dostupné ve velkých množstvích a je dobře biochemicky charakterizováno. Navíc jsou hlavní mléčné bílkoviny přítomny v mléku ve vysokých koncentracích (typicky 1 až 15 g/l).
Z hospodářského hlediska je jasně výhodnější použití jako hostitele druh, který má vysokou produkci mléka. Zatímco malí živočichové, jako jsou myši a krysy, mohou být použiti (a je jim dávána přednost pri testování základní konstrukce), je výhodné použít savcehospodářského zvířectva, např. mimo jiné vepře, kozy, ovce a skot. Ovce jsou zvláště výhodné kvůli takovým okolnostem, jako je předcházející historie transgeneze u tohoto druhu, produkce mléka, cena a snadná dostupnost zařízení pro sběr ovčího mléka. Viz WIPO Publication WO 88/00239 pro porovnání faktorů, majících fl· ··· « · fl fl fl ·« • « · · • · fl · • flflfl flflfl • fl flfl fl* vliv na výběr hostitelských druhů. Je obecně žádoucí vybrat takové plemeno hostitelských zvířat, které bylo vyšlechtěno pro produkci mléka, jako např. východofríské ovce, nebo později s takovým plemenem transgenní linii zkřížit.
V každém případě by se měly používat zvířata dobrého a známého zdravotního stavu.
Aby byla dosažena exprese v mléčných žlázách, používá se transkripční promotor míéčného proteinu. Geny mléčných proteinů zahrnují geny kódující kaseiny (viz U.S. Patent No. 5,304,489,-uvedený zde jako reference), beta-laktoglobulin, alaktalbumin a kyselé proteiny syrovátky. Výhodný je beta-laktoglobulinový promotor »
(BLG). V případě ovčího beta-laktoglobulinového genu se obecně používá oblast \ nejméně 406 bázových párů bezprostředně sousedící s 5'-koncem genu, ačkoli jsou výhodné i větší části této oblasti (až do 5 kbp), jako např. 4,25 kbp DNA fragment,
.....zahrnující promotor v 5'-oblasti a nekódující část láktoglobulinového genu - viz
Whitelaw a kol., Biochem J. 286: 31-39 (1992). Vhodné jsou také podobné fragmenty promotorové DNA z pocházející z jiných druhů.
Do konstruktů mohou být zabudovány také jiné oblasti beta-laktoglobulinového . genu, stejně, tak jako genomické oblasti exprimovaného genu. Obecně se uznává, že např. konstrukty bez intronú, exprimují slaběji, ve srovnání s těmi, které tyto sekvence obsahují (viz Brinster a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:836-840 (1988); Palmiter a kol., Proč. Nati. Acad, Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw a kol., Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO 89/1343 a WO 91/02318, každý z nich je zde uveden jako odkaz).
V tomto ohledu se dává přednost, pokud je to možné, použití takových genomíckých • i sekvencí, které obsahují všechny nebo jen některé přirozené introny genu kódujícího žádaný protein nebo polypeptid, tak je např, výhodné zahrnutí přinejmenším některých intronů z' beta-laktoglobulinového genu. Jednou takovou oblastí je úsek DNA, který . zajišťuje místa pro sestřih intronů a polyadenylaci RNA, pocházející z 3'-nekódující oblasti ovčího beta-laktoglobulinového genu. Tento segment ovčího betafl laktogiobulinu, pokud nahradí přirozené 3'-nekódující sekvence genu, může jak zvýšit, , tak i stabilizovat úrovně exprese žádaných proteinů nebo polypeptidů. Při jiném provedení je oblast kolem ATG-počátku sekvence modifikovaného Faktoru VII
PahrazĚn£QópQvídajícími sekvencemi/ genu specifického mléčného.proteinu, Jaková záměna poskytne předpokládané, tkáňově specifické iniciační prostředí pro rozšíření exprese. Je vhodné zaměnit celé pre-pro- a 5'-nekódující oblasti modifikovaného Faktoru VII, odpovídajícími sekvencemi např. genu BLG, třebaže je možno zaměnit i oblasti menší.
• C »«
4 0 *
0 0 ·
040 ·»·
0
0· 00 ·
6« ·*·* • V ·
0 4 ·
0 ·0 0· 0 ti·.·
Pro expresi modifikovaného Faktoru VII v transgenních zvířatech, úsek DNA kódující modifikovaný Faktor VII je operativně připojen k dalším DNA úsekům, vyžadovaným pro jeho expresi a tvořil tak expresní jednotky. Takové další úseky obsahuji výše zmíněný promotor, rovněž tak sekvence zajišťující terminaci transkripce a polyadenylaci mRNA. Expresní jednotka dále obsahuje úsek DNA, kódující sekreční signální sekvenci operativně připojenou k úseku, kódujícímu modifikovaný Faktor VII. Sekreční signální sekvence může být buď přirozená sekreční signální sekvence Faktoru VII, nebo může pocházet z jiného proteinu, jako je např. mléčný protein. Viz např. von Heinje, Nucl, Acids Res. 14: 4683-4690 (1986) a Meade a kol., U.S. Patent No. 4,873,316, které jsou zde uvedeny jako reference.
Konstrukci expresních jednotek pro použití v transgenních zvířatech je vhodné provádět vnesením-sekvence modifikovaného Faktoru VII do plazmidu nebo fágové ho vektoru, obsahujícího další DNA úseky, třebaže expresní jednotka může být konstruována v podstatě jakoukoli posloupností ligací. Je obzvláště výhodné připravit vektor obsahující DNA úsek kódující mléčný protein a zaměnit kódující sekvenci mléčného proteinu sekvencí modifikovaného polypeptidů Faktoru VII, čímž se vytvoří genová fúze, obsahující expresní kontrolní sekvence genu pro mléčný protein. V každém případě klonování expresních jednotek v plazmidech nebo jiných vektorech usnadňuje amplifikaci sekvence modifikovaného Faktoru VII. Amplifikaci je vhodné provádět ν’bakteriálních hostitelských buňkách (např. E.coli). takže vektory běžně obsahují počátek replikace a selekční markér, funkční v bakteriálních hostitelských buňkách.
Expresní jednotka je pak vnesena do oplozeného vajíčka (popřípadě časného embrya) Vybraného hostitelského druhu. Vnesení cizorodé DNA se může provést jedním z několika způsobů, mezi jinými mikroinjekcí (např. U.S. Patent No. 4,873,191), infekcí retroviry (Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988)) nebo místně směrovanou integrací, využívající embryonální kmenové buňky (ES - embryonic stem cetls) (přehled viz. Bradley a kol., Bio/Technoloqy 10: 534-539 (1992)). Vajíčka jsou pak implantována do vejcovodů nebo dělohy pseudogravidních samic a ponechána se vyvíjet do konce těhotenství. Potomci obsahující vnesenou DNA ve svých zárodečných^buněčných liniích, přenášejí DNA do svého potomstva normálním, Mendelístickým způsobem a umožňují tak vznik transgenních stád.
Obecné postupy pro přípravu transgenních zvířat jsou v oboru známy. Viz např. Hogan a kol., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring ····«· ·· * · ♦ ·· a · a a · ·· a · · · aa · ♦ · ««a· • a a» a a a a a a a a a a a a a · a a «aaa · aa ··· aa ··
Harbor Laboratory, 1986; Simons a kol., Bio/Technology 6: 179-183 (1988); Wall a kol., Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler a kol., Bio/Technology 8: 140-143 (1990); Ebert a kol., Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort a kol., Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall a kol., J, Cell. Biochem. 49: 113-120 (1992); U.S. Patent Nos. 4,873,191 a 4,873,316; WlPO publikace WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757 a GB 87/00458, které jsou zde uvedeny jako reference. Techniky pro vnášení cizorodých DNA sekvecí do savců a jejich zárodečných buněk byly původně vyvinuty na myších. Viz např. Gordon a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon a Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter a Brinster. Cell 41: 343-345 (1985);. Brinster a kol., Proč. Nati. Acad. Sci, USA 82: 4438-4442 (1985) a Hogan a kol., (tamtéž). Tyto techniky byly. následně adaptovány pro použití· u větších zvířat, včetně druhů hospodářského zvířectva (viz např. WlPO publikace WO 88/00239, WO 90/05188 a WO 92/11757 a Simons a kol., Bio/Technology 6: 179-183 (1988). Souhrně řečeno, při dosud nejefektivnějším způsobu přípravy transgenních myší nebo hospodářského zvířectva, je několik set lineárních molekul příslušné DNA pomocí zavedené techniky injikováno do jednoho z předjader oplodněného vajíčka. Může se také použít injekce do cytoplazmy zygoty.
Také lze použít produkci v transgenních rostlinách. Exprese může být generalizovaná nebo zaměřená na zvláštní orgán, jako je např. hlíza. Víz Hiatt, Nátuře 344: 469-47© (1990); Edelbaum a kol., J.lnterferon Res, 12: 449-453 (1992); Sijmons a kol., Bio/Technology 8: 217-221 (1990) a European Patent Office Publication EP 255,378.
Modifikovaný Faktor VII se může čistit affinitní chromatografii na sloupci s protilátkami proti němu. Zvláště výhodné je použití monoklonálních protilátek, závislých na vápníku, jak je popsáno u Wakabayashi a kol., J. Biol, Chem. 261: 1109711108, (1986) a Thim a kol., Biochem. 27: 7785-7793 (1988), které jsou zde uvedeny jako reference. Další purifikace se dá dosáhnout vhodnými chemickými purifikačními způsoby, jako je HPLC (high performance liquid chromatography). Jiné způsoby purifikace, včetně precipitace citranem barnatým, jsou v oboru známy a lze je použít k čistění zde popsaného, nově modifikovaného Faktoru Vil (obecně viz Scopes, R., , „ - ,n J--·-·— — ΜβΜΒΗ-— —- * · — — I. NM i* t.i.ttu... m ι«Ίι»ζ..ηι* -—· *—--··
Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.,1982). Pro farmaceutické účely je výhodný značně čistý modifikovaný Faktor VII, který má homogenitu přinejmenším 90 až 95 % a ještě výhodnější je produkt o homogenitě 98 až 99 % a více. Když je purifikován,
MM
částečně nebo do požadované homogenity, pak může být Faktor VII použit terapeuticky.
Modifikovaný Faktor VII je štěpen ve svém aktivačním místě, čímž je převeden na svou dvouřetězcovou formu. Aktivaci lze provést pomocí způsobů v oboru známých, jako ty, které popsali Osteruda kol., Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, U.S. Patent No. 4,456,591; Hedner a Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983) nebo Kisiel a Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983), které jsou zde uvedeny jako reference. Výsledná molekula je pak upravena na léčivo a podávána, jak je popsáno dále.
Prostředky
Sloučeniny budou obyčejně podávány v období 24 hodin před provedením zásahu, a až 7 nebo více dní po ném..Podání prostředků pro předcházení nebo minimalizaci poškození myokardu lze uskutečnit řadou způsobů, jak je zde dále popsáno. Sloučeniny mohou být také podány místně na cévní místa, citlivá ke tvorbě sraženin, např. na místa, kde'bylo .provedeno cévní spojení nebo na cévní místa se sníženou průchodností.
Při předcházení nebo léčení- poškození myokardu, se dávka modifikovaného Faktoru VI! pohybuje v rozmezí 50 mg až 500 mg na den, častěji v rozmezí 1 mg až 200 mg na den a ještě výhodněji v rozmezí 10 mg až 175 mg na den pro pacienta vážícího 70 kg, jak pro úvodní, tak pro udržovací dávky, závisející ná váze pacienta a vážnosti stavu. - - -
Farmaceutické prostředky pro léčení poškození myokardu jsou určeny pro parenterálni 'podávání jak při preventivním, tak i léčebném použití. Farmaceutické prostředky,jsou výhodněji podávány parenterálně, tj. intravenózně, subkutánně nebo intramuskúlámě. Prostředky pro parenterálni podávání obsahují roztok molekul modifikovaného Faktoru VII, rozpuštěných v použitelném nosiči, s výhodou se jedná o vodný nosič. Je možno použít řadu vodných nosičů, např. vodu, pufrovanou vodu, 0,4% solný roztok, 0,3% glycin a tak podobně. Molekuly modifikovaného Faktoru VII mohou být upraveny do formy lipozómových přípravků pro cílené podáni na zraněná místa. Přípravy lipozómů jsou obecně popsány v např. U.S, 4,837,028, U.S. 4,501,728 a U.S, 4,975,282, uvedených zde jako reference. Přípravky mohou^býtjsterilizovány.běžnýmL dobře známými způsoby. Výsledné vodné roztoky mohou být baleny pro použití nebo filtrovány za aseptických podmínek a lyofilizovány, lyofilizované preparáty jsou pak před použitím rozpuštěny ve sterilní vodě. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné přídavné látky, které jsou vyžadovány pro přiblížení se fyziologickým fc * fcfcfcfc ·· « fcfc »· fcfc · · fc · · fcfcfcfc • fc ··· fcfcfcfc • · fc* · · * ♦····· • fc · · · fcfc fcfcfcfc fc fcfc ·«· fcfc fc* podmínkám, jako jsou činidla upravující pH a pufrující, činidla upravující osmotický tlak a podobné, např. octan sodný, mléčnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý atd. Koncentrace modifikovaného Faktoru VII v těchto přípravcích může kolísat v širokém rozmezí, tj. od méně než 0,5%, obvykle od nejméně 1 % do až 15 nebo 20 váhových % a bude vybírána v první radě podle objemů tekutin, viskozit atd., ve shodě s určitým zvoleným způsobem podávání.
Tedy typický farmaceutický prostředek pro intravenózní infuzi by měl obsahovat 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 10 mg modifikovaného Faktoru VII. Skutečné způsoby přípravy parenterálně podávaných sloučenin jsou známy nebo zřejmé pracovníkům se zkušenostmi v oboru a jsou detailněji popsány např. v Remingtonů Pharmaceutical· Science, 16. vydání, Mack Publishing .Company, Easton, PA (1982), která je zdě uvedena jako reference.
Prostředky, obsahující molekuly modifikovaného Faktoru VII, mohou být podávány jak za účely preventivními, tak za účely léčebnými. Při léčebných aplikacích jsou prostředky podávány pacientovi, který již trpí nemocí, jak je výše popsáno, v množství postačujícím pro léčení nebo přinejmenším zastavení vývoje nemoci a jejích průvodních projevů. Množství postačující k dosažení tohoto výsledku je definováno jako „terapeuticky účinná dávka,,. Toto účinné množství bude záviset na závažnosti nemoci nebo poranění a na váze a všeobecném stavu pacienta, ale obecně se nalézá v rozmezí od 0,05 mg až do 500 mg modifikovaného Faktoru VII na den pro pacienta o váze 70 kg, přičemž bývají běžně používány denní dávky od 1,0 mg až do 200 mg modifikovaného Faktoru VII. Musíme mít na paměti, že materiály uváděné v tomto vynálezu l^e obecně využít při vážných nemocech nebo stavech poranění, tedy při život ohrožujících nebo potenciálně život ohrožujících situacích. V takových případech, se zřetelem na minimální obsah cizorodých látek a to, že modifikovaný Faktor VII nevykazuje u lidí imunogenicitu, je možno a dokonce může být ošetřujícím lékařem považováno za žádoucí, podávat značné nadbytky těchto prostředků, obsahujících modifikovaný Faktor VII.
Při preventivních aplikacích jsou prostředky, obsahující modifikovaný Faktor VII podávány pacientovi, citlivému k nemoci, nebo jinak ohroženému nemocí nebo poraněním, aby byly podpořeny vlastní pacientovy protisrážlivé schopnosti. Takové množství definováno jako „preventivně účinná dávka,,. Při tomto typu použití, přesné množství opět závisí na pacientovu zdravotním stavu a váze, ale obecně se nalézá
4 ·>»» « 4 · * 4 · 4 4 4 4
4 * · 444· • 4 4* 4 « · 444444
- _ * * 4 4 * · ·
..... ·· ·'.....* v rozmezí od 0,05 mg až do 500 mg pro pacienta o váze 70 kg, běžněji od 1,0 mg až do 200 mg na 70 kg tělesné váhy.
Mohou se provádět jednotlivá nebo opakovaná podání prostředků, přičemž úrovně dávek a časový průběh bude určen ošetřujícím lékařem. U ambulantně léčených pacientů, výžadujících denní udržování hladiny, může být modifikovaný Faktor VII podáván kontinuální infuzí, např: pomocí přenosné pumpy.
Místní podávání modifikovaného Faktoru VII jako takového, např. místní podání modifikovaného Faktoru VII na cévní místa citlivá k tvorbě krevní sraženiny, (např. místa, kde byla provedena cévní spojení) nebo na cévní místa náchylná ke snížené r'· ” 'průchodnosti, lze provádět např. pomocí spreje, perfúzi, dvojitými balónkovými katétry, stenty, začleněnými do cévních štěpů, nebo hydrogely, používanými jako povlaky balónkových katétru; či jinými, zavedenými způsoby. Vkaždém případě by měly farmaceutické přípravky poskytnout takové, množství modifikovaného Faktoru VII, připraveného podle tohoto vynálezu, které je dostatečné pro účinné léčení pacienta.
Popis obrázků .
Obr. č.1 ukazuje konstrukci expresního vektoru pro Ser344®Ala modifikovanou DNA sekvenci Faktoru VII. Použité symboly jsou: 0-1, 0-1 mapové jednotky sekvence adenoviru 5; E, enhancer z viru SV40; MPL, velký pozdní promotor adenoviru 2; SS, soubor míst pro sestřih; pA, signál k polyadenylaci z SV 40 v pozdní orientaci.
Obr č.2 ukazuje vliv injekce DEGR-Faktoru Vila na tvorbu krevní sraženiny (ukládání krevních destiček) v aortě paviána s provedeným mechanickým poškozením, v porovnání s kontrolou ošetřovanou pomocí solného roztoku. Tepny byly měřeny po dobu 60 minut, DEGR-Faktor Vila významně potlačuje vývoj krevních sraženin bohatých na krevní destičky u tohoto modelu akutního cévního poškození u primátů.
P
Obr. č.3 ukazuje výsledky získané u buněk hladkého svalstva paviána, které * byly inkubovány se zvyšujícími se koncentracemi buď FVIIa (prázdné čtverečky), nebo
DEGR-FVIIa v přítomnosti konstantního množství FVIIa (5nM) (plné čtverečky). Úroveň aktivace FX byla poté určena za použití chromogenního substrátu S-2222. Hodnoty jsou vyjádřeny jako procenta amidolytická aktivity, naměřené v přítomnosti samotného nM FVIIa.
CC «*«.<· fc.ťp. A· CC cc
r. C <' <S» · C C C5 *' C.C; 5 r cř e č σΐ is c^c c· c </·· c; el c tf, β ccc «ce-β
C č ’« t cl C C
Cf.cn C r.c Ο.«Λ Μ Λ<·
Obr. č.4 zobrazuje velikost plochy vnitrní vrstvy u paviánů, kteří prodělali mechanické poškození karotidy a léčbu, DEGR-Faktorem Vila po dobu 7 nebo 30 dní, v porovnání s kontrolními zvířaty.
Obr. č.5 ukazuje poměr velikosti vnitřní vrstvy k. velikosti vnitřní + střední vrstvy ,stehenní.,tepny; paviána,;který podstoupil poranění balónkem a léčbu DEGR-Faktorem
Vila, přičemž kontrolní skupina zahrnovala 5 cév, při 7-denní léčbě bylo zkoumáno 11 /cév a při 30;denní[lécbě.byiy zkoumány 2cévy (ň= počet zkoumaných cév).
Obr.^č.fT ukazuje,protokol· pokusu; kde.byl.měřen;rozsah;-infarktujs(IS), oblast ve kterémedošlo k,obnovení průtoku: krve (NR);.oblast rizika (ARbprotromb.inový čas (PJ) .,Λ .1, , ·* .v ·►·'*· ' Γ* » -.'Wk ·** O. H.-4 . J. _ 4 - J .«Γ'-Μ· -V—. -ii·. »<·-’>
áclóbacaštecňé^aktjyacetrůmbop!astirar(aRlT)..,..,Λ f,-¾ ,Obr, č.7; ukazuje,.pjagram yelikpstr.infarktu,na.. konci, obdobíř obnovy^ krevního .•průtoku, ..vyjádřené-,jako / procento ^.oblastis rizikem^, infarktu ΐ ve střech 'léčebných * ' · ... 'J V > T .1 :} . .. fc· 'φρ.'·. · ···' * s“· ' C.· skupinách, přičemž tyto.tři léčebné skupinyJsou zvířata, léčená FFR-Faktorem. Vila, Faktorem Vila, á solným^roztokem. V každém ze sloupců je. vynesen průměr hodnot získaný z osmi zvířat + SD. ·
Obr. č.8 ukazuje diagram oblasti, ve- které nedošlo k obnovení krevního zásobení (NR) na konci období obnovy krevního průtoku, vyjádřeného jako procento oblasti s rizikem infarktu (zvířata léčená(FFR-Faktorem Vila, Faktorem Vila a solným roztokem)., V každém ze sloupců je,vynesen průměr hodnot získaný z osmi zvířat ±.SD.
.i ί ‘ v. . w-;-' MimW-· · ·“** - rWr.i» W· —·*»
ObrAč.S ukazuje závislost mezi očekávanou velikostí oblasti-bez obnoveného průtoku krve, (jako procento levé·, srdeční komory, LV), která-byla pro.Taždé zvíře vypočítána..pomocí rovnice mnohonásobné;lineární regrese a skutečně pozorovanou velikostí oblasti bez obnoveného průtoku krve (vyjádřeno jako procento z LV).
Obrn č. 10 ,ukazuje,/.diagram krevního .průtoku oblastí· myokardu (RMBF) pro myokard postižený ischemií po_dobu 20 min. a dále, po 10 min. a 2 hodinách po obnovení průtoku;krve.
