SU1114699A1 - Способ выделени лейцинаминопептидазы - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ из биологических жидкостей , предусматривающий нанесение пробы жидкости на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, с последующим элюированием целевого продукта , отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа, в качестве исходного сырь  используют биологические жидкости больных с демиелинизирующими заболевани ми, в качестве сорбента используют сефадекс G-75, промывают колонку физиологическим раствором и вьщерживают сорбированный на сефадексе фермент 3-4 сут, а целевой продукт элюируют физиологическим раствором.

Description

4 С9д QO СО Изобретение относитс  к биохимии и предназначено дл  получени  широк используемого в биологии и медицине фермента лейцинаминопептидазы. Известен способ получени  лейцин аминопептидазы путем микробиологического синтеза с последующей много стадийной очисткой Lll. Однако данньй способ достаточно сложен, требует длительного времени и дорогосто щих реактивов. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату  вл етс  способ выделени лейцинаминопептидазы из крови убойных животных, заключающийс  в нанесении исходной биологической жидкос ти на хроматографическую колонку, 3 аполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой , с последующим элюированием целевого продукта буферным раствором диализом элюата,, после чего диализат подвергают повторной хроматогра фии на колонках с гидроксилапатитом и ДЭА,Э.-сефадексом. Степень очистки целевого продукта 5042 раза от исходного С 21, Недостатками известного способа  вл ютс  его сложность и многостадийность . Цель изобретени  - упрощение спо соба. Указанна  цель достигаетс  тем, что согласно способу выделени  лейцинаминопептидазы ;из биологических жидкостей, предусматривающему нанес ние пробы жидкости на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом , с последующим элюированием целевого продукта, в качестве исходно сырь  используют биологические жидкости больных с демиелинизирующими заболевани ми, в качестве сорбента используют сефадекс , промываю колонку физиологическим раствором и выдерживают сорбированный на сефа дексе фермент 3-4 сут, а целевой пр дукт элюируют физиологическим раств ром. Способ заключаетс  в проведении всего одной хроматографической стад и обусловливает достаточно высокую степень очистки, в среднем 5161 раз Упрощение способа при сохранении на большего эффекта очистки получают п использовании сефадекса Q-75. При применении частиц декстрана другимиразмерами пор (U-10, Gt-25, 6-50) степень очистки ниже. Жесткие услови  опыта не позвол ют использовать крупнопористые сефадексы. Оптимальное врем  инкубации сефадекса с адсорбированным ферментом установлено опытным путем и составл ет 3-4 сут. При инкубации сорбированного фермента менее трех суток активность его не определ етс  или значительно снижена, а более четырех суток - активность фермента также низка по отношению к оптимальной, котора  достигаетс  при инкубации в течение 3-4 сут. Упрощенное получение фермента объ сн етс  следующими причинами. В биологических жидкост х у больных с демиелинизирующими заболевани ми основна  масса фермента лейцинаминопептидазы св зана с ингибитором. Ингибитор имеет повышенное сродство к соединени м типа дектрана и мол. вес в пределах 20000-50000, поэтому он адсорбируетс  на колонке с размером частиц, соответствуюш;им сефадексу Q-75, тогда как св занный фермент имеет мол. вес 150000 и в поры сефадекса Q -75 не проникает. Инкубаци  в течение указанного времени приводит к отделению фермента от ингибитора, после чего фермент элюируют физиологическим раствором. Ингибитор остаетс  на колонке и может быть использован дл  реохроматографии. Предлагаемый способ осуществл ют следующим образом. Биологическую жидкость (сыворотка, кровь, ликвор, моча) нанос т на хроматографическую колонку с приспособлени ми дл  центрифугировани , заполненную предварительно отцентрифугированным сефадексом , центрифугируют в течение 2 мин со скоростью 3000 об/мин, промывают физиологическим раствором дл  удалени  балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин. Колонку инкубируют в течение 3-4 сут при , а конечньш продукт элюируют физиологическим раствором. Пример 1. Сыворотку