UA24182U - Method for isolation and purification of thrombin - Google Patents
Method for isolation and purification of thrombin Download PDFInfo
- Publication number
- UA24182U UA24182U UAU200700211U UAU200700211U UA24182U UA 24182 U UA24182 U UA 24182U UA U200700211 U UAU200700211 U UA U200700211U UA U200700211 U UAU200700211 U UA U200700211U UA 24182 U UA24182 U UA 24182U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- thrombin
- purification
- solution
- isolation
- sorbent
- Prior art date
Links
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 5
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 claims abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- UGCDBQWJXSAYIL-UHFFFAOYSA-N vat blue 6 Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C(C=C2Cl)=C1C1=C2NC2=C(C(=O)C=3C(=CC=CC=3)C3=O)C3=CC(Cl)=C2N1 UGCDBQWJXSAYIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 2
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 7
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940006612 barium citrate Drugs 0.000 description 2
- PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H barium(2+);2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Ba+2].[Ba+2].[Ba+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- YMVFJGSXZNNUDW-UHFFFAOYSA-N (4-chlorophenyl)methanamine Chemical compound NCC1=CC=C(Cl)C=C1 YMVFJGSXZNNUDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenecarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=C(N)C=C1 WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 1
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 1
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N gramicidin S Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1)C(C)C)=O)CC(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010055790 immunoglobulin B Proteins 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Опис винаходу
Корисна модель відноситься до галузі біотехнології - одержанні очищених білкових препаратів, - і може 2 бути використана в медико-біологічній промисловості, на станціях переливання крові, а також в науково-дослідницьких лабораторіях.
Препарат очищеного тромбіну використовується в медичній клінічній практиці як терапевтичний засіб (для місцевої зупинки кровотечі з дрібних капілярів та паренхіматозних органів, а також як основний компонент у виробництві так званого фібринового клею) та діагностичний препарат для коагулологічних досліджень. На 70 даний момент вітчизняна промисловість не випускає препаратів очищеного тромбіну людини.
Для виділення та очищення тромбіну в якості лігандів біоспецифічних сорбентів використовували інгібітори тромбіну п-хлорбензиламін |1| чи п-амінобензамідин (2), специфічні амінокислотні залишки Іі-лізин чи
Ї-аргінін, а також аліфатичні о, о-диаміни, що містили не менше 4 метиленових ланок |З). Ці ліганди іммобілізували на органічних матрицях - сефарозі |2, З) чи гідрофільному синтетичному полімері (11.
Відомі способи одержання очищеного тромбіну людини шляхом афінної хроматографії на кремнеземних сорбентах, що містять в якості ліганда І -лізин, І -аргінін, гексаметилендиамін, граміцидин С і бацитрацин (41, п-СІ-бензил |5, 61.
Серед відомих носіїв, що використовуються для хроматографічного виділення та очищення тромбіну, найбільш ефективними є макропористі кремнеземні матриці з регульованим розміром пор. Вони достатньо жорсткі, хімічно інертні, термостійкі а хроматографічні сорбенти на їх основі легко регенеруються, витримують високу швидкість пропускання розчинів з достатньої специфічною ємкістю по відношенню до тромбіну, не піддаються гідролізу мікроорганізмами.
Найближчим по сукупності ознак, подібних до сукупності суттєвих ознак даного винаходу є спосіб одержання тромбіну з використанням афінного сорбенту п-СІ-бензилсилохрому |6Ї, який полягає в пропусканні через 29 колонку з сорбентом активованого концентрату протромбінового комплексу. 8
Для здійснення цього способу осад фракції ІІІ! плазми крові за Коном суспендують в 0,02М тріс-буферному розчині, рН 8,0, що містив 0,15М Масі, 0,03М тринатрій-цитрату, 50г/л ПЕГ-115 і центрифугують протягом 10 хв при 25009 І7Ї. Осад відкидають. Далі повільно додають охолоджений до ї49С хлорид барію. При цьому утворюється нерозчинний цитрат барію на якому сорбуються фактори протромбінового комплексу. На с наступному етапі осад цитрату барію суспендують в дистильованій воді і відділяють баластні білки (ее) висолюванням сульфатом амонію. Супернатант діалізують проти 0,15М хлориду натрію. Активацію протромбіну в тромбін проводять з використанням тромбопластин-кальцієвої суміші. --
Афінну хроматографію тромбіну проводять на колонці з п-СІ-бензилхлорид-силохромом, врівноважену 0,05М Й тріс-НСІ-буфером, рН 8,0. Після пропускання екстракту тромбіну колонку послідовно промивають вихідним буфером, 25 96-ним розчином пропанолу-2, 0,25М розчином 56-АКК і десорбують тромбін 2595-ним розчином с пропанолу-2 з ТМ Масі в 0,05М тріс-НСІ-буфері, рН 8,0.