Obr. č. 11 ukazuje vliv FFR-Faktoru Vila a. Faktoru Vila na protrombinový čas (PT) a dobu částečné aktivace tromboplastinu (aPTT).
i/' r:r-'f*í· *r 'Ar·'.-'•'irSf·, v 13 L-UHjTS 0:'ÍT ..1. ,
-si; n,
4444 • 4 « · | 4 4 4 | • 4 | • 4 *· • 4 · · |
4 · · 4 | 4 | 4 · | • 4 · ·44 |
4 4 4 | • | • * | |
44*· 4 | 4 4 | 4 4 4 | • 4 ·· |
Následující příklady jsou uvedeny jakožto ilustrace, nikoli jako omezení oblasti působnosti vynálezu
Příklady provedení vynálezu
Přiklad 1. Exprese Ser344®Ala344 Faktoru VII
Pro vytvoření Ser344®Ala Faktoru VII s mutovaným aktivním místem, byl plazmid FVII(565+2463)/pDX (U.S. Patent No. 4,784,950, uvedený zde jako citace; uložený v Americké typové sbírce kultur (American Type Culture Collection) pod přístupovým číslem 40205) štěpen Xba I a Κρη I a byl izolován výsledný fragment 0,6 kb, obsahující kódující oblast pro serin 344. Tento fragment byl klonován do M13mp19 štěpeného Xba I, Κρη I jak je ukázáno na Obrázku. Tato manipulace a následující kroky popsané dáte byly provedeny podle standardních postupů (popsaných např. vManiatís a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982) uvedený zde jako reference).
Mutageneze byla provedena na templátu M13 podle metod Zollera a Smitha, za použití mutagenního oligonukleotídů ZC1656 (5' TGG GCC TCC GGC GTC CCC CTT 3') a „univerzálního,, druhého primeru ZC87 (5' TCC CAG TCA CGA CGŤ 3'). Reakční produkty byly roztříděny pomocí kinázovaného oligonukleotídů ZC 1656. Pozitivní plaky byly vypíchány a byla připravena DNA matrice, která byla sekvencována od Pst I místa ě
na 1077 do místa Κρη I na 1213. Sekvenční analýza potvrdila přítomnost požadované mutace. Mutovaný klon byl označen 1656.
Za použití klonu 1656 byl konstruován expresní vektor. Mutovaná sekvence byla z M13 vektoru izolována jako 0,14 kb fragment Pst Ι-Κρη I. Tento fragment byl ligován k 1,7 kb Hind lll-Xba I fragmentu z FVII(565+2463)/pDX, 0,5 kb Xba 1 -Pst I fragmentu z FVII(565+2463)/pDX a 4,3 kb Kpn l-Hind III fragmentu z FVII(565+2463)/pDX, jak je ukázáno na Obrázku. Přítomnost požadované mutované sekvence byla potvrzena štěpením mutovaného a původního klonu pomocí Pst I a mutovaného inzertu Faktoru VII v M13 pomocí Κρη I a Xba I, připravením Southernových biotů z takto štěpené DNA a hybridizací biotů s radioaktivně značeným oligonukleotidem ZC1656.
Tkáňová linie ledvinných buněk z novorozených křečků BHK 570 (uložená v Americké sbírce kultur (American Type Culture Collection) pod přístupovým číslem 40205) byly transfekovány dvěma izoláty (označeny #544 a #545) expresního vektoru • · fcfcfc · · •fcfc· · fcfc fcfc* ·· ·*
1656. Buňky byly připraveny zředěním souvisle narostlé 10 cm plotny BHK 570 1:10 na pět 10 cm ploten v neselektívním médiu (Eaglovo médium modifikované podle Dulbecca [DMEM], obsahující 10% fetální hovězí sérum a 1% PSN - směs antibiotik [GIBCO Life Technologies, Gaithersburg, MD]). Po 24 hodinách, když buňky dosáhly 20 až 30 % souvislého nárůstu, byly kotransfekovány jedním izolátem expresního vektoru kódujícího mutaci 1656, piazmidem p486 (obsahující Adenovirus 5 ori, SV40 enhancer, Adenovirus 2 větší pozdní promotor, Adenovirus 2 trojdílnou úvodní sekvenci, 5' a 3' sestřihová místa, DHFRr cDNA a SV40 polyadenylační signál v pML-1 (Lusky a Botchan, Nátuře 293:79-81, (1981)) a 10 mg nosičové DNA (sonikovaná DNA z lososího spermatu), jak je ukázáno· vTabulce 1. DNA byla přidána do 15 ml zkumavky, pak bylo přidáno 0,5 ml 2x Hepes (25 g Hepes, 40 g NaC!,. 1,8 g KCI, 0,75 g Na2HPO4-2H2O a 0,5 g dextrózy, zředěno do 2,5 litru destilovanou vodou a pH upraveno na 6,95 až 7,0) a zkumavky byly promíchány. DNA v každé zkumavce byla sražena přidáním 0,5 ml 0,25 M CaCI2, přičemž byl tento DNA/Hepes roztok probubláván vzduchem pomocí Pasteurovy pipety. Zkumavky byly pak vortexovány inkubovány při teplotě místnosti 15 min. a znovu vortexovány. Směsi DNA pak byly po kapkách pomocí Pasteurovy pipety přidány na plotny s buňkami. S plotnami bylo rychle . zakrouženo a inkubovány při 37 °C po dobu 4 až 6 hodin. Po inkubaci byly ke každé misce přidány 2 ml 20% glycerolu. zředěného v Tris-NaCI (0,375 g KCI, 0,71 g Na2HPO4'2H2O, 8,1 g NaCI, 3,0 g Tris-HCI, 0,5 g sacharózy, zředěno v celkovém objemu 1 litr a pH upraveno na 7,9). S plotnami bylo rychle zakrouženo a ponechány při teplotě místnosti 2 min. Médium bylo poté z misek odebráno a nahrazeno 2 ml TrisNaCI. Plotny byly ponechány 2 mih. při teplotě místnosti, pak byl Tris-NaCI odebrán a nahrazen10 mi neselektivního média. Plotny byly inkubovány při teplotě 37 °C dva dny..
• fl fl ·· ·· « · · • fl flflfl· ·« • « ·· • · · · flfl * ···· ·· • · ··· ·· · •flfl ·· ··
Tabulka 1
Transfekce*
4-:
544 | 545 | 544 kontrola | 545 kontrola | |
Jméno piazmidu | ||||
klon 544 | 15 ml | — | 15 ml | — |
klon 545 | — | 30 ml | — | 30 ml |
p486 | 1,5 ml | 1,5 ml | — | — |
nosičova DNA | 1,6 ml | 1,6 ml | 1,6 ml | 1,6 ml |
* Použité koncentrace DNA byly: klon 544: 0,7 mg/ml; klon 545: 0,3 mg/ml p486: 1,49 mg/ml.
Po dvou dnech inkubace byly buňky rozředěny v selektivním médiu (DMEM obsahující 10% dialyzované fetální hovězí sérum, 1 % směsi antibiotik PNS a 150 nM methotrexátu) a vysety v ředěních 1:100, 1:250 a 1:500 na velké plotny. Plotny byly ''.i' inkubovány při 37 °C jeden týden. Po týdnu bylo médium vyměněno, nahrazeno selektivním médiem a u ploten kontrolována tvorba kolonií.
Po dalších osmi dnech, po tvorbě kolonií, bylo náhodně vybráno z transfekčních ploten #54¼ a #545 s ředěním 1:500 dvacet kolonií. Každý klon byl vyset do jedné jamky na šesti|amkové plotně a pěstován v selektivním médiu.. Po sedmi dnech byly pfotny souvisle narostlé a každý klon by! rozdělen na 10 cm plotny se selektivním médiem.
Výše popsané klony a kontrolní buňky transfekované tak, aby exprímovaly původní typ Faktoru Vil byly metabolicky označeny směsí, značící proteiny, s 35SMetionin-Cystein (NEN DuPont Biotechnology Systems, Wilmington, DE). Klony byly pěstovány v selektivním médiu a připraveny pro pokus pulzního značení. Buňky byly opláchnuty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem (Sigma, St. Louis, MO) a označeny čtyřhodinovým pulzem v 20 mCi/ml 35S-Cys-35S-Met, Po 4 hodinách byly buňky a supernatant odebrány. Buňky byly lyžovány v podstatě jak je popsáno • fl flflfl· flfl · flfl ·· fl* · · * · · flflfl* « flflfl Vflflfl • · flflfl flfl flfl* flflfl flfl · · · · · ···* · ·· ··· ·· ·* v Lenk a Penman, Cell 16:289-302,(1979) a 400 ml každého lyzátu a predčištěno s 50 ml staph A (Sigma, St. Louis, MO).
U vzorků z metabolicky značených buněk byla provedena radioimunoprecipitace (RIP) a to inkubací vzorků s 6 ml anti-Faktor VII polyklonálního antiséra po dobu 4 hodin. Ke každému vzorku byío přidáno šedesát mikrolitrů promytého stafylokokového proteinu A a vzorky byly míchány 1,5 hodiny při 4 °C. Vzorky byly centrifugovány a supernatant byl odstraněn. Sedimentty byly 2x promyty pufrem 0,7 M RIPA (10 mM Tris, pH 7,4, 1% deoxycholová kyselina [Calbiochem Corp., La Jolla, CA], 1% Triton X100, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 0,7 M NaCl) a 1x pufrem 0,15 M RIPA (10 mM Tris, pH 7,4, 1% deoxycholová kyselina [Calbiochem Corp., La Jolla, CA], 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Ke každému vzorku bylo přidáno sto mikrolitrů Ix SDS barvičky (50 mM tris-HCl; pH 6,8, 100 mM dithiothreitol, 2% SDS, 0,1% bromfen.olová modř, 10% glycerol) a vzorky byly povařeny 5 min., pak následovala centrifugace, kvůli odstranění proteinu A. Padesát mikrolitrů každého vzorku, bylo testováno na 10% polyakrylamidovém gelu. Výsledky ukázaly, že 9 z 10 klonů vylučovalo modifikovaný Faktor VII.
Příklad 2. Antikoagulační aktivita modifikovaného Faktoru VII
Schopnost proteinu modifikovaného Faktoru VII inhibovat krevní srážení byla měřena v jědnostupňovém srážecím testu za použití původního typu Faktoru VII jako kontroly. Rekombinantní proteiny byly připraveny vpodstatě tak, jak bylo popsáno výše, z buněk pěstovaných v médiu obsahujícího 5 mg/ml vitaminu K. Různá množství modifikovaného Faktoru VII (z klonu 544) nebo rekombinantního původního typu Faktoru VII byia naředěna do 100 ml 50 mM Tris pH 7,5, 0,1% hovězí sérumalbumin. Směsi byly inkubovány se 100 ml plazmy bez Faktoru VII (George King Bio-Medícal Inc., Overland Park, KS) a 200 ml tromboplastinu C (Dade, Miami, FL; obsahuje tromboplastin z králičího mozku a 11,8 mM Ca+t). Srážecí test byl proveden v přístroji na automatické měření doby srážení krve (MLA Electra 800, Medical Laboratories Automation, Pleasantville, NY) a srážlivost byla převedena na jednotky aktivity Faktoru VII za použití standardní křivky, zkonstruované z ředění 1:5 až 1:640 normální směsné lidské plazmy (předpokládáno, že obsahuje 1 jednotku aktivity Faktoru Vll/ml; připravena spojením citrátovaného séra zdravých dárců). Pří použití tohoto testu nevykazovaly preparáty modifikovaného Faktoru VII žádnou detekovatelnou koagulační aktivitu. Tabulka 2 ukazuje výsledky testu s údaji o srážlivosti pro kontrolní ·* ··»« ·· · · · · · « · · * ·* · · · ··· » » · · · · » ······ • · · · · ·
..............
(netransfekované) BHK buňky pěstované v médiu bucf s nebo bez vitaminu K, pro původní typ Faktoru VII a dva izoláty z buněk, exprimujících modifikovaný Faktor VII. Aktivita Faktoru VII se projevuje zkrácením doby srážení oproti kontrolním vzorkům.
Tabulka 2
Vzorek | Ředění | Doba srážení (sekundy) |
Kontrola +K | 1:5 | 33,1 |
1:1.0 | 33,4 | |
Kontrola -K | 1:5 | 34,3 |
1:10 | 33,2 | |
Původní typ Faktoru VII | 1:20 | 19,0 |
1:40 | 21,5 | |
1:80 | 23,3 | |
Modifikovaný Faktor VII (#6) | 1:1 | 33,5 |
Modifikovaný Faktor VII (#10) | 1:1 | “ 32,5 |
Pro určení vlivu modifikovaného Faktoru VII na substráty plazmatického faktoru, /
preparáty; modifikovaného Faktoru VII, rekombinantní původní typ Faktoru VII nebo nativní Faktor VII jsou inkubovány bud s Faktorem X nebo Faktorem IX a jejich inaktivace je zjišťována buď srážecím testem nebo polyakrylamidovou elektřoforézou.
Příklad 3. Schopnost modifikovaného Faktoru VII vázat se k tkáňovému faktoru
Schopnost modifikovaného Faktoru VII kompetovat s původním Faktorem VII o tkáňový faktor a inhibovat tak jeho srážecí aktivitu byla zjišťována v jednostupňovém srážecím testu za přítomností omezeného množství tkáňového faktoru (tromboplastinu).
Doby srážení byly určovány jednostupňovým srážecím testem podobně, jak bylo popsáno v Příkladu 2. Ve směsných pokusech bylo použito omezené množství tkáňového faktoru, konstantní množství původního Faktoru VII a zvyšující se množství ·· «tototo toto · ·· *· • to to · · ♦· «toto • to to1 to · to to ·· to to toto • to ··· to* • to·* to toto ·«· ·· ·* variant Faktoru VII. Inhibice Faktor Vll/Vlla prokoagulační aktivity by se mělo projevit prodlužováním srážecích časů u testů obsahujících zvyšující se množství změněných Faktorů VII.
Velikost aktivity Faktoru VII v testovaných vzorcích byla spočtena jako procento ze standardní křivky, jež měří aktivitu Faktoru VII v normální směsné plazmě. Standardní křivka pro aktivitu Faktoru VII byla vytvořena pomocí sériových ředění normální směsné plazmy v roztoku pufrovaném fosfátem (PBS), jež byla v rozmezí 1:5 až 1:640. Pro tento účel bylo předpokládáno, že normální plazma obsahuje přibližně 500 ng/mf Faktoru VII a toto bylo pokládáno za jednu jednotku aktivity. Směs 100 ml píázmy bez Faktoru VII, 100 ml ředění plazmy a 200 ml tromboplastinu C (Dade, Miami,
FL) bylo použito pro měření srážecích časů na automatickém přístroji na měření doby srážení krve MLA Electra 800. Pro stanovení standardní křivky byly výsledky vyneseny do grafu jako procenta aktivity (1:5 = 100 % aktivity) oproti srážecímu času v sekundách.
Test vyžadoval, aby médium, obsahující původní a pozměněný typ Faktoru VII, mělo méně než 1 % séra. Ředění byla provedena v PBS tak, aby se srážecí časy v grafu umístily podél standardní křivky. Typické bylo minimální ředění T.2. Konečný objem byl 100 ml. V těchto pokusech byly testovány dvě odlišné varianty lidského Faktoru VII Ser344®Ala34<t, označené jako klony „#10„ a „#6„. Výsledky ..sestavené . v Tabulce uvedené dále ukazují, že jak se množství pozměněných Faktorů VII zvyšuje, tak se snižuje procento aktivity Faktoru Vila.
00 0000 | 0 0 | 0 | 00 0« | |||
• 0 · | 0 | 0 | 0 0 | 0 0 « | • | |
0 | ||||||
* 0 | 0' · | 0 | • 0 | 000 0· | 0 | |
0 0 | 0 | 0 | • | 0 | 0 | |
• 010 0 | >0 | 000 | 00 00 |
Tabulka 3
Výsledky směsných pokusů s Ser344 Ala variant (B4A1 (původní typ) médium bylo použito jako 100 % aktivity při 10 μΙ/reakci).
Ser344 -> Ala klon číslo | Množství média | Množství Β4Α1 média | ΒΗΚ kontrola* | % FVIIa aktivity |
10 μΙ | 10 μΙ | 0 | 70 | |
' #10 | ...... ..... —· | ---------. ... | ..... -------- ... | _ .... .. .......- |
20 μ! | 10 μΓ | 0 | . 51 | |
. 30 μΙ | 10 μΙ | 0 | 43 | |
40 μΙ | 10 μΙ | 0 | 34 | |
50 μΙ | 10 μΙ | 0 | 28 | |
’ #10 (-K)§ | 20 μΙ | ΊΟμΙ | 0 | 78 |
#6 | 10 μΙ | 10 μΙ | 0 | 74 |
20 μΙ | 10 μΙ | 0 | 56 | |
t | 30 μΙ | 10 μΙ | 0 | 46 |
40 μΙ | 10 μΙ | 0 | 41 | |
50 μΙ | 10 μ! | 0 | 32 | |
20 μΙ | 10 μΙ | 0 | 85 | |
BHK kontrola | 0 | 10 μΙ | 20 μΙ | 91 |
BHK kontrola (-K) | 0 | 10 μ! | 20 μΙ | 107 |
* Netransfekované médium § Pro expresi variant Faktoru VII byly buňky pěstovány v přítomnosti vitaminu K, kromě těch, které jsou označeny fcfc «*·♦ *· · ·· ·« • · · fcfc fcfc · · · * fcfc · fc · ««fcfc
V · »1 · fc 9 9 999 999
9 9 9 9 9 9 ···· · ..... ·· ··
Tyto výsledky ukazují, že varianty Faktoru VII, které mají substituci Ser344®Ala, kompetují s nativním Faktorem VII způsobem, který je závislý na dávce v reakci a inhibují prokoagulační aktivitu nativního Faktoru Vll/Vlla. Lze tedy uzavřít, že Ser344®Ala varianta lidského Faktoru Vil kompetuje s nativním lidským Faktorem Vila a následkem toho inhibuje aktivaci Faktoru X anebo IX v lidské plazmě.
Příklad 4. Reakce Faktoru VII s PPACK
Rekombinantní faktor VII byl produkován v transfekovaných ledvinných buňkách připravených z novorozených křečků. Protein byl vyčištěn a aktivován podle Thim a kot. fBiochemistry 27: 7785-7793, 1988), Brinkous a. kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:·
1382-1386, 1989) a Bjoem a Thim (Res. Pisci. No, 269, 564, 1986),. které jsou zde uvedeny v citacích. Medium z buněčných kultur bylo odebráno, filtrováno a zředěno kvůli snížení koncentrace soli. Zředěné medium pak bylo frakcionováno aniontovou výměnnou chromatografií za použití eiučního pufru, obsahujícího CaCi2. Získaná frakce Faktoru Vil byla dále čištěna imunochromatografií za použití Ca-dependentní antiFaktor Vil monoklonální protilátky. Další čištění bylo provedeno za použití dvou stupňů aniontové výměnné chromatografie, kde byl Faktor VII eluován CaCI2 a NaCl. Faktor Vila,byl získán v konečném eiuátu.
Rekombinantní Faktor Vila (1 mM) v 50.mM Tris-HCI, .100 mM NaCl, 5 mM CaCI2, pH 7,’4 byl inkubován s 20 mM PPack (D-Phenylalanyl-Prolyl-Arginyl chlorometyl keton; Calbiochem, La Jolla, CA) po dobu 5, 20 a 60 minut. Poté byl přidán pufr •obsahující chromogenní substrát S2288 (H-D-lsoleucine-L-Propyl-L-Arginine pnitroanilide; Kabi Vitrum AB, Molndal, Sweden) tak, aby se dosáhlo 2,5-násobné zředění a tím konečné koncentrace 0,3 mM S2288. Byla měřena tvorba p-nitroanilinu a. srovnána s výsledky dosaženými s neupraveným Faktorem VII jako kontrolou. Výsledky ukazují, že Faktor Vila je-za těchto reakčních podmínek asi po 60 minutách zcela inaktivován.
Příklad 5. Tvorba DEGR-Faktoru Vila
Rekombinantní lidský Faktor Vila byl připraven, jak je uvedeno v Příkladu 4. Rekombinantní lidský Faktor Vila v 10 mM glycinovém pufru, pH 8.0, 10 mM CaCI2, 50 mM NaCl, byl zředěn na koncentraci 1,5 mg/ml. K tomuto Faktoru Vila byl přidán 10násobný molární nadbytek Dansyl-L-Glu-Gly-Arg-chlorometylketonu, DEGRck, (Calbiochem, La Jolla, CA 92037), který byl rozpuštěn v destilované H2O. Po 2 c, n
C f r; C f i;
«Ϊ <;
Γ· ¢/
15] « «ť ·'·«;
*?< « ·:: «' »i , iff * *: c ♦:· rf. f|-i <·*:· :·:<· *í L *· »?-i ···>
hodinách inkubace při 37 °C'byl ke-směsi; přidán druhý 10-násobný molární nadbytek DEGRck a inkubovário'další 2 hodiny pří 37 °C. Pak byl k Faktoru Vila přidán třetí 10násobný molární nadbytek DEGRck a inkubováno přibližně 16 hodin pri 4 °C. Vzorek DEGRčk-Faktor.VI lat byl·, rozsáhle 'dialyzován· při 4’“C -proti iTris-pufrovanému, solnému 'roztoku (0,05 M Tris-HCI, 0,1 M NaCI, pH 7,5), aby byl odstraněn veškerý volný DEGRck.
Konečná směs DEGR-FaktorůVllá».býla testována na přítomnost volného DEGRck pomoci)pokusu s Faktorem, Xa a chromogením r substrátem. Směs.DEGRFaktor Vllaj byla přidána k čištěnému lidskému Faktoru Xa spolu s chromogením substrátem S-2222. Tento substrát je specificky, štěpen.Faktorem Xa·a nikoli Faktorem Vila. Nevázaný DEGRck ve směsi má schopnost se vázat k Faktoru Xa a tak inhibovat jehéřchronriogeriníf aktivituX Vychytání' (Volného· DEGRck ve směsi ‘s Faktorem Xa vytvořilo standardní křivku.pro měřenhhládřny volného DEGRck v roztoku proti inhibici Ghromogénní. aktivityiFaktoru-Xa.'Analýza směsi DEGR-Faktor Vila ukázala, že poměr ;volňého;lDEGRčk:,DEGR-Fáktor,Vlla-íbyl,ypó'rozsáhlé dialýze menší než 0,5 %, což zajišťuje; že pozoroVáhá inhibice DEGR-Faktorem Vila v různých dále popisovaných pokusných systémech; nebyla způsobena volným DEGRck.
