UA24182U - Method for isolation and purification of thrombin - Google Patents
Method for isolation and purification of thrombin Download PDFInfo
- Publication number
- UA24182U UA24182U UAU200700211U UAU200700211U UA24182U UA 24182 U UA24182 U UA 24182U UA U200700211 U UAU200700211 U UA U200700211U UA U200700211 U UAU200700211 U UA U200700211U UA 24182 U UA24182 U UA 24182U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- thrombin
- purification
- solution
- isolation
- sorbent
- Prior art date
Links
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 5
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 claims abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- UGCDBQWJXSAYIL-UHFFFAOYSA-N vat blue 6 Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C(C=C2Cl)=C1C1=C2NC2=C(C(=O)C=3C(=CC=CC=3)C3=O)C3=CC(Cl)=C2N1 UGCDBQWJXSAYIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 2
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 7
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940006612 barium citrate Drugs 0.000 description 2
- PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H barium(2+);2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Ba+2].[Ba+2].[Ba+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- YMVFJGSXZNNUDW-UHFFFAOYSA-N (4-chlorophenyl)methanamine Chemical compound NCC1=CC=C(Cl)C=C1 YMVFJGSXZNNUDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenecarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=C(N)C=C1 WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 1
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 1
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N gramicidin S Chemical compound C([C@@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1)C(C)C)=O)CC(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 IUAYMJGZBVDSGL-XNNAEKOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010055790 immunoglobulin B Proteins 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Корисна модель відноситься до галузі біотехнології - одержанні очищених білкових препаратів, - і може 2 бути використана в медико-біологічній промисловості, на станціях переливання крові, а також в науково-дослідницьких лабораторіях.The useful model belongs to the field of biotechnology - the production of purified protein preparations - and can be used in the medical and biological industry, at blood transfusion stations, as well as in research laboratories.
Препарат очищеного тромбіну використовується в медичній клінічній практиці як терапевтичний засіб (для місцевої зупинки кровотечі з дрібних капілярів та паренхіматозних органів, а також як основний компонент у виробництві так званого фібринового клею) та діагностичний препарат для коагулологічних досліджень. На 70 даний момент вітчизняна промисловість не випускає препаратів очищеного тромбіну людини.The purified thrombin preparation is used in medical clinical practice as a therapeutic agent (for local stopping of bleeding from small capillaries and parenchymal organs, as well as as the main component in the production of the so-called fibrin glue) and a diagnostic preparation for coagulation studies. Currently, the domestic industry does not produce preparations of purified human thrombin.
Для виділення та очищення тромбіну в якості лігандів біоспецифічних сорбентів використовували інгібітори тромбіну п-хлорбензиламін |1| чи п-амінобензамідин (2), специфічні амінокислотні залишки Іі-лізин чиTo isolate and purify thrombin, thrombin inhibitors p-chlorobenzylamine were used as ligands of biospecific sorbents |1| or p-aminobenzamidine (2), specific amino acid residues of II-lysine or
Ї-аргінін, а також аліфатичні о, о-диаміни, що містили не менше 4 метиленових ланок |З). Ці ліганди іммобілізували на органічних матрицях - сефарозі |2, З) чи гідрофільному синтетичному полімері (11.Y-arginine, as well as aliphatic o, o-diamines containing at least 4 methylene units |Z). These ligands were immobilized on organic matrices - sepharose (2, C) or hydrophilic synthetic polymer (11.
Відомі способи одержання очищеного тромбіну людини шляхом афінної хроматографії на кремнеземних сорбентах, що містять в якості ліганда І -лізин, І -аргінін, гексаметилендиамін, граміцидин С і бацитрацин (41, п-СІ-бензил |5, 61.There are known methods of obtaining purified human thrombin by affinity chromatography on silica sorbents containing I -lysine, I -arginine, hexamethylenediamine, gramicidin C and bacitracin as ligands (41, p-CI-benzyl |5, 61.