Недоліками даного способу є наступні: 1. Для досягнення високої очистки тромбіну необхідна рехроматографія одержаного елюату. « 20 2. Двоетапність афінної хроматографії зменшує кінцевий вихід продукту внаслідок втрат на кожному з етапів. -в
Задачею даної корисної моделі є підвищення ступеню очищення тромбіну, збільшення його кінцевого виходу, с спрощення технології внаслідок одностадійності хроматографічного процесу. :з» Поставлена задача досягається запропонованим способом одержання тромбіну, яка включає пропускання активованого тромбопластин-кальцієвою сумішшю концентрату тромбіну через колонку з силохромом-Активним 415 яскраво-голубим К, десорбцію баластних біліків 25 9о-ним розчином пропанолу-2, 0,25М розчином 8-АКК та г елюцію тромбіну 2596-ним розчином пропанолу-2 в присутності 1 М розчину натрію хлориду, діаліз одержаного розчину та ліофілізацію. ве Відмінність запропонованого способу полягає у застосуванні в якості ліганда для афінної хроматографії - тромбіну на кремнеземній матриці тріазинового барвника - Активного яскраво-голубого К (С.І. 61211).
Застосування нового хроматографічного носія дозволяє підвищити ступінь очищення тромбіну на 3395 со (близько 2000 од. МІН/мг білка), спростити технологію одержання препарату за рахунок одностадійності
ГК хроматографічного процесу, зменшити тривалість процедури, збільшити кінцевий вихід препарату на 4095.
Пропонований хроматографічний сорбент має суттєво вищу сорбційну ємність по відношенню до тромбіну у порівнянні з найближчим аналогом (ємність по тромбіну 10500бод-МІН/г сорбенту проти 2000од. од.МН/г сорбенту у У и найближчого аналога).
В представлених прикладах кількість білка наведена в мг, активність тромбіну виражена в міжнародних с одиницях МІН (Маїйопаї Іпзійше ої Неаї() по часу утворення фібринового згустка в стандартизованих умовах з використанням розчину фібриногену.
Активність тромбіну визначали по часу зсідання мл 0,195-ного розчину фібриногену в 0,15М Масі з 0,01М во тріс-НСІ буфером, рН 7,3, при додаванні 0,01-0,05мл розчину тромбіну при температурі 372. Калібрувальну криву будували аналогічно, використовуючи в якості стандарту тромбін ВРХ фірми "СаІріоспет" (США), а також 1-й Міжнародний стандарт тромбіну (код 70/157) (81.
Приклад 1. 2кг фракції ІІ за Коном суспендували протягом 1,5-2 год в вл розчину такого складу: 0,02М тріс-НСІ-буфер, рН 8,0, 0,15М Масі, 0,02М тринатрій-цитрат і Ббо-ний ПЕГ-115. В присутності ПЕГ-115 65 осаджуються ліпопротеїни, фібриноген і денатуровані білки, від яких позбавлялись центрифугуванням протягом
ЗОхв при 25009.
До одержаного супернатанту додавали 1/10 об'єму охолодженого до ї492С 1М розчину хлориду барію.
Перемішували протягом 1 год., центрифугували 20 хв. при 2000 д. Надосадкову рідину заморожували при -302С і використовували в подальшому для виділення плазміногену і імуноглобуліну б. Осад промивали 2л дистильованої води, повторно центрифугували при аналогічних умовах, суспендували в 500мл дистильованої води, по краплях додавали 75мл 3,3 М забуференого до рН 8,0 розчину сульфату амонію. Нерозчинний матеріал видаляли центрифугуванням при 4000-50009 протягом 25хв, а надосадкову рідину (приблизно 600-700мл) діалізували протягом 10-15 год проти вл 0,15М розчину Масі. За цей час розчин 0,15М Масі змінювали двічі.
