KR102317930B1 - 트롬빈의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

지정된 BaSO4 시약을 프로트롬빈 흡착제로서 사용하여 프로트롬빈 공급원으로부터 트롬빈을 생산하는 방법 및 트롬빈의 제조에 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성을 평가하는 방법이 제공된다. 적어도 하나의 실시 형태에서, 상기 방법은 지정된 BaSO4 시약의 샘플을 프로트롬빈 공급원과 접촉시켜, BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하는 단계, 및 후속하여, BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 방법은 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성과 대비하여 평가하는 단계를 포함한다.

Description

트롬빈의 제조 방법{METHOD FOR PREPARATION OF THROMBIN}
본 발명은 트롬빈 생산 분야에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 트롬빈의 제조 시에 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
트롬빈은 피브리노겐의 피브린으로의 전환을 촉매함으로써 혈병화 (blood clotting)를 촉진하는 세린 프로테아제이다. 트롬빈은 또한 혈소판의 활성화에 관여하며, 다수의 단백분해 피드백 메커니즘을 통해, 자체 생산 및 억제의 조절에 간접적으로 관여한다. 트롬빈은 또한 인자 VIII, 인자 V, 인자 XI, 인자 XIII 및 단백질 C의 활성화에 관여한다. 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환시킴으로써, 상처의 출혈을 멈추게 하기 위한 응고 인자로서 임상 분야에서 광범위하게 사용된다. 트롬빈은 외과용 드레싱의 일반적인 성분이며, 피브린 글루 (fibrin glue), 접착제 및 실란트와 같은 2-성분 지혈 시스템에서 피브리노겐 및 기타 응고 단백질과 병용되어 왔다.
트롬빈은 전구체 (치모겐 (zymogen)) 프로트롬빈의 단백분해 활성화에 의해 생산된다. 트롬빈의 생산을 위해서는, 프로트롬빈이 2개의 부위에서 절단되어, 중간 생산물이 발생되어야 한다. 체내에서 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환은, 활성화된 인자 X 및 인자 V를 포함하고 칼슘 이온의 존재 하에 음으로 하전된 인지질 막에서 조립되는 프로트롬비나제 복합체에 의해 촉매된다.
트롬빈은 프로트롬빈 공급원 (예를 들어, 혈장 또는 혈액 분획)을 상기 프로트롬빈 공급원으로부터의 프로트롬빈을 흡착할 수 있는 고체 흡착제, 예를 들어 황산바륨 (BaSO4)과 접촉시킴으로써, 프로트롬빈으로부터 제조될 수 있다. 상기 고체 흡착제는 전형적으로 세척 용액을 사용하여 세척하여 미결합 단백질과 같은 오염물을 제거하고, 후속하여 용리액(elution solution)을 사용하여 프로트롬빈을 그로부터 용리시킨다. 선택적인 추가 정제 및 처리 단계 이후, 용리된 프로트롬빈은, 활성화제, 예를 들어 칼슘 이온을 사용한 활성화에 의해, 트롬빈으로 전환될 수 있다.
상이한 BaSO4 시약들, 예를 들어 상이한 제조업체들에서 입수한 BaSO4 시약들 또는 심지어, 특정 제조업체에서 생산된 시약의 상이한 배치(batch)들을 사용하는 경우, 지정된 부피의 프로트롬빈 공급원으로부터의 트롬빈의 수율에 유의한 차이가 있는 것으로 밝혀졌음이 보고된 바 있다.
보고된 바에 따르면, 트롬빈 수율의 차이는 적어도 부분적으로는 상이한 BaSO4 시약들에 의한 프로트롬빈 흡착의 변동에 기인하며, 흡착능이 프로트롬빈 흡착을 위한 BaSO4 시약의 선택에서의 주요 인자인 것으로 제안되었다. Surgenor 및 Neortker (1952)는, 혈장으로부터의 프로트롬빈의 흡착 단계에서 특정 BaSO4 시약이 다른 시약보다 더욱 효과적이라고 명시하였으며, 한편 Voss D. (1965)는, 프로트롬빈 복합체의 흡착을 위해 상이한 BaSO4 시약들을 사용하는 경우, 동일량의 프로트롬빈 복합체를 흡착하는 데 필요한 BaSO4 양에서 유의한 차이가 발견됨을 적시하였고, 이는 그의 결정 구조의 차이로 인한 것이라고 고찰하였다. 그러나, 본 출원인의 사례에서, BaSO4의 상이한 배치들에 대한 형태(morphology)가 시험되었으며, 유의한 차이가 없는 것으로 판정되었다. 또한, 일부 이온, 예를 들어. Ca2+는 상이한 BaSO4 배치들에 대해 상이한 흡착률을 부여하는 것으로 보고되었으며, 이 경우, BaSO4의 상이한 배치들 중의 Ca2+의 존재는 역시 유의하게 상이하지 않았다.
트롬빈 제조업체는 다수의 상이한 BaSO4 시약들 중에서 적합한 BaSO4 시약을 선택하는 시행착오법에 기대어, 트롬빈 수율을 증가시키려는 시도를 하고 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 지정된 BaSO4 시약을 프로트롬빈 흡착제로서 사용하여 프로트롬빈 공급원으로부터 트롬빈을 생산하는 방법뿐만 아니라, 프로트롬빈 공급원과 지정된 BaSO4 시약을 접촉시켜 BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하는 단계, 및 일부 실시 형태에서, 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성 (pro-coagulant activity)에 대비하여, BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계에 의해, 트롬빈의 제조에 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
접촉 단계는 본 명세서에서 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 예를 들어, 프로트롬빈 공급원을 BaSO4와 충분히 근접시켜, 상기 공급원 내의 프로트롬빈과 BaSO4 사이에 결합 상호작용이 일어나게 할 임의의 유형의 조합 작용을 지칭한다. 접촉 단계는 BaSO4 내로 상기 공급원을 혼합, 혼화 및/또는 첨가하거나, 상기 공급원 내로 BaSO4를 첨가하는 단계를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명에서는 놀랍게도 일부 BaSO4 시약과의 프로트롬빈 접촉이 트롬빈으로의 전환 (즉, 프로트롬빈의 그의 중간체 및/또는 트롬빈으로의 전환)을 촉발하는 것으로 밝혀졌다. 이는 생산 과정의 종료 시점에서 트롬빈 수율을 저해하는 조기 전환인 것으로 밝혀졌다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태에서, 응고 촉진 활성은 프로트롬빈의 그의 중간체 및/또는 트롬빈으로의 전환 후에 발생한다. 이러한 중간체는 프로트롬빈의 트롬빈으로의 단백분해 전환 과정 동안 형성될 수 있다. 중간체의 비제한적인 예에는 프리트롬빈 (prethrombin) 및 메이조트롬빈 (meizothrombin)이 있다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태는, 바람직하게는 실규모 (full scale) 트롬빈 생산 과정의 일부로서, 지정된 BaSO4 시약을 흡착제로 사용하기 전에, 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기에 적합한 BaSO4 시약의 확인을 가능하게 한다.
