(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ТРИПСИНА Изобретение относитс к области энзимологаи и родственным ей област м науки и промышленности , использующим высокоочищенные ферменть. Высокорчищенные трипсин и химотрипсин могут быть использованы в фармацевтической , медицинской и пищевой промышленности , а также в р де областей науки - молек л рной биологии, биохимии и т. д. Б современно знзимологйи дл выделени и очистки трипсина и Химотрипсина весьма успешно примен етс метод биоаффинной хроматографии с использованием биоспецифических сорбентов, полученных на основе синтетических или природных ингибиторов указанньтх фермен тов. . Однако биоспёцифические сорбенты, получен ные на основе специфических синтетических низкомолекул рных ингибиторов трипсина и Химотрипсина, вл ютс пригодными дл раздельной очистки данных ферментов, и лишь в отдельнь1х случа хдостигаетс одновременное разделение и очистка трипсина и Химотрипсина, и то при условии использовани предварительно очищенных ферментных препаратов ,(1 . И ХИМОТРИПСИНА С другой стороны, биоспецифические сорбенты , полученнь1е на основе природных ингибиторов трипсина, позвол ют проводить одновременный процесс выделени и очистки трипсина и Химотрипсина непосредственно из:сырых экстрактов, но возможность применени таких сорбентов в препаративных масштабах ограничиваетс в св зи с дороговизной их получени и низкой устойчивостью к химическим и микробиологическим воздействи м.. Известен способ очистки частично очищенных препаратов рипшна и химотрипсина гидрофобнрй вь1сагшвающей хроматографией на бензилагарозе , заключающийс в сорбции ферментов в 0,1 М цитратном буфере i рН 3,0, содержащем 3 М NaCI и десорбции ферментов градиентной люцией градиентом NaCI в концентрации 3,0 М в исходном буфере или линейным градиезгтом от исходного буфера с 3 М NaGI до исходного буфера с 50% зтиленгликол 2. Однако существующий способ обладает следу-ющими недостатками: 1) исходна матрица,используема дл синтеза сорбента сефароза, дорогосто щий, низко37 стабильный к действию химических реагентов, JKTKO подвергаемый действию микроорганиимов материал-; 2)в таких услови х проведени хроматографии трипсина или химотрипсина на бензилагарозе с содержанием бензильных групп 900 мк М/г носител наблюдаетс незначительное повыигение удельной активности десорбируемото фермента (дл трипсина от 0,90 ед/мг до 1,3 ед/мг, дл химотрипсина от 970 ед/мг до 1100 ед/мг) в 1,2-1,4 раза, при этом выход активного фермента составл ет всего лишь 40-55% 3)в указанных услови х проведени хроматографии даже наличие таких агентов, как 3 М МаС| или 50% этиленгликоль не обеспечивает количественных выходов десорбции посторонних белков, что может привести к постепенному загр знению колонки с сорбентом и трудности его регенерации; 4)отсутствуют какие-либо данные о возмож ности выделени и очистки трипсина и Химотрипсина непосредственно из сырых экстрактов и возможности поочередной десорбции ферментов при их совместной .сорбции на сорбенте. Целью предлагаемого изобре тени вл етс повышение выхода и степени очистки целевых ферментов и упрощение процесса их выделени и очистки. Поставленна цель достигаетс , согласно изо ретению, описываемым способом выделени и очистки трипсина и химотрипсина, включающим сорбцию ферментов в 0,002-0,005 М ацетат е кальци при рН 6,9-7,1 на сорбенте, в качестве которого используют N-бензилхитин с кондантрацией бензильных групп 60-90 мк М/г и десорбцию, причем дл десорбции трипсина используют 0,5Ч),6 М раствор NaCI в исходном буфере, а дл десорбции химотрипсина 1,5-2,0 раствор NaCI в исходном буфере. Существенными отличи ми описываемого аюсоба вл ютс использование в качестве сор бента N-бензилхитина с концентрацией беизильных групп 60-90 мк М/г, использование при сорбции 0,002-0,005 М ацетата кальци , рН 6,9-7,1, использование дл десорбции трипсина0 ,,6 М раствора NaCI в исходном буфере, а дл десорбции химотрипсина - 1,5-2,0 М раствора NaCI в исходном буфере. Преимущество предлагаемого способа заключаетс в том, что процесс сорбции - десорбции ферментов на бензилхитине осуществл етс в м гких.