Příklaď.6..Tvorba FaktóruXa· na povrchubuněk^hládkých svalů krys··,-,,.__________ př r . - Buňky ,. hladkých!. svalů cév.'3 by ly. analyzovány .na- přítomnost, povrchového ..tkáňového, faktoru?měřením schopnosti těchto buněk Stimulovat přeměnu Faktoru X ha
- í j Faktor Xa za použití chromogenního substrátu;který je specifický pro Faktor Xa. Λ,ν.
• .-i? mdKrysí buňky-hladkých svalů, cév (Clowesta.- kol:y.. JjCIin.; Invest.., 93:644-651 (1994)) byly vysazeny v růstovém médiu do'’ 96-jamkových kultivačních destiček (American Scientific Products, Chicago, II.) za použití 8000 buněk..na jamku (Tabulka 4)· '
Tabulka 4
500 ml Eaglovo medium modifikováno dle Dulbecca (DMEM) (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.) ' .
10% fetálni telecí sérum (Hyclone, logan, UT.). ,· mM pyruvát sodný (Irvine, Santa Anna, CA.)· .0,29 mg/ml L-glutamin (Hazelton/Lenexa, KS), „ ...
·· «*4« | ·· * | fcfc fcfc | |
• · · | • · | • · | fc · ♦ · |
» · | fcl · « | • | • ··· |
• · | • · | • | * » |
·· · · · | • · | • ·· | • fc fc· |
1x PSN (100x je 5 mg/ml penicilín, 5 mg/ml streptomycin, 10 mg/ml neomycin) (GIBCOBRL, Gaithersburg, MD.)
Po inkubaci 48 hodin při 37 °C bylo medium zaměněno za medium bez séra (Tabulka 5).
Tabulka 5
250 ml Eaglovo medium modifikováno dle Dulbecca (DMEM) (GIBCO-BŘL, Gaithersburg, MD.)
250 ml Hamsovo medium F-12..(Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) mM pyruvát sodný (Irvine, Santa Anna, CA.)
0,29 mg/ml L-glutamin (Hazelton, Lenexa, KS) mM transfenn (JRH, Lenexa, KS.) mM insulin (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.) ng selen (Aldrich, Milwaukee, WI.) mg/ml hovězí sérumalbumin (Sigma, St. Louis, MO.)
Buňky byly inkubovány 72 hodin při 37 °C. ^Po této inkubaci bylo k buňkám přidáno buď PDGF-ΒΒ (Wng/ml) nebo 10% fetální telecí sérum, aby došlo ke stimulaci exprese tkáňového faktoru (Taubman a kol., J, Clin. Invest. 91:547-552, 1993). -Paralelní soubor buněk neobdržel ani PDGF ani sérum, kvůli zjištění vnitřní aktivity nestimulovaných buněk. Po 6- hodinové inkubaci byl k buňkám přidán rekombinantní lidský Faktor Vila v konečné koncentraci 10 nM. K jednomu souboru buněk nebyl Faktor Vila přidán - tento soubor byl použit jako negativní kontrola. Buňky byly inkubovány 2 hodiny při 37 °C a promyty HEPES pufrem (10 mM HEPES, 137 mM NaCI, 4 mM KCL, 5 mM CaCI2,11 mM glukóza, 0,1% hovězí sérumalbumin). Po promytí byly buňky inkubovány 5 min. s 50 ml (na kultivační jamku) 200 nM lidského Faktoru X (izolovaného z plazmy) v Tris-pufrovaném solném roztoku doplněném 5 mM CaCI2. Ke každé kultivační jamce bylo přidáno 25 μ| 0,5 M EDTA a 25 ml 800 mM roztoku chromogenního substrátu S-2222' (Kabi Pharmacia, Franklin, OH.). Plotny byly inkubovány 40 min. při teplotě místnosti a poté analyzovány při 405 nm na přístroji na odečítání mikrodestiček THERMOMAX (Molecular Devices, Menlo Park, CA).
ΒΒ ·» • · · · • · · 9
Β Β · Β Β Β » Β
ΒΒ »»
BB BBBB * 9 » Β Β · • · ·»«» Λ ·· 9 • Β ·· • Β »
Β Β Β • « · ·· 9 ΒΒ
Tabulka 6 ukazuje zvýšení absorbance u buněk, na které bylo působeno Faktorem Vila, ve srovnání s kontrolními buňkami (nepřidán Faktor Vila). Zvýšení absorbance je přímou mírou úrovně Faktoru X, tvořeného v buňkách a jeho následného štěpení chromogenního substrátu, při kterém je uvolňován chromofor. Údaje také ukazují, že úroveň chromogenní aktivity v buňkách, na které se předem působilo buď PDGF-BB nebo 10% fetálním telecím sérem, byla vyšší, než u nestimulovaných buněk.
Tabulka 6
Testovaný vzorek | OD405 |
Kontrola | 0,043 |
Vnitřní aktivita | 0,247 |
PDGF-BB | 0,360 |
10% hovězí fetální sérum | 0,342 |
Tyto výsledky jasně ukazují, že aktivace Faktoru X na Faktor Xa na povrchu buněk hladkých svalů cév u krys je závislá na Faktoru Vila.
Příklad 7? Ir)hibice chromogenní aktivity na buněčném povrchu pomocí DEGR-Faktoru Vila
Krysí hladké svalové buňky cév byly nasazeny v růstovém médiu do 96jamkových kultivačních destiček, jak bylo popsáno výše. Buňky byly pěstovány 72 - hodin v médiu bez séra, jak bylo popsáno výše a potom k nim bylo přidáno na 6 hodin 10% fetální telecí sérum, aby došlo k stimulaci exprese tkáňového faktoru. Po stimulaci byl přidán ke každé kultivační jamce bud pouze pufr (kontroly), 10 nM Faktor Vila, nebo 10 nM Faktor Vlla+100 nM DEGR-Faktor Vila. Buňky byly inkubovány 2 hodiny při 37 °C a poté promyty HEPES pufrem. Po promytí byly buňky inkubovány 5 min. s 50 ml (na kultivační jamku) 200 nM lidského Faktoru X (izolovaného z plazmy) v Trispufrovaném solném roztoku doplněném 5 mM CaCI2. Ke každé kultivační jamce bylo přidáno 25 μΙ 0,5 M EDTA a 25 ml S-2222 (800 mM) chromogenního substrátu (Kabi Pharmacia). Buňky byly inkubovány 40 min. při teplotě místnosti. Chromogenní aktivita byla analyzována při 405 nm jak bylo popsáno výše.
«4 » * • · » 4 • 4 «44 • 4 ♦ • 4
4 4 • · t* 4
44 «4 4 • 4 4 · • ·44 4*4
4
44
Tabulka 7 ukazuje stimulaci chromogenní aktivity v buňkách, na které bylo působeno pouze Faktorem Vila, a naopak inhibici této stimulace, když byl s Faktorem Vila společně inkubován DEGR-Faktor Vila. Tyto výsledky ukazují, že DEGR-Faktor Vila působí jako kompetitivní inhibitor pro vazbu Faktoru Vila, tudíž inhibuje aktivaci Faktoru X na Faktor Xa a následné štěpení chromogenu S-2222.
Tabulka 7
Testovaný vzorek | OD405 |
Kontrola - - | - ........0,035 .......... |
. Faktor Vila | 0,342 |
Faktor Vila + DEGR-Faktor Vila | 0,073 |
Příklad 8.. Závislost inhibice chromogenní aktivity na.buněčném povrchu svalových buněk hladkých svalů krys na dávce podaného DEGR-Faktoru Vila
Hladké svalové buňky cév krys byly nasazeny v růstovém médiu do 96jamkových kultivačních destiček’(4000 búněk/jámku)’v růstovém médiu doplněném 1% fetálním telecím sérem (jako v Tabulce 4 bez 10% fetálního telecího séra). Po pěti dnech bylo médium odebráno a k buňkám přidány buď zvyšující se koncentrace samotného Faktoru Vila, nebo 10 nM Faktor Vila se zvyšujícími se koncentracemi DEGR-Faktoru Vila. Buňky byly se směsemi Faktoru Vila inkubovány 2 hodiny při 37 -°C. Po inkubaci byly buňky promyty a inkubovány s 50 ml 200 nM Faktoru X v Trispufrovaném solném roztoku 5 min. při teplotě místnosti. Ke každé kultivační jamce bylo přidáno 25 ml 0,5 M EDTA a 25 ml 800 mM S-2222 (Kabi Pharmacia) a destičky byly inkubovány 40 min. při teplotě místnosti. Chromogenní aktivita byla analyzována při 405 nm na přístroji na odečítání mikrodestiček, jak bylo popsáno výše.
Tabulka 8 ukazuje zvyšování chromogenní aktivity, závislé na zvyšující se dávce Faktoru Vila, přidaného do kultivačních jamek. Když byla k buňkám přidána směs DEGR-Faktoru Vila s 100 nM Faktoru Vila (Tabulka 9), byla zřejmá inhibice chromogenní aktivity, závisící na podané dávce. Při molárním poměru 1:1 DEGRFaktor Vlla:Faktor Vila bylo inhibováno přibližné 95% chromogenní aktivity. Tyto údaje ► · flflfl
A • fl ···· naznačují, že při tomto pokusném uspořádání má DEGR-Faktor Vtla podstatně vyšší afinitu k tkáňovému faktoru na povrchu buněk, než nativní Faktor Vila v kulturách buněk hladkých svalů. Pokud by DEGR-Faktor Vila a Faktor Vila měly stejnou afinitu pro vazbu tkáňového faktoru, pak by úroveň inhibice, která je pozorována při přidání stejného molárního poměru těchto dvou molekul k buňkám, neměla být tak vysoká.
Tabulka 8
Koncentrace Faktoru Vila (nM) | OD405 |
0,10 | 0,005 |
0,39 | 0,025 |
1,56 | 0,058 |
6,25 | 0,111 |
65,00 | 0,154 |
100,00 | 0,208 |
Tabulka 9 ukazuje závislost inhibice „chromogenní .aktivity Faktoru Xa na buněčném povrchu v kulturách buněk hladkých svalů na dávce DEGR-Faktoru Vila. Zvyšující se.(koncentrace DEGR-Faktoru Vila byly inkubovány společně s 100 nM Faktoru Vila a chromogenní aktivita Faktoru Xa byla určena za použití chromogenního substrátu 3-2222.
·· • 0 ···0
· · ♦♦4 ··· ♦ ·
4· 0· • 4 0 · 0
Tabulka 9 •hi fa'
Λ·
Konc. DEGR-Faktoru Vila (nM) | OD405 |
0,10 | 0,208 |
0,39 | 0,176 |
1,56 | 0,116 |
6,25 | 0,073 |
65,00 | 0,026 |
100,00 | 0,014 |
Příklad 9. Závislost inhibice tvorby Faktoru Xa pomoci DEGR-Faktoru Víla při testování rozpustného tkáňového faktoru
Přeměna Faktoru X na Faktor Xa pomocí Čištěného rekombinantního rozpustného tkáňového faktoru byla stanovena pomocí chromogenního testu. Tkáňový -faktor byl exprimován a vyčištěn z Saccharomyces cerevisiae (Shigematsu a kol., 1 Biol, Chem. 267:21329-21337, 1992), Rozpustný tkáňový faktor byl čištěn a charakterizován Dr. W. Kisielem (University of New Mexico). Byla připravena reakční směs obsahující 65,9 ml rozpustného tkáňového faktoru (2,2 mM), 29,0 ml PCPS (1 f
mM, Sigma, ST. Louis, MO), 29,5 ml lidského Faktoru X (4,1 mM), 2,77 ml Hanksova pufru (25 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 5 mM CaCh, 0,1% hovězí sérumalbumin). Čtyřicet μί směsi tkáňový faktor/Faktor X, 25 ml Faktoru Vila zředěného vTBS a 25 ml DEGR-Faktor Vila zředěného vTBS bylo přidáno ke každé kultivační jamce v 96-jamkové mikrotitračnl destičce. Rovněž byla zahrnuta kontrola používající 40 ml směsi tkáňový faktor/Faktor X; 25 ml Faktor Vila zředěného v TBS a 25 ml TBS. Deset mikrolitrů chromogenního substrátu S-2222 (4 mM) bylo přidáno k reakční směsi v kultivačních jamkách a inkubováno při teplotě místnosti 2 až 10 min.. Výsledky byly analyzovány při 405 nm na přístroji na odečítání mikrodestiček, jak bylo popsáno výše.
Standardní křivka pro aktivaci Faktoru X Faktorem Vila byla stanovena za použití zvyšujících se koncentrací Faktoru Vila přidávaného v nepřítomnosti DEGRFaktoru Vila. Výsledky uvedené v Tabulce 10 ukazují, že existuje zvyšování
999 « · ·« • * ···« v« • · * · » * · « Λ
9 9 9 9 · · · chromogenní aktivity, závislé na zvyšující se dávce Faktoru Vila, přidaného do reakční směsi. Současné přidání různých množství DEGR-Faktoru Vila a 100 nM Faktoru Vila vedlo k dávkově závislému snižování chromogenní aktivity (Tabulka 11). Tyto údaje ukazují, že DEGR-Faktor Vila působí jako kompetitivní inhibitor vazby nativního Faktoru Vila k rozpustnému tkáňovému faktoru a tedy inhibuje tvorbu Faktoru Xa, což se projevilo naměřeným snížením chromogenní aktivity pro chromogenní substrát S2222.
Tabulka 10
Stimúlače chromogenní aktivity Faktoru Xa zvyšujícími se koncentracemi Faktoru Vila, přidanému k rozpustnému tkáňovému faktoru. Změny v optické densitě byly měřeny za použití chromogenního substrátu S-2222.
Koncentrace Faktoru Vila (nM) | OD405 | |
0,78 | 0,168 | |
1,56 | 0,288 | |
3,12 | 0,478 | - |
6,25 | 0,694 | |
12,50 | 0,764 | |
25,00 | . 0,790 | |
50,00 | 0,738 | |
100,00 | 0,770 |
• toto* • * « · · · ’
.............*
Tabulka 11
Zde je měřena inhibice chromogenní aktivity Faktoru Xa přidáním DEGR-Faktoru Vila k rozpustnému tkáňovému faktoru za přítomnosti nativního Faktoru Vila. Změny v optické densitě byly měřeny za použití chromogenního substrátu S-2222.
Konc. DEGR-Faktoru Vila (nM) | OD405 |
0 | 0,810 |
............. 50’ ’ | 0,750 |
100 | 0,609 |
200 | 0,296 |
400 , | 0,167 |
800 | 0,083 |
1600 | 0,055 |
Příklad 10. Inhibice koagulace působením DEGR-Faktoru Vila ” ' . Standardní-srážecí pokusy, zjišťující vliv DEGR-Faktoru Vila na srážlivost, byly připraveny takto: 100 mí normální paviání plazmy, odebrané s citrátem sodným jako antikoagulačním prostředkem, bylo přidáno k 100 ml různých koncentrací DEGR..Faktoru Víla, zředěného v TBS (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl). Vzorky byly smíchány, krátce inkubovány při 37 °C a poté vloženy do přístroje na automatické měření doby srážení krve Efectra 800 (Medical Laboratories Automation, Pleasaníville, NY). Po inkubaci bylo k preparátům DEGR-Faktoru Víla přidáno 200 ml preparátu tkáňového fáktoru, obsahujícího 25 mM CaCI2. Preparát tkáňového faktoru byl připraven jako extrakt ve fyziologickém roztoku z čerstvě zmražené tkáně paviáního mozku a byla zjišťována jeho schopnost iniciovat koagulaci paviání plazmy. Byla vybrána taková koncentrace tkáňového faktoru, která dávala dobu srážení asi 40 sekund.
fc fcfc í · · ·
F fcfc · fcfcfc · · · • fc * · · · fc · fc · * · · fc··· · fcfc ···
Údaje uvedené vTabulce 12 ukazují zvyšování doby srážení v závislosti na dávce přidaného DEGR-Faktoru Vila. Dávka asi 1 mg/ml DEGR-Faktoru Vila v plazmě má za následek zřetelné zvýšení doby srážení.
Tabulka 12
Závislost doby srážení na dávce DEGR-Faktoru Vila.
Konc. DEGR-Faktoru Vila (gg/ml plazmy) | Doba srážení (sekundy) |
0 | 40,7 |
0,5 | 46,2 |
1,0 | 50,8 |
2,5 | 64,5 |
5,0 | 108,1 |
10,0 | 158,4 |
Příklad 11. Inhibice shlukování krevních destiček působením DEGR-Faktoru Vila
U nižších primátů byla testována schopnost DEGR-Faktoru Vila inhibovat shlukování krevních destiček na místech arteriální trombózy, způsobené mechanickým poraněním'. Byl použit model vynětí částí tepny u paviánů, jak bylo popsáno u Lumsden a kol.. (Blood 8T.1762-1770 (1993)). Úsek aorty dlouhý asi 1 až 2 cm byl vyjmut, -obrácen a oškrábán, aby byla odstraněna vnitřní vrstva arteriální stěny a přibližně 50 % střední vrstvy. Tepna byla obrácena zpět do správné orientace, na obou koncích byla zavedena kanyla, a umístěna paviánovi jako mimotělní odbočka. Mechanicky poškozená tepna tedy byla vystavena krvi paviána při jejím průchodu odbočkou.Těsně před otevřením odbočky pro průtok krve byly zvířeti injekčně podány autologní krevní destičky značené 111 In. Úroveň shlukování krevních destiček na místě poraněné tepny byla v reálném čase zaznamenávána gamma kamerou.
Vliv DEGR-Faktor Vila na inhibici shlukování krevních destiček byl hodnocen po injekčním podání DEGR-Faktoru Vila nebo fyziologického roztoku (jako kontroly), které • * · »·* · • · · • « « · · · · ··* ··· • · * · * * - - * ·««« · flfl ··· ·* ·· byly podány těsně před otevřením odbočky. Poraněné tepny byly nepřetržitě měřeny po dobu 60 min. Dávka DEGR-Faktoru Vila 0,005 mg/kg inhibovala shlukování krevních destiček. Při injekčním podání 1,0 mg/kg bylo shlukování krevních destiček přibližně z 90 % inhibováno 60 min. po podání látky. Tyto výsledky jsou ukázány na Obr. 2.
Uvedené údaje ukazují, že v tomto modelu akutního cévního poškození u nižších primátů, může inhibice tkáňového faktoru DEGR-Faktorem Víla významně zamezovat tvorbě krevních sraženin bohatých krevními destičkami v cévách.
Příklad 12. DEGR-FVIIa inhibuje opětné zúžení cév po operaci cév u atherosklerotických králíků.
- ... Byla hodnocena schopnost DEGR-FVIIa zmírnit vývoj poranění, vzniklých při operaci cév u-novozélandských bílých (NZW) atherosklerotických králíků. Tento zvířecí model byl dobře prostudován a ukázal se být vhodný pro hodnocení vlivu antithrombotických látek na vývoj cévních poranění (Gimple a kol., Circulation 86:15361546 (1992) a Rogosta a kol., Circulation 89:1262-1271 (1994)). Zvířecí model, použitý k testování DEGR-FVIlaje se v podstatě shoduje s Rogosta a kol., tamtéž.
Anestézie byla u králíků navozena intramuskulární injekcí 5 mg/kg xylazinu a 35 mg/kg ketaminu. Proximální stehenní tepny byly odkryty řezem pod tříselným vazem, podvázány a na obou koncích byly zavedeny kanyly. Jehlou byl vytvořen otvor a izolované segmenty byly promyty fyziologickým roztokem, aby byl odstraněny zbytky krve a vysušeny proudem vzduchu při rychlosti 80 ml/mín. po dobu 8 min. Po sušení vzduchem byly izolované segmenty znovu propláchnuty fyziologickým roztokem a odstraněny podvázání. Krevní oběh byl udržován místním tlakem. Úseky byly vyznačeny kovovými svorkami. Místní křeče byly léčeny místním podáváním 1% Xylokainu. Den po operaci byla zvířatům nasazena dieta obsahující 1 % cholesterolu a 6 % oleje podzemnice olejně na dobu 1 měsíce, až do operace tepen pomocí balónkového katétru. Pro potlačení pooperační bolesti byl podáván orálně Tylenol v dávce 10 mg/ml během 3. až 5. dne po operaci. Ambipen v dávce 1cc byl podáván během 3. až 5. dne po operaci,
Test podáváni léků zvířatům spočíval v podání počáteční injekce bezprostředně před operací pomocí balónkového katétru, následované kontinuální systémovou infuzí pomocí osmotické pumpy přes vnitrní krční žílu. Infúze léku trvala 3 dny. Kontrolním zvířatům byl před operací pomocí balónkového katétru podán heparin v dávce 150 ·
• · * ·
Μ · · · • · 4 4 4 ·« · «4 4 4« · » · ·44 4·44 * « 4 4 · ···· · “ ” jednotek/kg, následován infuzi fyziologického roztoku. Zvířata léčená DEGR-FVIIa dostala injekci 1 mg/kg a poté následovala infuze 50 mg/kg/hodinu.