구체적으로는, 일부 실시 형태에서는, 지정된 BaSO4 시약의 샘플을 프로트롬빈 공급원과 접촉시켜 그로부터의 프로트롬빈을 흡착시켜 BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하고, 후속으로 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가한다. 전형적으로는, BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성이 작을수록, 지정된 BaSO4 시약이 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기에 더욱 적합하다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 제조 과정에서 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성은, BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성이 정상적인 포유동물 혈장, 예를 들어 정상적인 인간 혈장의 응고 촉진 활성을 초과하지 않는 것에 의해 지시된다.
정상적인 포유동물 혈장, 예컨대 인간 혈장은 다양한 응고 시험을 위한 보정용 혈장 (calibration plasma)으로 사용하도록 의도된, 잘 알려진 풀링 (pooling)된 혈장 조제물 또는 단일 공여자 혈장 조제물이다.
정상적인 인간 혈장은, 예를 들어, 8명 이상의 건강한 성인들로부터 시트르산칼륨 또는 시트르산나트륨 용액, 또는 둘 모두가 첨가된 전혈의 액체 부분을 풀링하는 단계 및 이를 자외광에 노출시켜 세균성 오염물 및 바이러스성 오염물을 파괴하는 단계에 의해 수득된 멸균 혈장일 수 있다.
정상적인 인간 혈장은 Coagulation Tests 00625의 Unicalibrator 보정용 혈장일 수 있다.
적어도 일부의 경우, 본 명세서에 기재된 방법은 시행착오법에 의한 적합한 BaSO4 시약의 선택 단계의 필요성을 제거한다.
본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태는 사용하기에 신속 간편하며, 잠재적으로는 시간 및/또는 생산 비용의 절감을 제공한다. 본 명세서에 기재된 방법의 일부 실시 형태는 지정된 프로트롬빈 공급원으로부터의 트롬빈의 수율의 증가를 가능하게 한다.
본 발명의 태양 및 실시 형태가 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에서 설명된다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태의 일 태양에 따르면, 지정된 BaSO4 시약을 프로트롬빈 흡착제로서 사용하여 프로트롬빈 공급원으로부터 트롬빈을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
a. 상기 지정된 BaSO4 시약 및 상기 프로트롬빈 공급원을 제공하는 단계;
b. 상기 지정된 BaSO4 시약에 의해 상기 프로트롬빈 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 가능하게 하는 조건 하에 상기 지정된 BaSO4 시약의 샘플과 상기 프로트롬빈 공급원을 접촉시켜, BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하는 단계; 및
c. 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계를 포함하며,
상기 c.의 평가 단계가 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성과 비교함으로써 수행될 때, 트롬빈 제조에 사용하기 위한 상기 지정된 BaSO4 시약의 적합성이, 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성이 상기 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성을 초과하지 않는 것에 의해 지시된다.
추가의 태양에 따르면, 지정된 BaSO4 시약을 프로트롬빈 흡착제로서 사용하여 프로트롬빈 공급원으로부터 트롬빈을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 단계 a 내지 c를 포함하고,
d. 프로트롬빈 흡착을 가능하게 하는 조건 하에 상기 적합한 BaSO4를 프로트롬빈 공급원과 접촉시키는 단계;
e. 용리 완충액을 사용하여 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈으로부터 프로트롬빈-함유 분획을 용리시키는 단계;
f. 상기 용리 분획을, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 가능하게 하는 조건에 적용시켜, 트롬빈을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 단계 'e' 이후 상기 용리 분획을 수집하는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 프로트롬빈의 트롬빈으로의 조기 전환을 실질적으로 회피한다. "프로트롬빈으로부터 트롬빈으로의 조기 전환"은 단계 'd'에서 프로트롬빈이 트롬빈으로 전환되는 것을 의미한다.
종종, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용어 "용리"는 용어 "탈착 (desorption)"과 상호교환 가능하다.
일 실시 형태에서, 트롬빈의 제조에서 BaSO4에 대한 프로트롬빈 흡착을 가능하게 하는 조건은 pH 7.4 내지 8.6, 및/또는 약 1% 내지 22% (w/v), 예를 들어 약 1%의 농도 범위의 BaSO4를 포함한다.
일 실시 형태에서, 트롬빈의 제조 과정 동안 용리 완충액은, 예를 들어 3.0 내지 4.4% (w/v)의 농도의 칼슘 킬레이팅 염, 예를 들어 시트르산나트륨을 포함하고/하거나, pH 6.3 내지 7.4를 가진다.
일 실시 형태에서, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 가능하게 하는 조건은 프로트롬빈을 칼슘 이온과 같은 활성화제에 적용하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시 형태의 추가의 태양에 따르면, 프로트롬빈 공급원으로부터 트롬빈을 제조하는 데 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성을 평가하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
a. 상기 지정된 BaSO4 시약 및 프로트롬빈 공급원을 제공하는 단계;
b. 상기 지정된 BaSO4 시약에 대한 상기 프로트롬빈 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 가능하게 하는 조건 하에 상기 지정된 BaSO4 시약의 샘플과 상기 프로트롬빈 공급원을 접촉시켜, BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하는 단계; 및
c. 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계를 포함하며,
상기 c.의 평가 단계가 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성과 비교함으로써 수행될 때, 트롬빈 제조에 사용하기 위한 상기 지정된 BaSO4 시약의 적합성이, 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성이 상기 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성을 초과하지 않는 것에 의해 지시된다.