услови х,, обеспешвающих высокую степень сохрайени активности и очистки ферментов за счет наличи в сорбенте двух сорбционных центров (бензильных групп и белковой части хитина), способных к строго селективному взаимодействию с целевыми ферментами , тогда как в известном способе сорбци ферментов реализуетс на бензильйых остатках Л за счет действи неспецифических ги р(х{)об11ых Лл св зывани . Эти особенности N-бензилхигина определ ют услови проведени всего процесса хроматографии ферментов, что выражаетс и в том, что оба фермента десорбируютс при достаточно различающихс концентраци х солей в буферном растворе (как при хроматографии неочищенного нанкреатина, так и при хроматографии частично очищенных препаратов трипсина и химотрипсина ) , в результате чего достигаетс значительное повышение удельной активности трипсина (от 3 до 5 раз), химотрипсин достигает электро- , форетически гомогенного состо ни . Выход активных ферментов составл ет не менее 70-80%. Пример 1. Выделение и очистка трипсина и химотрипсина из медицинского панкреатина ... Колонку (1,1x31 см), наполненную 10,63 г N-бензилхитина, уравновещивают 0,002 М растврррм Са(СНзСОО)2 рН 7,0 и нанос т 50 мл IMCTBOpa медицинского панкреатина в 0,002 М Са(СНзСОО)2 рН 7,0 концентрацией белка 2,6 мг/мл общей протеолитической активностью 0,15 казеиновых единиц на 1 мг белка (каз. ед/мг). Скорость течени элюента 40 мл/ч. После нанесени раствора медиданского панкреатина колонку промывают начальным буфером (0,002 М Са(СНзСОО)2рН 7,0) до отрицательной реакции на белок. После чего через колонку пропускают 0,5 М раствор NaCI в 0,002 М Са(СНзСОО)2 рН 7,0 до отрицательной реакции на белок (около 100 мл). Фракции с протеолитической активностью собирают, общий объем 60 мл, концентраци белка 0,87 мг/мл, получают 52,2 мг трипсина с активностью 0,10 каз. ед/мг белка. После отделени трипсина через колонку пропускают 1,5 М раствор NaCI в 0,002 М Са(СНзСОО)2 до отрицательной реакции на белок (около 100 мл). Фракции ,с протеолитичгской активностью объедин ют: 60 мл с концентрацией белка 0,76 мг/мл, получают 45,6 мг а -химотрипсина с активностью 0,08 каз. ед/мг белка. После диализа фракции с трипсином и с а -химотрипсином лиофильно высушивают. Из 1 г медицинского панкреатина получают 28,0 мг трипсина, содержащего 85-90% белка. Активность препарата 0,09 каз. ед/мг белка, что соответствует 67 ед. БАЭЭ/мг белка . (N-бензоил-DL-аргининэтиловый эфир). Из 1 г медицинского панкреатина, кроме трипсина, получают 23 мг химотрипсина. Активность препарата 0,08 каз. ед/мг белка; Гомогенность устанавливают методом электрофореза в полиак рилами дном геле.(54) METHOD OF SEPARATION AND CLEANING OF TRIPSIN The invention relates to the field of enzymology and related fields of science and industry using highly purified enzyme. Highly purified trypsin and chymotrypsin can be used in the pharmaceutical, medical and food industries, as well as in a number of areas of science - molecular biology, biochemistry, etc. The bio-affinity method for the isolation and purification of trypsin and chymotrypsin has been successfully used by modern scientists. chromatography using biospecific sorbents obtained on the basis of synthetic or natural inhibitors of the indicated enzymes. . However biospotsificheskie sorbents prepared nye based on specific synthetic low molecular weight inhibitors of trypsin and chymotrypsin are suitable for separate purification of these enzymes, and only otdeln1h instances hdostigaets simultaneous separation and purification of trypsin and chymotrypsin, and then under the condition of using pre-purified enzyme preparations, (1. AND HIMOTRIPSINA. On the other hand, biospecific sorbents, obtained on the basis of natural trypsin inhibitors, allow simultaneous The isolation and purification of trypsin and chymotrypsin directly from: crude extracts, but the possibility of using such sorbents on a preparative scale is limited due to the high cost of their preparation and low resistance to chemical and microbiological effects. There is a known method of cleaning partially purified ripsna preparations and chymotrypsin hydrophobry. in benzilagarose chromatography, consisting in the sorption of enzymes in 0.1 M citrate buffer i pH 3.0, containing 3 M NaCI and the desorption of enzymes by gradient luciation with NaCl concentration of 3.0 M in the initial buffer or linear gradient from the initial buffer with 3 M NaGI to the initial buffer with 50% ethylene glycol 2. However, the existing method has the following disadvantages: 1) the initial matrix used for the synthesis of sorbent Sepharose, expensive, low-37 chemical-resistant, JKTKO microorganism-exposed material-; 2) under such conditions as chromatography of trypsin or chymotrypsin on benzylagarose with a content of benzyl groups of 900 µM / g of carrier, a slight increase in the specific activity of the desorbable enzyme is observed (for trypsin from 0.90 U / mg to 1.3 U / mg from 970 units / mg to 1100 units / mg) 1.2-1.4 times, while the yield of the active