Pro umístění osmotické pumpy pro kontinuální systémovou infuzi byla navozena anestézie, jak je popsáno výše, a udržována po dobu procedury dalšími intramuskulárními injekcemi ketaminu a Xylazinu. Řezem podél střední linie krku byla odkryta pravá vnitřní krční žíla, izolována příčným odříznutím a vzdálenější konec byl podvázán. Do pravé vnitrní krční žíly byla zavedena trubice (PE 160). Byl vytvořen podkožní tunel pro vedení této trubice. Trubice byla spojena s osmotickou pumpou, která byla implantována pod kůži na zádech králíka. Pravá krční tepna byla izolována příčným' oddělením a vzdálenější konec byl podvázán. Do tepny byl umístěn 5F zaváděč a posunut ke spojení srdečnicového oblouku. Byla odebírána krev pro měření hemostatických parametrů, léků a hladiny cholesterolu. Dvacet miligramů xylokainu bylo aplikováno i.ntraarteriálně. Kontrolní .angiogram stehenní aorty byl proveden pomocí 5F Bermanova katétru, umístěného nad rozvětvením aorty za pomoci 3 až 4 ml renografinu, injikovaného ručně po 3 sekundách.
Po odstranění Bermanova katétru byl do sestupné aorty zaveden 0,014 palcový vodící drát a umístěn nad rozvětvením aorty. Za fluoroskopické kontroly byl zaveden angioplastický balónkový katétr vhodné velikosti 2 až 2,5 mm, veden pomocí vodícího drátu a umístěn do zúžení. Balónek byl ručně nafouknut na 6 atmosfér po dobu 60 sekund. Byla provedena 3 nafouknutí, mezi nimiž byly 60 sekundové intervaly. Tato procedura byla provedena u každého zvířete v obou stehenních tepnách.
Po roztažení pomocí balónku byl angioplastický katétr odstraněn a Bermanův katétr znoyu uveden do pozice 3 cm nad rozvětvením aorty. Pro minimalizaci křečí bylo intraarteríálně podáno 20 mg lidokainu. Angiogram po proceduře byl proveden, jak bylo popsánu výše. Jednocentimetrový rastr byl umístěn na úrovni stehenní tepny, aby bylo možno vypočítat skutečný průměr. Katétr byl pak odstraněn. Pravá krční tepna pak byla podvázána 3-0 hedvábím a rána sešita. Ambipen a acetaminofen byly podávány, jak bylo popsáno výše.
Protrombinový čas a koncentrace DEGR-FVIIa v krvi byly měřeny bezprostředně před injekcí testovaných látek, 1 hodinu po injekci a po 3 dnech na konci kontinuální infuze. Byly odebrány jeden až dva mililitry plazmy do citrátu a změřeny protrombinové časy a hladiny antigenů.
Standardní test srážlivosti byl použit ke sledování protrombinového času jak v kontrolních zvířatech, tak v zvířatech léčených DEGR-FVIIa. Test byl proveden takto:
♦ 000 • · · · · * • i 0 0 0 v · 000 ···
0 · *00 ·« **
Dvacet pět mikrolitrů králičí plazmy odebrané s citrátem sodným jako antikoagulačním prostředkem, bylo přidáno k 150 ml TBS (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl). Vzorky byly promíchány a umístěny v automatickém přístroji na měření doby srážení krve Electra 800 (Medical Laboratories Automation, Pleasantviile, NY). Po inkubaci bylo k preparátům přidáno 200 ml přípravku thromboplastin (Sigma Chemical), obsahujícího 25 mM CaCI2. Byla vybrána taková koncentrace thromboplastinu, která způsobovala u kontrolní králičí plazmy dobu srážení přibližně 20 sekund.
Pro určeni koncentrace DEGR-FVIla ve vzorcích plazmy z kontrolních a z DEGR-FVíla léčených zvířat byl použit ELISA test. V pokusu se napřed naředí protiř, lidská FVIIa monoklonální protilátka.(Dr. W. Kisiel, U. of New Mexico) na koncentraci
2,0 mg/mí v 0,1 M uhličitanovém pufru pH 9,6 a rozplní po 100 ml/buňku v 96j jamkových destičkách. Destičky byly pak inkubovány při 4 °C přes' noc a poté dvakrát promyty promývacím pufrem (PBS, pH 7,4, obsahující 0,05% Tween 20). Blokování nespecifických vazebných míst bylo dosaženo přidáním 200 ml blokujícího pufru na jamku (PBS, pH 7,4, obsahující 0,05% Tween 20 a 1% hovězí sérumalbumin), inkubováno 2 hodiny při 37 °C a poté promyto promývacím pufrem.
Po blokování byla přidána standardní série ředění DEGR-FVIla v rozsahu 20 až 0,027 ng/ml, spolu se sérií ředění testované králičí plazmy (1.100 až T.4000 v blokujícím, pufru) v množství 100 ml/jamku. Plazma neimunízovaných králíků byla použita jako negativní kontrola. Destičky byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C a následovala 4 promytí promývacím pufrem.
' A
DEGR-FVIla byl detekován přidáním 100 ml/jamku ředění 1:1000 králičí protílidské FVIL polyklonální protilátky (Dr. W. Kisiel, U. of New Mexico) v blokujícím pufru. Destičky'byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C a následovalo 5 promytí promývacím pufrem. Vazba specifických protilátek byla detekována za použití 100 ml/jamku ředění 1:2000 kozího proti-králičího konjugátu IgG protilátka-peroxidáza (Tágo,* lne). Destičky b
* byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C a poté šestkrát promyty promývacím pufrem.
Nakonec bylo přidáno 100 ml roztoku substrátu (0,42 mg/ml o-fenylendiamin dichloridu (OPD) v 0,2 M citrátovém pufru, pH 5,0, obsahující 0,3% H2O2). Po 1 až 3 min. inkubace při teplotě místnosti byla barevná reakce zastavena přidáním 100 ml/jamku 1 N H2SO4 a destičky byly odečteny při 490 nm na spektrofotometru. Koncentrace DEGRFVIla ve vzorcích plazmy byla určena porovnáním hodnot A490 neznámého vzorku a DEGR-FVIla standardní křivky.
• «
Analýza protrombinových časů a hladin DEGR-FVIIa antigenů u vzorků plazmy je uvedena v Tabulkách 13 a 14. Jsou uvedeny údaje pro každého testované zvíře. Tabulka 15 ukazuje souhrn průměrných dob srážení. Ve všech případech, zvířata léčená DEGR-FVIIa měla 1 hodinu po obdržení injekce zvýšené protrombinové časy, které se však po třech dnech snížily téměř na úroveň před započetím pokusu. Analýza hladin DEGR-FVIIa antigenů také ukázala vysokou úroveň DEGR-FVIIa v plazmě 1 hodinu po obdržení injekce (v rozsahu 2 až 6 mg/ml plazmy), zatímco po třech dnech byly zjištěny mnohem nižší hladiny. Hladiny DEGR-FVIIa naměřené 1 hodinu po injekci odpovídaly předpověděnému zvýšení protrombinového času, zjištěnému ve standardním in vitro ředícím tromboplastinovém testu po přidání DEGR-FVIIa do normální kráiičíplazmy.
• · • · • flflfl · fl* · fl flfl * « · · · flflfl ··· flfl
Tabulka 13 | ||||
Měření protrombinových časů | ||||
Doba srážení (sekundy) | ||||
Zvíře číslo | Léčba | Před testem | 1 hodina | 3 dny |
73 | Kontrola | 24,8 | 22,3 | 17,8 |
74 | Kontrola | 24,8 | 27,9 | 18,6 |
75 | Kontrola | 24,6 | N/D | 20,5 |
76 | Kontrola | . 22....... | . N/D..... | . 17,9......-- |
169 | Kontrola. | 21,2 | 22,9 | 22 |
.. 170 , | ..Kontrola | 24,9 | 23,5 | 18,6 |
' .173 | Kontrola | 25,9 | 21 | 20,8 |
174 | Kontrola | 25 | 29,4 | 20,1 |
77 | DEGR-FVIIa' | 22,5 | 40,1 | 18,3 |
78 | DEGR-FVIIa | 24,3 | 34 | 20,9 |
80 | DEGR-FVIIa | 24,7 | 50 | 21,7 |
96 | DEGR-FVIIa | N/A | N/A | '21 |
' 97·, | DÉGR-FVIIa ' | 23,6 | 33,3 | 21,2 |
171 '. ' i | DEGR-FVIIa· | 20,6 | 45,8 | 21,9 |
172 ' | DEGR-FVIIa. | 23,5 | 41,6 | 22,4 |
N/A - údaje nezískány
«· ···· ·♦
Tabulka 14 Detekce DEGR-FVIla v králičí plazmě ELIZA-testem | ||||
FVIIa ELISA (ng/ml) | ||||
Zvíře číslo | Léčba | Před testem | 1 hodina | 3 dny |
73 | Kontrola | 0 | 13 | 0 |
74 | Kontrola | 36 | 14 | 4 |
75 | Kontrola | 0 | N/A | 9 |
76 | Kontrola | .... 0 . . . . | .....N/A... | ........14...... |
169 | Kontrola | 0 | 0 | 1 |
170 | Kontrola | 0 | 0 | 0 |
173 | Kontrola | 36 | 31 | 0 |
174 | Kontrola | 87 | 86 | 160 |
77 | DEGR-FVIla | 0 | 3,210 | 102 |
78 | DEGR-FVIla | 1 | 4,950 | 7 |
80 | DEGR-FVIla | 13 | 4,543 | 661 |
96 | DEGR-FVIla | 65 | 4,900 | 117 |
97'·;,- | DEGR-FVIla | 4 | ' 4,600 | 502 |
171 | DEGR-FVlia | 13 | 2,145 | 212 |
'172 ' | , DEGR-FVIla | 9 | 2,830 | 228 |
Ň/A - údaje nezískány ·· ·» ► · · · » · · · ··» ··* • * ·· *♦
Β· ···» ·· l · · « « · • · · · • « » · ···· ·
Tabulka 15. Statistický souhrn průměrných dob srážení.
Nepárový t-test X: DF:
Nepárová t-hodnota 1,12
Před pokusem
Pravděpodobnost
0,2852
Standardní | Standardní | |||
Skupina: | Počet: | Průměr: | odchylka: | chyba: |
Kontrola | 8 | 24,15 | 1,64 | 0,58 |
DEGR-Vlla | 6 | 23,2 | 1,48 | 0,60 |
Nepárový t-test X: DF:
Nepárová t-hodnota -5,44 hodina po operaci cév
Pravděpodobnost
0,0003
Standardní | Standardní | |||
Skupina: | Počet: | Průměr: | odchylka: | chyba: |
Kontrola | 6 | 24,5 | ..... 3,35 | 1,37 |
DEGR-Vlla'< | 6 | 40,8 | 6,53 | 1,67 |
Nepárový t-test X: DF:
Nepárová t-hodnota -2,04 dny po operaci cév Pravděpodobnost
0,0622
Standardní | Standardní | |||
Skupina: | Počet: | Průměr: | odchylka: | chyba: |
Kontrola | 8 | 19,54 | 1,53 | 0,54 |
DEGR-Vlla | .7 | 21,06 | 1,33 | 0,50 |
Tři týdny po operaci cév byl opětně pořízen angiogram již dříve popsaným způsobem přes levou krční tepnu, bezprostředně před usmrcením zvířete. Vertikálním • fc ···· • fcfc * • fcfc · fc fcfcfc fcfcfc • · fcfc ·· fcfc · · fc · fcfc fcfc fc · fcfcfc : ·..* · břišním řezem byla izolována koncová část aorty, podvázána a nad rozvětvení aorty byla umístěna promývací kanyla. Koncová část aorty byla promyta 50 ml fyziologického roztoku, poté in vivo fixována 500 ml roztoku Histochoice (AMRESCO, Solon, OH), aplikovaného po dobu 15 min. při tlaku 120 mm Hg. Při započetí promývání byla zvířata usmrcena předávkováním nembutalem (3 ml pentobarbitalu sodného IV, 65 mg/ml). Byl vyříznut pět centimetrů dlouhý úsek stehenní tepny a uchován v roztoku Histochoice pro světelnou mikroskopii.
Aby byl zjištěn vývoj poškození na vnitřní stěně cévy v místě angioplastiky pomocí balónku, vyříznuté stehenní tepny byly rozřezány na 3 mm segmenty, zality do parafínu a byly pořízeny řezy z mnoha oblastí každé tepny. Řezy byly montovány na mikroskopická sklíčka, barveny hematoxylinem, eosinem a van Giemsovým barvivém. Morfometrická analýza byla provedena pomocí programu Bioquant, aby byly získány plošné hodnoty pro průřez, vnitřní stěnu a střední vrstvu. Morfometrická analýza tkáňových řezů z poraněných tepen byla prováděna měřením celkové plochy průsvitu cévy; plochy vnitřní vrstvy - určena změřením oblasti uvnitř vnitřní elastické vrstvy a odečtením odpovídající plochy průsvitu pro každý tkáňový řez; a plochy střední vrstvy určena změřením oblasti uvnitř vnější elastické vrstvy a odečtením odpovídající plochy uvnitř vnitřní elastické vrstvy. Měřeni poškození na vnitřní stěně stehenních cév u kontrolních zvířat a zvířat léčených DEGR-FVIIa ukázala, že se významně snížila velikost vnitrní stěny u zvířat léčených DEGR-FVIIa (Tabulka 16). Naopak měření střední vrstvy neukázala žádné významné rozdíly mezi oběma skupinami.
·· ···· rf • · a »· ·· ♦ · · · • · · · · • « «·· ··· • · · m· ♦· ·* • « · « « • · · ♦ • · ·? · ♦ » · · · ·*·· · ··
Tabulka 16: Měření vnitřní a střední vrstvy cév u králíků po zákroku pomoct balónkového katétru | ||||
skupina | počet | vnitrní stěna (mm2) | standardní odchylka | pravděpodobnost |
kontroly | 13 | 0,819 | 0,414 | 0,0138 |
DEGR-FVIIa | 10 | 0,438 | 0,192 | |
skupina | počet | střední vrstva - -·' (mm-2) · | standardní - odchylka - | pravděpodobnost |
. kontroly | 13 | 0,389 | 0,098 | 0,172 |
DEGR-FVIIa | 10 | 0,329 | 0;105 |
Údaje z angiografických měření jsou uvedeny v Tabulce 17 jako střední .průměr průřezu (Mean Luminal Diameter - MLD) +/- standardní odchylka pro kontrolní a DEGR-FVIIa léčená zvířata pro všechny tři časové okamžiky: bezprostředně před cévní operací, bezprostředně po cévní operaci a 21 dní po cévní operaci. Neprokázaly- se významné rozdíly mezi MLD u kontrolních a DEGR-FVIIa léčených zvířat ani bezprostředně před cévní operací ani bezprostředně po ní. Významné zvýšení MLD však bylo pozorováno u DEGR-FVIIa léčených zvířat 21 dní po cévní operaci.' « ·*»· «« · »· ·· « * * ·*·· *·· • · · · · · · « · ·ι * * · · »»···· _ ·»«·· · · 50 ···· * .........
Tabulka 17: Měření minimálního průměru průřezu (MLD) | ||||
Měření MLD před operací | ||||
skupina | počet | střední MLD | standardní odchylka | pravděpodobnos t |
kontroly | 13 | 1,202 | 0,24 | 0,3883 |
DEGR-FVIIa | 10 | 1,283 | 0,19 | |
Měření MLĎ po operaci | ||||
skupina | počet | střední MLD | standardní odchylka | pravděpodobnos t |
kontroly | 13 | 1,492 | 0,551 | 0,5326 |
DEGR-FVIIa | 10 | 1,323 | 0,725 | |
Měření MLD 21 dní po operaci | ||||
skupina | počet | střední MLD | standardní odchylka | pravděpodobnos ť |
kontroly | 13 | 0,889 | 0,228 | 0,0001 |
DEGR-FVIIa | 10 | 1,393 | 0,242 |
Příklad 13. Inhibice tvorby Faktoru Xa vlivem DEGR-Faktóru“Vila na povrchu paviáních hladkých svalových buněk (SMCs).
Byl vyvinut chromogenní test na buněčném povrchu, v podstatě jak bylo popsáno výše v Příkladu 8, aby bylo možno měřit účinnost s jakou DEGR-FVIIa blokuje vazbu Faktoru Vila na tkáňový faktor na buněčném povrchu a následnou konverzi Faktoru X na Faktor Xa na jednovrstevných tkáňových kulturách paviáních hladkých svalových buněk (SMCs). Tato metoda je modifikací metody popsané Sakai a kol., 1 Biol. Chem. 264:9980-9988 (1989) a Wildgoose a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:7290-7294 (1990). Paviání SMCs byly získány z University of Washington, Seattle, WA a byly pěstovány zexplantátů aorty. Paviání SMCs byly vysety do 96-jamkových kultivačních destiček při použití koncentrace 8000 buněk/jamku v 200 ml/jamku DMEM toto to· to to · * • · · · • «·· ··· • · to* toto ··*· «· · to · ·· ♦ · * • toto · ·«« • to toto· to to • * • «
Cd ♦ ♦
JI toto ♦ · * kultivačního média, doplněného 10 % fetálního telecího séra a udržovány v tomto médiu 4 dny při 37 °C v 5 % CO2. Při pokusu bylo odebráno 110 ml média a do jamek byly přidány zvyšující se koncentrace FVIIa nebo FVIIa v kombinaci s DEGR-FVIIa. Byla sestrojena standardní křivka pro koncentraci FVIIa v rozsahu 5 nM až 0,04 nM. Pro změření inhibiční aktivity DEGR-FVIIa na aktivitu FVIIa, byly do testovacích jamek přidány zvyšující se koncentrace DEGR-FVIIa v přítomnosti konstantního množství FVIIa (5 nM). Jak FVIIa tak.DEGR-FVIIa byly ředěny v HEPES pufru (10 mM HEPES, 137 mM NaCl, 4 mM KCl, 5 mM CaCI2, 11 mM glukóza, 0,1 % hovězí sérumalbumin) a 10 ml 1.0-krát koncentrovaného zásobního roztoku bylo přidáno k buňkám. Buňky bylu ~ihkúbováný's testovanými látkami 2 hodiny při 37 °C a poté 3-krát promyty HEPES pufrem^ Padesát mikrolitrů 200 nM roztoku Faktoru X v trisovém pufru (25 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5 mM CaCI2, 0,1 % hovězí sérumalbumin) bylo pak přidáno ke každé jamce. Po 4 min. při teplotě místnosti bylo přidáno 25 mi 0,5 M EDTA, . aby byla zastavena konverze Faktoru X na Faktor Xa. Ke každé jamce bylo přidáno 25
- μΙ 0,8 mM S-2222 v irisovém pufru, chromogenního substrátu specifického pro Faktor Xa, a po 60 min. byla odečtena absorbance při 405 nM na přístroji na odečítání mikrodestiček THERMOMAX (Molecular Devices, Menlo Park, CA).
Výsledky, uvedené v Obr. 3 ukazují dávkovou závislost zvyšování amidolytické aktivity u buněčných kultur, ke kterým byl přidán Faktor Vila (prázdné čtverečky). Zvýšení absorbance je přímo úměrné úrovni Faktoru Xa tvořeného v buňkách, a jím zprostředkovanému štěpení chromogenního substrátu. Po přidání zvyšujících se
J množství DEGR-Faktoru Vila spolu s konstantním, množstvím FVIIa (5 nM) .nastává snižování amidolytické aktivity, nepřímo úměrné zvyšující se úrovni DEGR-Faktor Vila (plné čtverečky). Stejný molární poměr DEGR-FVIIa a FVIIa inhibuje >90 % chromogenní aktivity. Dokonce ještě při 10-násobně nižší úrovni DEGR-FVIIa trvá stále 40 % inhibice tvorby chromogenní aktivity Faktoru Xa. Tyto výsledky podporují závěr, že DEGR-FVIIa je extréme účinný inhibitor aktivace Faktor X na Faktor Xa na povrchu intaktních jednovrstevných kultur SMCs.
Příklad 14. Vliv DEGR-Faktoru Vila na tvorbu cévní sraženiny a cévních poranění u paviánů.
U lidského DEGR-Faktoru Vila byla testována schopnost inhibovat u tkáňového faktoru (TF) a u aktivovaného Faktoru Vil (FVIIa) zprostředkování tvorby cévních ·· ···· ; . *· · · · · • · ·· · · · ······ .:.. : ·.·· ·:· ··’ ·· poranění (vascular lesion formation - VLF), které byly indukovány mechanickým poškozením cévy u nižších primátů.
Bezprostředně před vytvořením mechanických cévních poranění u paviánů, jim byl podáván infúzné DEGR-Faktor Vila po dobu 7 dní (5 zvířat) nebo 30 dní (1 zvíře). Měření tvorby cévních poranění byla provedena 30. den. Výsledky u pěti léčených zvířat byly srovnány s nálezy u pěti kontrol, kterým byl infúzné podáván pouze příslušný pufr.
Měření základních hodnot bylo získáno u studovaných živočichů pro: a) počet krevních destiček, počet neutrofilů, počet monocytů a počet červených krvinek; b) úroveň piazmatického fibrinogenu; c) úroveň aktivity plazmatických koagulačních faktorů VII, Vila, X a V, spolu s antigenní hladinou FVIÍ; d) základní úroveň hladiny protilátek proti Faktoru Vila u piazmatického vzorku.
Pod anestézií a.za sterilních operačních podmínek obdržela zvířata, označená autolognimi 111ln-krevními destičkami, intravenózní infuze DEGR-FVIIa, přičemž byl použit připevněný systém pro kontinuální intravenózní podávání (počáteční injekce 1 mg/kg,. následovaná kontinuální intravenózní infuzí 50 mg/kg/hodinu). Zvířata byla podrobena chirurgickému otevření krční tepny, operaci obou pažních nebo stehenních tepen za použití Fogartova balónkového katétru.
DEGR-Faktor Vila byl podáván po dobu 7 až 30 dní kontinuální infuzí žilním katétrem, za-použití připevněného systému. Třicet dní po operaci byla zvířata uspána halothanem a podrobena in sítu fixaci, pomocí promývání pod tlakem za použití 4% paraformaldehydu, obsahujícího 0,1 % glutaraldehyd, po dobu 30 min. Po této době byly porno,cí metody Harker a kol., Circulation 83:31-44 (1991) a Hanson a kol, Hypertension 18: 18:rtension_91) a Hanson a kol., _ího 0,1 % glutaraldříve poraněná místa). Vzorky byly poté fixovány in vitro (4% paraformaldehyd, obsahující 0,1 % glutaraldehyd), uchovány zmražené a zpracovány pro morfometrickou analýzu rozsahu poškození.