본 발명의 일부 실시 형태의 일 태양에 따르면, 지정된 BaSO4 시약을 프로트롬빈 흡착제로서 사용하여 프로트롬빈 공급원으로부터 트롬빈을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
a. 상기 지정된 BaSO4 시약 및 프로트롬빈 공급원을 제공하는 단계;
b. 상기 지정된 BaSO4 시약에 의해 상기 프로트롬빈 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 가능하게 하는 조건 하에 상기 지정된 BaSO4 시약의 샘플과 상기 프로트롬빈 공급원을 접촉시켜, BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하는 단계; 및
c. 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 제조 과정에서 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성은, BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성이 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성을 초과하지 않는 것에 의해 지시된다. 일부 실시 형태에서, 상기 c.의 평가 단계는 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성과 비교함으로써 수행된다.
본 발명의 일부 실시 형태의 일 태양에 따르면, 프로트롬빈 공급원으로부터 트롬빈의 제조 시, 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성을 평가하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
a. 상기 지정된 BaSO4 시약 및 프로트롬빈 공급원을 제공하는 단계;
b. 상기 지정된 BaSO4 시약에 의해 상기 프로트롬빈 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 가능하게 하는 조건 하에 상기 지정된 BaSO4 시약의 샘플과 상기 프로트롬빈 공급원을 접촉시켜, BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하는 단계; 및
c. 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 제조 과정에서 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성은, BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성이 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성을 초과하지 않는 것에 의해 지시된다. 일부 실시 형태에서, 상기 c.의 평가 단계는 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성과 비교함으로써 수행된다.
본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시 형태에서, 응고 촉진 활성을 평가하는 단계는 응고 촉진 검정을 수행하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시 형태에서, 응고 촉진 검정은 기능 검정, 예를 들어 혈병화 검정 (예를 들어, NAPTT 검정, APTT 검정, 프로테아제 발색 검정 또는 지표 검정(indicative assay) (예를 들어, 면역검정))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능 검정을 포함한다.
일부 실시 형태에서, NAPTT 비가 0.8 이상인 용리물을 생성한 BaSO4 시약이 트롬빈 제조 시에 사용하기에 적합한 것으로 고려되었다.
일부 실시 형태에서, 혈병이 시각적으로 즉시 관찰되거나 (칼슘 첨가 시에 그리고 혈병화 시간 (clotting time) 이전에 발생되는 혈병은 응고 측정기로 기록할 수 있음) 또는 NAPTT 비가 0.8 이하인 용리물을 생성하는 BaSO4 시약은 트롬빈 제조 시에 사용하기에 적합하지 않은 것으로 고려된다.
본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈 공급원은 혈장 (예를 들어, 옥살산염 첨가 혈장 (oxalated plasma)) 또는 혈장 분획으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈 공급원은 포유동물 (예를 들어, 인간, 말, 소 및 돼지)로부터 채혈된 혈장을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈 공급원은 돼지 혈장을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈 공급원은 재조합 프로트롬빈이다. 일부 실시 형태에서, 프로트롬빈 공급원은 바이러스 불활성화 처리에 적용된다. 예를 들어, 상기 공급원은 용매/표면활성제(solvent/detergent, SD) 처리 혈장이다.
"용매 표면활성제 (SD) 바이러스 불활성화 처리"는 전형적으로 외피보유(enveloped) 바이러스 또는 지질 코팅 바이러스의 지질 외피를 파괴하여 그것을 불활성화하는 과정을 지칭한다. 상기 처리는 표면활성제 (예를 들어, Triton X-45, Triton X-100 또는 폴리소르베이트 80) 및 용매 [예를 들어, 트라이(n-부틸) 포스페이트 (TnBP), 다이- 또는 트라이알킬포스페이트]의 첨가에 의해 수행될 수 있다. 지질 코팅 바이러스를 불활성화시키는 데 사용되는 용매-표면활성제 조합은 TnBP와 Triton X-100; 폴리소르베이트 80과 콜산나트륨; 및 기타 조합과 같은 당업계에 공지된 임의의 용매-표면활성제 조합일 수 있다.
사용되는 용매(들) 표면활성제(들)의 농도는, 예를 들어 US5094960A, US4789545A에서 수행된 바와 같이, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 사용되는 용매(들) 표면활성제(들)의 농도는 0.1% 초과의 TnBP와 0.1% 초과의 Triton X-100의 조합일 수 있다. 사용되는 용매(들) 표면활성제(들)의 농도는 1% Triton X-100과 0.3% TnBP의 조합일 수 있다. 그러나, 다른 용매 표면활성제 조합 및 적합한 조건이 당업자에게 명백할 것이다.
일 실시 형태에서, 0.5% Tween-80과 0.15% TnBP가 SD 처리에 사용된다. pH는 7.4 내지 8.6의 범위이다. 상기 용액은 실온에서 1시간 동안 인큐베이션된다.
일 실시 형태에서, 1% Tween-80과 0.3% TnBP가 SD 처리에 사용된다. pH는 7.4 내지 8.6의 범위이다. 상기 용액은 실온에서 6시간 동안 인큐베이션된다.
본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시 형태에서, 지정된 BaSO4 시약의 샘플과 프로트롬빈 공급원을 접촉시키는 단계는 약 1% 내지 약 22% 또는 약 1% 내지 약 10% (w/v)의 BaSO4 시약을 프로트롬빈 공급원 (예를 들어, 채혈 혈장)에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 약 1% (w/v)의 BaSO4 시약이 첨가된다.
일부 실시 형태에서, 지정된 BaSO4 시약에 의한 프로트롬빈 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 가능하게 하는 조건은 pH 7.4 내지 8.6을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조건은 실온 - 예를 들어, 20℃ 내지 25℃ 범위 - 을 포함한다.
BaSO4 시약에 의한 프로트롬빈의 흡착은 배치 방식으로 수행되거나, 또는 BaSO4가 충전된 컬럼에서 수행될 수 있다.