крови больного с рассе нным склерозом наслаивают на хроматографическую колонку (с приспособлени ми дл  центрифугировани ), заполненную предварительно отцентрифугипои нным сефадексом Gf-75, центрифугируют 3 мин со скоростью 3000 об/мин, промывают 3 20 мл физиологического раствора дл  удалени  балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин. Колонку, содержащую сор бированный фермент, инкубируют в течение 72 ч при 4,0°С, конечный продукт элюируют 5 мл физиологического раствора. Удельна  активность ЛАП до инкубации 0,048 ед/г белка, после инкуба ции - 250 ед/г белка. Степень очистки 5208 раз. Пример 2. Метод осуществл ют аналогично примеру 1, при этом ин кубацию провод т 96 ч. Удельна  активность фермента до инкубации 0,011 едУг белка, после инкубации вЬ ед/г белка. Степень очистки 5454 раза. Пример 3. У больного с рассе нным склерозом берут ликвор, провод т исследовани  аналогичные приме ру 1, инкубацию провод т 84 ч. При этом удельна  активность ЛАП до инку бации 0,7 ед./г белка, после инкубации 3910 ед/г белка. Степень очистки 5585 раз. Пример 4. Исследовали мочу больного рассе нным склерозом. Приемы исследовани  аналогичны примеру инкубировали 74 ч. Исходна  активность ЛАП нулева , после инкубации 125 ед/г белка. Специфическа  активность целевого продукта подвергаетс  исследованию его активности с помощью ЛАП-тес та фирмы Fermognost. Метод определени  ЛАП основан на том, что лейцингидразид под вли нием ЛАП расщепл етс , отщепленный гидразин образует с 4-диметиламинобензаль 9 дегидом в сол нокислой среде оранжево-красное крас щее вещество, которое определ ют колориметрически. Испытани  провод т в четырех пробирках. Вначале в пробирки 1 и 2 наливают по 0,5 мл лейцингидразида, выдерживают на вод ной бане при 37С в течение 10 мин, в опытную пробирку добавл ют 0,2 МП испытуемой жидкости. Далее все пробирки инкубируют на вод ной бане при 37®С 30 мин, после инкубации, в контрольную пробу (пробирка 3) внос т 0,7 мл гидразина, а в пробирку (4 внос т 0,7 мл дистиллированной воды . Затем во все пробирки 1-4 добавл ют по 5 мл димётилбензальдегида и быстро перемешивают содержимое пробирок . Далее в пробирку 2 добавл ют 0,2 мл испытуемой жидкости и 30 мин инкубируют при 37°С. Не более, чем через 6 ч, измен ют экстинкцию опытной пробы (пробирка 1) против пустой пробы (пробирка 2) и экстинкцию контрольной пробы (пробирка 3) против второй пустой пробы (пробиркг 4), длина волны 455 мм (можно 13 области 450-460 им), Ш11рина сло  1 ,00 см. При расчете первое полученное значение экстинкции дел т не второе, активность фермента выражают в единицах (1 ед. - количество ЛАП, которое расщепл ет 1 мМоль |: -лейцинг}одразиде в течение 1 мин в услови х одной пробы). Одновременно в исследуемых образцах провод т количественное определение белка методом Лоури и удельную активность фермента выр жают на 1 г белка. Выделение лейцинаминопептидазы из различных биологическтс жидкостей приведено в таблице. ,

Доноры

0,05 1 2 0,08

О

О О

О

Продолжение табли1ды

7111469.98

Данные таблицы показывают, чтовз тый у больных с демиелинизирукицимй

предлагаемый способ эффективен призаболевани ми, который в насто щее

использовании биологических жидкостейврем   вл етс  отходом после к инико

только от больных демиелинизирующимидиагностических исследований, заболевани ми. 5 Преимуществом способа  вл етс 

предлагаемый способ значительнобиологических жидкостей после сорбции

упрощен при сохранении высокой сте-лейцинаминопептидазы как исходного

пени очистки, позвол ет практическисырь  дл  получени  биологическихtipeиспользовать биологический материал. паратов.

возможность дальнейшего использовани 

Claims (1)

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛЕЙЦИНАМИН0ПЕПТЦЦАЗЫ из биологических жидкос- тей, предусматривающий нанесение пробы жидкости на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, с последующим элюированием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве исходного сырья используют биологические жидкости больных с демиелинизирующими заболеваниями, в качестве сорбента используют сефадекс β-75, промывают колонку физиологическим раствором и ввдерживают сорбированный на сефадексе фермент 3-4 сут, а целевой продукт элюируют физиологическим раствором.

   Од ¢0 с© >

   1 111