Серед відомих носіїв, що використовуються для хроматографічного виділення та очищення тромбіну, найбільш ефективними є макропористі кремнеземні матриці з регульованим розміром пор. Вони достатньо жорсткі, хімічно інертні, термостійкі а хроматографічні сорбенти на їх основі легко регенеруються, витримують високу швидкість пропускання розчинів з достатньої специфічною ємкістю по відношенню до тромбіну, не піддаються гідролізу мікроорганізмами.Among known carriers used for chromatographic separation and purification of thrombin, the most effective are macroporous silica matrices with adjustable pore size. They are hard enough, chemically inert, heat-resistant, and chromatographic sorbents based on them are easily regenerated, withstand a high rate of passage of solutions with a sufficient specific capacity in relation to thrombin, and are not subject to hydrolysis by microorganisms.
Найближчим по сукупності ознак, подібних до сукупності суттєвих ознак даного винаходу є спосіб одержання тромбіну з використанням афінного сорбенту п-СІ-бензилсилохрому |6Ї, який полягає в пропусканні через 29 колонку з сорбентом активованого концентрату протромбінового комплексу. 8The method of obtaining thrombin using the affinity sorbent p-CI-benzylsilochrome |6Y, which consists in passing an activated concentrate of the prothrombin complex through a 29 column with a sorbent, is the closest in terms of the set of features to the set of essential features of this invention. 8
Для здійснення цього способу осад фракції ІІІ! плазми крові за Коном суспендують в 0,02М тріс-буферному розчині, рН 8,0, що містив 0,15М Масі, 0,03М тринатрій-цитрату, 50г/л ПЕГ-115 і центрифугують протягом 10 хв при 25009 І7Ї. Осад відкидають. Далі повільно додають охолоджений до ї49С хлорид барію. При цьому утворюється нерозчинний цитрат барію на якому сорбуються фактори протромбінового комплексу. На с наступному етапі осад цитрату барію суспендують в дистильованій воді і відділяють баластні білки (ее) висолюванням сульфатом амонію. Супернатант діалізують проти 0,15М хлориду натрію. Активацію протромбіну в тромбін проводять з використанням тромбопластин-кальцієвої суміші. --To implement this method, sediment fraction III! blood plasma according to Kohn is suspended in a 0.02M Tris-buffered solution, pH 8.0, containing 0.15M Mass, 0.03M trisodium citrate, 50g/l PEG-115 and centrifuged for 10 minutes at 25009 I7Y. The sediment is discarded. Then slowly add barium chloride cooled to 149C. At the same time, insoluble barium citrate is formed, on which the factors of the prothrombin complex are sorbed. At the next stage, the barium citrate precipitate is suspended in distilled water and ballast proteins (ee) are separated by salting out with ammonium sulfate. The supernatant is dialyzed against 0.15M sodium chloride. Activation of prothrombin into thrombin is carried out using a thromboplastin-calcium mixture. --
Афінну хроматографію тромбіну проводять на колонці з п-СІ-бензилхлорид-силохромом, врівноважену 0,05М Й тріс-НСІ-буфером, рН 8,0. Після пропускання екстракту тромбіну колонку послідовно промивають вихідним буфером, 25 96-ним розчином пропанолу-2, 0,25М розчином 56-АКК і десорбують тромбін 2595-ним розчином с пропанолу-2 з ТМ Масі в 0,05М тріс-НСІ-буфері, рН 8,0.Affinity chromatography of thrombin is carried out on a column with p-CI-benzyl chloride-silochrome, equilibrated with 0.05M Tris-HCl buffer, pH 8.0. After the passage of the thrombin extract, the column is successively washed with the initial buffer, a 25-96% solution of propanol-2, a 0.25M solution of 56-AKK, and the thrombin is desorbed with a 2595% solution of propanol-2 from TM Masi in a 0.05M Tris-HCI buffer. pH 8.0.