Bylo studováno jedenáct normálních dospělých paviánů (Paio anubis). Šesti zvířatům byla podána infuze DEGR-FVIIa (50 mg/kg/hodinu) a zbylých pět byla kontrolní zvířata, která DEGR-FVIIa nedostala. Zvířata byla odčervena a tři měsíce před použitím byla pozorována, zda netrpí nějakou nemocí. Všechny procedury byly odsouhlaseny Výborem pro péči o zvířata a jejich užití v instituci a splňovaly postupy a metody Směrnice pro péči a využiti laboratorních zvířat (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals), navržené NIH (National Institute of Health), rovněž tak Zákonu o • · • · ♦ · · · * · · β * » · · · · ······
Γ-π · ♦ · · · ’ * ···· · *· ··· ** ** péči ο zvířata (Animal Welfare Act) a podobné předpisy. Invazivní procedury byly prováděny v anestézií halothanem, po jejím navození ketaminem (10 mg/kg intramuskulárně) a valiem (0,5 mg/kg intravenozně). Pro následné krátkodobé znehybnění při pooperativním provádění experimentálních procedur byl použit hydrochlorid ketaminu (5 - 20 mg/kg intramuskulárně).
Otevření krční tepny bylo provedeno středovým krčním řezem, pomocí techniky Hanson a kol., Hypertension 18:É170-É-176 (1991) a Krupski a kol., Circulation 84:1749-1757 (1991), které jsou zde uvedeny mezi odkazy. Otevření krční tepny bylo použito jako model cévního poranění pro jeho klinickou závažnost a protože VLF, indukované otevřením normálních tepen se ukázalo být reprodukovatelné. Krátce řečeno, krční tepna byla zbavena obklopujících tkání v oblasti od klíční kosti až k jejímu rozvětvení. Tepna byla uzavřena na obou koncích exponované oblasti pomocí netraumatizujících cévních sponek tři min. po injekci heparin-sulfátu (100 U/kg intravenozně; Elkins-Simm lne., Cherry Hill, NJ) a odříznuta 1 cm před zadní svorkou. Přední segment tepny byl poté obrácen naruby pomocí zahnuté pinzety. Po obrácení co největšího úseku byly provedeny polypropylénovou nití (7-0) dva zajišťovací stehy na každé straně v přední části, druhý pár stehů byl umístěn v zadní části na úseku s exponovaným vnitřkem cévy.
Pak bylo provedeno odstranění vnitrní stěny tepny v úseku 1 cm, počínaje 1 cm od odříznutého- konce obráceného úseku cévy, Tato procedura znamenala mechanické odstranění normální vnitrní stěny cévy a částečně i střední vrstvy pomocí pinzety a ' J chirurgického mikroskopu (32-násobné zvětšení). Po tomto odstranění vnitrní stěny tepny byl^ céva navrácena do svého normálního postavení, provedeno sešití (7-0 polypropylénová nit) pod 2,5-násobným zvětšením a rána byla uzavřena.
Při morfometrické analýze VLF byly segmenty zalité v parafinu a s obarvenými tkáňovými pojivovými složkami (kolagen, elastin), dále obarvené hematoxylinem a eosinem, hodnoceny pomocí Ziess Photoscopu spojeného se systémem analýzy obrazu (Thomas Optical Measurement Systems, Columbus, GA), sestávajícího z mikroskopové CCD kamery o vysokém rozlišení (580 řádek), spojené s monitorem o vysokém rozlišení (700 řádek), čipem IBM 386 a s 80 MB počítačem s grafickým digitalizačním tabletem o vysokém rozlišení pro snímání a uchovávání obrazu. Kvantitativní analýza obrazu byla provedena pomocí morfometrického software (Optimas, Bioscan, lne., Edmonds, WA). Příčné řezy tepen byly hodnoceny s ohledem na celkovou plochu prol iterujících poranění v nově se tvořící vnitřní stěně cévy a na • · • · · · * · · · • «·· ··· • · • V* · ·· ·**·
I · * · odpovídající plochu střední vrstvy stěny tepny. Pro statistickou analýzu byla provedena porovnání mezi skupinami pomocí Studentova T-testu, pro párované a nepárované údaje.
Výsledky ukázaly, že plocha vnitrní vrstvy byla výrazně zmenšena u zvířat léčených 7 dní DEGR-Faktorem Vila a zkoumaných ve 30. dni, ve srovnání s kontrolními zvířaty, která prodělala stejné cévní poranění, ale nebyl jim podán žádný DEGR-Faktor Vila (Obr. 4). Podobný výsledek byl zjištěn u zvířat léčených 30 dní DEGR-Faktorem Vila a zkoumaných ve 30. dni.
Předběžná studia s modelem balónkové angiografie pažní tepny nenaznačoval žádný měřitelný prospěšný vliv terapie pomocí DEGR-Faktoru Vila. Tento model však, jak se ukázalo u paviánů, nebyl takovým protrombickým modelem, v němž by hrál klíčovou roli tkáňový faktor.
Studia s poškozením stehenní tepny paviánů pomocí balónku ukázaly na statisticky významný prospěšný vliv DEGR-Faktoru Vila, ve srovnání s kontrolami, jak je ukázáno v Obr. 5.
Příklad 15, Vliv DEGR-Faktoru Vila na tPA-indukovanou trombolýzu.
Tvorba krevní sraženiny ve věnčitých cévách během infarktu myokardu je primárně způsobena tkáňovým faktorem (TF) spolu s Faktorem Vila v průběhu vnějšího systému srážení krve. Byl zjišťován vliv dodatečné inhibice v různých bodech koagulační kaskády zevního srážení krve na efektivitu tkáňového plazminogenového aktivátoru (TPA) trombolýzy.·
Třicpt šest psů s elektricky indukovanou sraženinou ve věnčitých cévách a podstupujících trombolýzu pomocí tPA (1 mg/kg během 20 min.) bylo léčeno jedním ze čtyř dodatečných postupů: 9 obdrželo protisrážlivý peptid klíštěte (tick anticoagulant peptide - TAP), selektivní inhibitor Faktoru Xa, v dávce 30 mg/kg/min. po dobu 90 min. Komplex TF-Faktor Vila byl inhibován rekombinantním tkáňovým faktorem inhibujícím srážení (tissue factor pathway inhibitor - TFPI) v dávce 100 až 150 mg/kg/min. po dobu 90 min.) u 9 psů, a pomocí DEGR Vila (1 až 2 mg/kg), jako kompetitivním inhibitorem aktivovaného Faktoru Vila u 9 psů. Devět psů dostalo jakožto kontrola fyziologický roztok. Psi byli pozorováni po dobu 120 min. po trombolýze, zda dojde k opětnému uzavření krevního průtoku. Vliv zkoumaných látek na efektivitu trombolýzy jsou ukázány dále v Tabulce 18 (je uveden průměr hodnot ± SD (standardní odchylka)).
• ·
« ·· · * i
· 0 • 0 0 •·0 000 • *
0« 0«
fyziologický roztok | DEGR- FVIIa | TFPI | TAP | |
obnovení průtoku (min.) | 32 ±13 | 20 + 7* | 21 ±6* | 18 ±10* |
trvání průtoku (min.) | 62 ±45 | 70 ±48 | 91 ±35* | 120 |
variace průtoku | 70% | 89% | 56% | 0% |
opětné uzavření | 70% | 78% | 67% | 0% |
* Hodnoty lišící se od fyziologického roztoku na hladině významnosti 0,05.
Uvedené údaje naznačují, že inhibici vnějšího systému srážení krve Faktorem Xa nebo TF-Faktorem Vila je možno blokovat buď DEGF Vila nebo TFPI a urychlit tak tPA-indukovanou trombolýzu. Selektivní inhibice Faktoru Xa efektivněji udržovalo průchodnost tepen po jejích úspěšném zprůchodnění.
Příklad 16. Modifikovaný Faktor Vila inhibuje tvorbu nitrocévních krevních sraženin bez ovlivnění sýštémového krevního srážení.
Pro určení, zda inhibice vazby Faktoru VII na TF by mělo za následek ‘ i protisrážlivé 'efekty, byly vyvolány cyklické variace průtoku (cycle flow variatíons CFVs), pomocí umístění vnějšího konstriktoru kolem králičích krčních tepen s poraněnou endotheliální vrstvou (Fottův model). Tok krve krční tepnou byl průběžně měřen Dopplerovou průtokovou sondou, umístěnou před konstriktorem. Po umístění konstriktoru kolem tepny se vyvinuly CFVs s průměrnou frekvencí 11+2 cykly/hodinu u 6 králíků ze 6, zatímco rychlost průtoku krve krční tepnou v minimu CFVs činila průměrně 5 ± 2 % základní úrovně. Po 30 min. pozorování CFVs obdržela zvířata infúzi lidského rekombinantního Faktoru Vila s blokovaným aktivním místem (pomocí PhePhe-Arg chlormetylketonu) - FVIIai - (0,1 mg/kg/min. po dobu 10 min.). Faktor Vllai zcela eliminoval CFVs u 6 zvířat ze 6 (frekvence CFV = 0 cyklů/hodinu; p<0,05; rychlost průtoku krve krční tepnou = 106,9 % základní hodnoty; p=NS vzhledem k základní hodnotě). Třicet minut po inhibici CFVs byl infúzně podán lidský flfl flfl • · · fl • flfl * • ··* ··· __ · · · · fl ·· »»·· 1 ·· .......
rekombinantní FVIIa v dávkách 0,1 mg/kg/min. po dobu 10 min. Infuze Faktoru Vila obnovila CFVs u všech zvířat, což ukazuje, že vazba Faktoru Vila k TF je kompetitivní. Protrombinové časy, doby částečné aktivace tromboplastinu a ex vivo agregace krevních destiček jako reakce na ADP a trombin se po infuzi FVIIai nelišily od základních hodnot. FVII-Vlla tedy hraje důležitou roli při iniciaci tvorby krevní sraženiny in vivo. Podáni Faktoru Vllai ukázalo v tomto modelu silný protisrážlivý efekt bez ovlivnění systémového srážení.
Příklad 17. Inhibice tvorby krevní sraženiny v drobných tepnách pomocí lokální aplikace modifikovaného Faktoru Vila.
Při cévní chirurgii, chirurgickém rekonstruování mikroskopických cév nebo replantační chirurgii bývá nejčastější příčinou neúspěchu tvorba krevní sraženiny v místech spojení. Riziko uzávěru krevní sraženinou se velmi zvyšuje, když cévy podléhají traumatu, vykazují patologickézměny nebo když jsou pro spojení použity žilní segmenty. Proto se často v souvislosti s chirurgickou operací užívá zásah proti srážení krve. Látky, které jsou běžně dostupné a v těchto případech používané se podávají parenterálně (heparin, dextran} nebo orálně (ASA) a se všemi jsou spojeny vedlejší hemoragické účinky. Navíc heparin a zvláště ASA jsou při zabránění tvorby (tepenné) krevní sraženiny pouze částečně účinné, Na základě těchto nedostatků existuje potřeba zabránit tvorbě krevní sraženiny v průběhu chirurgického zákroku na cévách pomocí látky, která se váže a je účinná v oblastech spojení a místech cévního traumatu, látky, kterou je možno aplikovat lokálně a vyhnout se tak nežádoucím vedlejším systémovým účinkům. V tomto Příkladu byla pro vyvolání antitrombotického účinku použita lokální aplikace Faktoru Vila s inaktivovaným aktivním místem na místa s tepenným traumatem, bez toho, že by souběžně vznikla tendence k zvýšenému krváceni nebo jiným hemostatickým efektům.
Metody:
Švédští králíci (samci i samice), vážící asi 3.5 kg byli krmeni standardní grandovou dietou s dostatkem vody. Před použitím k pokusu byli přinejmenším 1 týden v laboratoři pozorováni, zda netrpí nemocí.
Do okrajové ušní cévy byla králíkům zavedena kanyla a pomocí pentobarbitalu sodného (18 mg/kg) byla navozena anestézie, která byla udržována pomocí opakujících se injekcí.
flfl flflflfl
Ifllu fl · « fl fl · fl · fl fl « flfl fl · · ······ ·*·· ! *·· *·» ·· ·*
Na kůži obou uší byly vytvořeny chlopně a vypreparovány 3 cm dlouhé úseky středních tepen (vnější průměr asi 1 mm). Všechny odbočky byly zašity stehy 10-0 a odstřiženy. Prostor operace byl omýván izotonickým solným roztokem a překryt tenkou plastickou fólií. Pro udržení stálého a vysokého průtoku krve a kvůli zabránění křečovitým stahům cév byla zvířata umístěna na tepelné podložky a udržována za slabě hypertermických podmínek při tělesné teplotě asi 39,5 °C (normální tělesná teplota je asi 38,5 °C), a po manipulacích byly místně aplikovány na cévy 3 kapky lidocainu 10mg/ml (po opětném obnovení průtoku a po testování průchodnosti 30 min. po opětném obnovení průtoku).
Na cévy po obou stranách byly současně umístěny dvojice mikrocévních svorek . (S&T 2V, S&T Marketing Ltd., Neuhausen, Switzerland), tak aby mezi svorkami by, izolován úsek tepny dlouhý 7 mm. Bylo provedeno podélné rozříznutí tepen (7 mm), načež byly sponky přiblíženy, cévy uvedeny do správné polohy a vnitřek cévy obrácen a zploštěn, čímž se obnažily hlubší úrovně střední vrstvy cévní stěny. Řezy na tepnách byly uzavřeny spojitým jednovláknovým nylonovým 10-0 stehem (Ethilon 10-0 BV-75-3, Ethicon Ltd., Edinburgh, U.K.). Všechny chirurgické procedury byly provedeny jedním chirurgem za použití vysoce kvalitního operačního mikroskopu (Wild M-650, LeicaHeerbrugg, Heerbrugg, Switzerland).
V cévách byl obnoven průtok současným otevřením cévních svorek. Byly rychle překryty gázovými polštářky nasáklými fyziologickým roztokem a kontrolovány jedenkrát za minutu. Byl zaznamenán čas potřebný k úplnému zastavení krvácení z takovéhoto/oranění tepny.
V dgbě 30 min. a 120 min. po obnovení průtoku krve byla stanovena průchodnost cév pomocí standardního mikrochírurgického „empty/refill,, testu: cévy byly opatrně uzavřeny v místě vzdáleném od traumatické oblasti pomocí páru mikrosvorek a vyprázdněny po směru toku krve jiným párem svorek. Po uvolnění prvního páru svorek bylo hodnoceno opětné naplnění cévy krví, a cévy byly klasifikovány buď jako průchodné nebo uzavřené. Uzavřené cévy nevykazovaly opětné naplňování krví, zatímco průchodné cévy vykazovaly rychlé nebo pomalé naplňování krví, druhé jmenované byly označeny „se sníženou průchodností,,. Po konečném testu průchodnosti byly cévy vystřiženy a podélně otevřeny, přičemž trombotický materiál byl vyjmut a zvážen.
• · · · · ·
• · · « ·····* Β · · · · «· »·« ·· ··
Léčiva:
Rekombinantní chemicky inaktivovaný lidský Faktor Vila (Vllai) v koncentraci 3,1 mg/ml nebo vehikulum byly uloženy ve formě 200 ml alikvotů v kódovaných ampulkách.
Experimentální protokol:
Dvacet králíků bylo ošetřeno ve slepém, náhodně uspořádaném pokusu tak, jak je popsáno dále, přičemž každý králík zároveň sloužil jako vlastní kontrola: po provedení hlubokého tepenného poškození, jak bylo popsáno výše v metodické sekci, Obnažené traumatické místo na jednom'uchu bylo omýváno v průběhu 5 min. roztokem Vllai {celkom 0,5 mg) a na druhém uchu vehikulem. Promývané traumatické oblasti byly ponechány inkubovat v roztoku po dobu dalších 5 min., po čemž byl veškerý přebytek roztoků opláchnut izotonickým solným roztokem. Arteriotomie byly pak uzavřeny a v cévách obnoven průtok krve.
Statistické metody:
Výsledky měření průchodnosti cév byly porovnány pomocí znaménkového testu a váhy sraženin a údaje o krvácení arteriotomií pomocí Wilcoxonova testu. Jako výsledky jsou uvedeny oboustranné p-hodnoty.
Výsledky:
Podávání Vllai mělo za následek různý protisrážlivý efekt, jak bylo měřeno stupněm průchodnosti cév. Ve skupině Vllai byla průchodnost cév 30 min. po obnovení průtoku krve 85 % a 120 min. po obnovení průtoku krve 75 %. Odpovídající hodnoty u skupiny s vehikulem byly 40 % a 30 %. . Rozdíl je statisticky významný (p=0,008 a p=0,004). Středové váhy sraženin byly 0,3 mg ve skupině Vllai a 0,5 mg ve skupině s vehikulem, třebaže tento rozdíl není statisticky významný (p=0,19). Středové doby krvácení arteriotomií byly 1,5 min. ve skupině Vllai a 2 min. ve skupině s vehikulem. Skupiny nejsou statisticky rozlišitelné (p=1).
Tento Příklad ukazuje, že místní aplikace Vltai na místo s tepenným poškozením, má protisrážlivý účinek, přičemž však nevyvolává sklon k zvýšenému krvácení. To představuje vysoce atraktivní přístup pro zabránění trombotických komplikací ph chirurgických zákrocích, mikrochirurgii krevních cév, cévních operacích a jiných traumatech.
4« .
4
444 I «4 •
« 4 4 4
44« «·· ·
4 4 4
Příklad 18: Místní aplikace FVIlai snižuje váhu krevní sraženiny a zlepšuje průchodnost cév.
Tento Příklad ukazuje, že místní aplikace chemicky inaktivovaného FVIIa (FVIIaí) snižuje váhu krevní sraženiny a zlepšuje průchodnost cév.
V tomto Příkladě bylo použito 20 králíků v anestézii. Byla odhalena krční žíla a svorkami byl izolován úsek.o délce 10 mm. Sraženina byla indukována pomocí kombinace chemického rozrušení buněčné výstelky (ethoxysclerolem) izolovaného úseku a částečného podvázání, umístěného kaudálně od úseku. Ve slepém, náhodně usporácáném ookusu byla jedna stráná’ošětřeria 0,5’mg chemičky inaktivovánétíb FVIIa (FVIIaí) a druhá pufrem. Testovaná látka byla podána injekčně do izolovaného úseku žíly a inkubována 10 min. po-chemickém rozrušení buněčné výstelky. Po 30 á 120 min. byla kontrolována průchodnost cév pomocí standardního „empty/refill,, testu. Případná sraženina byla zvážena po usmrcení zvířete.
středová váha krevní sraženiny | rozsah vah krevních sraženin | p- hodnota | průchodnost po 30 min. | p- h od nota | průchodnost po 120 min. | p- h od nota | |
FVIIaí | 0,85 mg | 0-22,3 mg | 0,035 | 90 % | 0,0070 | 85% | 0,070 |
pufr | 9,3 mg | 0-22,3 mg | 55% | 50% |
Výsledky ukazují, že místní aplikace inaktivovaného FVIIa významně snižovala váhu krevní sraženiny a zlepšovala průchodnost cév v použitém modelu žilní trombózy.
Příklad 19: Podáni FVIIaí zmenšuje velikost oblasti rizika a zdokonaluje opětné krevní zásobování.
Metody:
Příprava pokusu.
Bylo studováno dvacet osm Novozélandských bílých králíků obou pohlaví (3,2 až 3,8 kg). Krátce řečeno, králíci byli uspáni směsí ketaminu (35 mg/kg) a xylazinu (5mg/kg) podanou intramuskulárně, intubováni a bylo jim prováděno umělé dýchání pomocí respirátoru (Harvard Apparatus Co., Cambridge, MA). Polyetylénové katétry byly v fcfc·» ·· · *· · • fc · fcfc·'* ···· • fc fc·· ···· fc · fcfc · fc « ·♦···· • · fc·· fc fc • fcfc* * · · fcfcfc ·· ·· zavedeny do aorty levou krkavící a do krční žíly pro monitorování tepenného tlaku a podávání léčiv. Hrudník byl rozříznut v pátém mezižeberním prostoru a byl otevřen osrdečník. Polyetylénový katétr byl umístěn do levého předsíňového přívěsku pro pozdější injekce barvených mikrokuliček. Velká krajní větev zahnuté věnčité tepny byla dočasně uzavřena přibližně 0,3 cm od jejího počátku kličkou chirurgické nitě. Uzavření věnčité tepny bylo ponecháno 30 min., potom bylo podvázání uvolněno a umožněno opětné krevní zásobování po další 5,5 hodiny. Během pokusu byl kontinuálně zaznamenáván systémový tepenný tlak (snímač tlaku Statham P23 DB, Gould Instruments).
Experimentální protokol
V okamžiku obnovení průtoku krve byla zvířata náhodně přidělena do některé z následujících skupin s odlišnými ošetřovacími postupy. Kontrolní skupina obdržela dávku 5 ml fyziologického roztoku do levé srdeční předsíně; skupina ošetřená lidským rekombinantním Faktorem Vila s blokovaným aktivním místem (FVIIai, Novo Nordisk A/S, Gentofte, Denmark, dávka 1 mg/kg do levé srdeční předsíně); skupina ošetřená lidským rekombinantním aktivovaným Faktorem Vila (FVIIai, Novo Nordisk A/S, Gentofte, Denmark, dávka 1 mg/kg do levé srdeční předsíně).
Určeni velikosti rizikové oblasti, rozsahu infarktu a oblasti bez krevního zásobování (jev „no-reflow,,).