일 실시 형태에서, BaSO4에 의한 프로트롬빈의 흡착은 pH 7.4 내지 8.6에서 2시간 동안 실온, 예를 들어 25℃에서 배치 방식으로 수행된다.
본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시 형태에서, BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계는 BaSO4 시약에 흡착되어 있는 동안의 BaSO4-흡착 프로트롬빈에 대한 것이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 단계 'b' 이후에 그리고 단계 'c' 이전에, BaSO4 시약으로부터 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 적어도 일부를 용리시키는 단계를 추가로 포함하며; BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계는 용리된 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 적어도 일부에 대한 것이다. 이러한 일부 실시 형태에서, BaSO4 시약으로부터 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 적어도 일부를 용리시키는 단계는 pH 6.0 이상 및 pH 7.0 이하에서 용리액과 BaSO4 시약을 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 용리액의 pH는 6.1 이상, 6.2 이상 및 심지어 6.3 이상이다. 일부 실시 형태에서, 상기 용리액의 pH는 6.5 이하, 6.6 이하, 및 심지어 6.7 이하, 또는 약 pH 6.3 내지 6.7이다. 일부 실시 형태에서, 상기 용리액의 pH는 6.3 내지 7.4이다.
일부 실시 형태에서, 상기 용리액은 킬레이팅 염을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 용리액 중의 킬레이팅 염의 농도는 약 0.2% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v) 또는 약 3.0% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 킬레이팅 염은 시트르산나트륨을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 용리액 중의 시트르산나트륨의 농도는 약 0.2% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v) 또는 약 3.0% (w/v) 내지 약 4.4% (w/v)이다.
일부 실시 형태에서, 지정된 BaSO4 시약은 적어도 75% (w/w) (중량/중량)의 BaSO4, 예를 들어 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97.5%, 및 심지어 적어도 88% (w/w)의 BaSO4를 포함하는 시약이다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 설명, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "지정된 BaSO4 시약"은 특정 공급업체의 특정 로트(lot)의 BaSO4 시약을 지칭한다. 따라서, 상이한 지정된 BaSO4 시약들은 상이한 공급업체들에 의해 제공되는 시약이거나 동일한 공급업체에 의해 제공되는 시약의 상이한 로트들일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "응고 촉진 활성"은 혈액 응고의 촉진을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "~를 포함하는", "~를 함유하는", "~를 가지는" 및 이들의 문법적 변형은 명시된 특징, 정수, 단계 또는 성분을 지정하는 것으로 간주되나, 하나 이상의 추가 특징, 정수, 단계, 성분 또는 이들의 군의 추가를 배제하는 것은 아니다. 이러한 용어들은 용어 "~로 이루어진" 및 "~로 본질적으로 이루어진"을 포괄한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 부정 관사 "하나 (a, an)"는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않는 한, "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 ± 10%를 지칭한다.
본 발명의 일부 실시 형태를 첨부 도면을 참고하여 본 발명에 기재한다. 도면과 함께 설명은 본 발명의 일부 실시 형태를 어떻게 실시할 수 있는지를 당업자에게 자명하게 할 것이다. 도면은 예시적인 논의의 목적이며, 본 발명의 기본적인 이해를 위해서 필요한 것보다 더 상세하게 실시 형태의 구조적인 상세 사항을 나타내려는 시도가 아니다. 명확성을 위해서, 도면에 도시된 일부 물품은 축적대로 도시되지 않는다.
도면에서:
도 1은 상이한 공급업체들의 BaSO4 시약들을 사용하여 트롬빈의 생산 규모의 제조 과정 동안 제조된 실규모의 BaSO4-흡착 프로트롬빈 샘플로부터 수득된 용리물의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 도시한다.
도 2는 동일한 공급업체의 BaSO4 시약의 상이한 로트들을 사용하여 제조된, 돼지 혈장으로부터 수득된 용리물의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 3은 상이한 공급업체들의 BaSO4 시약을 사용하여 제조된, 돼지 혈장으로부터 수득된 용리물의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 지정된 BaSO4 시약을 프로트롬빈 흡착제로서 사용하여 프로트롬빈 공급원으로부터 트롬빈을 제조하는 방법뿐만 아니라, 프로트롬빈 공급원과 지정된 BaSO4 시약을 접촉시켜 BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하는 단계, 및 일부 실시 형태에서, 정상적인 포유동물 혈장의 응고 촉진 활성에 대비하여, BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계에 의해, 트롬빈의 제조에 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 교시의 원리, 사용 및 실시는 첨부된 상세한 설명을 참고하여 더욱 양호하게 이해될 수 있다. 상세한 설명을 정독하면, 당업자는 과도한 노력 또는 실험 없이 본 발명을 실시할 수 있다.
적어도 하나의 실시 형태를 자세하게 설명하기 전에, 본 발명은 그것의 응용에 있어서 하기의 기재에서 설명되는 구조의 세부 사항 및 성분의 배열 및/또는 방법에 필수적으로 제한되는 것은 아니라는 점이 이해될 것이다. 본 발명은 다른 실시 형태가 가능할 수 있으며, 다양한 방법으로 실시되거나 수행될 수 있다. 본 발명에 사용된 어법 및 용어는 설명의 목적을 위해서이며, 제한으로서 간주되어서는 안 된다.
실시예
재료 및 방법
재료
하기 표 1에 제시된 바와 같은 BaSO4 시약을 제공하였다:
[표 1]
Figure 112021071401077-pat00001
염화나트륨은 Sigma-Aldrich (Cat# S1679, 분석 등급, 적어도 99.0 중량%)로부터 입수하였다.
시트르산삼나트륨 2수화물은 Sigma-Aldrich (Cat# S1804, 분석 등급, 적어도 99.0 중량%)로부터 입수하였다. 옥살산염 첨가 돼지 혈액 (0.25% (w/w)의 옥살산염 용액을 포함함)은 이스라엘 소재의 Kibbutz Lahav의 도축장으로부터 입수하였다.