Одержаний концентрат факторів протромбінового комплексу використовували для подальшої очистки з 70 метою одержання препарату тромбіну.
Для активації протромбіну в тромбін 10г ліофільно висушеного тромбопластину гомогенізували з 100мл 0,2 5М розчину хлориду кальцію в 0,2М тріс-НСІ-буфері, рН 7,4 і до одного об'єму гомогенату додавали 7 об'ємів віддіалізованого протромбінового комплексу. Суміш інкубували протягом 60-120хв при температурі 37 С, доки активність тромбіну не виходила на плато (приблизно 700-1000 од. МІН/мл розчину). Через кожні 10хв відбирали 75 проби для визначення згортуючої активності тромбіну.
Одержаний екстракт тромбіну центрифугували ЗОхв при 40009 при ж 42С і супернатант пропускали через колонку з сорбентом активним-яскраво-голубим К розміром 2,5х32см, врівноважену 0,05М тріс-НСІ-буфером, рН 8,0. Далі колонку із зв'язаним на сорбенті тромбіном послідовно промивали вихідним буфером, 2595-ним розчином пропанолу-2, 0,25М розчином 5-АКК і десорбували тромбін 2595-ним розчином пропанолу-2 з 1М Масі в 0,05М тріс-НСІ-буфері, рН 8,0. Швидкість елюції становила 0,2-04мл/(хв х см). Тромбінвмісні фракції об'єднували, діалізували проти 0,15ММасі при яї49С протягом ночі і після заморозки при - 25 С ліофільне висушували.
Вихід тромбіну з 2 кг фракції І-Ш за Коном - 1000000-1500000 од. МІН, питома активність - 2000 од.
МІН/мг білка.
В таблиці представлені характеристики препарату тромбіну, одержаного пропонованим способом і пт) способом-найближчим аналогом. властивості Сорбційна властивість сорбенту, (Активність тромбіну в|Питома активність тромбіну, Вихід тромбіну (по с од. МІН/г сорбенту елюаті, од.МІН/мл од. МІН/мг білка активності), 90 со - спосіб « " й аналог
З наведених даних видно, що ступінь очищення тромбіну, який характеризується підвищенням його питомої фібриноутворюючої здатності, вищий в 1,3 рази в пропонованому способі. «
Вихід сумарної згортуючої активності (ефективність способу) у порівнянні з аналогічним показником для шщ с найближчого аналога для пропонованого способу у 1,14 рази вищий. . Питома ємність пропонованого сорбенту в 5,25 рази вища у порівнянні з найближчим аналогом, що дозволяє «» за один технологічний цикл використати значно більшу кількість вихідної сировини для одержання препарату тромбіну.
Скорочення часу виділення тромбіну за рахунок одностадійного хроматографічного процесу здешевлюють ка пропонований спосіб, елюція тромбіну більш концентрованим піком спрощує наступні роботи технологічного процесу (діаліз, ліофілізацію), внаслідок чого покращуються аналітичні показники кінцевого продукту - ть діагностичного чи лікувального препарату. - Джерела інформації: 1. Грачева Н.А., Ужинова Л.Д., Курд А.Л. и др./УБисорган. химия.-1981.- Т. 7.- Мо 10.- С. 1560-1565.
Со 2. Зсптег б. Те ргиїісавбйоп Ге) роміпе Іготрбіп ру апйіпцу спготайдгарну оп з репгатідіпе-адагозе.//Норре-ЗеуЇегз 2. Рпувіої. Спет.-1972.-М.353.-Р. 810-814.