Pro odhadnuti rozložení krevního zásobování tkáně na konci pokusu (jev „no-reflow„, NR), obdržela zvířata injekci 6% roztoku thioflavinu S (1 mg/kg) pomocí katétru do levé srdeční předsíně. Aby bylo možno určit velikost rizikové oblasti infarktu, věnčitá céva byla bezprostředně po injekci thioflavinu opětně uzavřena a pomocí katétru byl do levé srdeční předsíně injikován roztok klášterní modři (E.l.DuPont; 1 mg/kg). Srdce bylo ihned nato vyjmuto a levá srdeční komora oddělena od ostatních struktur a zvážena. Levá srdeční komora byla zmražena na -70 °C po dobu 30 min. a rozřezána na 8 až 10 plátků rovnoběžně se síňokomorovou rýhou. Obrysy normálně prokrvované srdeční svaloviny a rovněž riziková-oblast byly sledovány podle rozložení klášterní modři na průhledné plastikové ploše Řezy připravené ze srdeční svaloviny pak byly pozorovány v ultrafialovém světle a normálně prokrvované svalovina (fluoreskující) byla pak snadno odlišena a oddělena od ischemické svaloviny (nefluoreskující) podle rozložení thioflavinu. Tyto oblasti byly také sledovány na průhledných plastikových plochách. Řezy pak byly dále inkubovány v 2% roztoku trifenyltetrazoliumchloridu (TTC, Sigma Chemicals) po dobu 10 min. při 37 °C, aby byla zviditelněna oblast nekrózy. Znovu byla fc· ·· ► fcfc ·
I fc · * • fcfc · · » • fc fc ··· fcfc ·
Λ · fc · ♦ ·« • · · · fc · ♦ · fc fc fc • · fc · · ···· fc fc* fc·· použita průhledné plastiková plocha pro sledování obrysů normální svaloviny (TTCpozítivní) a infarktové části (TTC-negativní).
Byly vypočteny následující proměnné: 1) oblast s rizikem infarktu, jako procento levé komory, zjištěné na konci období obnoveného krevního zásobování (rozložení klášterní modři) (AR); 2) rozsah infarktu (infarct size - IS), jako procento oblasti s rizikem infarktu, ve které se skutečně vyvinula nekróza podle kritérií barvení TTC; 3) procento oblasti s rizikem infarktu, ve které bylo přerušeno zásobování krví na konci období obnoveného krevního zásobování (jev ,,no-reflow„).
Měření krevního průtoku v oblasti srdeční svaloviny.
Krevní průtok v oblasti krevní svaloviny (RMBF - regional myocardial blood flow) byl měřen u všech králíků v každé ošetřované skupině. Různě zbarvené umělohmotné mikrokul.ičky (modré, červené a žluté, Triton Technology, San Diego, CA) byly použity pro měření RMBF 20 min. po uzavření a 10 min. a 5 hodin po obnovení krevního zásobování. Velikost mikrokuliček byla 15 ± 1 pm a byly suspendovány v roztoku 10% dextranu s 0,01 % Tweenu 80. Aby byl zajištěno odpovídající rozptýlení, mikrokuličky byly před použitím sonikovány v ultrazvukové lázni po dobu 5 min. Přibližně 500 000 mikrokuliček bylo injikováno (v celkovém objemu 0,5 až 1,0 ml) do katétru levé srdeční předsíně. Minutu před ínjikováním mikrokuliček bylo započato s odběrem referenčních vzorků tepenné krve, která pokračoval až do doby 1 min. po injekci. Na základě TTC barvení bylývybrány tkáňové vzorky (100 až 300 mg) ze středu ischemické oblasti a z neischemické oblasti. Mikrokuličky pak byly z tkáně odstraněny vyluhováním v 4 M KOH při 72 °'C po dobu 3 hodin a z referenčních vzorků krve vyluhováním v 16 Μ KOH při teplotě/místnosti a následnou mikrofiitrací, podle instrukcí výrobce. Barvy pak byly z kuliček získány do známého objemu rozpouštědla (dimetylformamid) a jejich koncentrace určena spektrofotometru při optimálních vlnových délkách pro každou barvu podle návodů výrobce. Složené spektrum každého barevného roztoku bylo rozloženo na spektra jednotlivých složek pomocí techniky inverzní matrice. Krevní tok pro každý vzorek krevní svaloviny byl spočten podle vzorce: RMBF = Fr χ Am / Ar, kde RMBF = krevní průtok srdeční svalovinou v ml/min., AM = absobance ve vzorku z krevní svaloviny a Ar = absobance v referenčním krevním vzorku. Hodnota krevního průtoku srdeční svalovinou byla vydělena váhou vzorku (za vlhká) a vyjádřena v ml/min./g.
π/ ·» ·»·· ·’ '-'ί- β φ fcfcfc • fc fcfc • fc fcfc*
Koagulační studia ···· · ’··*
Pro určení, jaký vliv má podání FVIIai a FVII na systémovou krevní koagulaci, byly měřeny protrombinový čas (PT - prothrombin time) a doba částečné aktivace tromboplastinu (aPTT - activated partial thromboplastine time) na počátku a 30 min. po podání léčiva, Vzorky krve (4,5 ml) byly odebírány do 0,5 ml citrátu sodného (3,8 %) a centrifugovány pro oddělení plazmy při 2000 g 10 min. při teplotě 4 °C. PT a aPTT byly měřeny duplicitně do dvou hodin po provedení krevního odběru.
Statistické analýzy
Výsledky jsou vyjádřeny ve formě průměru ± standardní odchylka průměru. Pro porovnáni mezi skupinami byla použita variance. Odchylky pro jednotlivé skupiny byly testovány Studentovým t-testem pro nepárová pozorování s Bonferroniho korekcí. Pro porovnání hemodynamických proměnných, stejně jako průtoku krve různými oblastmi krevní svaloviny mezi skupinami, byla použita analýza variance v uspořádání pro opakovaná měření.
Výsledky
Dvacet osm králíků podstoupilo chirurgický zákrok; dvě zvířata zahynula v průběhu uzávěru věnčitých cév na fibrilaci srdečních komor ještě před umístěním do té které ošetřovací skupiny a dva další králíci zahynuli během obnovení krevního průtoku (jeden v kontrolní skupině, a jeden ve skupině, ošetřované FVIIa). Tato zvířata byla vyloučena z následuj ících statistických analýz. Tedy bylo v každé ošetřované skupině zahrnuto do studie osm zvířat.
Hemoáynamická měření:
Ve všech ošetřovaných skupinách indukovalo uzavření věnčitých cév slabé snížení srdeční frekvence a středního tepenného tlaku. Mezi těmito třemi skupinami nebyly v průběhu experimentálního období zjištěny odchylky v srdeční frekvenci a středním tepenném tlaku (Tabulka 1).
Určeni velikosti rizikové oblasti, rozsahu infarktu a oblasti bez krevního zásobování (jev ,,no-ref/ow„):
Uzavření věnčitých cév mělo za následek vznik rizikové oblasti (hodnocené pomocí injekce klášterní modři na konci pokusu), jejíž velikost byla podobná u všech tří různě ošetřovaných skupin (31,6 ± 6,3, 28,2 ± 4,1 a 28,2 ± 5,3 % levé komory u kontrolní skupiny, skupiny ošetřené FVIIai a skupiny ošetřené FVIIa, p=NS).
·· ···♦ flta fl ·· ·· • » · * · · · ♦ · • · · · * * * ♦ * • · · · ta flfl·**··* « · · · · · »·« fl · *·· ·♦ ·
Po 30 minutovém uzavření věnčitých cév a 5,5 hodiny obnoveného krevního průtoku, byl podíl rizikové oblasti, který přešel do stádia nekrózy 59,8 ± 12,8 % v kontrolní skupině (Obr.7). Podání FVIIai významně zmenšilo rozsah infarktu na 28,1 ± 11,3 % plochy rizikové oblasti (p<0,01 podle ANOVA, Obr.1), zatímco podání FVIIa bylo spojeno s významným zvýšením rozsahu infarktu na 80,1 ±13,1 % plochy rizikové oblasti (p<0,01 vzhledem ke kontrolám a skupině králíků ošetřených FVIIai, Obr.7).
U skupiny kontrolních králíků 24,4 ± 2,7 % rizikové oblasti infarktu se stalo oblastí bez krevního zásobování, jak bylo zjištěno pomocí, distribuce thioflavinu S na konci pokusu (jev ,,no-reflow„). Rozsah této oblasti bez krevního zásobování byl výrazně zmenšen pomocí FVIIai na 11,1 ±6,1 % a výrazně zvětšen po aplikaci FVIIa na,61,9 ± 13,8 % rizikové oblasti infarktu (p<0,01, Obr.8).
Předešlé výsledky potvrdily, že rozsah oblasti srdeční svaloviny, která zůstane bez krevního zásobování po obnovení krevního oběhu po infarktu, závisí na různých parametrech; nejdůležitější jsou velikost rizikové oblasti, rozsah infarktu a rozsah zbytkového vedlejšího průtoku během uzavření. Kontrola těchto parametrů dovoluje přesnější odhad vlivu zákroků na rozsah vzniklé oblasti bez krevního zásobování. Když byl rozsah oblasti bez krevního zásobování u kontrolních králíků v předkládané studii s těmito parametry porovnán, byl pozorován vztah, vyjádřený lineární regresní rovnicí: NR (% levé komory [LV - lefí ventricle]) = -14,62 + 0,75(AR) + 0.07(IS) + 3,69(RMBF); r2 = 0,98; F:'test = 109,3, (0,37)(0,3)(3,69), kde NR je oblast bez krevního zásobování, AR je riziková oblast a RMBF je rozsah zbytkového vedlejšího průtoku během uzavření (v ml/min./g). Číslo v závorkách ukazuje standardní chyby koeficientů. S hodnotou r2 rovnající se 0,98 tento model vysvětluje >95 % variability plochy oblasti bez krevního zásobování, jež byla pozorována v této studii u kontrolních králíků.
Koeficienty rovnice, které byly získány pomocí hodnot od kontrolních králíků v regresní rovnici, pak.byly použity k výpočtu očekávané velikosti oblasti bez krevního zásobováni pro jednotlivá zvířata v každé ošetřované skupině (Obr.9). Skutečně pozorované velikosti oblastí bez krevního zásobování u králíků, kterým byl podán FVIIai, byly významně menší, než bylo očekáváno podle výpočtů, provedených pomocí rovnice, získané mnohonásobnou regresní analýzou. Opravdu u králíků léčených FVIIai, pro kteroukoliv očekávanou oblast bez krevního zásobování, skutečně pozorovaná velikost byla vždy menší, takže všechna zvířata této skupiny se rozkládala pod regresní přímkou, získanou pro kontrolní zvířata (Obr.9). Naopak, králíci léčení FVIIa vykazovali pravý opak, tj. pro kteroukoliv očekávanou oblast bez krevního ··
0* ·
0 0 0
000 000
0 * 0 0 0 · ·· • 0 0 0 0
0· 0 0 0 0 0
0 0 0 0
0000 0 00 <00 zásobování, skutečně pozorované velikosti byly vždy významně větší, tak že všechna zvířata se rozkládala nad regresní přímkou, získanou pro kontrolní zvířata (Obr.9). Souhrnně řečeno, tyto údaje ukazují, že zmenšení velikosti oblasti bez krevního zásobování, pozorované u králíků léčených FVIIai, není zcela vysvětlitelné zmenšením rozsahu infarktu a naznačují, že aktivace koagulační kaskády zevního srážení krve během obnovy krevního zásobováni po infarktu, přispívá ke vzniku oblasti bez krevního zásobování.
Měření krevního průtoku v oblasti srdeční svaloviny:
U kontrolních zvířat, v oblasti myokardu nepostižené infarktem, byl průměrný RMBF 1,20 ml/min./g tkáně v celém průběhu studia (údaje nejsou uvedeny). U téže skupiny, zvířat, RMBF v oblasti, myokardu postižené infarktem, byl 0,08 ± 0,02, 1,43 ± 0,28 a-’ 0,98 ± 0,19. ml/min./g tkáně 20 min. po uzávěru Věnčité tepny, 10 .min. a 5 hodin po obnovení-krevního průtoku. Aplikace různých léků, použitých .v této práci, významně nezměnila RMBF v průběhu pokusného .období ani. v normálním myokardu, ani v myokardu postiženém infarktem,.ve srovnání s kontrolními zvířaty.
Koagulační studia:
Ke studiu možných systémových vlivů FVIIai, které by mohly zvýšit riziko krvácivosti, byly měřeny PTs a aPTT ve krevních vzorcích odebíraných v 30 min. CFVs a po podání FVIIai a FVIIa. Na konci 30 min. období CFVs byly průměrné hodnoty PTs a aPTT 8,2 ± 0,6 sekundy a 25 ± 3 sekundy. Slabé zvýšení PTs na 10,1 ± 0,6 sekundy bylo pozorováno po podáni FVIIai- (Obr. 11). Toto zvýšení však nedosahuje statistické
I významnosti'(p=0,09 podle ANOVA a Studentova t-testu s Bonferroniho korekcí). aPTT se významně nezměnil po podání FVIIai (Obr.10). Podání FVIIa mělo za následek výrazné zkrácení jak PTs tak aPTTs pouze vzhledem k hodnotám,· získaným po podání FVIIai (Obr.11),
0
0*00 0
Tabulka I: Hemodynamické proměnné v průběhu uzávěru a opětného uvolnění věnčité tepny
Tepová frekvence (tepy/min.) | |||||
Doba po uzavření | Kontrola | SQ29548 | Dazoxiben | R68070 | ASA |
0 | 175 ±5 | 170 + 4 | 178±6 | 169 ±5 | 1 |
30 min. | 169 + 4 | 165 ±5 | 173 + 5 | 164 ±6 | 1 |
1 hodina | 169±6 | 167 ±4 | 171 ±5 | 166 ±5 | 1 |
2 hodiny | 173 ± 5 | 172 ±5 | 175 + 6 | 170 + 5 | 1 |
3 hodiny | 170 + 4 | 168 + 5 | 177 ±5 | 168 ±6 | 1 |
4 hodiny | 175 + 5 | 168 ±6 | 174 + 5 | 169 ±5 | 1 |
5 hodin | 175 ± 5 | 172 ±2 | 173 ±5 | 172 ±6 | 1 |
6 hodin | ' 168 ±5 | 170 ±4 | 174 ±5 | 168 ±5 | 1 |
Střední tepenný tlak (mm Hg) | |||||
Doba po uzavření | Kontrola | SQ29548 | Dazoxiben | R68070 | ASA |
0 7 | 75 ± 5 | 78 ±3 | 78 ±4 | 73 ±3 | 7 |
30 mip. | 69 ±4 | 65 ±4 | 71 ±3 | 67 ± 4 | 6 |
1 hodina | 69 ± 3 | 67 ±4 | 71 +4 | 69 ±4 | 6 |
2 hodiny | 73 + 4 | 75 ±4 | 75 + 5 | 72 + 4 | 7 |
3 hodiny | 74 ±4 | 75 + 3 | 77 + 5 | 75 ±3 | 7 |
4 hodiny | 75 + 5 | 78 ±4 | 76 ± 4 | 73 + 4 | 7 |
5 hodin | 73 ±4 | 74 ±5 | 78 ±5 | 72 ±4 | 7 |
6 hodin | 73 ± 5 | 76 ±4 | 74 ±5 | 73 + 5 | 7 |
<r«i OM* M fc fcf? «··' ř fe· * c fc fcfc o r> i· 4 o: Λ fc fc' fc fc, <ř' fc·· fc c b' fc fc- fc fc oqfc1 fc*>i
C fc fc fc· fc fc 1 «ιοοε fc nc níiťf tH·’ *·'*·
Tabulka II · ·· ' ’ ··“ '*
Krevní průtok oblastí srdeční svaloviny (ml/min./g tkáně) v průběhu uzávěru věnčitých cév a po následném obnovení krevního oběhu „
1 * | Kontrola | ' FVIIai ’ | FVIIa |
Normální srdeční svalovina | · , \ 1· - í | . * . \ | |
20 min. CAO (Ur ‘ | 1,19±0.22 Γ j , | , 1,03 ±0,19 1 \ . .ί· J J | 1 27 ± 0,24 |
,10 min. REP | 1,22 ±0.'Í5” | . ,.,1,10 ± 0,17 | ‘ 1,19 ± 0,20 .^ |
1 2 hodiny REP. | > · 1,17 + 0,1:8 i | ' ? 1,07 ±0,16 ' | Λ 1,22 ± 0,19- |
•r * r | - '· '** -i · | / t í | |
ischemická srdeční svalovina | |||
20 min. CAO | 0,091 0,05 | 0,08 ±0,05 | 0,08 ± 0,04 |
10 min. REP | 1,53 ± 0,12 | 1,65 ±0,18 | 1,24 ±0,14 |
2 hodiny REP | 0,89 ± 0,14 | 1,23 ± 0,15 | 0,72 ±0,13 |
r , H Ί CAO’’- uzavření věnčité tepny (Coronary Artery Occlusion)
I i REP = obnovení krevního zásobování (Reperfusion) i · i · Příklad 19:, Podávání FVIIai snižuje rozsah infarktu a velikost oblasti rizika infarktu
Expozice tkáňového faktoru nastává v průběhu obnovení krevního zásobení í
j *' srdce po infarktu uvnitř věnčitých cév a vede ke snížení místního krevního průtoku.
i Abychom určili, zda expozice tkáňového faktoru může přispět k poškození i 3 s myokardu tím, že aktivuje srážení krve a snižuje průtok krve věnčitými cévami í 0 ‘ 4 v průběhů obnovení krevního zásobení srdce po infarktu, novozélandští bílí králíci byli
Ě podrobeni na 30 minut uzavřeni věnčitých cév, po němž byl krevní oběh na 5,5 hodiny ř obnoven. V průběhu obnoveni krevního oběhu zvířata náhodně dostala: fyziologický : roztok (n=8): lidský rekombinantní Faktor Vila s blokovaným aktivním místem (FVIIai,
100 pg/kg/min. po dobu 10 min. do levé srdeční předsíně, n-8) nebo lidský í rekombinantní Faktor Vila (FVIIa, 100 pg/kg/min. po dobu 10 min. do levé srdeční předsíně, n=8). Krevní průtok v oblasti srdeční svaloviny (RMBF) byl měřen pomocí ♦· ···· ·« .· »· ·. fcfc · fcfc·* · · · • * fc · · ♦··· • · fcfc··· ♦♦♦ ··« • · · · · · ·
Q7 ..... ....... ·· barvených mikrokuliček v 20 minutách ischémie a 10 min. a 2 hodiny po obnovení krevního zásobování. Na konci pokusu byly pomocí distribuce klášterní modři a thioflavínu a pomocí barvení TTC změřeny: velikost rizikové oblasti infarktu (AR), rozsah infarktu (IS) a velikost oblasti bez krevního zásobení (NR). Podání FVIIai mělo za následek významné zmenšení jak IS, tak NR vzhledem ke kontrolám (28,1 ± 11,3 % a 11,1 ± 6,1 % AR oproti 59,8 ± 12,8 % a 24,4 ± 8,2 % AR, p<0,01), zatímco podání FVIIa mělo za následek významné zvětšení jak IS, tak NR na 80,1 ±13,1 % a 61,9 ± 13,8 % AR, p<0,Ó1, vzhledem ke kontrolám. U skupin zvířat nebyly pozorovány rozdíly v krevním tlaku, tepové frekvenci, AR a RMBF v 20 minutách ischémie. RMBF byl významně vyšší 2 hodiny po obnovení krevního zásobování u zvířat, jimž byl podán FVIIai, zatímco u králíků, jimž byl..podán. FVIIa byl nižší. Tedy tkáňovým faktorem zprostředkovaná aktivace krevního srážení významně přispívá ke vzniku poškození myokardu v období obnoveni krevního zásobování po infarktu.
FVIIai(AR) | Kontrola (AR) | FVIIa (AR) | |
iS | 28,1 + 11,3 | 59,8 + 12,8 | 80,1 ± 13,1 |
NR . | 11,1+6,1 | 24,4 ±8,2 | 61,9 + 13,8 |
AR -velikost oblasti s rizikem infarktu
IS = rozsah infarktu
NR - oblast bez krevního zásobení
Ačkoli zde uvedený vynález byl popsán do jistých podrobností ilustracemi 'a příklady za účelem jasného porozumění, je zřejmé, že v rámci připojených patentových nároků mohou být uplatněny určité změny a modifikace.
Průmyslová využitelnost
Faktor VII s modifikovaným aktivním místem připravený podle vynálezu účinně blokuje kaskádu krevního srážení a je použitelný pro zabránění vzniku poškození myokardu v souvislosti s ischemickou chorobou srdeční, pro léčení takto vzniklých poškození, pro zlepšení průchodnosti cév a rovněž pro místní aplikaci na místa citlivá na vznik krevních sraženin.
• · 444* · 4 «' · ·
4 ·
4··
4 • 44 4 • 4 4 • 4 4 · 4 • 4 44 « 4 4
4 4 4 • ··· 444
4 ··
Seznam sekvencí (1) Všeobecné informace (i) Žadatel: ZymoGenetics a
Novo Nordisk A/S
OD | Název vynálezu: Modifikovaný Faktor VI! | |
il | (iv) | Počet sekvencí; 4 . |
(v) | Adresa pro korespondenci: |
(A) Adresa: Novo Nordisk A/S, Corporate Patents (B) Ulice: Novo Allé (C) Město: DK-2880 Bagsvaerd (D) Stát: Dánsko (viii) Počítačové vybavení:
(A) Druh média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release#1.24
(ix) | Údaje o nynější žádosti: |
(I) | Číslo žádosti; |
(J) | Datum podání: |
(K) | Klasifikace: |
(vii) Údaje o předchozí žádosti: | |
(B) | Číslo žádosti: 08/475,845 |
(C) | Datum podání: 7 června 1995 |
(D) | Klasifikace: |
««. A··* ·· » · · · • » · • · · ♦ .
• · · ·*·· « ·· • ·· ·*· »»fl · »·...·· » · ··· ··» ··«.' ··· ··· ·· ’·♦ ť2)l? Informace k sekvenci č. 1:
(i) Charakteristika sekvence:
(a) délka: 2422 párů baží “ (b) typ: nukleová kyselina (O typ řetězce: jednovláknový <d) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA o (ííí) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (ix) Význačné rysy:
(a) Název/klíč: CĎS ... ' : (B) Umístění: 28..1420 (d) Další informace: /štartovací_kodon= 28 /produkt= “Faktor VII“
.. . .. ..