Недоліками даного способу є наступні: 1. Для досягнення високої очистки тромбіну необхідна рехроматографія одержаного елюату. « 20 2. Двоетапність афінної хроматографії зменшує кінцевий вихід продукту внаслідок втрат на кожному з етапів. -вThe disadvantages of this method are as follows: 1. Rechromatography of the obtained eluate is necessary to achieve high purification of thrombin. « 20 2. Two-stage affinity chromatography reduces the final yield of the product due to losses at each of the stages. -in
Задачею даної корисної моделі є підвищення ступеню очищення тромбіну, збільшення його кінцевого виходу, с спрощення технології внаслідок одностадійності хроматографічного процесу. :з» Поставлена задача досягається запропонованим способом одержання тромбіну, яка включає пропускання активованого тромбопластин-кальцієвою сумішшю концентрату тромбіну через колонку з силохромом-Активним 415 яскраво-голубим К, десорбцію баластних біліків 25 9о-ним розчином пропанолу-2, 0,25М розчином 8-АКК та г елюцію тромбіну 2596-ним розчином пропанолу-2 в присутності 1 М розчину натрію хлориду, діаліз одержаного розчину та ліофілізацію. ве Відмінність запропонованого способу полягає у застосуванні в якості ліганда для афінної хроматографії - тромбіну на кремнеземній матриці тріазинового барвника - Активного яскраво-голубого К (С.І. 61211).The purpose of this useful model is to increase the degree of purification of thrombin, increase its final yield, and simplify the technology due to the one-stage chromatographic process. The task is achieved by the proposed method of obtaining thrombin, which includes passing thrombin concentrate activated with a thromboplastin-calcium mixture through a column with silochrome-Active 415 bright blue K, desorption of ballast proteins with 25 9% propanol-2 solution, 0.25M solution 8 -AKK and g elution of thrombin with a 2596 solution of propanol-2 in the presence of 1 M sodium chloride solution, dialysis of the obtained solution and lyophilization. The difference of the proposed method consists in the use as a ligand for affinity chromatography - thrombin on a silica matrix of a triazine dye - Active bright blue K (SI 61211).
Застосування нового хроматографічного носія дозволяє підвищити ступінь очищення тромбіну на 3395 со (близько 2000 од. МІН/мг білка), спростити технологію одержання препарату за рахунок одностадійностіThe use of a new chromatographic medium makes it possible to increase the degree of purification of thrombin by 3395 so (about 2000 units of MIN/mg of protein), to simplify the technology of obtaining the drug due to the one-step process
ГК хроматографічного процесу, зменшити тривалість процедури, збільшити кінцевий вихід препарату на 4095.GC of the chromatographic process, reduce the duration of the procedure, increase the final yield of the drug by 4095.
Пропонований хроматографічний сорбент має суттєво вищу сорбційну ємність по відношенню до тромбіну у порівнянні з найближчим аналогом (ємність по тромбіну 10500бод-МІН/г сорбенту проти 2000од. од.МН/г сорбенту у У и найближчого аналога).The proposed chromatographic sorbent has a significantly higher sorption capacity in relation to thrombin compared to the nearest analog (thrombin capacity of 10,500 bod-MIN/g of sorbent versus 2,000 units of MH/g of sorbent in U and the closest analog).
В представлених прикладах кількість білка наведена в мг, активність тромбіну виражена в міжнародних с одиницях МІН (Маїйопаї Іпзійше ої Неаї() по часу утворення фібринового згустка в стандартизованих умовах з використанням розчину фібриногену.In the presented examples, the amount of protein is given in mg, the activity of thrombin is expressed in international units of MIN (Maiopai Ipziishe oi Neai) according to the time of formation of a fibrin clot under standardized conditions using a solution of fibrinogen.
Активність тромбіну визначали по часу зсідання мл 0,195-ного розчину фібриногену в 0,15М Масі з 0,01М во тріс-НСІ буфером, рН 7,3, при додаванні 0,01-0,05мл розчину тромбіну при температурі 372. Калібрувальну криву будували аналогічно, використовуючи в якості стандарту тромбін ВРХ фірми "СаІріоспет" (США), а також 1-й Міжнародний стандарт тромбіну (код 70/157) (81.Thrombin activity was determined by the settling time of ml of 0.195 ml of fibrinogen solution in 0.15 M mass with 0.01 M in Tris-HCI buffer, pH 7.3, when adding 0.01-0.05 ml of thrombin solution at a temperature of 372. The calibration curve was constructed similarly, using as a standard bovine thrombin of the company "SaIriospet" (USA), as well as the 1st International standard of thrombin (code 70/157) (81.
Приклад 1. 2кг фракції ІІ за Коном суспендували протягом 1,5-2 год в вл розчину такого складу: 0,02М тріс-НСІ-буфер, рН 8,0, 0,15М Масі, 0,02М тринатрій-цитрат і Ббо-ний ПЕГ-115. В присутності ПЕГ-115 65 осаджуються ліпопротеїни, фібриноген і денатуровані білки, від яких позбавлялись центрифугуванням протягомExample 1. 2 kg of fraction II according to Kohn were suspended for 1.5-2 hours in a solution of the following composition: 0.02 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 0.15 M Mass, 0.02 M trisodium citrate and Bbo- ny PEG-115. In the presence of PEG-115 65, lipoproteins, fibrinogen, and denatured proteins precipitate, which were removed by centrifugation during
ЗОхв при 25009.ЗОхв at 25009.
До одержаного супернатанту додавали 1/10 об'єму охолодженого до ї492С 1М розчину хлориду барію.1/10 of the volume of a 1M barium chloride solution cooled to 492С was added to the obtained supernatant.
Перемішували протягом 1 год., центрифугували 20 хв. при 2000 д. Надосадкову рідину заморожували при -302С і використовували в подальшому для виділення плазміногену і імуноглобуліну б. Осад промивали 2л дистильованої води, повторно центрифугували при аналогічних умовах, суспендували в 500мл дистильованої води, по краплях додавали 75мл 3,3 М забуференого до рН 8,0 розчину сульфату амонію. Нерозчинний матеріал видаляли центрифугуванням при 4000-50009 протягом 25хв, а надосадкову рідину (приблизно 600-700мл) діалізували протягом 10-15 год проти вл 0,15М розчину Масі. За цей час розчин 0,15М Масі змінювали двічі.Stirred for 1 hour, centrifuged for 20 minutes. at 2000 d. The supernatant liquid was frozen at -302C and used later for the isolation of plasminogen and immunoglobulin b. The sediment was washed with 2 liters of distilled water, centrifuged again under similar conditions, suspended in 500 ml of distilled water, and 75 ml of 3.3 M ammonium sulfate solution buffered to pH 8.0 was added dropwise. The insoluble material was removed by centrifugation at 4000-5000g for 25 min, and the supernatant (approximately 600-700 ml) was dialyzed for 10-15 h against 0.15 M mass solution. During this time, the 0.15 M Mass solution was changed twice.
Одержаний концентрат факторів протромбінового комплексу використовували для подальшої очистки з 70 метою одержання препарату тромбіну.The resulting concentrate of factors of the prothrombin complex was used for further purification in order to obtain the preparation of thrombin.
Для активації протромбіну в тромбін 10г ліофільно висушеного тромбопластину гомогенізували з 100мл 0,2 5М розчину хлориду кальцію в 0,2М тріс-НСІ-буфері, рН 7,4 і до одного об'єму гомогенату додавали 7 об'ємів віддіалізованого протромбінового комплексу. Суміш інкубували протягом 60-120хв при температурі 37 С, доки активність тромбіну не виходила на плато (приблизно 700-1000 од. МІН/мл розчину). Через кожні 10хв відбирали 75 проби для визначення згортуючої активності тромбіну.To activate prothrombin into thrombin, 10 g of lyophilized thromboplastin was homogenized with 100 ml of 0.2 5 M calcium chloride solution in 0.2 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, and 7 volumes of dialyzed prothrombin complex were added to one volume of homogenate. The mixture was incubated for 60-120 minutes at a temperature of 37 C until the thrombin activity reached a plateau (approximately 700-1000 units of MIN/ml of solution). Every 10 minutes, 75 samples were taken to determine the coagulation activity of thrombin.
Одержаний екстракт тромбіну центрифугували ЗОхв при 40009 при ж 42С і супернатант пропускали через колонку з сорбентом активним-яскраво-голубим К розміром 2,5х32см, врівноважену 0,05М тріс-НСІ-буфером, рН 8,0. Далі колонку із зв'язаним на сорбенті тромбіном послідовно промивали вихідним буфером, 2595-ним розчином пропанолу-2, 0,25М розчином 5-АКК і десорбували тромбін 2595-ним розчином пропанолу-2 з 1М Масі в 0,05М тріс-НСІ-буфері, рН 8,0. Швидкість елюції становила 0,2-04мл/(хв х см). Тромбінвмісні фракції об'єднували, діалізували проти 0,15ММасі при яї49С протягом ночі і після заморозки при - 25 С ліофільне висушували.The resulting thrombin extract was centrifuged at 40,009 rpm at 42C and the supernatant was passed through a column with an active-bright-blue K sorbent measuring 2.5x32cm, equilibrated with 0.05M Tris-HCl buffer, pH 8.0. Next, the column with thrombin bound on the sorbent was sequentially washed with the initial buffer, a 2595% solution of propanol-2, a 0.25M solution of 5-ACC, and the thrombin was desorbed with a 2595% solution of propanol-2 with 1M mass in 0.05M Tris-HCI- buffer, pH 8.0. The elution rate was 0.2-04ml/(min x cm). The thrombin-containing fractions were combined, dialyzed against 0.15 MMas at 49C overnight and, after freezing at -25C, lyophilized.
Вихід тромбіну з 2 кг фракції І-Ш за Коном - 1000000-1500000 од. МІН, питома активність - 2000 од.Thrombin output from 2 kg of fraction I-Sh according to Kohn - 1000000-1500000 units. MIN, specific activity - 2000 units.
МІН/мг білка.MIN/mg protein.
В таблиці представлені характеристики препарату тромбіну, одержаного пропонованим способом і пт) способом-найближчим аналогом. властивості Сорбційна властивість сорбенту, (Активність тромбіну в|Питома активність тромбіну, Вихід тромбіну (по с од. МІН/г сорбенту елюаті, од.МІН/мл од. МІН/мг білка активності), 90 со - спосіб « " й аналогThe table presents the characteristics of the thrombin preparation obtained by the proposed method and by the closest analog method. properties Sorptive property of the sorbent, (Thrombin activity in|Thrombin specific activity, Thrombin output (according to units of MIN/g of sorbent eluate, units of MIN/ml of units of MIN/mg protein activity), 90 so - method "" and analog
З наведених даних видно, що ступінь очищення тромбіну, який характеризується підвищенням його питомої фібриноутворюючої здатності, вищий в 1,3 рази в пропонованому способі. «It can be seen from the given data that the degree of purification of thrombin, which is characterized by an increase in its specific fibrin-forming capacity, is 1.3 times higher in the proposed method. "
Вихід сумарної згортуючої активності (ефективність способу) у порівнянні з аналогічним показником для шщ с найближчого аналога для пропонованого способу у 1,14 рази вищий. . Питома ємність пропонованого сорбенту в 5,25 рази вища у порівнянні з найближчим аналогом, що дозволяє «» за один технологічний цикл використати значно більшу кількість вихідної сировини для одержання препарату тромбіну.The yield of the total clotting activity (efficiency of the method) is 1.14 times higher for the proposed method compared to the similar indicator for the closest analogue. . The specific capacity of the proposed sorbent is 5.25 times higher compared to the nearest analog, which allows "" to use a significantly larger amount of raw materials for the preparation of thrombin in one technological cycle.
Скорочення часу виділення тромбіну за рахунок одностадійного хроматографічного процесу здешевлюють ка пропонований спосіб, елюція тромбіну більш концентрованим піком спрощує наступні роботи технологічного процесу (діаліз, ліофілізацію), внаслідок чого покращуються аналітичні показники кінцевого продукту - ть діагностичного чи лікувального препарату. - Джерела інформації: 1. Грачева Н.А., Ужинова Л.Д., Курд А.Л. и др./УБисорган. химия.-1981.- Т. 7.- Мо 10.- С. 1560-1565.Reducing the time of thrombin extraction due to a one-stage chromatographic process makes the proposed method cheaper, elution of thrombin with a more concentrated peak simplifies the subsequent work of the technological process (dialysis, lyophilization), as a result of which the analytical indicators of the final product - a diagnostic or therapeutic drug - are improved. - Sources of information: 1. Gracheva N.A., Uzhinova L.D., Kurd A.L. etc./UBysorgan. chemistry.-1981.- T. 7.- Mo. 10.- P. 1560-1565.
Со 2. Зсптег б. Те ргиїісавбйоп Ге) роміпе Іготрбіп ру апйіпцу спготайдгарну оп з репгатідіпе-адагозе.//Норре-ЗеуЇегз 2. Рпувіої. Спет.-1972.-М.353.-Р. 810-814.So 2. Zspteg b. Te rgyiisavbyop Ge) romipe Igotrbip ru apyiptsu spgotaidgarnu op z repgatidipe-adagoze.//Norre-ZeuYegz 2. Rpuvioi. Spet.-1972.-M.353.-R. 810-814.
З. Найоп М.МУ., Кедоесгі Е. Те айіпйу ої питап, гаррії апа Броміпе (пготбріпз їТог зерпагозе-іІузіпе апа оїпег сопічддайез /Віоспет. Віорпуз. Асіа.-1976.-М.427.-Р. 575-585. 4. АПіпйу спготайдгарпу ої Ппитап (готбріп оп птодйей зййса /СбСаіїда АМ., Мопавіугекії М.А.,Z. Naiop M.MU., Kedoesgi E. Te ayipyu oi pitap, harryi apa Bromipe (pgotbripz yTog zerpagoze-iIuzipe apa oipeg sopichddayez /Viospet. Viorpuz. Asia.-1976.-M.427.-R. 575-585. 4. APipyu spgotaidgarpu oi Ppitap (gotbrip op ptodyei zyysa /SbSaiida AM., Mopaviugekii M.A.,
Мадегоу»гкії Ми. еї а. /). Спготаїйоаг. - 1987. - М. 424, Мо. 2.-Р. 385-391. с 5. Хроматография тромбина на модифицированньїх кремнеземах: роль матриць, спейсера и величинь рнН./Madegou»gkii We. her a. /). Spgothaiyoag. - 1987. - M. 424, Mo. 2.-R. 385-391. p 5. Chromatography of thrombin on modified silicas: role of matrices, spacer and pH values./
Гайда А.В., Монастьірский В.А., Магеровский Ю.В. и др.//Биотехнология.- 1989.- Т. 5.- Мо 4.- С. 449-454. б. Магеровский Ю. В. Очистка тромбина и тромбопластина методом аффинной и гельпроникающей бор хроматографии на модифицированньїх кремнеземньїх сорбентах: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Львов, 1989. -21с. 7. 65. Монастьірский В.А., Магеровский Ю.В., Гайда А.В. Применение полизтиленгликоля для вьіделения протромбинового комплекса // Гематол. и трансфузиол.-1986.- Мо2.-С.51-53. 8. Нитап Віоод Соадишіайоп, Наетовіазів апа Тиготровзів./ЕЯа. ру Кк. Відов//ВіасКуеї! Зсіепійіс 65 Рибіїсакопв, РпйПадеї!рпіа.-1976.- 722 Р.Hayda A.V., Monasthirsky V.A., Magerovsky Yu.V. et al.//Biotechnology.- 1989.- T. 5.- Mo. 4.- P. 449-454. b. Magerovsky Yu. V. Purification of thrombin and thromboplastin by affinity and gel-penetrating boron chromatography on modified silica sorbents: Autoref. thesis ... candidate biol. of science - Lviv, 1989. -21 p. 7. 65. Monasthirsky V.A., Magerovsky Yu.V., Hayda A.V. The use of polyethylene glycol for the elimination of the prothrombin complex // Hematol. and transfusiol.-1986.- Mo2.-S.51-53. 8. Nytap Viood Soadyshiyop, Naetoviaziv apa Tygotrovziv./Eyaa. ru Kk. Vidov//ViasKuei! Zsiepiyis 65 Rybiisakopv, RpyPadei!rpia.-1976.- 722 R.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU200700211U UA24182U (en) | 2007-01-09 | 2007-01-09 | Method for isolation and purification of thrombin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU200700211U UA24182U (en) | 2007-01-09 | 2007-01-09 | Method for isolation and purification of thrombin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA24182U true UA24182U (en) | 2007-06-25 |
Family
ID=38439790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU200700211U UA24182U (en) | 2007-01-09 | 2007-01-09 | Method for isolation and purification of thrombin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA24182U (en) |
-
2007
- 2007-01-09 UA UAU200700211U patent/UA24182U/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2458067C2 (en) | Method of extracting plasminogen or plasmin from mixture in presence of fibrinogen | |
| US5112949A (en) | Method of and apparatus for separating proteins | |
| CA2024667C (en) | Process for preparing a concentrate of blood coagulation factor viii-von willebrand factor complex from total plasma | |
| FI95136C (en) | Procedure for cleaning annexins | |
| JPH0724723B2 (en) | Sulfated non-carbohydrate Germantrics adsorbent | |
| US4137127A (en) | Process for the preparation of thrombin-like enzymes from snake venoms | |
| JPH0386900A (en) | Novel thrombin-combining substance and production its | |
| EP0391974B1 (en) | Process for the purification of vitamin k-dependent blood clotting factors | |
| HU219828B (en) | Process for the isolation and purification of vitamin k dependent proteins | |
| CN106928344A (en) | Method for being reduced from the solution containing clotting factor and/or remove FXI and FXIa | |
| CA1252744A (en) | Ultrapurification of factor ix and other vitamin k- dependent proteins | |
| US5445958A (en) | Process for purifying blood clotting factors | |
| KR102317930B1 (en) | Method for preparation of thrombin | |
| UA24182U (en) | Method for isolation and purification of thrombin | |
| Mannhalter | Purification of plasma protein | |
| WO2012036140A1 (en) | Affinity carrier for refining or removing protein or peptide having kringle sequence, and refinement method and removal method in which affinity carrier is used | |
| AU4311893A (en) | Purification of kringle containing proteins, and especially t-pa | |
| JPS6251589B2 (en) | ||
| AU627446C (en) | Chemical process | |
| Mannhalter | 4. Therapy with Plasminogen Concentrates: Preliminary Results and Future Strategies | |
| SU1114699A1 (en) | Method for isolating leucineamino peptidase | |
| RU1517545C (en) | Method of immunosorbent making | |
| Wu | Protein C separation from homologous human blood proteins, Cohn fraction IV-1, using immobilized metal affinity chromatography | |
| SU767121A1 (en) | Method of isolating and purifying trypsin and chymotrypsin | |
| KR20220111307A (en) | Pro-thrombin Tablets |