З. Найоп М.МУ., Кедоесгі Е. Те айіпйу ої питап, гаррії апа Броміпе (пготбріпз їТог зерпагозе-іІузіпе апа оїпег сопічддайез /Віоспет. Віорпуз. Асіа.-1976.-М.427.-Р. 575-585. 4. АПіпйу спготайдгарпу ої Ппитап (готбріп оп птодйей зййса /СбСаіїда АМ., Мопавіугекії М.А.,
Мадегоу»гкії Ми. еї а. /). Спготаїйоаг. - 1987. - М. 424, Мо. 2.-Р. 385-391. с 5. Хроматография тромбина на модифицированньїх кремнеземах: роль матриць, спейсера и величинь рнН./
Гайда А.В., Монастьірский В.А., Магеровский Ю.В. и др.//Биотехнология.- 1989.- Т. 5.- Мо 4.- С. 449-454. б. Магеровский Ю. В. Очистка тромбина и тромбопластина методом аффинной и гельпроникающей бор хроматографии на модифицированньїх кремнеземньїх сорбентах: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Львов, 1989. -21с. 7. 65. Монастьірский В.А., Магеровский Ю.В., Гайда А.В. Применение полизтиленгликоля для вьіделения протромбинового комплекса // Гематол. и трансфузиол.-1986.- Мо2.-С.51-53. 8. Нитап Віоод Соадишіайоп, Наетовіазів апа Тиготровзів./ЕЯа. ру Кк. Відов//ВіасКуеї! Зсіепійіс 65 Рибіїсакопв, РпйПадеї!рпіа.-1976.- 722 Р.
Claims (1)
- Формула винаходу Спосіб виділення та очищення тромбіну з активованого концентрату протромбінового комплексу, який 2 включає використання методу афінної хроматографії на макропористому кремнеземному носії, який відрізняється тим, що для підвищення ступеня очищення препарату, ефективності способу, а також для покращення аналітичних характеристик кінцевого продукту як ліганд використовують тріазиновий барвник Активний яскраво-голубий К. 70 Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2007, М 9, 25.06.2007. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. з о с (ее) «- « с -сІ.Й и? іме) щ» - Ге» ШИН Ко) с 60 б5
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU200700211U UA24182U (en) | 2007-01-09 | 2007-01-09 | Method for isolation and purification of thrombin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU200700211U UA24182U (en) | 2007-01-09 | 2007-01-09 | Method for isolation and purification of thrombin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA24182U true UA24182U (en) | 2007-06-25 |
Family
ID=38439790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU200700211U UA24182U (en) | 2007-01-09 | 2007-01-09 | Method for isolation and purification of thrombin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA24182U (uk) |
-
2007
- 2007-01-09 UA UAU200700211U patent/UA24182U/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI106721B (fi) | Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin valmistamiseksi | |
| US5112949A (en) | Method of and apparatus for separating proteins | |
| CA2024667C (en) | Process for preparing a concentrate of blood coagulation factor viii-von willebrand factor complex from total plasma | |
| FI95136C (fi) | Menetelmä anneksiinien puhdistamiseksi | |
| CN104109202A (zh) | 一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法 | |
| US4137127A (en) | Process for the preparation of thrombin-like enzymes from snake venoms | |
| CN106928344A (zh) | 用于从含有凝血因子的溶液中减少和/或除去FXI和FXIa的方法 | |
| JPH0386900A (ja) | 新規なトロンビン結合性物質及びその製法 | |
| EP0391974B1 (en) | Process for the purification of vitamin k-dependent blood clotting factors | |
| HU219828B (hu) | Eljárás K-vitamin-függő proteinek izolálására és tisztítására | |
| CA1252744A (en) | Ultrapurification of factor ix and other vitamin k- dependent proteins | |
| KR102317930B1 (ko) | 트롬빈의 제조 방법 | |
| KR20220111307A (ko) | 프로-트롬빈 정제 | |
| UA24182U (en) | Method for isolation and purification of thrombin | |
| CA1288711C (en) | Therapeutic blood product means and methods of preparing same | |
| US4945054A (en) | Process for the separation and purification of proteases and antiproteases of blood clotting, as well as of the protease/antiprotease complex | |
| Mannhalter | Purification of plasma protein | |
| WO2012036140A1 (ja) | クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを精製または除去するアフィニティ担体、及びそれを用いた精製方法、除去方法 | |
| JPS6251589B2 (uk) | ||
| AU627446C (en) | Chemical process | |
| Mannhalter | 4. Therapy with Plasminogen Concentrates: Preliminary Results and Future Strategies | |
| SU1114699A1 (ru) | Способ выделени лейцинаминопептидазы | |
| RU1517545C (ru) | Способ получени иммуносорбента | |
| KR20240132350A (ko) | 전체 혈장에서 표적 성분을 정제하거나 제거하는 방법 | |
| Wu | Protein C separation from homologous human blood proteins, Cohn fraction IV-1, using immobilized metal affinity chromatography |