4,· . .....
(xi) Popiš sekvence č. 1:
CCTCCCGACA ÁTACAGGGGC AGCACTGCAG AGATTTCÁTC ATG GTC TCC CAG GCC 55
Met Val Ser Gin Ala | ||||||||||||||||
-38 | -35 | |||||||||||||||
CTC | AGG | CTC | CTC | TGC | CTT | CTG | CTT | GGG | CTT | CAG | GGC | TGC | CTG | GCT | GCA | 103 |
Leu | Arg | Leu | Leu | Cys | Leu | Leu | Leu | Gly | Leu | Gin | Gly | Cys | Leu | Ala | Ala | |
-30 | -25 | -20 | ||||||||||||||
GTC | TTC | GTA | ACC | CAG | GAG | GAA | GCC | CAC | GGC | GTC | CTG | CAC | CGG | CGC | CGG | 151 |
Val | Phe | Val | Thr | Gin | Glu | Glu | Ala | His | Gly | Val | Leu | His | Arg | Arg | Arg |
* . 10 • to ·♦·♦ to * .♦ • to • · · • to toto·» · to · > · to · • to « ·» to· · · · · to · · · · to · ··· ··* • ** toto» ·· ·
CGC GCC Arg Ala | AAC Asn | GCG TTC Ala Phe | CTG Leu 5 | GAG GAG CTG CGG CCG GGC TCC CTG GAG AGG | 199 | |||||||||||
Glu Glu | Leu | Arg Pro 1.0 | Gly. | Ser | Leu Glu Arg 15 | |||||||||||
1 | ||||||||||||||||
GAG | TGC | AAG | GAG | GAG | CAG | TGC | TCC | TTC | GAG | GAG | GCC | CGG | GAG | ATC | TTC | 247 |
Glu | Cys | Lys | Glu | Glu | Gin | Cys | Ser | Phe | Glu | Glu | Ala | Arg | Glu | Ile | Phe | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
AAG | GAC | GCG | GAG | AGG | ACG | AAG | CTG | TŤC | TGG | ATT | TCT | TAC | AGT | GAT | GGG | 295 |
Lys | Asp | Ala | Glu | Arg | Thr | Lys | Leu | Phe | Trp | Ile | Ser | Tyr | Ser | Asp | Gly | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
GAC | CAG | TGT | GCC | TCA | AGT | CCA | TGC | CAG | AAT | GGG | GGC | TCC | TGC | AAG | GAC | 343 |
Asp | Gin | Cys | Ala | Ser | Ser | Pro | Cys | Gin | Asn | Gly | Gly | Ser | Cys | Lys | Asp | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
CAG | CTC | CAG | TCC | TAT | ATC | TGC | TTC | TGC | CTC | CCT | GCC | TTC | GAG | GGC | CGG | 391 |
Gin | Leu | Gin | Ser | Tyr | Ile | Cys | Phe | Cys | Leu | Pro | Ala | Phe | Glu | Gly Arg | ||
65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
AAC | TGT | GAG | ACG | CAC | AAG | GAT | GAC | CAG | CTG | ATC | TGT | GTG | AAC | GAG | AAC | 439 |
Asn | Cys | Glu | Thr | His | Lys | Asp | Asp | Gin | Leu | Ile | Cys | Val | Asn | Glu | Asn | |
80 | ? | 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
GGC | GGC | ,ÝGT | GAG | CAG | TAC | TGC | AGT | GAC | CAC | ACG | GGC | ACC | AAG | CGC | TCC | 487 |
Gly Gly | Cys | Glu | Gin | Tyr | Cys | Ser | Asp | His | Thr | Gly | Thr | Lys | Arg | Ser | ||
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
TGT | CGG | TGC | CAC | GAG | GGG | TAC | TCT | CTG | CTG | GCA | GAC | GGG | GTG | TCC | TGC | 535 |
Cys | Arg | Cys | His | Glu | Gly | Tyr | Ser | Leu | Leu | Ala | Asp | Gly | Val | Ser | Cys | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
ACA | CCC | ACA | GTT | GAA | TAT | CCA | TGT | GGA | AAA | ATA | CCT | ATT | CTA | GAA | AAA | 583 |
Thr | Pro | Thr | Val | Glu | Tyr | Pro | Cys | Gly | Lys | Ile | Pro | Ile | Leu | Glu | Lys |
130
135
140 flfl fl· » · fl 71 » flflflfl flfl · » * • · fl · flflflfl · • flfl flflfl fl. · • fl ··
AGA | AAT | GCC | AGC | AAA | CCC | CAA | GGC | CGA | ATT | GTG | GGG | GGC | AAG | GTG | TGC | 631 | ||
Arg | Asn | Ala | Ser | Lys | Pro | Gin | Gly | Arg | Ile | Val | Gly | Gly | Lys | Val | Cys | |||
c | 145 | 150 | 155 | |||||||||||||||
0 | CCC | AAA | GGG | GAG | TGŤ | CCA | TGG | CAG | GTC | CTG | TTG | TTG | GTG | AAT | GGA | GCT | 679 | |
Pro | Lys | Gly | Glu | Cys | Pro | Trp | Gin | Val | Leu | Leu | Leu | Val | Asn | Gly | Ala | |||
160 | 165 | 170 | 175 | |||||||||||||||
. . ,---- | ...— | : i r | - | - - - — | .....- | . ... . | . »- | — | —- | . | ||||||||
' ÍJ' | 10 | CAG | TTG· | TGT | GGG | GGG | ACC | CTG | ATC | AAC | ACC | ATC | TGG | GTG | GTC | TCC | GCG | 727 |
Gin | Leu | Cys | Gly | Gly | Thr. | Leu | Ile | Asn | Thr | Ile | Trp | Val | Val | Ser | Ala | |||
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||||
GCC | CAC | TGT | TTC | GAC | AÁA | ATC | AAG | AAC | TGG | AGG | AAC | CTG | ATC | GCG | GTG | 775 | ||
15 | Ala | His | Cys | Phe | Asp | Lys | Ile | Lys | Asn | Trp | Arg | Asn | Leu | Ile | Ala | Val | ||
1 | 195 | 200 | 205 | |||||||||||||||
CTG | GGC | GAG | CAC | GAC | CTC | AGC | GAG | CAC | GAC | GGG | GÁT | GAG | CAG | AGC | CGG | 823 | ||
. Leu | Gly | Glu | His | Asp | Leu | Ser | Glu | His | Asp | Gly | Asp | Glu | Gin | Ser | Arg | |||
► | 20 | - | 210, | - | ,215 | ->· | 220 | |||||||||||
CGG | GTG | GCG | CAG | GŤC | ATC | ATC | CCC | AGC | ACG | TAC | GTC | CCG | GGC | ACC | ACC | 871 | ||
Árg | Val | Alá | Gin | Val | Ile | Ile | Pro | Ser | Thr | Tyr | val | Pro | Gly | Thr | Thr | |||
225 | 230 | 235 | ||||||||||||||||
25 | ||||||||||||||||||
AAC | CAC | GAC | ATC | GCG | CTG | CTC | CGC | CTG | CAC | CAG | CCC | GTG | GTC | CTC | ACT | 919 | ||
Asn | His | Asp | Ile | Ala | Leu | Leu | Arg | Leu | His | Gin | Pro | Val | Val | Leu | Thr | |||
& | 240 | 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
30 | GAC | CAT | GTG | GTG | CCC | CTC | TGC | CTG | CCC | GAA | CGG | ACG | TTC | TCT | GAG | AGG | 967 | |
rfl | Asp | His | Val | Val | Pro | Leu | Cys | Leu | Pro | Glu | Arg | Thr | Phe | Ser | Glu | Arg |
260 265 270 . BB
BB
B . « «· BBBB
BB
Β ·.' ► · B · ••Β BBB
Β B
B· ·*
ACG CTG | GCC TTC | GTG CGC TTC TCA | TTG GTC | AGC GGC TGG GGC CAG CTG | 1015 | |||||||||||
Thr. | Leu | Ala | Phe 275 | Val Arg Phe | Ser | Leu 280 | Val | Ser Gly Trp | Gly Gin Leu 285 | |||||||
CTG | GAC | CGT | GGC | GCC | ACG | GCC | CTG | GAG | CTC | ATG | GTC | CTC | AAC | GTG | CCC | 1063 |
Leu | Ašp Arg Gly | Ala | Thr | Ala | Leu | Glu | Leu | Met | val | Leu | Asn | Val | Pro | |||
290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
CGG | CTG | ATG | ACC | CAG | GAC | TGC | CTG | CAG | CAG | TCA | CGG | AAG | GTG | GGA | GAC | 1111 |
Arg | Leu | Mét | Thr | Gin | Asp | Cys | Leu | Gin | Gin | Ser | Arg | Lys | Val | Gly | Asp | |
305 | 310 | 315 | - | |||||||||||||
TCC | CCA. AAT | ATC | ACG | GAG | TAC | ATG | TTC | TGT | GCC | GGC | TAC | TCG | GAT | GGC | 1159 | |
Ser | Pro | Asn | Ile | Thr | Glu | Tyr | Mét | Phe | Cys | Ala | Gly Tyr | Ser | Asp | Gly | ||
320 | 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
AGC | AAG | GAC | TCC | TGC | AAG | GGG | GAC | AGT | GGA | GGC | CCA | CAT | GCC | ACC | CAC | 1207 |
Ser | Lys | Asp | Ser | Cys | Lys | Gly Asp | Ser | Gly | Gly | Pro | His | Ala | Thr | His | ||
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
TAC | CGGVGGC | ACG | TGG | TAC | CTG | ACG | GGC | ATC | GTC | AGC | TGG | GGC | CAG | GGC | 1255 | |
Tyr | Arg | Gly | Thr | Trp | Tyr | Leu | Thr | Giy | Ile | Val | Ser | Trp | Gly | Gin | Gly | |
! | 355 | 360. | 365 | |||||||||||||
TGC | GCA | ACC | GTG | GGC | CAC | TTT | GGG | GTG | TAC | ACC | AGG | GTC | TCC | CAG | TAC | 1303 |
Cys | Ala | Thr | Val | Gly | His | Phe | Gly | Val | Tyr | Thr | Arg | Val | Ser | Gin | Tyr | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
ATC | GAG | TGG | CTG | CAA | AAG | CTC | ATG | CGC | TCA | GAG | CCA | CGC | CCA | GGA | GTC | 1351 |
Ile | Glu | Trp | Leu | Gin | Lys | Leu | Met | Arg | Ser | Glu | Pro | Arg | Pro | Gly | Val | |
385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
CTC | . CTG | CGA | GCC | CCA | TTT | CCC | TAG | C CCAGCAGCCC TGGCCTGTGG | 1396 | |||||||
Leu | Leu | Arg | Alá | Pro | Phe | Pro |
400
405 «3.
. . *« · • ;· · · a · * a aa* aaa a a aa aa . ·· 4 4 · 4' • 4 ' *
4
·.
• 4
444 4 4 «44 .: :
• * aa ·
AGAGAAAGCC AAGGCTGCGT CGAACTGTCC | |||
TTAATGGGGT | AGAGGAGGGC | ATGGGAGGGA | |
5 | AACAGAGAGA | GACAGAGACA | GAGAGAGACT |
ACTCAAAGAG | ACTCCAAGAT | TCAAAGAGAC | |
. ATGAGAGGCA | GAGGCAGACA | GGCGCTGGAC | |
10 | |||
GGAGGCAGAC | AGCCCAGCTG | AGCCTCCTTA | |
GATCTGCTGG | CCCTČAGGCT | GCTGCTCTGC | |
15 | CACACATGGA | TGCACACACA | CACACGCCAA |
GATGCACACA | CAGATGGTCA | CACAGAGATA | |
GATATGCACA | CACAGATGCA | CACACAGATA | |
20 | |||
CGCACACATC | AGTGCACACG | GATGCACACA | |
• 1» GATATGCACA | CACATGGATG | AGCACACACA | |
25 | t ACACAGÁTGC | ACACACAGAT | GCACACACAC |
AAGGCGGTTG | TTTAGCTCTC | AČTTTTCTGG | |
AAŤTCAGAAG | CATCACCATG | CATGGTGGCG | |
30 | |||
TCTCCCTŤCG | CTGGGTGCCG | GGCTGCACAG | |
ATAAACGGCT | GCGTCTCCTC | CGCACACCTG | |
35 | AAAAAA |
TGGCACCAAA. TCCCATATAT TCTTCTGCAG 1456
GGGAGAGGTG GGGAGGGAGA CAGAGACAGA 1516
GAGGGAGAGÁ.CTCTGAGGAC ÁTGGAGAGAG 1576
TAATAGAGAC ACAGAGATGG AATAGAAAAG 1636
AGAGGGGCAG GGGAGTGCCA AGGTTGTCCT 1696
CCTCCCTTCA GCCAAGGCCC ACCTGCACGT 1756
CTTCATTGCT GGAGACAGTA GAGGCATGAA 1816
TGCACACACA CAGAGATATG CACACACACG 1876
CGCAAACACA CCGATGCACA CGCACATAGA 1936
TACACATGGA TGCACGCAČA TGCCAATGCA 1996
GATATGCACA CACCGATGTG CGCACACACA 2056
CACCAAGTGC GCACACACAC CGATGTACAC 2116
CGATGCTGAC TCCATGTGTG CTGTCCTCTG 2176
TTCTTATCCA TŤATCATCTT CACTTCAGAC 2236
AATGCCCCCA AACTCTCCCC CAAATGTATT 2296
ACTATTCCCC ACCTGCTTČC CAGCTTCACA 2356
TGGTGCCTGC CACCCAAAAA AAAAAAAAAA 2416
2422 • fc fcfcfcfc • . · .· • · • fcfc ·
• itfc fc : «· -fc • · ·· • · · fc * ' · fc < ' fc • fc fcfcfc ·· fcfc • ,· fc · • fcfcfc « ·· ··· fc · fcfc «· (2) Informace k sekvenci č 2:
5 | (i) | Charakteristika sekvence: | ||||||||||
(A) (B) (D) | délka: 444 aminokyselin typ: aminokyselina topologie: lineární | |||||||||||
(ii) | Typ molekuly: protein | |||||||||||
10 | (xi) | Popis Sekvence č. 2: | ||||||||||
Met | Val | Ser | Gin | Ala Leu Arg Leu Leu | Trp | Leu | Leu | Leu | Gly | Leu | Gin | |
-38 | -35 | -30 | -25 | |||||||||
15 | Gly | Cys | Leu | Ala | Ala Val Phe Val Thr | Gin | Glu | Olu | Ala | His | Gly | Val |
-20 | -15 | -10 | ||||||||||
Leu | His | Arg | Arg | Arg Arg Ala Asn Ala | Phe | Leu | Glu | Glu | Leu | Árg | Pro | |
-5 | 1 | 5 | 10 | |||||||||
20 | - | |||||||||||
Gly | Sér | Leh | Glu | Arg Glu Cys Lys Glu | Glu | Gin | Cys | Ser | Phe | Glu | Glu | |
' í | 15 | 20 | 25 | |||||||||
Ala | Arg | Glu / | Ile | Phe Lys Asp Ala Glu | Arg | Thr | Lys | Leu | Phe | Trp | Ile | |
25 | 30 | 35 | 40 | |||||||||
Ser | Tyr | Ser | Asp | Gly Asp Gin Cys Ala | Ser | Ser | Pro | Cys | Gin | Asn | Gly | |
45 | 50 | 55 | ||||||||||
30 | Gly | Ser | Cys | Lys | Asp Gin Leu Gin Ser | Tyr | Ile | Cys | Phe | Cys | Leu | Pro |
60 | 65 | 70 | ||||||||||
Ala | Phe | Glu | Gly | Arg Asn Cys Glu Thr | His | Lys | Asp | Asp | Gin | Leu | Ile | |
75 | 80 | 85 | 90 |
·· ···· ·· · ·· ·· • · · ···· ·«·* » » ··· ···· ι « · * « · · ··· »·· · · · · · · ···· · ·· ··· ·· ··
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr 95 100 105 a
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 110 115 120
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile 125 130 135
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg Ile Val 140 ' 145 ISO
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu
155 160 165 170
Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile . 175 180 185
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
190 ’ '195 ... 200
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
J
205' 210 215 t
Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr 220 225 230
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gin
235 240 245 250
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
255 260 265
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe ser Leu Val Ser
270
275
280 ·· ř · · · · ► 0 0 · •·0 000 • 0 ·· ·· · 00 0 • * 0 0 0 0 • 0 • 0'0'0 0
Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala- Leu Glu Leu Met 285 290 295 .
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser 300 305 310
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 315 320 325 330
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 335 340 345
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
350 355 360
Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
365 370 375 . .20 , Arg Val Ser Gin Tyr Ile Glu Trp· Leu Gin Lys Leu Meť Arg Ser Glu
380 385 390
Pro Arg Pró Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro
395
400
405 (2) Informace k sekvenci č. 3:
íi) Charakteristika sekvence: tA) délka: 21 páru baží (B) typ: nukleová kyselina (c) typ řetězce: jednovláknový (d) topologie: lineární
Ui) Typ molekuly: cDNA o (iii) Hypotetická: ne íiv) Anti-sense: ne (xi) Popis sekvence č. 3:
TGGGCCTCČG GCGTCCCCCT T 21 ' i (2) Informace k sekvenci č. 4:
/ (ij Charakteristika sekvence:
(A) délka: 15 párů baží i (b) typ: nukleová kyselina (c) typ řetězce: jednovláknový (d) topologie: lineární 30 (ii) Typ molekuly: cDNA (ííí) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne * fcfc v ·· « • fc fcfcfcfc «•fcfc fc ··· ··« • · • · ·· íxi) Popis sekvence č. 4: 5
TCCCAGTCAC GACGT 15 li »· ···* ·· • a a a • a á a aaa aa a
Claims (28)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob zabránění tvorby krevní sraženiny vyznačující se tím, že obsahuje místní podání terapeuticky účinné dávky preparátu obsahujícího Faktor Vil přinejmenším s jednou modifikací v jeho katalytickém centru, kterážto modifikace podstatně inhibuje schopnost modifikovaného Faktoru Vil aktivovat plazmatický Faktor X nebo IX, na takové místo cévy, které je náchylné ke vzniku krevní sraženiny u pacienta.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující s e t í m, že modifikace, zahrnuje reakci Faktoru VII s inhibitorem šeřin proteázy.
- 3. Způsob podle nároku 2, v y z n a č u j í c í s e t í m, že proteázový inhibitor je organofosfátová sloučenina, sulfanylfluorid, halometylketonový derivát peptidu nebo azapeptid.
- 4' Způsob podle nároku 3, vyznačují'cí se t í m, že proteázový inhibitor je některý z těchto halometylketonových peptidových derivátů - Dansyl-Phe-Pro-Arg chlormetylketon, Dansyl-Glu-Gly-Arg chlormetylketon, Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormetylketon nebo Phe-Phe-Arg chlormetylketon.
- 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1až4, vyznačující se t í m, že místo tvorby krevní sraženiny souvisí s chirurgickým zákrokem, mikrochirurgií, operací cév nebo traumatem.
- 6. Způsob udržování nebo vylepšení průchodnosti cév pacienta vyznačující se tím, že obsahuje místní podání terapeuticky účinné dávky preparátu obsahujícího Faktor VII přinejmenším s jednou modifikací v jeho katalytickém centru, kterážto modifikace podstatně inhibuje schopnost modifikovaného Faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X nebo IX, na takové místo cévy, které je náchylné ke snížené průchodnosti.
- 7. Způsob podle nároku 6, v y z n a č u j í c í se t í m, že modifikace zahrnuje reakcí Faktoru VII s inhibitorem serin proteázy.·« · * ·
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že proteázový inhibitor je organofosfátová sloučenina, sulfanylfluorid, halometylketonový derivát peptidu nebo azapeptid.
- 9. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že proteázový inhibitor je některý z těchto halometylketonových peptidových derivátů - Dansyl-Phe-Pro-Arg chlormetylketon, Dansyi-Glu-Gly-Arg chlormetylketon, Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormetylketon nebo Phe-Phe-Arg chlormetylketon.
- 10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 6 áž 9, vyznačující setím, že místo tvorby krevní sraženiny souvisí s chirurgickým zákrokem, mikrochirurgií, operací cév . nebo traumatem. . . .... ......
- 11. Použití Faktoru VII obsahujícího přinejmenším jednu modifikaci v jeho katalytickém centru, kterážto modifikace podstatné inhibuje schopnost modifikovaného Faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X nebo IX, pro přípravu látek zabraňujících nebo minimalizujících poškození myokardu v souvislosti s obnovením krevního zásobování po ischemickém záchvatu.
- 12. Způsob podle nároku 16, v y z n a č u j í c í se t í m, že modifikace zahrnuje reakci Faktoru VII s inhibitorem šeřin proteázy.
- 13. Způsob podle nároku 17, v y z n a č u j í c í s e t í m, že proteázový inhibitor je iorganofosfátová sloučenina, sulfanylfluorid, halometylketonový derivát peptidu nebo azapeptid.
- 14. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že proteázový inhibitor je některý z těchto halometylketonových peptidových derivátů - Dansyl-Phe-Pro-Arg chlormetylketon, Dansyl-Glu-Gly-Arg chlormetylketon, Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormetylketon nebo Phe-Phe-Arg chlormetylketon.
- 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 16 až 19, vyznačující se tím, že poškození myokardu je nekróza myokardu.
- 16. Způsob zabraňující nebo minimalizující poškození myokardu v souvislosti s obnovením krevního zásobování po ischemickém záchvatu u jedince vyznačující se t í m, že obsahuje podání preparátu obsahujícího farmakologicky přijatelný Faktor VII přinejmenším s jednou modifikací v jeho katalytickém centru, kterážto modifikace podstatně inhibuje schopnost modifikovaného Faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X nebo IX.