enzyme is only 40-55% 3) under the indicated conditions of chromatography, even the presence of such agents as 3 M Mac | or 50% ethylene glycol does not provide quantitative desorption of foreign proteins, which may lead to the gradual contamination of the column with the sorbent and the difficulty of its regeneration; 4) there are no data on the possibility of isolating and purifying trypsin and chymotrypsin directly from the raw extracts and the possibility of alternate desorption of enzymes when they are co-adsorbed on a sorbent. The purpose of the inventive shadow is to increase the yield and purification of the target enzymes and simplify the process of their isolation and purification. The goal is achieved, according to the invention, described by the method of separation and purification of trypsin and chymotrypsin, including sorption of enzymes in 0.002-0.005 M calcium acetate e at pH 6.9-7.1 on a sorbent, which is used as N-benzyl chitin with benzyl condentation groups of 60-90 microns M / g and desorption, moreover, 0.5 × is used for stripping trypsin), 6 M NaCl solution in the initial buffer, and 1.5-2.0 NaCl solution in the initial buffer for desorption of chymotrypsin. Significant differences of the ausoba described are the use of N-benzyl chitin as a sorbent with a concentration of beisyl groups of 60-90 µM / g, the use of calcium acetate at pH 2.02-0.005 M, pH 6.9-7.1, the use of trypsin for desorption ,, 6 M solution of NaCl in the initial buffer, and for desorption of chymotrypsin - 1.5-2.0 M of NaCl solution in the initial buffer. The advantage of the proposed method is that the process of sorption - desorption of enzymes on benzylchitin is carried out in mild conditions, ensuring a high degree of conservation of activity and purification of enzymes due to the presence in the sorbent of two sorption centers (benzyl groups and the protein part of chitin), capable of strictly selective interaction with target enzymes, whereas in a known method sorption of enzymes is carried out on benzyl residues L due to the action of non-specific gy (x {) solid LL binding. These features of N-benzylchigine determine the conditions for carrying out the entire process of enzyme chromatography, which is also expressed in the fact that both enzymes are desorbed with sufficiently different concentrations of salts in the buffer solution (both in crude nancreatin chromatography and in chromatography of partially purified trypsin and chymotrypsin preparations ), as a result of which a significant increase in the specific activity of trypsin is achieved (from 3 to 5 times), chymotrypsin achieves an electrophore homogeneous state. The yield of active enzymes is at least 70-80%. Example 1. Isolation and purification of trypsin and chymotrypsin from medical pancreatin ... A column (1.1x31 cm) filled with 10.63 g of N-benzylchitin, equilibrated with 0.002 M solution of pH 7.0 and 50 ml applied IMCTBOpa of medical pancreatin in 0.002 M Ca (CH3SOO) 2 pH 7.0 with a protein concentration of 2.6 mg / ml with a total proteolytic activity of 0.15 casein units per mg of protein (Kazakh units / mg). The eluent flow rate is 40 ml / h. After applying the Medidansky Pancreatin solution, the column is washed with initial buffer (0.002 M Ca (CH3COO) 2pH 7.0) until a negative reaction to the protein. After that, a 0.5 M solution of NaCI in 0.002 M Ca (CH 2 SOO) 2 pH 7.0 is passed through the column to a negative reaction to protein (about 100 ml). Fractions with proteolytic activity are collected, a total volume of 60 ml, a protein concentration of 0.87 mg / ml, to obtain 52.2 mg of trypsin with an activity of 0.10 kaz. unit / mg protein. After separation of trypsin, a 1.5 M solution of NaCI in 0.002 M Ca (CH 3 COO) 2 is passed through the column to a negative reaction to protein (about 100 ml). Fractions with proteolytic activity are combined: 60 ml with a protein concentration of 0.76 mg / ml; 45.6 mg of α-chymotrypsin with an activity of 0.08 ka are obtained. unit / mg protein. After dialysis, the fractions with trypsin and with α-chymotrypsin are lyophilized. From 1 g of medical pancreatin get 28.0 mg of trypsin, containing 85-90% protein. The activity of the drug 0.09 kaz. unit / mg of protein, which corresponds to 67 units. BAEE / mg protein. (N-benzoyl-DL-arginine ethyl ether). From 1 g of medical pancreatin, except trypsin, get 23 mg of chymotrypsin. The activity of the drug 0.08 kaz. unit / mg protein; Homogeneity is established by polyacrylate electrophoresis by the bottom of a gel.