BaSO4-흡착 프로트롬빈은 실규모의 트롬빈 생산 과정 중에 수득하였는데 (본 명세서에서 실규모 샘플로도 지칭됨), 여기서는 프로트롬빈 흡착에 사용된 BaSO4를 상기 표 1에서 정의된 BaSO4-시약 A, B1 중 하나로부터 선택하였다.
Tween®-80은 Sigma-Aldrich (Cat#P8074, BioXtra, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노올레이트)로부터 입수하였다.
트라이-n-부틸 포스페이트 (TnBP)는 Merck-Millipore (Cat# 100002, 의약품 등급)로부터 입수하였다.
필터 1.2 μm는 인도 벵갈루루 소재의 Sartorius Stedim India Pvt Ltd. (Cat# Sartopore® 2 300)로부터 입수하였으며, 필터 0.45 + 0.2 μm는 Sartorius Stedim India Pvt Ltd (Cat# Sartopore® 300)로부터 입수하였다.
겔 전기영동용 프리캐스트 (precast) 폴리아크릴아미드 겔은 Bio-Rad Laboratories Inc.로부터 입수하였다 (미니-겔 4 내지 20%는 Cat. #: 456-1096으로 입수하였음).
양의 항 인간 트롬빈은 캐나다 소재의 Affinity Biologicals Inc. (Cat # SAHT-IG)로부터 입수하였다.
항 양 IgG 알칼리성 포스파타제 접합체는 Sigma-Aldrich (Cat # A-5187)로부터 입수하였다.
실시예 1: 용매/표면활성제 (SD) 바이러스 불활성화 혈장의 제조
옥살산염 첨가 돼지 혈액을 얼음 위에 배치하였다. 상기 혈액을 5,000 g (5440 rpm)의 상대 원심력 (rcf)으로 4℃의 온도에서 15분간 원심분리하였다. 혈장이 포함된 상청액을 수집하여, 분액 (300 내지 500 ml)으로 나누고, 필요할 때까지 -30℃에 동결 저장하였다.
SD 처리 혈장 ("SD 혈장")의 제조를 위해, 냉동 저장된 혈장 분액을 37℃에서 대략 1시간 동안 해동시킨 다음, 1.2 μm 필터에 통과시킨 후, 0.45 + 0.2 μm 필터에 통과시켰다. pH 7.4 내지 8.6에서, SD 처리를 위해 0.5% Tween-80 및 0.15% (v/v) TnBP를 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하고, pH를 7.4 내지 8.6으로 모니터링하였다.
실시예 2: 돼지 SD 혈장으로부터 BaSO 4 -흡착 프로트롬빈의 실험실 규모 용리물의 제조
프로트롬빈 공급원으로서 실시예 1에서 전술한 SD 혈장을 표 1에 열거된 지정된 BaSO4 시약의 샘플과 접촉시켰다.
구체적으로는, 표 1에 열거된 6종의 BaSO4 시약 각각에 대해:
(i) BaSO4 (1% w/v) 시약의 샘플을 SD 혈장 단위에 첨가하였다.
(ii) SD 혈장/BaSO4 시약 혼합물을 자석 교반기를 사용하여 25℃에서 2시간 동안 교반하여 (pH 7.4 내지 8.6), BaSO4 시약에 의해 SD 혈장의 프로트롬빈이 흡착되도록 하였다.
(iii) 상기 혼합물을 4℃에서 5,000 g (5,440 rpm)으로 15분간 원심분리하였다.
(iv) 상기 상청액과 침전물 (BaSO4-흡착 프로트롬빈을 포함함)을 분리하고, 필요할 때까지 각 침전물을 -80℃에서 개별 저장하였다.
(v) 사용 전에, 상기 침전물을 실온 (20 내지 25℃)에서 15분 동안 해동시켰다.
(vi) 상기 침전물을 BaSO4:세척 완충액 (w/w)의 비를 1:1.4로 하여 세척 완충액 (78 mM NaCl pH 6.9 내지 7.1)에 재현탁하고, 실온에서 15분 동안 튜브 롤러를 사용하여 혼합하였다.
(vii) 이어서, 세척 완충액의 침전물을 4℃에서 5,000 g (5,440 rpm)으로 15분간 원심분리하고, 상청액을 수집하여, 필요할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 상기 단계를 2회 반복하였다 (즉, 총 3회의 세척을 수행하였음).
(viii) 세척 단계 후, 세척된 침전물 (BaSO4-흡착 프로트롬빈을 포함함)을 BaSO4:용리 완충액 (w/w)의 비를 1:1.4로 하여 용리 완충액 (3% 시트르산나트륨 pH 6.3 내지 6.7)에 재현탁하고, 튜브 롤러를 사용하여 15분 동안 혼합하였다.
(ix) 이어서, 침전물/용리 완충액을 4℃에서 5,000 g (5,440 rpm)으로 15분간 원심분리하였다. 프로트롬빈-함유 용리물을 얼음 위에 놓여진 깨끗한 용기에 수집하고, 상기 용리 단계를 4회 반복하였다 (즉, 총 5회의 용리 사이클을 수행하였음).
(x) 5회 용리 사이클의 용리물 (탈착된 프로트롬빈을 함유함)을 단일 용리물로 합하고, 0.2 μm PVDF 필터를 통해 여과하고, NAPTT 또는 웨스턴 블롯에 의한 시험 시까지 -80℃의 깨끗한 용기에 저장하였다.
실시예 3: 돼지 SD 혈장으로부터 BaSO 4 -흡착 프로트롬빈의 실규모 용리물의 제조
돼지 혈장으로부터의 동결된 프로트롬빈-흡착 BaSO4의 실규모 샘플을 제조하였다.
사용된 BaSO4 시약은 표 1에 정의된 바와 같은 A 및 B1이었다.
SD 처리를 위해 1% Tween-80 및 0.3% TnBP를 사용하여 SD를 수행하였다. pH는 7.4 내지 8.6의 범위였다. 상기 용액을 SD와 함께 24 내지 26℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다.
실규모 샘플에서는, 단계 v를 실험실 규모 샘플의 해당 단계 대신 실행하였으며, 샘플을 단계 x까지 처리하였다.
실시예 4: 용리물의 프로트롬빈 및 트롬빈 함량의 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 검정을 위한 로딩 부피를 계산하고, 잔여 미결합 단백질 및 다른 오염물이 세척 단계 (vi 및 vii)에 의해 제거되었음을 검증하기 위해, 실시예 2 및 실시예 3에서 전술한 바와 같이 수득된 각 용리물 (표 1의 6종의 BaSO4 시약 중 하나에 해당하는 각각의 용리물)의 총 단백질 측정을 뷰렛 방법 (Biuret method)을 사용하여 수행하였다.
각 용리물로부터 더 우수한 단백질 분해능을 수득하기 위해, 용리물 샘플의 단백질을 환원 조건 하에서 SDS-PAGE 구배 미니 프리캐스트 겔 (4% 내지 20%)을 사용하여 분리하였다. 단백질을 상기 겔로부터 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 양의 항 인간 트롬빈, 그리고 2차 항체로서, 알칼리 포스파타제에 접합된 항 양 IgG를 사용하여, 웨스턴 블롯을 수행하였다.
일부 BaSO4-흡착 프로트롬빈 샘플에 트롬빈이 포함되어 있는 것으로 밝혀졌다 (하기 "결과" 섹션 참조).
실시예 5: 용리물의 응고 촉진 활성
돼지 SD 혈장으로부터 제조된 8개의 용리물 (실시예 2의 6개 및 실시예 3의 2개) 각각의 응고 촉진 활성을, 본질적으로 유럽 약전 (2.6.22)에 기재된 바와 같이, 불활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (Non-Activated Partial Thromboplastin Time, NAPTT) 검정을 사용하여 평가하였다. 요약하면, 당업자가 알고 있는 바와 같이, NAPTT 검정은 인지질 (토끼 뇌 세팔린(Rabbit Brain Cephalin))과 칼슘 이온 (CaCl2로서의 것)을 시험 용리물 또는 흡착된 BaSO4-흡착 프로트롬빈 샘플에, 그리고 정상적인 인간 혈장 대조군 [Coagulation Tests 00625의 Unicalibrator 보정용 혈장] (프로트롬빈을 본래 함유함)에 동시에 첨가하는 단계를 포함하며, 칼슘 이온은 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환에 의해 시험 샘플의 응고를 개시한다. 트롬빈은 가용성 피브리노겐을 불용성 피브린으로 전환시킴으로써 혈병 형성을 야기한다. 혈병화 시간은 코어귤로미터 (Coagulometer) (ST ART4 Stago machine)를 사용하여 측정한다.
더욱 구체적으로는, 45 μl의 인간 혈장을 4개의 시험 웰 각각에 첨가하였다. 대조군 샘플의 경우, 45 μl의 TBS/알부민 완충액을 2개의 대조군 웰 각각에 첨가하고, 45 μl의 희석된 시험 샘플을 2개의 추가 대조군 웰 각각에 첨가하였다. 이어서, 토끼 뇌 세팔린 0.02% 용액 45 μl를 4개의 시험 웰 각각에 첨가한 후, 37℃에서 1분간 온화하게 진탕하면서 인큐베이션하여, 웰의 내용물을 혼합하였다. 모든 웰에 0.025 M CaCl2 (37℃에서 사전 인큐베이션됨) 45 μl를 첨가하여 반응을 개시한 후, 혈병화 시간을 측정하였다. 시험 샘플의 혈병화 시간 (단위: 초)을 정상적인 인간 혈장 대조군의 혈병화 시간으로 나눈 값으로 NAPTT 비를 계산하였다.
활성 트롬빈이 확인된 용리물 (실시예 4)의 경우, 혈병화 시간이 정상적인 인간 혈장 대조군보다 실질적으로 짧은 것으로 밝혀졌다. 일부 용리물의 경우, 혈병화가 즉시 이루어진 것으로 밝혀졌다. 일부 용리물의 경우, 혈병화 시간이 450초를 초과하는 것으로 밝혀졌다.
BaSO4 B1 및 B2로부터 생성된 용리물은 과정의 종료 시점에서 고수율의 트롬빈을 제공한 것으로 밝혀졌다.
이들 결과는 NAPTT 검정이 트롬빈 생산에 적합한 BaSO4 시약을 확인하는 데 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 6: 돼지 SD 혈장으로부터 BaSO 4 -흡착 프로트롬빈의 제조
상기 단계 (i) 및 단계 (ii)를 표 1의 6종의 BaSO4 시약 각각에 대해 반복한다.
돼지 SD 혈장으로부터 제조된, 흡착된 BaSO4-흡착 프로트롬빈 샘플의 응고 촉진 활성을 불활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (NAPTT) 검정을 사용하여 평가한다.
결과
웨스턴 블롯 분석
BaSO4 시약 A 및 B1 (표 1)을 사용한 용리물 (실시예 3)의 웨스턴 블롯 분석이 도 1에서 제시되어 있다.
레인(lane) 번호는 하기를 나타낸다:
1 - MW 사다리 (ladder)
2 - 인간 프로트롬빈 표준물
3 - BaSO4 시약 A를 사용하여 수득된 실규모 용리물
4 - BaSO4 시약 B1을 사용하여 수득된 실규모 용리물
5 - 인간 프리트롬빈 2 표준물
6 - 인간 알파 트롬빈 표준물
도 1에서, BaSO4 시약 B1을 사용하여 수득된 실규모 용리물 (레인 4)의 경우, 프로트롬빈에 해당하는 밴드가 명확하게 보인다.
도 1에서, BaSO4 시약 A를 사용하여 수득된 실규모 용리물 (레인 3)의 경우, 프로트롬빈에 해당하는 밴드가 거의 보이지 않는다. 프로트롬빈 중간체 단백질뿐만 아니라 알파 트롬빈에 해당하는 다른 밴드가 분명히 보인다.
BaSO4 시약 A, B1 및 B2 (표 1)를 사용하여 돼지 SD 혈장으로부터 수득된 용리물 (실시예 2)의 웨스턴 블롯 분석이 도 2에 제시되어 있다.
레인 번호는 하기를 나타낸다:
1 - MW 사다리
2 - 인간 프로트롬빈 표준물
3 - BaSO4 시약 A를 사용하여 수득된 용리물
4 - BaSO4 시약 B1을 사용하여 수득된 용리물
5 - BaSO4 시약 B2를 사용하여 수득된 용리물
6 - 인간 알파 트롬빈 표준물
도 2에 제시된 결과는 동일한 제조업체에 의해 공급된 BaSO4의 상이한 로트들을 사용하여 수득된 용리물 (B1 - 레인 4, B2 - 레인 5)이 유사한 밴드 패턴을 나타내었음을 보여준다. BaSO4 시약 A를 사용하여 수득된 용리물 (레인 3)을 참조물로서 진행시켰다.
BaSO4 시약 A, B2, D2, D1 및 C를 사용하여 돼지 SD 혈장으로부터 수득된 용리물 (실시예 2)의 웨스턴 블롯 분석이 도 3에 제시되어 있다.
레인 번호는 하기를 나타낸다:
1 - MW 사다리
2 - 인간 프로트롬빈 표준물
3 - BaSO4 시약 A를 사용하여 수득된 용리물
4 - BaSO4 시약 B2를 사용하여 수득된 용리물
5 - BaSO4 시약 D2를 사용하여 수득된 용리물
6 - BaSO4 시약 D1을 사용하여 수득된 용리물
7 - BaSO4 시약 C를 사용하여 수득된 용리물
8 - 인간 프리트롬빈 2 표준물
9 - 인간 알파 트롬빈 표준물
도 3에 제시된 결과는, 의약품 등급 BaSO4를 사용하여 돼지 SD 혈장으로부터 수득된 용리물 (C - 레인 7, D1 - 레인 6)이 유사한 밴드 패턴을 나타내었음을 보여주는데, 이때 상기 패턴은 프로트롬빈 및 중간체에 해당하는 밴드를 포함한다. 이러한 밴드 패턴은 BaSO4 시약 A를 사용하여 수득된 용리물 (레인 3)과 유사하였다. 백색 표준 등급 BaSO4에 의해 수득된 용리물 ("D2" - 레인 5)은 프로트롬빈에 해당하는 훨씬 더 약한 밴드와 중간체 및 알파 트롬빈에 해당하는 더욱 강한 밴드를 나타내었다. 시약 B2를 사용하여 수득된 용리물 (레인 4)은 가장 강한 프로트롬빈 밴드와 중간체에 해당하는 가장 희미한 밴드를 나타내었다.
NAPPT 검정 결과
[표 2]
Figure 112021071401077-pat00002
BaSO4 시약 A, B1, B2, C, D1 및 D2를 사용하여 수득된 실규모 및 실험실 규모의 용리물에 대한 NAPTT 검정 결과가 표 2에 제시되어 있다.
이들 결과는, 프로트롬빈 공급원에 관계없이, 웨스턴 블롯에 의해 트롬빈이 거의 또는 전혀 없는 것으로 밝혀진 BaSO4 시약 B1 및 B2가 대조군 혈장보다 느린 혈병화를 야기하였다는 것을 보여준다.
이들 결과는 또한, 프로트롬빈 공급원에 관계없이, 웨스턴 블롯에 의해 유의한 트롬빈 함량을 가진 것으로 밝혀진 BaSO4 시약 A가 대조군 혈장보다 빠른 혈병화를 야기하였다는 것을 보여준다.
상이한 BaSO4 시약들을 사용하여 혈장으로부터 수득된 BaSO4-흡착 프로트롬빈을 포함하는 용리물을 웨스턴 블롯을 사용하여 단백질 조성에 대해 분석하고, NAPTT를 사용하여 응고 촉진 활성에 대해 분석하였다.
웨스턴 블롯 분석 결과 (도 1)는 BaSO4 시약 A 및 B를 사용하여 수득된 샘플들의 용리물들 (각각 레인 3 및 레인 4) 사이의 밴드 패턴의 차이를 보여준다. 이들 결과는 시약 A를 사용하여 수득된 샘플의 프로트롬빈이 트롬빈으로의 부분 전환을 거쳤음을 시사한다.
NAPTT 혈병화 검정에서, BaSO4 시약 A를 사용하여 수득된 용리물을 시험하였을 때 혈병이 즉시 형성되었으며, 한편 시약 B를 사용하여 수득된 용리물에서는 심지어 450초 후에도 혈병화가 관찰되지 않았다. 정상적인 인간 혈장은 NAPTT 검정에서 약 200 내지 300초 이내에 혈병이 생산될 것으로 예상되며, 실제로 표 2에 제시된 바와 같이 관찰되었다는 것에 유의해야 한다.
돼지 SD 혈장으로부터 프로트롬빈을 단리하기 위해 그리고 트롬빈을 생산하기 위해, 각종 상이한 BaSO4 시약들을 사용하였다. 의약품 등급 BaSO4 시약 A, C 및 D1은 저급 BaSO4 시약 A 및 D2와 같이, 만족스럽지 못한 결과를 제공하였으며, 한편 일부 의약품 등급 BaSO4 시약 B1 및 B2는 월등한 결과를 제공한다.
이들 결과는, 사용된 특정 BaSO4 시약이 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성 및 트롬빈의 수율에 유의한 영향을 미친다는 것을 보여주었다.
또한, 프로트롬빈 중 적어도 일부가 트롬빈 및/또는 트롬빈 중간체로 전환되는 것으로 나타나 있다. 이들 실험 결과는, 지정된 BaSO4 시약이 프로트롬빈 흡착제로 사용하기에 적합한지 그리고 과정의 종료 시점에서 트롬빈 수율의 증가를 가져오기에 적합한지를 정성적으로 결정하기 위해, 응고 촉진 검정이 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
명확성을 위해서 개별 실시 형태와 관련하여 설명된 본 발명의 소정의 특징부는 또한 단일 실시 형태와 조합하여 제공될 수 있다는 것이 인지된다. 반대로, 간략화를 위해, 단일 실시 형태와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징부는 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위 조합으로 또는 기재된 본 발명의 임의의 다른 실시 형태에 적합한 대로 제공될 수 있다. 다양한 실시 형태와 관련하여 기재된 소정의 특징부는, 실시 형태가 이들 부재 없이 사용될 수 있는 한, 이들 실시 형태의 본질적인 특징부가 아니다.
본 발명은 이의 구체적인 실시 형태와 관련하여 설명되었지만, 다수의 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 자명함이 분명하다. 따라서, 청구범위의 범주에 포함된 모든 이러한 대안, 수정 및 변형을 포함하고자 한다.
본 출원에서 임의의 참고문헌의 언급 또는 인지는 이러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 사용될 수 있음을 허용하는 것으로서 이해해서는 안 된다.
실시예 7: BaSO4 시약으로부터 프로트롬빈의 용리 후의 프로트롬빈의 활성화
BaSO4 A 및 B1 (하기 표에 정의된 바와 같음)으로부터 용리된 프로트롬빈을 하기와 같이 활성화시켰다:
Figure 112021071401077-pat00003
용리된 프로트롬빈 용액을 CaCl2 (6 g/L) 및 글리신 (10 g/L)과 혼합하고, pH를 조절하였다. 다음으로, 상기 용액을 0.22 μM 필터를 통해 여과하고, 20 내지 25℃에서 8시간 동안 인큐베이션한 후, 2 내지 8℃에서 최대 72시간 동안 인큐베이션하였다. 흡착제로서 BaSO4 B1을 사용하여 수득된 트롬빈 수율은 흡착제로서 BaSO4 A를 사용하여 수득된 수율에 비해 약 9배 더 높았다.
본 실시예는 트롬빈 수율을 최대화하기 위해, 실규모 트롬빈 제조 전에 적절한 BaSO4 시약을 선택하는 것이 유리하다는 것을 입증한다.

Claims (19)

  1. 지정된 BaSO4 시약을 프로트롬빈 흡착제로서 사용하여 프로트롬빈 공급원으로부터 트롬빈을 제조하는 방법으로서,
    a. 상기 지정된 BaSO4 시약 및 상기 프로트롬빈 공급원을 제공하는 단계;
    b. 상기 지정된 BaSO4 시약에 의해 상기 프로트롬빈 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 가능하게 하는 조건 하에 상기 지정된 BaSO4 시약의 샘플과 상기 프로트롬빈 공급원을 접촉시켜, BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하는 단계; 및
    c. 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성(pro-coagulant activity)을 평가하는 단계를 포함하며,
    상기 c.의 평가 단계가 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈에 함유된 단백질을 분석함으로써 수행될 때, 트롬빈 제조에 사용하기 위한 상기 지정된 BaSO4 시약의 적합성이, 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 트롬빈 수준이 정상적인 포유동물 혈장의 트롬빈 수준을 초과하지 않는 것에 의해 지시되고,
    d. 프로트롬빈 흡착을 가능하게 하는 조건 하에 적합한 BaSO4를 프로트롬빈 공급원과 접촉시킴으로써, BaSO4-흡착 프로트롬빈을 얻는 단계;
    e. 용리 완충액을 사용하여 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈으로부터 프로트롬빈-함유 분획을 용리시키는 단계; 및
    f. 상기 용리 프로트롬빈-함유 분획을, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환을 가능하게 하는 조건에 적용시켜, 트롬빈을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  2. 프로트롬빈 공급원으로부터의 트롬빈의 제조 시, 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기 위한 지정된 BaSO4 시약의 적합성을 평가하는 방법으로서,
    a. 상기 지정된 BaSO4 시약 및 프로트롬빈 공급원을 제공하는 단계;
    b. 상기 지정된 BaSO4 시약에 의해 상기 프로트롬빈 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 가능하게 하는 조건 하에 상기 지정된 BaSO4 시약의 샘플과 상기 프로트롬빈 공급원을 접촉시켜, BaSO4-흡착 프로트롬빈을 수득하는 단계; 및
    c. 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계를 포함하며,
    상기 c.의 평가 단계가 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈에 함유된 단백질을 분석함으로써 수행될 때, 트롬빈 제조의 과정에서 프로트롬빈 흡착제로서 사용하기 위한 상기 지정된 BaSO4 시약의 적합성이, 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 트롬빈 수준이 정상적인 포유동물 혈장의 트롬빈 수준을 초과하지 않는 것에 의해 지시되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 응고 촉진 활성을 평가하는 단계는 응고 촉진 검정을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 응고 촉진 검정은 기능 검정을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 기능 검정은 혈병화(clotting) 검정인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 혈병화 검정은 NAPTT 검정, APTT 검정 및 프로테아제 발색 검정으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로트롬빈 공급원은 혈장 또는 혈장 분획으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 혈장은 옥살산염 첨가 혈장(oxalated plasma)을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로트롬빈 공급원은 포유동물로부터 채혈된 혈장을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 말, 소 및 돼지로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 지정된 BaSO4 시약에 의한 상기 프로트롬빈 공급원으로부터의 프로트롬빈의 흡착을 가능하게 하는 조건은 pH 7.4 내지 8.6을 포함하는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 지정된 BaSO4 시약의 샘플과 상기 프로트롬빈 공급원을 접촉시키는 단계는, 상기 프로트롬빈 공급원인 상기 채혈 혈장에 1% (w/v) ±10% BaSO4 시약을 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계는, 상기 BaSO4 시약에 흡착되어 있는 동안의 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈에 대한 것인, 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단계 'b' 이후에 그리고 단계 'c' 이전에, 상기 BaSO4 시약으로부터 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 적어도 일부를 용리시키는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 응고 촉진 활성을 평가하는 단계는 상기 용리된 BaSO4-흡착 프로트롬빈의 적어도 일부에 대한 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 BaSO4-흡착 프로트롬빈으로부터 프로트롬빈-함유 분획을 용리시키는 단계는 pH 6.3 내지 7.4 ±10%에서 칼슘 킬레이팅 염의 사용을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 킬레이팅 염은 시트르산나트륨을 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 시트르산나트륨의 농도가 3% (w/v) 내지 4.4% (w/v) ±10%인, 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로트롬빈 공급원은 돼지 혈장을 포함하는, 방법.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 초과의 BaSO4 시약이 평가되는 경우, 프로트롬빈의 흡착에 적합한 BaSO4 시약이 선택되는, 방법.
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