- 17. Způsob podle nároku 21, vyznačující, se tím, že modifikace zahrnuje reakci Faktoru VII s inhibitorem serin proteázy.•i'
- 18. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že proteázový inhibitor je _v - organofosfátová sloučenina, sulfanylfluorid, halometylketonový derivát peptidu nebo azapeptid.
- 19. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že proteázový inhibitor je některý z těchto halometylketonových peptidových derivátů - Dansyl-Phe-Pro-Arg chlormetylketon, Dansyl-Glu-Gly-Arg chlormetylketon, Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormetylketon nebo Phe-Phe-Arg chlormetylketon.
- 20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 21 až 24, v y z n a č u j i c i se t i m, že poškození myokardu je nekróza myokardu.I
- 21. Použití Faktoru VII obsahujícího přinejmenším jednu modifikaci v jeho katalytickém centru,· kterážto modifikace podstatně inhibuje schopnost modifikovaného Faktoru . VII aktivovat plazmatický Faktor X nebo IX, pro přípravu látek zlepšujících místní průtok krve v myokardu během obnovení krevního zásobování po ischemickém ** záchvatu.
- 22. Způsob podle nároku 26, v y z n a č u j í c í se t í m, že modifikace zahrnuje reakci Faktoru VII s inhibitorem serin proteázy.
- 23. Způsob podle nároku 27, v y z n a č u j i c i se t i m, že proteázový inhibitor je organofosfátová sloučenina, sulfanylfluorid, halometylketonový derivát peptidu nebo azapeptid.• · ·· • to toto to toto • toto to *
- 24. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že proteázový inhibitor je některý z těchto halometylketonových peptídových derivátů - Dansyl-Phe-Pro-Arg chlormetylketon, Dansyl-Glu-Gly-Arg chlormetylketon, Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormetylketon nebo Phe-Phe-Arg chlormetylketon.
- 25. Způsob zlepšení místního průtoku krve v myokardu během obnovení krevního zásobování po ischemickém záchvatu u jedince vyznačující se tím, že obsahuje podání preparátu obsahujícího farmakologicky přijatelný Faktor VII přinejmenším s jednou modifikací v jeho katalytickém centru, kterážto modifikace podstatně inhibuje schopnost modifikovaného Faktoru VII aktivovat plazmatický Faktor X nebo IX.
- 26. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že modifikace zahrnuje reakci Faktoru VII s inhibitorem serin proteázy.
- 27. Způsob podle nároku 31, vyznačujíc í se tím, že proteázový inhibitor je organofosfátová sloučenina, sulfanylfluorid, halometylketonový derivát peptidů nebo azapeptid.1 * « · vrt· —
- 28. Způsob ppdle nároku 32, vyznačující se tím, že proteázový inhibitor je některý z těchto halometylketonových peptídových derivátů - Dansyl-Phe-Pro-Arg chlormetylketon, Dansyl-Glu-Gly-Arg chlormetylketon, Dansyl-Phe-Phe-Arg chlormetylketon nebo Phe-Phe-Arg chlormetylketon.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/660,289 US5833982A (en) | 1991-02-28 | 1996-06-07 | Modified factor VII |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ394698A3 true CZ394698A3 (cs) | 1999-04-14 |
Family
ID=24648892
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ983946A CZ394698A3 (cs) | 1996-06-07 | 1997-06-06 | Způsob zabránění tvorby krevní sraženiny a použití Faktoru VII |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5833982A (cs) |
EP (1) | EP0910580A1 (cs) |
JP (1) | JP2000513720A (cs) |
KR (1) | KR20000016415A (cs) |
CN (2) | CN1515318A (cs) |
AU (1) | AU735012B2 (cs) |
BR (1) | BR9709661A (cs) |
CA (1) | CA2256761A1 (cs) |
CZ (1) | CZ394698A3 (cs) |
HU (1) | HUP0003077A3 (cs) |
IL (1) | IL127099A0 (cs) |
NO (1) | NO985668L (cs) |
PL (1) | PL330365A1 (cs) |
RU (1) | RU2211704C2 (cs) |
UA (1) | UA68333C2 (cs) |
WO (1) | WO1997047651A1 (cs) |
ZA (1) | ZA975013B (cs) |
Families Citing this family (87)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040087498A1 (en) * | 1991-02-28 | 2004-05-06 | Novo Nordisk Health Care Ag | Modified factor VII |
US5997864A (en) | 1995-06-07 | 1999-12-07 | Novo Nordisk A/S | Modified factor VII |
ES2339196T3 (es) * | 1997-07-18 | 2010-05-17 | Novo Nordisk Health Care Ag | Uso de fviia o fviiai para el tratamiento de disfuncion endotelial y para la inhibicion de angiogenesis, respectivamente. |
US6747003B1 (en) | 1997-10-23 | 2004-06-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
US7247708B2 (en) | 1997-10-23 | 2007-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
US6693075B1 (en) * | 1997-10-23 | 2004-02-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
US6406488B1 (en) * | 1998-08-27 | 2002-06-18 | Heartstent Corporation | Healing transmyocardial implant |
EP0987274A1 (en) | 1998-09-15 | 2000-03-22 | Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH | Factor VIIa Inhibitors |
EP1059302A1 (en) | 1999-06-08 | 2000-12-13 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Factor VIIa inhibitors |
US6924359B1 (en) * | 1999-07-01 | 2005-08-02 | Yale University | Neovascular-targeted immunoconjugates |
EP1095933A1 (en) | 1999-10-30 | 2001-05-02 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Novel N-guanidinoalkylamides, their preparation, their use, and pharmaceutical preparations comprising them |
DK1257295T3 (da) * | 2000-02-11 | 2009-08-10 | Bayer Healthcare Llc | Faktor VII eller VIIA-lignende molekyler |
CA2405912A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US7220837B1 (en) | 2000-04-28 | 2007-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
US7812132B2 (en) * | 2000-04-28 | 2010-10-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
EP1162194A1 (en) | 2000-06-06 | 2001-12-12 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Factor VIIa inhibitory (thio)urea derivatives, their preparation and their use |
AU2001269803A1 (en) * | 2000-06-20 | 2002-01-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for modulating muscle cell and tissue contractility |
US20030211094A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
US6423826B1 (en) | 2000-06-30 | 2002-07-23 | Regents Of The University Of Minnesota | High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides |
US7160540B2 (en) * | 2000-06-30 | 2007-01-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods for detecting activity of clottings factors |
EE200300192A (et) | 2000-12-06 | 2003-08-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Guanidiini ja amidiini derivaadid, nende valmistamismeetod ja kasutamine, farmatseutiline preparaatning eelravim |
US6825323B2 (en) * | 2001-01-10 | 2004-11-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Compositions for treatment of hemorrhaging with activated factor VIIa in combination with fibrinogen and methods of using same |
CZ20032454A3 (en) * | 2001-03-22 | 2004-03-17 | Novo Nordisk Health Care Ag | Coagulation factor vii derivative |
US7235638B2 (en) | 2001-03-22 | 2007-06-26 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Coagulation factor VII derivatives |
RU2003134701A (ru) * | 2001-05-02 | 2005-03-27 | Ново Нордиск А/С (DK) | Модифицированный fvii при лечении ards |
EP1270551A1 (en) | 2001-06-26 | 2003-01-02 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Urea derivatives with antiproteolytic activity |
WO2003022122A2 (en) * | 2001-09-10 | 2003-03-20 | Florence Medical Ltd. | Individual ffr determination for lesions of a multi-lesioned blood vessel |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
EP2298354B1 (en) | 2001-10-10 | 2014-03-19 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of interferon-beta |
JP2005507008A (ja) * | 2001-11-02 | 2005-03-10 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | アポトーシスに関連した症状の治療のための、組織因子アゴニストまたは組織因子アンタゴニストの使用 |
EP1314733A1 (en) | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Indole-2-carboxamides as factor Xa inhibitors |
BR0215216A (pt) | 2001-12-21 | 2004-11-16 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Composição aquosa lìquida, método para preparar uma composição aquosa lìquida de um polipeptìdeo de fator vii, uso de uma composição aquosa lìquida, e, método para o tratamento de uma sìndrome de resposta ao fator vii |
PL370656A1 (en) * | 2001-12-21 | 2005-05-30 | Novo Nordisk A/S | Liquid composition of modified factor vii polypeptides |
KR20040065278A (ko) * | 2001-12-21 | 2004-07-21 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 변경된 인자 ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물 |
DK1499719T3 (da) * | 2002-04-30 | 2011-02-28 | Bayer Healthcare Llc | Faktor VII- eller VIIa-polypeptidvarianter |
US20040009918A1 (en) * | 2002-05-03 | 2004-01-15 | Hanne Nedergaard | Stabilised solid compositions of modified factor VII |
ATE536886T1 (de) * | 2002-05-03 | 2011-12-15 | Novo Nordisk As | Stabilisierte feste zusammensetzungen von modifizierter faktor vii |
KR101212025B1 (ko) * | 2002-06-21 | 2013-01-09 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 인자 ⅶ 폴리펩티드의 안정화된 고체 조성물 |
AU2003266931B2 (en) * | 2002-09-30 | 2010-01-21 | Bayer Healthcare Llc | FVII or FVIIa variants having increased clotting activity |
US7358268B2 (en) | 2002-12-04 | 2008-04-15 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Imidazole derivatives as factor Xa inhibitors |
US7429581B2 (en) | 2002-12-23 | 2008-09-30 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pyrazole-derivatives as factor Xa inhibitors |
US20040176704A1 (en) * | 2003-03-04 | 2004-09-09 | Stevens Timothy A | Collection device adapted to accept cartridge for point of care system |
CA2518327A1 (en) * | 2003-03-18 | 2004-09-30 | Novo Nordisk Health Care Ag | Liquid, aqueous, pharmaceutical compositions of factor vii polypeptides |
WO2004083361A2 (en) * | 2003-03-20 | 2004-09-30 | Maxygen Holdings Ltd. | FVII OR FVIIa VARIANTS |
US7897734B2 (en) * | 2003-03-26 | 2011-03-01 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Method for the production of proteins |
US20070026485A1 (en) | 2003-04-09 | 2007-02-01 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
US20040202726A1 (en) * | 2003-04-10 | 2004-10-14 | Deshay Samuel L. | Topical blood pressure composition |
EP1479677A1 (en) | 2003-05-19 | 2004-11-24 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | New indole derivatives as factor xa inhibitors |
EP1479675A1 (en) | 2003-05-19 | 2004-11-24 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Indazole-derivatives as factor Xa inhibitors |
US7317027B2 (en) | 2003-05-19 | 2008-01-08 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Azaindole-derivatives as factor Xa inhibitors |
US7223780B2 (en) | 2003-05-19 | 2007-05-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Triazole-derivatives as blood clotting enzyme factor Xa inhibitors |
US7741341B2 (en) | 2003-05-19 | 2010-06-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Benzimidazole-derivatives as factor Xa inhibitors |
EP1479680A1 (en) | 2003-05-19 | 2004-11-24 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Azaindole derivatives as Factor Xa inhibitors |
AU2004241698A1 (en) * | 2003-05-23 | 2004-12-02 | Novo Nordisk Health Care Ag | Protein stabilization in solution |
US7029675B1 (en) * | 2003-06-04 | 2006-04-18 | Shu-Wha Lin | Hepsin antagonist and methods of use |
AU2004247799B2 (en) * | 2003-06-19 | 2009-12-03 | Bayer Healthcare Llc | Factor VII or VIIa Gla domain variants |
ES2382157T3 (es) | 2003-06-25 | 2012-06-05 | Novo Nordisk Health Care Ag | Composición líquida de polipépttidos del factor VII |
ATE446768T1 (de) * | 2003-07-01 | 2009-11-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Flüssige wässrige pharmazeutische zusammnesetzung von factor vii polypeptiden |
US9005625B2 (en) | 2003-07-25 | 2015-04-14 | Novo Nordisk A/S | Antibody toxin conjugates |
EP1656158B1 (en) * | 2003-08-14 | 2016-03-09 | Novo Nordisk Health Care AG | Liquid, aqueous pharmaceutical composition of factor vii polypeptides |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
MXPA06006886A (es) * | 2003-12-19 | 2006-09-04 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Composiciones estabilizadas de polipeptidos del factor vii. |
EP1568698A1 (en) | 2004-02-27 | 2005-08-31 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Pyrrole-derivatives as factor Xa inhibitors |
CN102718859A (zh) * | 2004-09-29 | 2012-10-10 | 诺和诺德医疗保健公司 | 通过分级洗脱从阴离子交换材料中纯化批量凝血因子vii多肽 |
US20080176790A1 (en) | 2004-10-29 | 2008-07-24 | Defrees Shawn | Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf) |
EP1858543B1 (en) | 2005-01-10 | 2013-11-27 | BioGeneriX AG | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
US9187546B2 (en) | 2005-04-08 | 2015-11-17 | Novo Nordisk A/S | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
US8969532B2 (en) | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
DK2144923T3 (da) | 2007-04-03 | 2013-05-13 | Biogenerix Ag | Behandlingsfremgangsmåder under anvendelse af glycopegyleret g-csf |
ES2551123T3 (es) | 2007-06-12 | 2015-11-16 | Ratiopharm Gmbh | Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido |
CN101965200B (zh) | 2008-02-27 | 2013-06-19 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 缀合的因子ⅷ分子 |
BRPI0922344A2 (pt) | 2008-12-19 | 2017-10-24 | 3B Pharmaceuticals Gmbh | inibidores de tfpi e métodos de uso |
AU2010290077C1 (en) | 2009-08-24 | 2015-12-03 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same |
JP5730983B2 (ja) | 2010-03-19 | 2015-06-10 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドBaxter International Incorp0Rated | Tfpi阻害剤および使用方法 |
KR101294351B1 (ko) * | 2010-05-27 | 2013-08-07 | 동국대학교 산학협력단 | 뇌혈전 형광영상기술을 이용한 뇌졸중 동물모델의 뇌경색 영역의 크기 예측 방법 |
WO2013122617A1 (en) | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Amunix Operating Inc. | Factor viii compositions and methods of making and using same |
CA2864126A1 (en) | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Biogen Idec Ma Inc. | Recombinant factor viii proteins |
SI2827883T1 (sl) | 2012-03-21 | 2019-08-30 | Baxalta GmbH | Inhibitorji TFPI in postopki uporabe |
US10548953B2 (en) | 2013-08-14 | 2020-02-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof |
JP2018524391A (ja) * | 2015-07-22 | 2018-08-30 | アイコニック セラピューティクス, インコーポレイテッド | 血管形成および血管新生に付随する障害を処置するための方法 |
CN108472337B (zh) | 2015-08-03 | 2022-11-25 | 比奥贝拉蒂治疗公司 | 因子ix融合蛋白以及其制备和使用方法 |
WO2017121436A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-20 | Rigshospitalet | Quantitative pet imaging of tissue factor expression using 18f-labled active site inhibited factor vii |
MA46864A (fr) | 2016-11-17 | 2021-04-28 | Minerva Imaging Aps | Facteur vii inhibé par le site actif marqué par 177-lu |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4775624A (en) * | 1985-02-08 | 1988-10-04 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of human protein C |
GR860984B (en) * | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
DE3684546D1 (de) * | 1985-04-22 | 1992-04-30 | Genetics Inst | Herstellung mit hoher leistung des aktivfaktors ix. |
US4959318A (en) * | 1985-06-27 | 1990-09-25 | Zymogenetics, Inc. | Expression of protein C |
US4829052A (en) * | 1986-06-11 | 1989-05-09 | Monsanto Company | Serine protease inhibitors |
US5258288A (en) * | 1986-07-25 | 1993-11-02 | Genzyme Corporation | Vector containing DNA encoding mature human protein S |
JPS63290852A (ja) | 1987-02-10 | 1988-11-28 | グラクソ、グループ、リミテッド | 化合物 |
FR2619314B1 (fr) * | 1987-08-11 | 1990-06-15 | Transgene Sa | Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant |
US4994371A (en) * | 1987-08-28 | 1991-02-19 | Davie Earl W | DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences |
US5023236A (en) * | 1988-04-07 | 1991-06-11 | Corvas, Inc. | Factor VII/VIIA active site inhibitors |
US5258180A (en) * | 1988-09-02 | 1993-11-02 | Genetech, Inc. | Tissue plasminogen activator having fibrin specific properties and deletion of amino acids 466-970, compositions and methods of treatment |
WO1990003390A1 (en) * | 1988-09-23 | 1990-04-05 | Corvas, Inc. | Peptidyl inhibitors of the initiation of coagulation |
US5120537A (en) * | 1989-06-14 | 1992-06-09 | Oklahoma Medical Research Foundation | Factor xa based anticoagulant compositions |
US5190919A (en) * | 1989-11-13 | 1993-03-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antihemostatic factor vii peptides |
AU651573B2 (en) | 1990-01-29 | 1994-07-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Anticoagulant proteins |
US5278144A (en) * | 1990-09-04 | 1994-01-11 | Cor Therapeutics, Inc. | Antithrombosis agents |
CA2103546C (en) * | 1991-02-28 | 2002-10-01 | Kathleen L. Berkner | Modified factor vii |
US5861374A (en) | 1991-02-28 | 1999-01-19 | Novo Nordisk A/S | Modified Factor VII |
US5817788A (en) | 1991-02-28 | 1998-10-06 | Zymogenetics, Inc. | Modified factor VII |
WO1994027631A1 (en) * | 1993-05-21 | 1994-12-08 | Zymogenetics, Inc. | Modified factor vii |
US5788965A (en) | 1991-02-28 | 1998-08-04 | Novo Nordisk A/S | Modified factor VII |
US5326559A (en) * | 1991-05-16 | 1994-07-05 | Miller D Douglas | Treatment of accelerated atheosclerosis with interleukin-2 receptor targeted molecules |
US5419760A (en) * | 1993-01-08 | 1995-05-30 | Pdt Systems, Inc. | Medicament dispensing stent for prevention of restenosis of a blood vessel |
GB9301093D0 (en) * | 1993-01-20 | 1993-03-10 | Rca Thomson Licensing Corp | Digital video tape recorder for digital hdtv |
US5648331A (en) * | 1994-08-26 | 1997-07-15 | G.D. Searle & Co. | Method of inhibiting tissue ischemia and reperfusion injury |
-
1996
- 1996-06-07 US US08/660,289 patent/US5833982A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-06-06 UA UA98126442A patent/UA68333C2/uk unknown
- 1997-06-06 EP EP97925917A patent/EP0910580A1/en not_active Withdrawn
- 1997-06-06 KR KR1019980709998A patent/KR20000016415A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-06-06 CN CNA031066089A patent/CN1515318A/zh active Pending
- 1997-06-06 JP JP10501082A patent/JP2000513720A/ja not_active Ceased
- 1997-06-06 CZ CZ983946A patent/CZ394698A3/cs unknown
- 1997-06-06 BR BR9709661-0A patent/BR9709661A/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-06-06 PL PL97330365A patent/PL330365A1/xx unknown
- 1997-06-06 CN CN97195294A patent/CN1131872C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-06 AU AU30906/97A patent/AU735012B2/en not_active Ceased
- 1997-06-06 ZA ZA9705013A patent/ZA975013B/xx unknown
- 1997-06-06 CA CA002256761A patent/CA2256761A1/en not_active Abandoned
- 1997-06-06 HU HU0003077A patent/HUP0003077A3/hu unknown
- 1997-06-06 RU RU99100089/14A patent/RU2211704C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-06-06 IL IL12709997A patent/IL127099A0/xx unknown
- 1997-06-06 WO PCT/DK1997/000251 patent/WO1997047651A1/en not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-11-10 US US09/189,607 patent/US6168789B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-04 NO NO985668A patent/NO985668L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL127099A0 (en) | 1999-09-22 |
HUP0003077A2 (hu) | 2000-12-28 |
JP2000513720A (ja) | 2000-10-17 |
CN1221427A (zh) | 1999-06-30 |
AU3090697A (en) | 1998-01-07 |
HUP0003077A3 (en) | 2003-01-28 |
WO1997047651A1 (en) | 1997-12-18 |
CN1515318A (zh) | 2004-07-28 |
BR9709661A (pt) | 2000-04-25 |
UA68333C2 (en) | 2004-08-16 |
US5833982A (en) | 1998-11-10 |
AU735012B2 (en) | 2001-06-28 |
NO985668L (no) | 1999-02-04 |
CA2256761A1 (en) | 1997-12-18 |
CN1131872C (zh) | 2003-12-24 |
NO985668D0 (no) | 1998-12-04 |
US6168789B1 (en) | 2001-01-02 |
RU2211704C2 (ru) | 2003-09-10 |
KR20000016415A (ko) | 2000-03-25 |
PL330365A1 (en) | 1999-05-10 |
EP0910580A1 (en) | 1999-04-28 |
ZA975013B (en) | 1997-12-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU735012B2 (en) | Modified factor VII | |
US6183743B1 (en) | Modified factor VII | |
US5788965A (en) | Modified factor VII | |
US5817788A (en) | Modified factor VII | |
AU703110B2 (en) | Modified factor VII | |
US5861374A (en) | Modified Factor VII | |
JP5451101B2 (ja) | 第vii凝固因子誘導体 | |
MXPA97002951A (en) | Factor vii modific | |
JP2004508822A (ja) | ヒト凝固因子vii変異型 | |
US6039944A (en) | Modified Factor VII | |
US20040197370A1 (en) | Modified factor VII | |
AU766827B2 (en) | Modified factor VII | |
RU2214833C2 (ru) | Модифицированный фактор vii | |
MXPA98010211A (en) | Factor vii modific | |
AU5940799A (en) | Modified factor VII | |
AU2004200261A1 (en) | Modified Factor VII | |
UA48149C2 (uk) | Спосіб інгібування активності фактора тканини, спосіб пригнічення відкладення тромбоцитів, спосіб пригнічення судинного рестенозу, спосіб лікування гострої закупорки коронарної артерії за допомогою модифікованого фактора vii |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |