UA126114C2

UA126114C2 - Спосіб лікування захворювання або стану, викликаного вірусом, що належить до сімейства picornaviridae, тіазолідними сполуками

Info

Publication number: UA126114C2
Application number: UAA201809863A
Authority: UA
Inventors: Жан-Франсуа Россінол; Жан-Франсуа Россинол; Марія Габріела Санторо; Мария Габриела Санторо
Original assignee: Ромарк Лебореторіз Ел.Сі.; Ромарк Лебореториз Эл.Си.
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2022-08-17
Also published as: ES2810303T3; EP3436074B1; HRP20201261T1; HK1250945A1; IL280327A; JP2019203014A; US20170281603A1; US20220125767A1; IL262018A; KR102136803B1; AU2017244145A1; CN108289961A; EA036505B1; KR20180125552A; PH12018502058A1; MX2021004464A; HUE050601T2; JP2019510044A; LT3436074T; CA3113354A1

Abstract

Винахід стосується способу лікування захворювання або стану, викликаного вірусом, що належить до сімейства Picornaviridae, або пов'язаного із зазначеним вірусом, який включає введення суб'єкту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить щонайменше один з нітазоксаніду, тізоксаніду або їх фармацевтично прийнятної солі.

Description

(57) Реферат:

Винахід стосується способу лікування захворювання або стану, викликаного вірусом, що належить до сімейства Рісотамігдає, або пов'язаного із зазначеним вірусом, який включає введення суб'єкту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить щонайменше один з нітазоксаніду, тізоксаніду або їх фармацевтично прийнятної солі.

ЕТ Е

ІЗ Бий Ї кс: ШИ Ех оса МЕНОВТ ії г 1. : . Н ї - це РОТА Е | і

Е Еш нина В ща : Ме і

В т : рем Кеш ВОК : т ча 7 5 : ; я ТЕ В

ГУ КЯ пика - їх ; я Шен : -Е ЕЙ п КК мо Й линяння - : ; и КН Модвжкахат ними ї о :

ЕВ. ню яю ЗО оо 5-0 0 ша Зю

Час до початку послаблення симптомів (години)

ОШ07-02072010 т | хтро5т

Бівліна СО іа і57РІ МЯЗІВ 5510 | Ба 5 МК

Р значення відносввя 3 Ж? або

БТіланера

ЗМішкоксона

НО

ПРІОРИТЕТ

Дана заявка просить пріоритет на підставі попередньої заявки на патент США Мо 62/316463, поданої 31 березня 2016 року, повний вміст якої включено в даний опис.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

Дана заявка в цілому відноситься до тіазолідних сполук, більш конкретно до їх застосування для лікування певних вірусних інфекцій.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Спосіб лікування захворювання або стану, викликаного вірусом сімейства Рагатухомігідає або пов'язаного з ним, включає введення суб'єкту, який цього потребує, ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить щонайменше одного з нітазоксаніду, тізоксаніду або їх фармацевтично прийнятної солі, при цьому вказана ефективна кількість являє собою кількість, яка блокує дозрівання глікопротеїну Е вірусу у суб'єкта.

Спосіб лікування захворювання або стану, викликаного вірусом, що належить до сімейства

Рісогпамігідає, або пов'язаного з ним, включає введення суб'єкту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості фФармацевтичної композиції, що містить щонайменше один з нітазоксаніду, тізоксаніду або їх фармацевтично прийнятної солі.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

На ФІГ. 1 представлена таблиця аналізу виживаності за процедурою Каплана-Мейєра для інфікованих респіраторно-синцитіальним вірусом (К5М) пацієнтів, які отримували нітазоксанід і плацебо. ТТЗАЇЇ позначає час до початку ослаблення симптомів (в годинах). Цей графік показує, що з лікуванням нітазоксанідом пов'язане 76-годинне зниження тривалості симптомів (медіана).

На ФІГ. 2 представлений графік виживаності за процедурою Каплана-Мейєра для пацієнтів, інфікованих вірусом, що належить до роду Епіегоміги5 (включаючи ентеровіруси і риновіруси), визначених як єдина причина хвороби, і які отримували лікування а) нітазоксанідом; Б) нітазоксанідом і озельтамівіром; с) озельтамівіром і 4) плацебо.

На ФІГ. З представлений графік виживаності за процедурою Каплана-Мейєра для пацієнтів, інфікованих вірусом, що належить до роду Епіегоміги5 (включаючи ентеровіруси і риновіруси), визначених як єдина причина хвороби, після лікування а) окремо нітазоксанідом або

Зо комбінацією нітазоксаніду і озельтамівіру і 5) окремо озельтамівіром або плацебо.

ФІГ. 4А-В ілюструє противірусну активність нітазоксаніду в інфікованих вірусом Сендай клітинах АОМК. Зокрема, на ФІГ. 4А представлений графік, що показує інгібування вірусу

Сендай в залежності від концентрації нітазоксаніду. На ФІГ. 48 представлені фотографії контролю, необробленого вірусу Сендай і вірусу Сендай, обробленого нітазоксанідом.

На ФІГ. 5 представлені графіки інгібування для вірусу Сендай (5ем) в залежності від концентрації нітазоксаніду для різних кратностей інфекції і різних типів клітин. Дані на ФІГ. 5 показують, що противірусна активність нітазоксаніду в ЗемМм-інфікованих клітинах не залежить від множинності зараження і типу клітин.

На ФІГ. 6 представлені дані 5ХО5-РАСЕ, що демонструють вплив нітазоксаніду на синтез білку зем.

На ФІГ. 7 представлені дані 50О5-РАСЕ і вестерн-блоту, що демонструють вплив нітазоксаніду на синтез білку 5ем-РЕ.

На ФІГ. 8 представлені дані вестерн-блоту, що демонструють виявлення незрілої форми білка ЗеМм-Е в нерозчинній фракції білкових екстрактів АСМК, оброблених нітазоксанідом (МТ2).

На ФІГ. 9 представлені дані вестерн-блоту, що демонструють виявлення незрілої форми білка ЗеМм-Е в нерозчинній фракції білкових екстрактів АСМК, оброблених нітазоксанідом (МТ2).

На ФІГ. 10 представлені фотографії, які свідчать про те, що нітазоксанід пригнічує перенесення глікопротеїну вірусу Хендра (Неу) Е на поверхню клітини.

ФІГ. 11А-С ілюструють інгібування вірусу парагрипу 5ем нітазоксанідом в клітинах АСМК. А,

В. МТ пригнічує реплікацію ЗеМм в умовах одностадійного (А) і багатостадійного (В) росту вірусу. Клітини нирки мавпи АСМК, інфіковані зем, обробляли різними концентраціями МТ2 або носієм відразу після періоду адсорбції вірусу. Вихід вірусу (0) визначали через 24 год (А) або 48 год (В) після інфікування (р.і.) за допомогою титрування гемаглютиніном (праві панелі) і аналізу бляшкоутворення (ліві панелі). Вихід вірусу, виражений в одиницях ГА (ГАО)/мл або БУО/мл, являє собою середнє ж СВ з чотирьох паралельних зразків. " - р «005; р «0,01.

Життєздатність контрольних псевдоіїнфікованих клітин (А) визначали МтТТ-тестом. (С)

Цитопротекторний ефект МТ2 (10 мкг/мл) в зеУ-інфікованих клітинах АСМК через 24 год р...

МТ2 ефективний в інгібуванні реплікації ем в концентраціях, які були не токсичними для клітин-господарів. МТ фактично забезпечував цитопротекторну дію в інфікованих клітинах. бо Фактично інфікування 5ем (3 БУО/клітину) в цілому характеризується великим цитопатичним ефектом, викликаючи зміну форми і розміру клітин і втрату адгезії (Панель С, Зем). Було також виявлено, що обробка МТ2 (10 мкг/мл) на додаток до пригнічення продукування вірусного потомства захищає клітини АСМК від пошкодження, що викликається вірусом (Панель С, зем їх

МТ2). Дані, представлені на ФІГ. 11А-С, схожі з даними, представленими на ФІГ. 4А-В.

На ФІГ. 12 представлені дані, що демонструють інгібування вірусу парагрипу ем нітазоксанідом в альвеолярних клітинах людини А549. Альвеолярні тип-ІІ-подібні клітини людини А5Б49, інфіковані Зем в одностадійних (3 БУО/клітину) і багатостадійних (0,01

БУО/клітину) умовах росту вірусу, обробляли різними концентраціями МТ7 або носія відразу після періоду адсорбції вірусу. Вихід вірусу (0) визначали через 24 год (для одностадійних умов) або 48 год (для багатостадійних умов) р.і. титруванням ГА. Вихід вірусу, виражений у відсотках від необробленого контролю, являє собою середнє х СВ з чотирьох паралельних зразків. "- р 0,05; - рае0,О01.

Противірусна активність МТ72 не залежала від типу клітини. МТ2 фактично також ефективний в альвеолярних тип-ІІ- подібних клітинах людини А5Б49, інфікованих 5еу. Дані, представлені на

ФІГ. 12, схожі з даними, представленими на ФІГ. 5.

На ФІГ. 13 А-В показано вплив нітазоксаніду на синтез білку 5ем. (А) Авторадіографія Г»5|МеїуСув-мічених білків (тривалий імпульс, 18 год, початок через 6 год р.і-) з псевдоінфікованих (Моск) або Зем-інфікованих (Зем) клітин АСМК, оброблених 10 мкг/мл М1Т2, 2,5 мкг/мл тунікаміцином (ТМ) або носієм (С) після адсорбції вірусу. Вірусні білки позначені. (В) Авторадіографія І»5|МеїСув-мічених білків (короткий імпульс, 1 година) через 24 год р.і. з псевдоіїнфікованих або бем-інфікованих клітин, оброблених, як в (А). Зразки з однаковою радісактивністю (права панель, імпульсів в хвилину) або які містили рівну кількість білків (ліва панель, мл), обробляли 5О5-РАСЕ і авторадіографією.

Було виявлено, що основні білки ЗеМм синтезуються у великих кількостях в необроблених клітинах через 24 год р.і. як після тривалих (А, 18 год), так і після коротких (В, 1 год) імпульсів 55|Меї/Сув-мічення; в оброблених МТ клітинах не було виявлено суттєвих змін в синтезі білка ем, за винятком зникнення смуги молекулярної маси приблизно 65-70 кДа, згодом ідентифікованої як зріла ізоформа попередника білка злиття БО (див. ФІГ. 14). Дані, представлені на ФІГ. 13А-В, схожі з даними, представленими на ФІГ. 7.

На ФІГ. 14А-В показано вплив нітазоксаніду на білок злиття Зем. (А) Рівні білка бем-Е були визначені за допомогою вестерн-блоту з використанням моноклонального антитіла БеМм-Е в різний час р.і. в інфікованих 5еМм клітинах АСМК, оброблених 10 мкг/мл М1Т7, 2,5 мкг/мл тунікаміцином (ТМ) або носієм (С). Показаний також псевдоіїнфікований контроль (Моск). Рівні а-тубуліну в тих же зразках показані як контроль навантаження. (В) Радіоавтографія (55|МемСув-мічених білків (тривалий імпульс, 1 год, початок в різний час р.і.) з псевдоінфікованих (Моск) або Зем-інфікованих клітин АСМК, оброблених 10 мкг/мл МТ72 або носієм (С) після адсорбції вірусу. Позначено вірусні білки МР і г.

Результати підтверджують відсутність білка злиття ем в клітинах, оброблених МТ72.

Аналогічні результати були отримані в клітинах, оброблених ТМ. Дані, представлені на ФІГ. 14А-В, схожі з даними, представленими на ФІГ.8.

На ФІГ. 15А-В показано, що нітазоксанід викликає нерозчинність білка 5ем-Е.

Вестерн-блот для бем-Е і В-актину в псевдоінфікованих або Зем - інфікованих клітинах

АСМК, оброблених 10 мкг/мл МТ2, 2,5 мкг/мл тунікаміцином (ТМ) або носієм (С) в присутності (У або за відсутності (-) інгібітору протеасоми бортезомібу (рогіе2отібв) (Ві7, 25 нМ), або інгібітору аутофагії хлорохіну (СО, 20 або 40 мкМ). (А). Показані розчинні фракції клітинних лізатів, екстраговані буфером-В («розчинні») або сумарні лізати клітин з паралельних зразків, вилучених буфером Лемлі для зразків («загальні»). (В) Імуноблот проводили для бБем-Е і р- актину з розчинних і нерозчинних Фракцій екстрактів з цілих клітин, отриманих при екстракції буфером-В з клітин АСМК, оброблених, як зазначено. Нерозчинні фракції обробляли, як описано в розділі «Матеріали і методи». Символами «Ер» позначена більш швидкомігруюча БЕ- форма в оброблених МТ2 клітинах.

Інгібітор протеасом бортезоміб або інгібітор аутофагії хлорохін не запобігали зниженню рівня Е-білка в оброблених клітинах, що вказує на ефект, що не залежить від деградації, опосередкованої протеасомою або аутофагією; замість цього Е-білок був виявлений в нерозчинному стані в оброблених МТ клітинах, що вказує на те, що зміна в процесингу/дозріванні білка може привести до утворення агрегатів Е-білка, присутніх в нерозчинному стані. Дані, представлені на ФІГ. 15А - В, схожі з даними, представленими на ФІГ. 9.

На ФІГ. 16 представлені дані про наявність великих білкових агрегатів ЗеМм-Е в клітинах, 60 оброблених нітазоксанідом.

Імуноконфокальна мікроскопія псевдоіїнфікованих (Моск) і Зем-інфікованих клітин АСМК, оброблених МТ (10 мкг/мл) або носієм протягом 24 годин, помічений антикальнексином (СМХ, зелені) і анти-5ем-Е (червоні) антитілами. Ядра забарвлені БАРІ (синій). Зображення були отримані за допомогою системи конфокального лазерного сканування Оіутри5 БРійоміем/ ЕМ- 1000. Відображається накладання трьох флуорохромів (позначено як «МЕКСЕ») і збільшені зображення (риска 7 мкм).

Дослідження, проведені за допомогою імуноконфокальної мікроскопії, підтверджують наявність великих агрегатів Е-білка в ЕК з клітин, оброблених М1Т72.

На ФІГ. 17 показано, що нітазоксанід пригнічує перенесення глікопротеїну Зем-Е до поверхні клітини.

Рівні Зем-Е глікопротеїнів плазматичної мембрани (червоні) визначали через 24 год за допомогою конфокальної імунофлюоресцентної мікроскопії в зеМ-інфікованих клітинах АСМК, оброблених 10 мкг/мл МТ2 або носієм (ем). Псевдоіїнфіковані (МосК) клітини наведені як контрольні. Ядра забарвлені Хехстом (сині). Зображення були отримані за допомогою системи конфокального лазерного сканування ОІутриз Біпоміеж ЕМ-1000. Показане накладання двох флуорохромів (риска - 10 мкм).

Присутність Е-білка на поверхні клітин-господарів, оброблених МТ7, не виявлена, що підтверджує те, що зміна в процесингу/дозріванні Е-білка запобігає його перенесенню в клітинну мембрану.

На ФІГ. 18А-В показано, що нітазоксанід викликає інсолюбілізацію Е білка вірусу Хендра (Нем) і респіраторно-синцитіального вірусу (КМ).

А. Вестерн-блот для Нем-Б і са-тубуліну клітин Неї а, псевдотрансфекованих або трансфекованих за допомогою конструкції тегів Нем-Е ОВЕ С-НРіад, експресує білок Нем-Е, як описано в розділі «Матеріали і методи», і оброблених 5 мкг/мл МТ2 (С ю), 2,5 мкг/мл тунікаміціном (ТМ) або носієм (С-). В. Вестерн-блот для К5М-Е і а-тубуліну клітин Нега, псевдотрансфекованих (тоск) або трансфекованих за допомогою конструкції тегів ЕЗМ-Е ОВЕ

С-Ріад, експресує білок К5М-Е, як описано в розділі «Матеріали і методи», і оброблених 5 мкг/мл МТ2 (С як), 2,5 мкг/мл тунікаміціном (ТМ) або носієм (С-). А,В. Показані розчинні фракції клітинних лізатів, екстраговані буфером-В («розчинні») або сумарні лізати клітин з паралельних

Зо зразків, вилучених буфером Лемлі для зразків («загальні»), як описано в розділі «Матеріали і методи». Білки Нем-Е і К5М-Е визначали з використанням анти-РГ Ас антитіл. Символами «Ер» позначена більш швидкомігруюча Е-форма в оброблених ТМ клітинах. Е-білок Нем і К5М був в основному виявлений в нерозчинному стані в оброблених МТ2 клітинах, що вказує на те, що, подібно до того, як це відбувається з Е білком 5еуМ, зміна в процесингу/дозріванні білка може привести до утворення агрегатів Е-білка, присутніх в нерозчинному стані.

На ФІГ. 19А-В показано, що нітазоксанід пригнічує перенесення глікопротеїну Нем-Е і ЕЗМ-Е до поверхні клітини.

А. Рівні глікопротеїнів плазматичної мембрани Неу-Е (червоні) визначали через 24 год р.і. за допомогою конфокальної імунофлюоресцентної мікроскопії в непермеабілізованих клітинах

НеГа, псевдотрансфекованих або трансфекованих за допомогою конструкції тегів Нем-Е ОВЕ

С-Ріад, що експресує Нем-Е білок, як описано в розділі «Матеріали і методи», і оброблених 5 мкг/мл МТ2 або носієм. В. Рівні глікопротеїнів плазматичної мембрани К5М-Е (червоні) визначали через 24 год р.і. за допомогою конфокальної імунофлюоресцентної мікроскопії в непермеабілізованих клітинах Не а, нетрансфекованих або трансфекованих за допомогою конструкції тегів Е5М-Е ОВЕ С-Ріад, що експресує КЗМУ-Е білок, як описано в розділі «Матеріали і методи», і оброблених 5 мкг/мл МТ72 або носієм. А, В. Е-білки визначали з використанням анти-

ЕГ АС антитіл (червоні). Ядра забарвлені Хехстом (сині). Псевдотрансфековані (МоскК) клітини наведені як контроль. Зображення були отримані за допомогою системи конфокального лазерного сканування ОІутризх ЕРІйоміежм/ ЕМ - 1000. Показано накладання двох флюорохромів.

Присутність Е-білка визначали на більш низькому рівні на поверхні клітин-господарів, оброблених МТ2, що вказує на те, що, подібно до того, як це відбувається з Е білком 5еу, зміна в процесингу/дозріванні Нем і Е5М Е білка запобігає його переносу до клітинної мембрани.

У випадку інфікування ЕЗМ було виявлено, що нітазоксанід має противірусну активність проти КЗУ-А2 в клітинах Неї а в нецитотоксичних дозах з ІС5О 0,3 мкг/мл і ІС90 0,8 мкг/мл (для отримання детальної інформації про К5М-інфекції див. розділ "Матеріали і методи"). Дані, представлені на ФІГ. 19А-В, схожі з даними, представленими на ФІГ. 10.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Супутні документи

Наступні документи, які включені в даний опис за допомогою посилання, можуть бути 60 корисні для розуміння даного винаходу: патенти США Мо 9351937; 9126992; 9107913; 9023877;

8895752; 8846727; 8772502; 8633230; 8524278; 8124632; 7645783; 7550493; 7285567; 6117894; 6020353; 5968961; 5965590; 5935591; 5886013; 5859038; 5856348; 5387598; публікації заявок на патент США Мо 2015-025768; 2014-0065215; 2012-0294831; 2016-0243087; публікація РСТ Мо

МО2016077420; 9. Віої. Снет. 2009 Осі 23; 284 (43): 29798 - 29808; Апіїміга! Везеагси, 110 (2014): 94-103; Віоспіт Віорпуз Асіа., 2003 ди! 11; 1614 (1): 73-84.

Визначення термінів

Якщо не вказано інакше, однина означає «один або більше».

Використовуваний в цьому документі термін «вірусна інфекція» описує хворобливий стан, при якому вірус вторгається в здорову клітину, використовує репродуктивну систему клітини для розмноження або реплікації і в кінцевому підсумку лізує клітину, що призводить до загибелі клітини, вивільнення вірусних частинок і інфікування інших клітин новоствореним вірусним потомством. Можливим результатом вірусної інфекції також є латентна інфекція деякими вірусами. Гостра вірусна інфекція зазвичай характеризується швидким початком захворювання, відносно коротким періодом симптомів і припиненням протягом декількох днів до декількох тижнів. Це зазвичай супроводжується раннім виробництвом інфекційних віріонів і усуненням інфекції імунною системою господаря. Гострі вірусні інфекції є причиною епідемій хвороб, від яких щорічно страждають мільйони людей. Коли вакцини недоступні або не використовуються, може бути важко контролювати гострі інфекції, оскільки інфікована людина зазвичай заразна ще до того, як захворіє. Це ускладнює боротьбу з гострими інфекціями у великих популяціях і густонаселених районах, таких як коледжі, будинки для людей похилого віку, військові бази або судна. Діти, люди похилого віку і люди з ослабленим імунітетом більш сприйнятливі до ускладнень від цих інфекцій, які зазвичай є самообмежуваними.

Термін «захворювання або стан, викликаний вірусом або пов'язаний з ним» може відноситися до вірусної інфекції, викликаної вірусом, та/або до одного або більше її симптомів, які можуть бути пов'язані з вірусною інфекцією.

Використовуваний в цьому документі термін «лікування та/або запобігання захворюванню або стану, викликаного вірусом або пов'язаного з ним» може включати щонайменше одне з наступного: інгібування реплікації вірусу, інгібування передачі вірусу, запобігання закріплення вірусу в господарі, полегшення або ослаблення симптомів або прогресування зазначеного

Зо захворювання, викликаного вірусом. Лікування вважається терапевтичним, якщо є хоча б одне зі зниження вірусного навантаження, зниження смертності та/або захворюваності, пов'язаної з вказаним захворюванням, зниження прогресування захворювання або більш короткої тривалості захворювання. В окремих випадках реалізації винаходу «лікування та/або запобігання захворювання або стану, викликаного вірусом або пов'язаного з ним» може включати підвищену виживаність серед суб'єктів, уражених захворюванням або станом, викликаним вірусом грипу або пов'язаним з ним, і які отримали лікування активним агентом, таким як тіазолідна сполука, в порівнянні з суб'єктами, ураженими захворюванням або станом, але не отримали лікування активним агентом. У деяких варіантах реалізації цього винаходу «лікування та/або запобігання захворюванню або стану, викликаного вірусом або пов'язаного з ним» може включати в себе зниження вірусного навантаження у суб'єкта, ураженого захворюванням або станом, викликаним вірусом або пов'язаним з ним, при введенні активного агенту. Однак в деяких варіантах реалізації цього винаходу «лікування та/або запобігання захворюванню або стану, викликаного вірусом або пов'язаного з ним», може включати в себе поліпшення або зменшення симптомів або прогресування захворювання, викликаного вірусом.

Опис винаходу

Автори даного винаходу виявили, що деякі тіазолідні сполуки можуть бути ефективними проти вірусів, що належать до сімейств Рісогпамігідає і Рагатухомігідає.

Зокрема, такі сполуки можуть бути корисними для лікування або запобігання захворювання або стану, викликаного вірусом, що належить до сімейств Рісогпамігідає і Рагатухомігідає, або пов'язаного із зазначеним вірусом.

СІМЕЙСТВО ВІРУСІВ РІСОВЕМАМІВІОАЕ

Сімейство Рісогпамійідає являє собою (4)олЛРНК сімейство вірусів. Природними носіями пікорнавірусів можуть бути хребетні, включаючи людей. В даний час в цьому сімействі налічується 50 видів, розділених на 29 родів. Роди сімейства Рісогпамігїідає включають: рід

Арінвпомігих5 (афтовірус), який включає вірус риніту великої рогатої худоби А (Воміпе гпіпйі5 А), вірус риніту великої рогатої худоби В (Воміпе гпіпйі5 В), вірус риніту коней А (Едшіпе гпіпйіб А), вірус ящура; рід Адоатаміги5 (аквамавірус), який включає Адиатаміги5 А; рід Аміпераїйомігив, який включає вірус гепатиту А качок; рід Сагаїоміги5 (кардіовірус), який включає вірус енцефаломіокардіта, тейловірус, косавірус; рід Оісіріміги5, який включає кадіцивірус А; рід бо Епіегоміги5 (ентеровірус), який включає ентеровіруси А-У і риновіруси А-С; рід Егроміги5

(ербовірус), який включає вірус риніту коней В (Едшціпе гпіпйі5 В); рід Нераїйоміги5 (гепатовірус), який включає вірус гепатиту А; рід Кориміги5 (кобувірус), який включає Аїспіміги5 А, АїсВіміги5 В і

Аїспіміги5 С; рід Медгіміги5 (мегривірус), який включає Мегїедгіміги5 А (мелегривірус А), пареховірус людини; вірус Льюнган; рід Різсеміги5, який включає пікорнавірус чорного толстоголовога; рід Заїїміги5, який включає заїїміги5 А; рід Зареїоміги5 (сапеловірус), який включає свинячий сапеловірус, мавпячий сапеловірус і пташиний сапеловірус; рід Зепесаміги5 (сенекавірус), який включає вірус Долини Сенека; рід Тезспомігиз (тешовірус), який включає свинячий тешовірус; рід Тгетоміги5 (тремовірус), який включає вірус пташиного енцефаломієліту. Захворювання, пов'язані з сімейством Рісогамігідає, включають наступні: параліч (не поліомієлітного і поліомієлітного типу), застуду влітку, менінгіт, діарею, викликану ентеровірусами; ящур (великої рогатої худоби), викликаний афтовірусами; міокардит, викликаний кардіовірусами; звичайну застуду, викликану риновірусами; і гепатит, викликаний гепатовірусами. Захворювання, пов'язані з сімейством Рісогпамігідає, включають наступні: параліч (не поліомієлітного і поліомієлітного типу), застуду влітку, менінгіт, діарею, викликану ентеровірусами; ящур (великої рогатої худоби), викликаний афтовірусами; міокардит, викликаний кардіовірусами; звичайну застуду, викликану риновірусами; і гепатит, викликаний гепатовірусами.

Рід Епіегоміги5 (ентеровірус)

Рід ентеровірусів включає наступні дванадцять видів: ентеровірус А, ентеровірус В, ентеровірус С, ентеровірус О, ентеровірус Е, ентеровірус Е, ентеровірус С, ентеровірус Н, ентеровірус У, риновірус А, риновірус В, риновірус С. У цих дванадцяти видах є серотипи: 1) вірус Коксакі: а) серотипи СУ-А2, СУ-АЗ, СУ-А4, СУ-А5, СМ-Аб, СУ-А7, СМ-АВ, СУ-А10, СУ-А12,

СУ-А14 і СУ-А16, виявлені у виду Епіегоміги5 А; 5) серотипи СМ-В1, СУ-В2, СУ-В3, СУ-В4, Су-

В5, СУ-Вб і СУ-А9, виявлені у виду Епіегоміги5 В; с) серотипи СМ-АТ, СМ-А11, СУ-А13, СМУ-А17,

СУ-А19, СУ-А20, СУ-А21, СУ-А22 і СУ-А24, виявлені у виду Епіегоміги5 С; 2) серотипи еховірусу (Еспоміги5) Е-1, Б-2, Б-3, Е-4, Б-5, Е-6, Б-7, Б-9, Б-11, Б-12, Е-13, Е-14, Б-15, Е-16, Б-17, Е-18, Е- 19, Е-20, Б-21, Е-24, Б-25, Б-26, Е-27, Б-29, Е-30, Б-31, Е-32 і Е-33, виявлені у виду Епіегоміги5 В; 3) ентеровірус (Епіегоміги5) а) типи ЕМ-А71, ЕМ-А7б6, ЕМ-А8ВУ, ЕМ-АЗО, ЕМ-АЗ9ЗІ, ЕМ-АЗ2, ЕМ-А114,

ЕМ-А119, 5М19, 543, 5М46 і ВА13, виявлені у виду Епіегоміги5 А; Б) типи ЕМ-В69, ЕМ-В73, ЕМ-

Зо В74, ЕМ-8В75, ЕМ-В77, ЕМ-В878, ЕМ-879, ЕМ-880, ЕМ-В81, ЕМ-882, ЕМ-883, ЕМ-884, ЕМ-В85, ЕМ- вВ86, ЕМ-887, ЕМ-888, ЕМ-893, ЕМ-897, ЕМ-898, ЕМ-В100, ЕМ-В101, ЕМ-В106, ЕМ-8107, ЕМ-В110 і 5А5, виявлені у виду Епіегоміги5 В; с) типи ЕМ-С95, ЕМ-С9б6, ЕМ-С99, ЕМ-С102, ЕМ-С104, ЕМ-

С105, ЕМ-С109, ЕМ-С116, ЕМ-С117 ії ЕМ-С118, виявлені у виду Епіегоміги5 С; 4) типи ЕМ-О68, ЕМ- 070, ЕМ-094, ЕМ-0111 їі ЕМ-0120, виявлені у виду Епіегоміги5 О; е) тип: ЕМ-НІ, виявлений у виду

Епіегоміги5 Н; Її) типи: 5Мб6, ЕМ-О103, ЕМ-У108, ЕМ-У112, ЕМ-2У115 ї ЕМ-У121, виявлені у виду

Епіегомігив .); 4) риновірус людини а) типи НКМ-АТ, НАМУ-А2, НАМУ-А7, НАМ-АВ8, НАУ-А9, НЕАМ-

А10, НАХ-А11, НАХУ-А12, НАХУ-А13, НАМУ-А15, НАМ-А16, НАХУ-А18, НАМУ-А19, НАМУ-Аг20, НАМ-А21,

НАХ-А22, НАХУ-А23, НАМ-Аг24, НАМ-А25, НАМ-А28, НАМУ-А29, НАМ-АЗО, НАМ-АЗІ, НАМ-АЗ2,

НАХУ-АЗЗ, НАУ-АЗ4, НАМ-АЗб, НАМ-АЗ8, НАМ-АЗ9У, НАМУ-А40, НАМ-А41, НАМ-А43, ННАУ-Ада,

НАХУ-А45, НАУ-А46, НАМ-А47, НАМ-А49, НАМ-А5О, НАМ-АбІ, НАМ-А5З, НАМ-АБб4, НАМ-А5Б5,

НАХ-А5б, НАМУ-А57, НАМ-А58, НАМ-А5бО, НАМ-АбО, НАМ-АбІ, НАМ-Аб2, НАМ-АбЗ3, НАМ-АбА,

НАХУ-Аб5, НАМУ-Абб6, НАМ-Аб7, НАМ-Аб8, НАМ-А71, НАМУ-А7З3, НАМ-А74, НАМ-А75, НАМ-А?76,

НАХ-А77, НАМУ-А78, НАМ-АВО, НАМ-АВІ, НАМ-А82, НАМУ-А85, НАМ-АВ88, НАМ-А89, НАМ-АЗО,

НАХУ-АЗ94, НАМ-АЗ5, НАУ-АЗ9б, НАМУ-АЗУВ, НАМ-АТ00, НАМ-АТО1, НАХ-А102 і НКМУ-А103, виявлені у виду КПіпоміги5 А; В) типи НКМ-ВЗ3, НАМ-В4, НАМУ-В5, НАМ-Вб6, НАМ-814, НАМУ-В17, НАМУ-В26,

НАХУ-В27, НАУ-835, НАМ-837, НАМ-842, НАУ-848, НАУ-852, НАМ-В69, НАМ-В70, НАМ-872,

НАХУ-8В79, НАУ-883, НАМУ-884, НАУ-886, НАМУ-891, НАМУ-892, НАМУ-893, НАХМУ-897, і НКМ-899, виявлені у виду МПіпоміги5 В; с) типи НКМ-С1, НАМУ-С2, НАМ-С3, НАМ-С4, НАМУ-С5, НАМ-С6,

НАМХУ-С7, НАМ-С8, НАУ-С9, НАУ-С10, НАМ-С11, НАМУ-С12, НАМ-С13, НАМ-С14, НАУ-С15, НАУ-

С16, НАМ-С17, НАМ-С18, НАМУ-С19, НАУ-С20, НАУ-С21, НАУ-С22, НАМ-С23, НАМУ-С24, НАУ- б2г5, НАМУ-С26, НАМ-С27, НАМУ-С28, НАУ-С29, НАУ-С30, НАМУ-С31, НАМ-С32, НАМУ-С33, НАХ-

Сб34, НАУ-С35, НАМ-С36, НАМ-С37, НАУ-С38, НАУ-С39, НАУ-С40, НАМ-С41, НАМУ-С42, НАУ- бС43, НАМУ-С44, НАУ-С45, НАУ-С46, НАМ-С47, НАУ-С48, НАМУ-С49, НАМ-С50 ї НКМ-С51, виявлені у виду КПіпоміги5 С; 5) серотипи поліовірусу РМ-1, РУ-2 ії РУ-3, виявлені у виду

Епівегомігив б.

Віруси Коксакі в основному пов'язані з ящуром людини. Віруси Коксакі В можуть викликати ознаки і симптоми, схожі на «застуду», але ці віруси також можуть призвести до більш серйозних захворювань, включаючи міокардит (запалення серця); перікардит (запалення оболонки, що вистилає серце); менінгіт (запалення мембран, які з'єднують головний мозок і бо спинний мозок); і панкреатит (запалення підшлункової залози). Еховіруси є причиною багатьох неспецифічних вірусних інфекцій. Вони виявляються в основному в кишечнику і можуть викликати нервові розлади. Звичайними симптомами Коксакі і еховірусу є жар, легкий висип їі помірні хворобливі стани верхніх дихальних шляхів.

Захворювання, викликані вірусами, які належать до роду ентеровірусів, включають, але не обмежуються ними, поліомієліт; поліомієлітоподібний синдром; неспецифічне гарячкове захворювання, яке може характеризуватися одним або більше з таких симптомів: жар, біль у м'язах, біль у горлі, шлунково-кишковий розлад/дискомфорт в області живота, головний біль; септичний менінгіт; хвороба Борнхольма або епідемічна плевродінія, яка може характеризуватися одним або декількома з наступних симптомів: важкий пароксизмальний біль в грудях і животі, жар, нудота, головний біль і блювота; перикардит та/або міокардит, які можуть характеризуватися одним або більше з таких симптомів: жар, задишка і біль у грудях; гострий геморагічний кон'юнктивіт; герпетичну ангіну, яка може характеризуватися одним або більше з таких симптомів: везикулярний висип в порожнині рота і глотки, жар, біль у горлі, нездужання, дисфагія, втрата апетиту, біль в спині і головний біль; ящур.

СІМЕЙСТВО ВІРУСІВ РАВАМУХОМІВІОАЕ

Сімейство Рагатухомігідае являє собою (-олЛРНК сімейство вірусів. Природними носіями параміксовірусів є люди, хребетні і птахи. В даний час в цьому сімействі налічується 36 видів, розділених на 18 родів. Захворювання, пов'язані з сімейством Рагатухомігідає, включають: кір, епідемічний паротит, інфекції дихальних шляхів. Рагатухомігідає ділиться на дві підродини:

Рагатухомігіпае і Рпешитомігіпає. Роди сімейства Рагатухомійїдає включають: рід

Адиарагатухоміги5, який включає параміксовірус атлантичного лосося; рід Амшцаміги5 (авулавірус), який включає пташині параміксовіруси 1-12, гусячий параміксовірус і вірус ньюкаслської хвороби; рід Репаміги5, який включає параміксовірус Фер-де-Ланса; рід Непіраміги5 (хеніпавірус), який включає вірус Хендра, вірус Ніпах і вірус Цедар; рід Могбійїміги5 (морбілівірус), який включає вірус чуми м'ясоїдних, морбілівірус китоподібних, вірус кору, вірус чуми дрібних жуйних тварин, вірус тюленячої чуми, вірус чуми; рід Кезрігоміги5 (респіровірус), який включає вірус Сендай, вірус парагрипу людини типу 1 і вірус парагрипу людини типу 3; рід

Киршиїаміги5 (рубулавірус), який включає вірус епідемічного паротиту, вірус парагрипу людини типу 2 і вірус парагрипу людини типу 4; віруси, подібні параміксовірусу тупаї (ТРММ); рід

Зо Меїарпештомігиз (метапневмовірус), який включає пташиний метапневмовірус «|і метапневмовірус людини; рід Рпештоміги5 (пневмовірус), який включає респіраторно- синцитіальний вірус людини (НК5М), респіраторно - синцитіальний вірус великої рогатої худоби, респіраторно-синцитіальний вірус овець, респіраторно-синцитіальний вірус кіз, вірус пневмонії мишей.

Хеніпавіруси, такі як вірус Хендра, вірус Ніпах і вірус Цедар (Седаг) можуть бути причиною хвороб або навіть смертей домашніх тварин, включаючи коней, котячих, свиней, а також людей.

Сімейство Рагатухомігідає включає віруси парагрипу людини (НРІМ) типів 1-4. НРІМ-1 може бути причиною крупа, також відомого як ларинготрахеобронхіт, який являє собою тип респіраторної інфекції. Інфекція може призвести до набряку трахеї що перешкоджає нормальному диханню і викликає класичні симптоми «гавкаючого» кашлю, стридору і хрипкого голосу. Також можливі жар і нежить. НРІМ-2 також може бути причиною крупа, який викликає інші захворювання верхніх і нижніх дихальних шляхів. НРІМ-3 може бути причиною бронхіоліту і пневмонії. НРІМ-3 може в основному уражати маленьких дітей, таких як діти у віці до 1 року.

Бронхіоліт це запалення бронхіол, найменших повітряних проходів у легенях. Він супроводжується кашлем, хрипами та/або задишкою, які можуть ускладнювати годування деяких дітей. Пневмонія це запальний стан легені, що уражає насамперед мікроскопічні повітряні мішечки, відомі як альвеоли. Типові ознаки і симптоми включають такі (різної тяжкості і в різних комбінаціях): вологий або сухий кашель, болі в грудях, жар і утруднене дихання, в залежності від основної причини.

Вірус Сендай (зеум), також відомий як вірус парагрипу мишей типу 1 або гемаглютинуючий японський вірус (НУМ))), відповідальний за інфекцію дихальних шляхів з високою передачею у мишей, хом'яків, морських свинок, щурів та іноді свиней. Симптоми інфекції, викликаної вірусом

Сендай, включають чхання, згорбленість, пригнічення дихання, виділення порфірину з очей та/або носа, летаргію, втрату ваги і відставання у фізичному розвитку у новонароджених щурів і молодих особин, що вижили, анорексію.

Віруси, що належать до роду Рпешйтоміги5, такі як респіраторно-синцитіальний вірус людини, можуть викликати ряд захворювань, з якими пов'язані респіраторні розлади, які можуть варіюватися від менш важких форм розладів верхніх дихальних шляхів до важкого бронхіоліту або пневмонії. Симптоми таких захворювань можуть включати легкі симптоми, такі як риніт, 60 кашель і зниження апетиту, й більш серйозні симптоми, такі як хрипи, утруднене дихання, жар,

бронхіоліт і пневмонію.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу тіазолідна сполука, така як нітазоксанід та/або тізоксанід, може зменшити тривалість симптомів, викликаних респіраторно- синцитіальним вірусом людини або пов'язаних з ним. Наприклад, тіазолідна сполука, така як нітазоксанід та/або тізоксанід, може зменшувати тривалість симптомів, викликаних респіраторно-синцитіальним вірусом людини або пов'язаних з ним, щонайменше на 12 годин, або щонайменше на 24 години, або щонайменше на 36 годин, або щонайменше на 48 годин, або щонайменше на 60 годин, або щонайменше на 72 години, або щонайменше на 84 години, або щонайменше на 96 годин, або щонайменше на 108 годин, або щонайменше на 120 годин, або щонайменше на 132 години, або щонайменше на 144 години. Наприклад, у деяких варіантах реалізації даного винаходу тривалість симптомів, викликаних респіраторно- синцитіальним вірусом людини або пов'язаних з ним, можна зменшувати на період від 12 годин до 144 годин, або від 24 годин до 132 годин, або від 36 годин до 120 годин, або від 48 годин до 108 годин, або від 60 годин до 96 годин, або від 66 годин до 90 годин, або від 72 годин до 84 годин або на період будь-якого піддіапазону або на значення в межах цих діапазонів.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу вказана тіазолідна сполука може являти собою нітазоксанід (1, див. формулу нижче) або його фармацевтично прийнятну сіль.

Нітазоксанід в Сполучених Штатах схвалений для лікування інфекційного гастроентериту. У деяких варіантах реалізації даного винаходу вказана тіазолідна сполука може являти собою тізоксанід або його фармацевтично прийнятну сіль, яка також наведена нижче.

Аз у м - ек й ї Ш-х --Й і ще І (МТА) Ся ВЗ з і ко н а ях а о М ту

Ї ! й г ! ЖДооотта Я АК то ши: и а: :: Ше ак: н | Ї М км-янях еМм-5055

У деяких варіантах реалізації даного винаходу нітазоксанід і тізоксанід можна застосовувати спільно в комбінації.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу вказана тіазолідна сполука може являти собою КМ-4848, яка являє собою заміщений тіазолід, що має ту ж саму структуру, що й тізоксанід, але містить хлорогруппу замість нітрогрупи, М-(5-хлортіазол-2-іл)-2-гідроксибензамід.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу вказана тіазолідна сполука може являти собою

Зо ВАМ-5038, що являє собою складноефірні проліки ЕМ-4848. АМ-4848 і ЕМ-5038 описані, наприклад, в публікації заявки на патент США Мо 20120294831.

Тіазолідні сполуки можна синтезувати, наприклад, способами, опублікованими в патентах

США Мо 3950351 та 6020353, РСТ УМО2006042195А1 і 052009/0036467А. Інші відповідні тіазолідні сполуки описані в патентах США Мо 7645783, 7550493, 7285567, 6117894, 6020353, 5968961, 5965590, 5935591 і 5886013.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу при застосуванні проти вірусу, що належить до сімейства Рагатухомігідає, вказана тіазолідна сполука, така як нітазоксанід і/або тізоксанід, або ЕМ-4848 і її складний ефір (такий як КМ-5038), може знижувати внутрішньоклітинний рівень зрілого Е-білка вірусу. Наприклад, при застосуванні проти вірусу, що належить до роду

Кезрігоміги5, такого як вірус Сендай, вказана тіазолідна сполука може знижувати внутрішньоклітинний рівень такого вірусного білку. При застосуванні проти вірусу, що належить до роду Рпештоміги5, такого як респіраторно-синцитіальний вірус, вказана тіазолідна сполука може знижувати внутрішньоклітинний рівень такого вірусного білку. При застосуванні проти вірусу, що належить до роду Непіраміги5, такого як вірус Хендра, вказана тіазолідна сполука може знижувати внутрішньоклітинний рівень такого вірусного білку.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу при застосуванні проти вірусу, що належить до сімейства Рісогпамігідає, такого як вірус, що відноситься до роду Епіегоміги5, вказану тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід і/або тізоксанід, можна вводити разом з противірусним агентом прямої дії, інгібуючим реплікацію вірусів, що належать до сімейства Рісогпамігідає.

Противірусні агенти прямої дії включають, але не обмежуються ними, інгібітори ЗС протеази, такі як рупінтривір, піразоли 17 і 18, та інгібітори аналоги нуклеозидів, такі як МК-0608.

Переважно противірусний агент прямої дії вводять в ефективній кількості, яка являє собою кількість, необхідну для досягнення бажаного ефекту, коли зазначений противірусний агент прямої дії застосовують разом з тіазолідною сполукою, такою як нітазоксанід і/або тізоксанід.

Тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід і/або тізоксанід, можна вводити одночасно або послідовно з інгібітором нейрамінідази.

Коли вірус відноситься до роду Епіегоміги5, введення тіазолідної сполуки, такої як нітазоксанід та/або тізоксанід, окремо або разом з противірусним агентом прямої дії, може послаблювати щонайменше один симптом захворювання або стану, викликаного таким вірусом або пов'язаного з ним, симптому яким може бути, наприклад, жар, кашель, біль у горлі, закладеність носа, втома, головний біль, біль у м'язах та/або підвищена температура.

Наприклад, в деяких варіантах реалізації даного винаходу, коли вірус відноситься до роду

Епіегоміги5, введення тіазолідної сполуки, такої як нітазоксанід та/або тізоксанід, окремо або разом з противірусним агентом прямої дії може а) зменшувати жар, викликаний або пов'язаний із захворюванням або станом, викликаним таким вірусом або пов'язаним з ним, і б) послаблювати щонайменше один симптом такого захворювання або стану, яким може бути, наприклад, кашель, біль у горлі, закладеність носа, втома, головний біль, біль у м'язах та/або підвищена температура. У деяких варіантах реалізації даного винаходу, коли вводять тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід, окремо або разом з інгібітором нейрамінідази, таким як озельтамівір, може а) зменшувати жар, викликаний вказаним захворюванням або станом або пов'язаний з ним, і Б) послаблювати щонайменше один респіраторний симптом, викликаний вказаним захворюванням або станом або пов'язаний з ним, і щонайменше один системний симптом, пов'язаний з вказаним захворюванням або станом, при цьому зазначений щонайменше один респіраторний симптом вибраний з кашлю, болю в горлі та/або закладеності носа, і зазначений щонайменше один системний симптом вибраний з втоми, головного болю, міалгії й підвищеної температури.

Термін «сіль» може використовуватися в найширшому сенсі. Наприклад, термін «сіль» включає солі водню й гідроксидні солі з іонами сполуки даного винаходу. У деяких варіантах реалізації даного винаходу «сіль» може позначати підклас, який також називають фармацевтично прийнятними солями, які являють собою солі сполук відповідно до даного винаходу, що мають фармакологічну активність і які не є небажаними ні біологічно, ні будь-яким іншим чином. У всіх варіантах реалізації даного винаходу солі можуть бути утворені з кислотами, наприклад, без обмеження, водень, галогеніди, ацетат, адипат, альгінат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бісульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропіонат, диглюконат, додецилсульфат, етансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, гліцерофосфат, гемісульфат, гептаноат, гексаноат, гідрохлорид, гідробромід, гідройодид, 2-гідроксіетансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталінсульфонат, никотинат, оксалат, тіоціанат, тозилат і ундеканоат. У всіх варіантах реалізації даного винаходу солі можуть бути утворені з основами, наприклад, без обмеження, гідроксид, солі амонію, солі лужних металів, такі як солі літію, натрію і калію, солі лужноземельних металів, такі як солі кальцію, магнію, солі алюмінію, солі з органічними основами, такими як аміак, метиламін, діетиламін, етаноламін, дициклогексиламін, М-метилморфолін, М-метил-О-глюкамін і солі з амінокислотами, такими як аргінін і лізин. Основні азотовмісні групи можуть бути піддані кватернізації за допомогою агентів, включаючи нижчі алкілгалогеніди, такі як метил-, етил-, пропіл- і бутилхлориди, броміди і йодиди; діалкілсульфати, такі як диметил-, діетіл-, дибутил- і діамілсоульфати; довголанцюгові галогеніди, такі як децил-, лаурил-, міристил- і стеарилхлориди, броміди і йодиди; й аралкілгалогеніди, такі як бензил- і фенетилброміди.

Терміни «терапевтично прийнятна сіль» і «фармацевтично прийнятна сіль» при використанні в цьому документі відносяться до сольових і цвітеріоних форм сполук за даним винаходом, які є водорозчинними або диспергуються в воді, придатні для лікування захворювань без надмірної токсичності, подразнення й алергічної реакції, мають доцільне бо співвідношенням вигода/ризик і ефективні для передбачуваного застосування. Солі можна отримувати при кінцевому виділенні й очищенні сполук або окремо шляхом взаємодії відповідної сполуки в формі вільної основи з відповідною кислотою. Типові солі приєднання кислот включають ацетат, адипат, альгінат, І -аскорбат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат (безилат), бісульфат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, диглюконат, форміат, фумарат, гентизат, глутарат, гліцерофосфат, гліколят, гемісульфат, гептаноат, гексаноат, гіпурат, гідрохлорид, гідробромід, гідройодид, 2-гідроксіетансульфонат (ізетіонат), лактат, малеат, малонат, 0 -манделат, мезитиленсульфонат, метансульфонат, нафтиленсульфонат, нікотинат, 2-нафталінсульфонат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, З-фенілпропіонат, фосфонат, пікрат, півалат, пропіонат, піроглутамат, сукцинат, сульфонат, тартрат, І -тартрат, трихлорацетат, трифторацетат, фосфат, глутамат, бікарбонат, паратолуолсульфонат (п- тозилат) і ундеканоат. Крім того, основні групи в сполуках даного винаходу можуть бути кватернізовані метил-, етил-, пропіл- і бутилхлоридами, бромідами і йодидами; диметил, діетил, дибутил і діамілсульфатами; децил, лаурил, міристил і стерилхлоридами, бромідами і йодидами; та бензил і фенетилбромідами. Приклади кислот, які можна застосовувати для отримання терапевтично прийнятних солей приєднання кислот включають неорганічні кислоти, такі як хлористоводнева, бромистоводнева, сірчана і фосфорна, та органічні кислоти, такі як щавлева, малеїнова, бурштинова і лимонна. Солі також можуть бути утворені шляхом координації сполук з іоном лужного металу або лужноземельного металу. Отже, даний винахід передбачає натрієві, калієві, магнієві й кальцієві солі сполук за даним винаходом тощо.

Солі приєднання основ можуть бути отримані при кінцевому виділенні і очищенні сполук шляхом взаємодії карбоксильної, фенольной або аналогічної групи з відповідною основою, наприклад, такою як гідроксид, карбонат або бікарбонат металу, або з аміаком або органічним первинним, вторинним або третинним аміном. Катіони терапевтично прийнятних солей включають літій, натрій, калій, кальцій, магній і алюміній, а також нетоксичні четвертинні амонієві катіони, такі як аміак, тетраметиламоній, тетраеєтиламоній, метиламін, диметиламін, триметиламін, триетиламін, діетиламін, етиламін, трибутиламін, піридин, М,М-диметиланілін, М- метилпіперидин, М-метилморфолін, дициклогексиламін, прокаїн, дибензиламін, М,М- дибензилфенетиламін, 1-ефенамін і М,М'-дибензилетилендіамін. Інші типові органічні аміни, придатні для утворення солей приєднання основ, включають етилендіамін, етаноламін, діеєтаноламін, піперидин та піперазин.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу вказану тіазолідну сполуку можна вводити у вигляді частини фармацевтичної композиції. Фармацевтична композиція може містити, додатково до тіазолідної сполуки, носій, такий як фармацевтично прийнятний носій. Термін «носій» може використовуватися в найширшому сенсі. Наприклад, термін «носій» відноситься до будь-яких носіїв, розріджувачів, допоміжних речовин, змочувальних агентів, буферних агентів, суспендуючих агентів, змащуючих агентів, ад'ювантів, допоміжних основ, систем доставки, емульгаторів, розпушувачів, абсорбентів, консервантів, поверхнево-активних речовин, барвників, ароматизаторів і підсолоджувачів. У деяких варіантах реалізації даного винаходу носій може являти собою фармацевтично прийнятний носій, термін більш вузький, ніж носій, оскільки термін «фармацевтично прийнятний носій» означає нетоксичний носій, який був би придатним для використання у фармацевтичній композиції. Фактичні рівні доз активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях можуть варіюватися так, щоб вводити кількість активної сполуки (сполук), яка є ефективною для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта.

Вибраний рівень дози може залежати від активності тіазолідної сполуки, способу введення, тяжкості стану, що підлягає лікуванню, та стану і попередньої історії хвороби пацієнта, що підлягає лікуванню. Проте фахівець в даній галузі техніки може призначити початкові дози сполуки (сполук) на нижчому рівні, ніж потрібно для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово збільшувати дозування до досягнення бажаного ефекту. При бажанні ефективну добову дозу можна розділити на кілька доз для цілей введення, наприклад, від двох до чотирьох доз на добу. Однак варто розуміти, що питомий рівень дози для будь-якого конкретного пацієнта може залежати від множини факторів, включаючи масу тіла, загальний стан здоров'я, дієту, час і шлях введення і комбінацію з іншими терапевтичними агентами, а також ступеню тяжкості стану або захворювання, що підлягає лікуванню.

Фармацевтичні композиції можна вводити системно, наприклад, в пероральній композиції, такій як тверда пероральна композиція. Наприклад, вона може бути у фізичній формі порошку, таблетки, капсули, пастилки, гелю, розчину, суспензії, сиропу і т.п. У деяких варіантах реалізації даного винаходу зазначена фармацевтична композиція може бути у формі композиції, описаної в патентах США Мо 8524278 і 9351937. Така композиція може містити, наприклад, частину з бо контрольованим вивільненням, що містить тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід; і частину з негайним вивільненням, що містить тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід. Ці композиції можна вводити у вигляді разової дози або в декількох дозах, які вводять в різний час.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу загальна кількість тіазолідної сполуки, такої як нітазоксанід та/або тізоксанід, в композиції може становити від близько 60 до 7595 за масою композиції. Композиція може бути приготовлена для негайного вивільнення, контрольованого вивільнення або уповільненого вивільнення. Зазначені композиції можуть містити одну або кілька додаткових фармацевтично прийнятних добавок або допоміжних речовин. Ці допоміжні речовини є терапевтично інертними інгредієнтами, які добре відомі в даній галузі.

Використовуваний в цьому документі термін «інертний інгредієнт» може відноситись до терапевтично інертних інгредієнтів, які добре відомі у фармацевтичній промисловості, і які можна застосовувати окремо або в різних комбінаціях, та які включають, наприклад, розріджувачі, розпушувачі, зв'язуючі речовини, суспендуючі агенти, ковзкі речовини, змащувальні речовини, наповнювачі, покривні агенти, солюбілізуючі агенти, підсолоджувачі, барвники, ароматизатори та антиоксиданти. Див., наприклад: РКетіпдіоп: Те Зсієпсе апа

Ргасіїсе ої Рнаптасу 1995, єдіїєд Бу Е. МУ. Мапіп, Маск Рибіїзпіпа Сотрапу, 191п єдійоп, Еавіоп,

Ра.

Приклади розріджувачів або наповнювачів включають, але не обмежуються ними, крохмаль, лактозу, ксиліт, сорбіт, кондитерський цукор, пресований цукор, декстрати, декстрин, декстрозу, фруктозу, лактит, маніт, сахарозу, тальк, мікрокристалічну целюлозу, карбонат кальцію, кальцій фосфатний двоосновний або триосновний, дикальцийфосфат дегідрат, сульфат кальцію і т.п.

Кількість розріджувачів або наповнювачів може знаходитися в діапазоні від приблизно 2 до приблизно 1595 за масою всієї композиції.

Приклади дезінтегруючих агентів включають, але не обмежуються ними, альгінову кислоту, метакрилову кислоту ДВБ, поперечно-зшитий ПВП, мікрокристалічну целюлозу, кроскармелозу натрію, кросповідон, полакрилін калію, натрій крохмальгліколят, включаючи кукурудзяний або маїсовий крохмаль, прежелатинізований крохмаль і т.п. Кількість дезінтегруючого агенту (дезінтегруючих агентів) зазвичай становить від приблизно 2 до приблизно 1595 за масою всієї композиції.

Зо Приклади зв'язуючих речовин включають, але не обмежуються ними, крохмалі, такі як картопляний крохмаль, пшеничний крохмаль, кукурудзяний крохмаль; мікрокристалічна целюлоза; целюлози, такі як гідроксипропілцелюлоза, гідроксіетилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза (НРМС), етилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза натрію; природні камеді, такі як аравійська камедь, альгінова кислота, гуарова камедь; рідка глюкоза, декстрин, повідон, сироп, поліетиленоксид, полівінілпіролідон, полі-К-вініламід, поліетиленгліколь, желатин, поліпропіленгліколь, трагакант і т.п. Кількість зв'язуючої речовини (зв'язуючих речовин) становить від приблизно 0,295 до приблизно 1495 за масою всієї композиції.

Приклади ковзких речовин включають, але не обмежуються ними, діоксид кремнію, колоїднийбезводний діоксид кремнію, трисилікат магнію, триосновний фосфат кальцію, силікат кальцію, силікат магнію, колоїдний діоксид кремнію, порошкоподібну целюлозу, крохмаль, тальк тощо. Кількість ковзкої речовини (ковзких речовин) становить від приблизно 0,0195 до приблизно 0,395 за масою всієї композиції.

Приклади змащувальних речовин включають, але не обмежуються ними, стеарат магнію, стеарат алюмінію, стеарат кальцію, магнію цинку, стеаринову кислоту, поліетиленгліколь, гліцерилбегенат, мінеральне масло, стеарилфумарат натрію, тальк, гідрогенізовану рослинну олія тощо. Кількість змащувальної речовини (змащувальних речовин) становить від приблизно 0,295 до приблизно 1,095 за масою всієї композиції.

Зазначені композиції можуть містити зв'язуючу речовину, яка являє собою низьков'язкий полімер. Приклади низьков'язких полімерів включають, але не обмежуються ними, низьков'язкі полімери гідроксипропілметилцелюлози, такі як ті, що комерційно доступні від компанії Юом/

Спетіса! під торговою назвою МейПосе! "М (наприклад, МеїШосеї! ЕБОЇМ"М, Меїйпосе! КІО0ОІ МАМ ї

Меїнпосе! ЕБОЇ МАМ) ї низьков'язкі полімери гідроксіегилцелюлози. Низьков'язкий полімер зазвичай присутній в кількості від приблизно 10 до приблизно 20 95, або від приблизно 1095 до приблизно 1595, або переважно приблизно 1295 від загальної маси всієї композиції або в варіантах реалізації даного винаходу з частинами з контрольованим вивільненням і негайним вивільненням низьков'язкий полімер в частині з контрольованим вивільненням зазвичай присутній в кількості від приблизно 1595 до приблизно 2095, переважно приблизно 1895 за масою частини з контрольованим вивільненням. бо Зазначені композиції можуть додатково містити матеріал покриття. Матеріали покриття зазвичай присутні у вигляді зовнішнього шару на лікарській формі, який покриває композицію повністю. Наприклад, у деяких варіантах реалізації даного винаходу зазначена лікарська форма являє собою таблетку для перорального прийому, в якій частина з контрольованим вивільненням становить перший шар таблетки, а частина з негайним вивільненням становить другий шар, який наносять поверх першого шару з отриманням таблетки з ядром. У таких варіантах реалізації, наприклад, матеріал покриття може знаходитися у вигляді зовнішнього шару покриття, який наносять поверх таблетки з ядром. Матеріал покриття зазвичай становить від приблизно 1 до приблизно 595 за масою композиції і може містити гідроксипропілметилцелюлозу та/або поліетиленгліколь і одну або більше допоміжних речовин, вибраних з групи, що включає покривні агенти, непрозорі речовини, засоби, що маскують смак, наповнювачі, поліруючі агенти, барвники, агенти, що запобігають прилипанню тощо. Приклади речовин плівкових покриттів і способи їх застосування добре відомі фахівцям в даній галузі техніки.

Вказану композицію, яка містить тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід, можна вводити протягом періоду часу, потрібного для того, щоб ефективно лікувати захворювання або стан, викликаний вірусом, що належить до сімейства Рісогпаміїдає або пов'язаного з ним, таким як вірус, що відноситься до роду Епіегоміги5 або вірусом, що належать до сімейства Рагатухомігідає. Зазначені композиції можна застосовувати в декількох відповідних дозах і режимах. У деяких варіантах реалізації даного винаходу введення можна проводити протягом періоду часу від приблизно З днів до приблизно 104 тижнів. У деяких варіантах реалізації даного винаходу введення можна проводити протягом періоду часу більше 104 тижнів і можливо навіть необмежений час. Відповідні режими може визначати лікар.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу введення тіазолідної сполуки, такої як нітазоксанід та/або тізоксанід, можна починати протягом 24 годин, або протягом 36 годин, або протягом 48 годин, або протягом 60 годин, або протягом 72 годин, або протягом 96 годин з моменту початку у пацієнта, такого як людина, щонайменше одного симптому захворювання або стану, викликаного вірусом, що належить до сімейства Рісогпамігідає або пов'язаного з ним, таким як вірус, що належить до роду Епіегомігих5, або вірусом, що належить до сімейства Ра гатухомігідає. Наприклад, для вірусу, що належить до роду Епіегоміги5, введення тіазолідної сполуки, такої як нітазоксанід та/або тізоксанід, можна починати протягом 24 годин, або протягом 36 годин, або протягом 48 годин, або протягом 60 годин, або протягом 72 годин, або протягом 96 годин з моменту початку у пацієнта, такого як людина, щонайменше одного симптому захворювання або стану, викликаного таким вірусом або пов'язаного з ним, при цьому симптом може являти собою, наприклад, жар, кашель, біль у горлі, закладеність носа, втому, головний біль, міалгію і підвищену температуру.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу добова доза тіазолідної сполуки, такої як нітазоксанід та/або тізоксанід, яку вводять людині, може становити від 100 мг до 1300 мг, або від 200 мг до 1200 мг, або від 250 мг до 1100 мг, або від 300 мг до 1000 мг, або будь-яке значення дози або піддіапазон в цих межах. Приблизні значення дози включають 100 мг, 200 мг, 300 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 700 мг або 800 мг.

У деяких варіантах реалізації даного винаходу тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід, можна вводити щонайменше протягом 2 днів, або щонайменше протягом З днів, або щонайменше протягом 4 днів, або щонайменше в протягом 5 днів або щонайменше протягом б днів. У деяких варіантах реалізації даного винаходу тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід, можна вводити протягом періоду від 2 до 14 днів, або від З до 10 днів, або від 4 до 7 днів, або будь-якого значення або піддіапазону в цих межах. В окремих випадках реалізації винаходу тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід, можна вводити протягом 5 днів. Добова доза тіазолідної сполуки, такої як нітазоксанід та/або тізоксанід, може становити від 300 мг до 900 мг, або від 400 мг до 800 мг, або від 500 мг до 700

БО мг, або будь-яке значення дози або піддіапазон в цих межах. Приблизні значення дози включають 300 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 700 мг або 800 мг. Зазначену тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід, можна вводити один, два або три рази на добу. У певних випадках 600 мг нітазоксаніду та/або тізоксаніду можна вводити два рази на добу. Зазначену тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід, можна вводити разом з противірусним агентом прямої дії проти Рісогпамігідае, таким як рупінтривір або МК-0608, або противірусним агентом прямої дії проти респіраторно-синцитіального вірусу, таким як інгібітор злиття, 55-5806.

Доза зазначеного противірусного агента прямої дії може варіюватися. Зазначений противірусний агент прямої дії, такий як рупінтривір, МК-0608 або 55-5806, можна вводити один раз, два або три рази на добу. У деяких випадках 600 мг нітазоксаніду та/або тізоксаніду можна бо вводити два рази на добу разом з ефективною кількістю зазначеного противірусного агента прямої дії, що вводиться два рази на добу.

Тіазолідну сполуку можна вводити суб'єкту, ураженому вірусом, що належить до сімейства

Рісогпамігідає, таким як вірус, що належить до роду Епіегоміги5, або вірус, який належить до сімейства Рагатухомігідає. Такий суб'єкт може являти собою тварину, включаючи людину.

Переважно тіазолідну сполуку, таку як нітазоксанід та/або тізоксанід, вводять суб'єкту, ураженому вірусом, що належить до сімейства Рісогпамігдає, таким як вірус, що належить до роду Епіегоміги5, або суб'єкту, ураженому вірусом, що належить до сімейства Рагатухомігідає, в ефективній кількості, що може означати кількість, необхідну для досягнення бажаного ефекту.

Варіанти реалізації даного винаходу, описані в цьому документі, додатково проілюстровані наступними робочими прикладами, без обмеження.

ПРИКЛАДИ

Сімейство Рагатухоміїйдає включає множину важливих вірусних патогенів людини, включаючи кір, епідемічний паротит, парагрип, КМ (респіраторно-синцитіальних вірус), метапневмовіруси і хеніпавіруси, які викликають деякі з найбільш смертоносних загальних хвороб тварин і людини. Відсутність ефективної противірусної терапії підкреслює необхідність нових лікарських засобів, ефективних проти цих вірусів. Раніше було показано, що нітазоксанід (МТ2), безпечний, орально біодоступний тіазолід, ліцензований в США для лікування інфекцій

Стуріозрогідіит раг/ит і Сіагаїіа Іатбііа, має противірусну активність по відношенню до вірусів грипу. Автори в цьому документі досліджували активність МТ2 і клас тіазолідів другого покоління (50), КМ-4848 і КМ-5038, у відношенні інфекції Рагатухомійїдае іп мйко з використанням вірусів Сендай (5ем) і К5М-А2 як моделей, і досліджували механізм противірусної дії. Вихід вірусу визначали титруванням гемаглютиніном і аналізом інфекційності в клітинах мавпи і людини; життєздатність клітин визначали за допомогою МтТТ-тесту.

Синтез/дозрівання вірусного білка було охарактеризоване за допомогою 5ОБ/РАСЕ- авторадіографії після мічення (5|метіоніном, імунопреципітації та/або ендогенного розщеплення, а також методом імунофлуоресценції і вестерн-блоту в інфікованих клітинах або в клітинах, тимчасово трансфекованих РІ Асб-міченим білком злиття (Р) вірусу Хендра (Нем).

МТ2 ї 50 показали чудову противірусну активність у відношенні 5ем, при цьому вони знижували вихід вірусу дозозалежно від 5І в діапазоні від » 50 до » 625 в залежності від МОЇ

Зо (множинності зараження), і захищали клітину-господаря від пошкодження, викликаного вірусом.

Тіазоліди не впливали на проникнення вірусу і не викликали загальне пригнічення синтезу вірусного білка, але інгібували дозрівання і внутрішньоклітинну транслокацію вірусних НМ і є глікопротеїнів. Зокрема, МТ2 також викликав зниження внутрішньоклітинних рівнів Е-білка, що забезпечує критичний вплив на злиття клітин та інфекційність віріона. Цей ефект не був викликаний деградацією білка за рахунок системи убіквітин-протеасома або аутофагії, оскільки їх не вдалося «врятувати» за допомогою обробки інгібітором протеасом бортезомібом або інгібітором аутофагії хлорохіном. Замість цього було виявлено, що ем Е білок присутній в нерозчинному стані в клітинах, оброблених МТ7, що вказує на те, що викликаний лікарськими засобами дефект дозрівання буде приводити до агрегації Е білка. Що цікаво, тіазоліди аналогічним чином впливали на Е-білок вірусу Хендра в клітинах, тимчасово експресуючих Нем-

Е з РГАС-мітками за відсутності вірусної інфекції що дозволяє припустити механізм, опосередкований клітинами. Результати показують, що МТ72 ефективний проти інфекції параміксовірусу, діючи після входу вірусу за допомогою нового механізму, націленого на вірусні глікопротеїни. Лікування МТ2 також було ефективним проти К5У, що вказує на загальний ефект вказаного лікарського засобу на членів сімейства Рагатухомігдає. Результати дослідження представлені на ФІГ. 4-19.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Культура клітин, лікування та трансфекції. Епітеліальні альвеолярні тип-ЇЇ подібні клітини людини А5Б49, клітини карциноми шийки матки Нега і клітини нирок африканської зеленої мавпи (АОМК, клітинна лінія З/КС) вирощували при температурі 37 С в атмосфері 596 СО02 в середовищі ЕРМІ (сірсо-Іпмігодеп, Сагієрад, СА, США) (АСМК, А5Б49) або середовищі ОМЕМ (Сірсо-Іпийгодеп, Сагієрай, СА, США) (Неіа), доповненому 1095 фетальною телячою сироваткою (ЕС5), 2 мМ глутаміну і антибіотиками. Нітазоксанід (МТ), тізоксанід (ТІ) (Вотагк

І арогасогієв, І С), інгібітор глікозилювання тунікаміцин (ТМ), інгібітор протеасоми бортезоміб і інгібітор аутофагії хлорохін (Зідта-Аїагісп, Зі. І оці5, МО, США), розчинені в вихідному розчині

ДМСО (25 мг/мл), розбавляли в культуральному середовищі й додавали до інфікованих клітин відразу після одногодинного періоду адсорбції, якщо не вказано інакше. Сполуки підтримували в середовищі протягом усього експерименту. Контролі отримували рівні кількості носія ДМСО, що не впливало на життєздатність клітин або реплікацію вірусу. Кожну концентрацію кожної бо сполуки тестували в двох повторах і кожен експеримент повторювали щонайменше двічі. Для експериментів по трансфекції напівконфлюентні моношари клітин Неїа транзиторно трансфекували за допомогою конструкції на основі РСМУМ, що містить ген, який експресує Б- білок респіраторно-синцитіального вірусу людини (К5У, підтип А, штам Аг), пов'язаний з РІ АС- тегом (тег Е5М-Е ОВЕ С-Ніад, Зіпо Віоіодісаї! Іпс.), конструкції на основі РСМУ, що містить ген, який експресує Е-білок вірусу Хендра (Нем), пов'язаний з РІ Асб-тегом (тег Нем-Е ОВЕ С-Ріад, 5іпо Віоіодіса! Іпс.) або вектором рсрМАЗ як контроль. Трансфекції проводили з використанням реагенту трансфекції |(еї(РКІМЕ (Роїурієиз ігапеТесійоп) відповідно до інструкцій виробника.

Цитотоксичність. Життєздатність клітин визначали за допомогою аналізу перетворення 3- (4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-біфенілтетразоліум броміду (МТТ) в формазан МІ (5ідта-Аїйатси,

ЗІ Гоціз5, МО, США). Для аналізу МТТ відновлений МТТ (формазан) екстрагували з клітин шляхом додавання 100 мл кислого ізопропанолу, що містить 1095 Тритону Х-100, і вимірювали абсорбційну здатність формазану в зчитувачі мікропланшетів ЕГІЗА на двох різних довжинах хвиль (540 і 690 нм). 5095 летальну дозу (1050) розраховували з використанням програмного забезпечення Ргізт 5.0 (сгарп-Рай Зоймаге Іпс., Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Мікроскопічне дослідження псевдоінфікованих або інфікованих вірусом клітин проводили щодня, щоб виявити індукований вірусом цитопатичний ефект і можливі морфологічні зміни та/або цитопротекцію, якої надає лікарський засіб. Мікроскопічні дослідження проводили з використанням мікроскопу

Ї віса ОМ-ЇЇ,, ї зображення були отримані за допомогою камери І еіса ОС 300 з використанням програмного забезпечення І віса Ітаде-Мападег500.

Підготовка вірусу, зараження і титрування. Вірус Сендай (зем) вирощували в алантоїдній порожнині 10-денних яєць з ембріонами, що розвиваються. Через 48 год при температурі 37 "С алантоїдну рідину збирали і центрифугували при 5000 об/хв протягом 30 хвилин для видалення клітинного дебрису, а титри вірусу визначали за допомогою титрування гемаглютиніном (ГА) та аналізу бляшкоутворення відповідно до стандартних процедур (Вегпазсопі еї аї., 2005, Ріса еї а!., 2000).

Для вірусної інфекції конфлюентні моношари клітин АСМК були інфіковані Зем протягом 1 години при температурі 37 "С при множинності зараження (МОЇ), що становить З БУО (бляшкоутворююча одиниця)/клітину, якщо не вказано інакше. Аналогічні умови були використані для інфікування клітин Аб549 людини. Після періоду адсорбції вірусний інокулят

Зо видаляли, і моношари клітин три рази промивали фосфатно-буферним сольовим розчином (РВ5). Клітини утримували при температурі 37 "С в культуральному середовищі КРМІ 1640, що містить 295 фетальної телячої сироватки. Для багатостадійний кривих росту вірусів конфлюентні моношари АСМК/А549 інфікували 5ем протягом 1 години при температурі 37 "С при МОЇ (множинності зараження) 0,01 БУО/клітину. Після періоду адсорбції вірусний інокулят видаляли, і моношари клітин три рази промивали фосфатно-буферним сольовим розчином (РВ5). Клітини утримували при температурі 37 " С в культуральному середовищі КРМІ 1640, що містить 0,595 альбуміну бичачої сироватки (ВЗА) і трипсин (1 мкг/мл), оброблений |І-1- тозиламід-2-фенілетилхлорметилкетоном (ТРСК) (5ідта-Айагісп). Вихід вірусу визначали через 24 і 48 годин після інфікування (р.і.) за допомогою титрування ГА або аналізу бляшкоутворення, як описано раніше (Козвзідпої еї а!І., 2009). Для аналізу бляшкоутворення готували серійні 10 кратні розведення вірусу й інокулювали в конфлюентні моношари АСМК-клітин в 35-мм планшетах (Согпіпо, Мем/ Могк, МУ, США). Через 1 год при температурі 37 "С інокулят видаляли і клітини тричі промивали РВ5 перед додаванням КРМІ, що містить 0,590 В5БА, 1 мкг/мл трипсину, обробленого ТРСК, і 0,595 агарози беаРіадие (Гопла). Через 72 години при температурі 37 "С покриваючий шар видаляли і клітини фіксували 496 параформальдегідом в

РВЗ і забарвлювали 195 кристалічним фіолетовим (Зідта-Аїагісп). ІС50 (5095 інгібуючої концентрації) і ІСеО (9095 інгібуючої концентрації) зазначених противірусних сполук розраховували з використанням програмного забезпечення Ргібт 5.0.

Пневмовірус людини К5МУ-А2 (респіраторно-синцитіальний вірус, штам Аг) було надано лікарем Г. Томсом, Університет Ньюкасла, Ньюкасл-апон-Тайн, Великобританія. Для К5М- інфекції конфлюетні моношари клітин НегГа інфікували протягом 1 години при температурі 37 26 допомогою КЗМ-А2 при МОЇ 1 ТСІЮО 50 (5095 -ва інфекційна доза в тканинній культурі)/клітину.

Вихід К5М-А2 оцінювали шляхом підрахунку кількості індукованих вірусом синцитій через 48 годин р.і., при визначенні аналізом імунофлюоресценції (ІЄ) після маркування моноклональним антитілом, специфічним для білка злиття (Е-білка) КЗМ (анти-Е 1ЕЗ антитіло, Мігагот Ч.,

Ньюкасл-апон-Тайн, Великобританія). Для аналізу ІЄ неінфіковані і К5МУ-інфіковані моношари клітин НеГа фіксували 496-ним параформальдегідом (495 в РВ5) протягом 30 хв при кімнатній температурі. Фіксовані клітини інкубували з анти-Е ТЕЗ антитілом протягом 1 години при кімнатній температурі. Незв'язане антитіло видаляли промиванням в РВ5, потім інкубували з бо ЕІТО-кон'югованим антимишачим антитілом протягом 1 години при кімнатній температурі. Після забарвлення клітини досліджували на флюоресцентному мікроскопі І еіса ОМ-ІІ, обладнаному фільтрами збудження в УФ області спектру. Фотографії були отримані за допомогою камери

Ї віса О0С-300 з використанням програмного забезпечення І віса Ітаде-Мападег500. Для кожного зразка були підраховані щонайменше 150 синцитій. Було виявлено, що нітазоксанід має противірусну активність проти К5М-А2 в не цитотоксичних дозах, з ІС50 0,3 мкг/мл і ІС90 0,8 мкг/мл.

Метаболічне маркування, аналіз синтезу білка і вестерн-блот. Псевдоінфіковані (тосК) або інфіковані вірусом клітини були помічені 1ОмкКі/мл (3551|-метіонінцистеїну (І25|-Меї/Сув, Ведімие

Рго-Міх 55 суміш для мічення клітин іп міо, ЗЕ Неайсаге) протягом зазначених періодів після 30 хвилин витримування на мінімальному середовищі без метіоніну/цистеїну. І9355|-МеуСувз визначали після клітинного лізису в буфері радіоїмунного осадження (КІРА) (150 мМ Масі, 10

ММ Ттіз-НСІ, рН 7,5, 4 мМ ЕДТА, 195 Ттйоп Х-100, 600 мМ КС), що містить 1 мМ фенілметилсульфонілфториду (РМ5БЕ) і суміш інгібіторів протеази (РІС; Арріїей бсіепсе Коспе,

Репрегу, Німеччина). Зразки з однаковою радіоактивністю або такі, що містять ту ж кількість білка, розділялли ЗОБ/РАСЕ (395 концентруючого гелю, 1095 розділяючого гелю) і обробляли авторадіографією, як описано (Ріса еї аї., 2000). Авторадіографії візуалізували і кількісно визначали в Турпооп-8600 Ітадег (Моїесшаг Супатісв Рпозрпог-Ітадег "М (МОР))|, і зображення отримували з використанням програмного забезпечення ІтадеОцапі (Атегепат РВагтасіа

Віоїтесі)) (аналіз МОР).

Для аналізу розчинних/нерозчинних білків екстракти з цілих клітин (М/УСЕ) готували після лізису в екстрагуючому буфері з високим вмістом солі (буфер В) (50 мМ Тті5-НСЇ, рн 7,5, 400 мМ масі, 1 мМ ЕДТА, 1 мм ЕГТА, 195 Ттійоп Х-100, 0,595 МР-40 ї 1095 гліцерину) з додаванням 2 мМ дітіотреїтолу (017), 20 мМ В-гліцеринфосфату, 19 мМ (п-нітрофенілфосфат) РМРР, 2 мМ

Мазмо4, 1 мМ РМ5Е і коктейлю інгібіторів протеази (Коспе) (Кобзб5і еї аї., 2000). Клітини двічі промивали крижаним РВЗ, а потім лізували в буфері-В (80 мкл). Після одного циклу заморожування і відтавання, та після центрифугування при 15000 об/хв (15 хв при температурі 4 "С) збирали фракції супернатанту (розчинні) і осаду (нерозчинні). Нерозчинні фракції солюбілізували в 60 мкл буфера-5 (50 мМ Ттіб5-НСІ, рН 8,5, 195 505 й інгібітори протеази) шляхом обробки ультразвуком на льоду з використанням ультразвукового процесора ОРБОН

Зо (Нієі5зспег) (4095 амплітуда, імпульсний режим: б х 10 секунд, паузи по 15 секунд). Загальні екстракти були отримані при лізисі клітин в буфері Лемлі з подальшим ДНК-фрагментуванням при пропусканні через шприц для інсуліну з голкою калібру 28 Ж (приблизно 0,32 мм) 10 разів.

Для вестерн-блоту екстракти клітин (25 мкг) розділяли 505-РАСЕ і наносили на нітроцелюлозу, і фільтри інкубували з наступними антитілами: моноклональними анти-5ем-Е (аг-у236; ІО Ррагта) і анти-а-тубуліновими (В-5-1-2, бідта-Аїйгіс!) антитілами; поліклональними анти-а-тубуліновими (11Н10, Се! Зідпаїйпуд Тесппоіоду Іпс.), анти-РІ АС (оУКОООК Та, Сеї! Зідпаїїпд Тесппоподу, Іпс.) і анти-В-актиновими (Зідта-А|йагісп) антитілами, з наступним забарвленням міченим пероксидазою антикролячим Ідс, антикозиним Ідс або антимишачим Іде (набір для визначення Зирегзідпаї, Ріегсе).

Імунофлюоресцентна мікроскопія. 5ем-інфіковані клітини АСМК або А549 і К5МУ-Е- або Нем-

Е-трансфековані клітини Неіа, вирощені на покривних скельцях, фіксували 4905 параформальдегідом в РВ5 протягом 20 хвилин при кімнатній температурі через 24 години р...

Псевдоінфіковані або псевдотрансфековані клітини обробляли аналогічним чином. Фіксовані клітини інкубували з анти-Е моноклональними антитілами (аг-у236; ІЮ Ріагта) або анти-РІ АС (ОУКООООК тег, Сеї! 5ідпаїїпуд ТесппоїІоду, Іпс.) поліклональними антитілами протягом 1 години при температурі 37 "С для забарвлення плазматичної мембрани, або їх пермеабілізували 0,195

ТийопХ-100-РВ5 протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, а потім інкубували з моноклональним анти-Е і антикальнексином (5іге55депе) або поліклональним анти-а-тубуліном (11НІ10, Сеїї Зідпаїйпуд Тесппоїіоду Іпс.) протягом 1 години при температурі 37 "С з наступним забарвленням козячим антимишачим Ідс, кон'юЮгованим з АЇеха РіІног488 (Моїесшаг Ргоревз-

Іпмігодеп) або родамін-кон'югованим (Ріегсе), і родамін-кон'югованим козячим антикролячим

Іо (Ріегсе). Ядра забарвлювали 4"б-діамідино-2-феніліндолом (ОАРІ) або Хехстом 33342 (Ноеси5і 33342, МоіІесшаг Ргобев5, Іпмігодеп). Зображення були отримані за допомогою конфокальної лазерної скануючої системи Оіутри5 Ріпоміеєм ЕМ-1000 з використанням програмного забезпечення РіпоМміем/-1000.

Статистичний аналіз. Статистичний аналіз проводили з використанням І-критерію Ст'юдента для непарних даних. Дані виражаються як середнє - СВ для двох паралельних зразків. р значення «0,05 вважалися важливими.

Дослідження ЕМО8-3002 (дані клінічних випробувань для ентеровірусу/риновірусу) 60 Під час рандомізованого дослідження, проведеного в США, Канаді, Бельгії, Австралії та

Новій Зеландії, вивчали вплив М1Т7, озельтамівіру (О5Т), МТ2 ї- О5Т і плацебо на час до ослаблення симптомів у осіб віком від 13 до 65 років з неускладненим грипом або захворюванням, подібним грипу. 1941 суб'єкт з жаром, щонайменше одним помірним або важким респіраторним симптомом (кашель, біль у горлі, закладеність носа) і щонайменше одним помірним або важким системним симптомом (підвищена температура, головний біль, міалгія, втома, кашель, закладеність носа і біль в горлі) були зареєстровані як учасники дослідження протягом 48 годин після початку симптомів. На початковому рівні забирали мазки з носоглотки і піддавали бактеріологічному дослідженню і ЗТ-ПЛР для виявлення вірусних причин захворювання.

Після реєстрації як учасників дослідження пацієнтам у довільному порядку призначали прийом таблеток з пролонгованим вивільненням нітазоксаніду (МТ2), капсул озельтамівіру (О5Тт), МТ Жї- О5Т або плацебо. Введення кожного лікарського засобу проводили два рази на добу протягом 5 діб. Доза МТ становила 600 мг, а доза О5Т становила 75 мг.

Пацієнти реєстрували тяжкість своїх симптомів два рази на добу протягом як мінімум 14 діб (симптом відсутній, слабковиражений, помірний або важкий), і симптоми вважалися ослабленими тоді, коли всі симптоми оцінювалися як відсутні або слабко виражені і залишалися такими як мінімум 24 години без використання послаблюючих симптоми лікарських засобів.

Первинною кінцевою точкою дослідження був час від першої дози до ослаблення симптомів.

На основі аналізів ЗТ-ПЛР (І штіпех МХТАС Кезрігагу Раїподеп Рапеї) зразків мазків з носоглотки було встановлено, що у 251 суб'єкта єдиною причиною захворювання є вірус з роду

Епіегоміги5 (в тому числі ентеровіруси і риновіруси). Значення часу до початку ослаблення симптомів для цих пацієнтів представлені на діаграмі аналізу виживаності Каплана-Мейєра, представленоїй на ФІГ. 2.

Обидві групи, які приймали МТ7, показали статистично важливі (р «0,05) скорочення часу до ослаблення симптомів у порівнянні з пацієнтами, які отримували плацебо. Медіанне скорочення часу до початку ослаблення симптомів у порівнянні з плацебо становило приблизно 47 годин.

Дві групи, які приймали МТ72, були об'єднані і проведено порівняння з двома групами, які не отримували МТ2 (051 і плацебо). Пацієнти, які отримували М1Т7, показали значне (р - 0,005) зниження часу до початку ослаблення симптомів у порівнянні з тими пацієнтами, які не

Зо приймали МТ7. Результати цього порівняння наведено на ФІГ. 3.

На основі аналізів ЗТ-ПЛР (І штіпех МХТАС Кезрігаїгу Рашодеп Рапеї) зразків мазків з носоглотки було встановлено, що у 13 суб'єктів єдиною причиною захворювання є респіраторно-синцитіальний вірус. Час до початку ослаблення симптомів, таких як жар, головний біль, міалгія, втома, кашель, закладеність носа і біль в горлі, для цих пацієнтів представлені на діаграмі аналізу виживаності за процедурою Каплана-Мейєра, представленої на ФІГ. 1.

Хоча вищевикладене відноситься до конкретних кращих варіантів реалізації даного винаходу, варто розуміти, що даний винахід не обмежується тільки ними. Фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що описані варіанти реалізації даного винаходу можна піддавати різним модифікаціям, і що такі модифікації включені в обсяг даного винаходу.

Всі публікації, патентні заявки і патенти, що згадуються в даному описі, включені в даний опис за допомогою посилання у всій повноті.

Список літератури:

Вегпазсопі, 0., Атісі, С., Іа Егаліа, 5., Іапаго, А., апа Запіого, М. Сх. (2005) У. ВіоЇ. Спет. 280, 24127-24134.

Ї а Егаліа, 5., Атісі, С., апа Запіого, М. а. (2006) Апіїміг. ТНег. 11, 995-1004.

Ріса, Е., Раіатага, А. Т., Вов5і, А., ЮОе Магсо, А., Атісі, С., апа Запіого, М. с. (2000)

Апіїтістор. Адепі5 СпетоїНег. 44, 200-204.

Воззі, А., Карапйі, Р., Марії, а., ТаКаНавні, Т., Спеп, У., Каїіп, М., апа Запіого, М. а. (2000)

Маїшцге 403, 103-108.

Возвідпої, 9. Е., Га Егагіа, 5., Спіарра, Г., Сіиссі, А., Запіого, М.С. (2009) 9. ВіоІ.Спет. 284,

Claims

29798-29808. 55 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб лікування захворювання або стану, викликаного вірусом, що належить до сімейства Рісотамігідає, або пов'язаного із зазначеним вірусом, який включає введення суб'єкту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить бо щонайменше один з нітазоксаніду, тізоксаніду або їх фармацевтично прийнятної солі.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений вірус належить до роду Еліегомігив.

З. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що зазначене введення послаблює щонайменше один симптом зазначеного захворювання або стану, вибраного з жару, кашлю, болю в горлі, закладеності носа, втоми, головного болю, міалгії і підвищеної температури.

4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що зазначене введення а) зменшує жар, викликаний вказаним захворюванням або станом або пов'язаний з ним, і Б) послаблює щонайменше один симптом зазначеного захворювання або стану, вибраний з кашлю, болю в горлі, закладеності носа, втоми, головного болю, міалгії і підвищеної температури.

5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що зазначене введення а) зменшує жар, викликаний вказаним захворюванням або станом або пов'язаний з ним, і Б) послаблює щонайменше один респіраторний симптом, викликаний вказаним захворюванням або станом або пов'язаний з ним, і щонайменше один системний симптом, пов'язаний з вказаним захворюванням або станом, де зазначений щонайменше один респіраторний симптом вибраний з кашлю, болю в горлі і закладеності носа, а зазначений щонайменше один системний симптом вибраний з втоми, головного болю, міалгії і підвищеної температури.

6. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що зазначений вірус вибраний з ентеровірусів А-.).

7. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що зазначений вірус вибраний з риновірусів А-0.

8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості противірусного агента прямої дії.

9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що зазначений противірусний агент прямої дії являє собою рупінтривір або МК-0608 або їх фармацевтично прийнятну сіль.

10. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що зазначене введення починають в межах 48 годин з моменту виникнення у суб'єкта щонайменше одного симптому зазначеного захворювання або стану, де зазначений щонайменше один симптом вибраний з жару, кашлю, болю в горлі, закладеності носа, втоми, головного болю, міалгії і підвищеної температури.

11. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений суб'єкт являє собою людину. і Н ! : : ; миши ШЕ ! по Я00 Я8о о ояб 300 360 яба а ТІЗА, (час до початку послаблення симптохив) (Рзнаевни Тевтят 11010000 мя

Фт.1 клух ї ОМ ї тож і М : п Те про ШЕ ОА роді рої ї я рол плецево | : -жЖ Її пЕу ї т-- ї що ї о БЕН ; ЖЕ т в ї ш В ет ! ї 5 щей : : я Не Я

9. дроту : 0 : ше па Б Н Х Б Сб ння : Є й околі ї В с: ИН рнфнкоик мими ВО б нн ПИТИ нене рннтннї о НЯ 200 ЗО ДІ що воб ТО ВО час до початку послаблення симптомів (години) Ш00012ж00 | тек т Біедівна (ОВО ЕЕя ІЙ ПНІ

Р.значеннях відносних пліт Б З Тест Прентіц- Хітокосня.

г. ї ї х ! я ще Я ОВ Ї же ТЕ НЕД Гея о МЕ : 7 Ух ее НЕ: з ї ЕШ : а Ї 3 ЕЗ ї з - ї хе СХ Ж ке : дя Оу : - ї х ому ї з х я І х З ї Я ї ль ї, : де с х Я ї я вл я сх Тони Ї го НЕ Ре ке ще КК ЩЕ чо 5 ТІЗАТІ. Гчас до початку послаблення симптомів) ШШШШШ020202020020000000001700 чтятрят НеХТЕ Гру (ТетПрепіа ут 3030311 Фюю

Претивірруєна активність нітазоксаніду в клиннах ЛЄМК інфікованих Бе ФО ОК МО пе В і у ВО КХаонтрать КО КК МУ: Я її Мт Ї МОМ я ше і МОМ КЗ У о- 1, оо що й Я ОК ВВ Го х ск | -е ех х х Х док і х Й яз В х ВК ЖЕ Мезим: ЧЕ М У : ! Кк ВО ДОВ ! у ак Звм КО Я х ЗК ОО Щ | | КО Едді ун о й і ни ли шк о й «я ї її КУ МКК ОО КВК КК КК вва Момейн ротик занаю : ІОН і З БУСУКНиИВу с ВВ : ката : М ФІЗ АВ Протиніррусня активність нітязоксянілу в клитннах, фикованих зем, залежить від множинності зараження ії ЗБУОбуклітиму | І Об БУС клітинну ; ; стаді. : авта. се МКК клітини АЄМК З ЖК шоста его З х га х яв ОВ мкгмл - ВЕ у БООВО я бод Св 0.3 мкм же хо, В ж х Мо БУ ТЕ ЛЯ хг щОЕХ за У тт в ка ко ак ош Й Ба зж о жа ДО дрібне вв днк Зунне» 8 й лова ва я в Боно! Я она МТ івкомлі ; Й МІХ Ів млі та віІД ТИНУ ЮТтТИН жо доб бонеойї я жк ще Ів их АВМ; Ярнннвв клітини АЯЯЯ х Що КУ - х 5 да хво 0,1 мим ще ло 5 х - Х бе 04 мкгвмл ве Ке ЗЕ бо ут мл мале ца бе - ж і «5 БК с я "Ж Та о. в Со Я мя в ще Є м ю вові Я ще МТ мхтлал в омнпойв Я 30 За ех

Бплив штазокоавіду на синтез білку Ба У ЮРА х х зазторадег рація ге ІЗ Моск о Беу як За -

я. «чия ХЕ дк Й адло пал МАМА ЛГ Кт ПОТ Т ох тонтт т «во ото хйа й ВЗ де Звяаю зх М зак ча рі. й МИТІ хо КК КК яв . похо і ще о п о ЗЕ | дише і Пав НН с Е КАХ се МОЯ АК КК МК ХХ 0 бл ММ І Мне ЗМК КК КК А ве я ТОМА ВК о Ж щЕ Ох ОКО ри ВЕК КОВО В в о ВО м ПЕ а Б фа ве БО, же-- Б КМ меш пан ХИЖІ ПИНИ тт. А ЕІ МКУ МЛИН ПИ ДИКЕ раБЕМменоче Папульк 12 годі ГБ Маю пвпуйье годі ВУ « множ. зараж. 5 БУСКкпітину по 5 у АОМК кнітнки МТ 5 0 акті тд ТМ х тунікаміцик 2,5 мкг/мя Щі м

«ВЕ. 5 Вплив нітазоксаніду на синтез білку еУу-Е ї У ж ЗУ КЗ пн нн я яде х Б я ж х ЗЯ яв я Часті тоді ВЕ в АК ре о В ех Мо ВЕ ЩОро ди донних Пе ке с ШЕ НК МИ МИНА СВИ ОО ОК ж 23 М ж аю 6 М ЧУВ ті поді не в НН п ВН шо НН - ВЕК ЕЕ ЩЕ КО МЕ КО Коник клякн онко в леритв н С НПМ по оон А Ві БЕ КОКО я КЕ СЕ я Щ Ку ня тя ШК ОВ В Пестав- сит ПК ШКАККА К КЕ КВН ОУН В ЕКОИМ КК ВИМИ ЖИ ПЕКИ КК ПКТ ВК: МІН ЛК КВ МКК ОК М и ОУН и дн І Мох Кв НЕ о Пн ЕВ анторадютеня ВІ Менсух мини ї год п-о аВеМ-К под Зеу х множ. зараж З БУЗЖОонНИиМу МТ е ЗО кими БОМ кпітини 7ЛМ е туніка й. миля 84 годові,

О.Т

Визначення незрілих Форм білку че У-Е в нерозчннних фракціях їмлюовних екстрактів АСПТЯК після оброзкн МІЖ Ж щу фр «Е е т Чт брошку Ву Зо мкуимяй 000 вм) о її ще Розчинна фракція Ї они сини ан Шо ПО Бр Нерозчинна фракція кмин кА УАД Ко пишних М ще Возчинна й кція хЗККиНі Бестерн-блот ще: Нігазоксанід ГО мкм Е в БаЕМ-О ТМ ов о тумніваміцин 12.5 мкл Ере прекувсор ЗУ Бизначення незрілих Формінлюу беу-Е в нерозчинних фракщшях білкових екстрактів АСМК після сороски МІК рн МИ в ж ВЕ бат яко ОО НМ р) кемртао мк закгомя Мт: п и а п пи Еш: шо ко вк в се жо Розчинна фрахців І - Ж Ж ен савве Ж в ши н зим : Же мВ не С, Нерезчинна фракція я детнт Поні ! | Рв Бестерн-йпот МТХ хх Нітазоковзнід ПО мега) КЕ зако ТК т туніка гг, могти Ер ох пренурсов БеМ-Е т. я

Битазоксантія пригнітує перенесення тліІКЮПротеїнів Нех Е де поверхні клітини сОМАХ Наш Е СР ЛЗ МеУ-Б СЕ ло МТ шш пт; В 5, весою ПІ сш ПТ Ж Ти ї 0 БОКОМ НН Ох ПИШОТИМОМ ЖИМ ТТ, ХДИЮК, З ПОСУД ТЕКИ

Кия. МИ КОШТИ ЖИХ ОДЕУХ ї ЕВ я о НН се: зве, я МВ І ОДН КЕ, БО се В ЯН с КК СК Ко ее БУХ З КК. ДЕ и В. шо ня НН 5 а ДИНЯ ши НН дек, і 2 ше я лю З БО он ня ОО ши ЖЖ Мт ПО мкгмя ! клітини Неї з я. 16 й мнаж. зеВрвяж. д а БУСуклітину о хи - ста ат - У її ТО а Ов 05 с за атуя сет ени, Км Е: Га 1 меншини пла КЕ я - ї Я чита ЕЕ Я Е; я х Я КЕ о У вла М ще У Фа сть за у ДЕ: ПЕН чк У чЕ ша: х і в т щ жу - ї х пд хі 2» ї Я ЗЕ ДИ: , Е сова НИМИ з ок ко 4 і таз Ге -к р х 53 й - вх г Б ме С Я и ШК де ж З Е О бони ой ех М 103 -5. солянантеуснн ДО ШО б 0 о о З в 3: в ! МТ шкомлі МТА Укомл вна а а а а а І І вно. заряж. І І І ! В ОН БУСУКлітину ї пла КИ - і ФВ ВО У олне нях ж і ОЙ х у : З да їх ж 105 х У З м їое х вся Е і 434 2 З ко 2 св в о кА Ф КН ЗУ н КЕ х і Ва. » н к й с УКОоїо ча і ч во ВИЩЕ ре Е ОК нннтютнстенкі в й ЗО в нненетюеттттнтнтня ж що посол вою МТ екс МНТЕ |мкомлі о. МОМ що Бе Ве М ен НН в НН ШІ о і ни о НН ВМ ИМиИ понК Ме : нен В ІЕЕ нт ке свя ВОК КК ІЩЕ ї. РН МЕ МК ІВ Се ПК АК з о он и і в НН і их пе В о а и м п в о З З З Контроть БЗеу зе сопе постосовт свт осстоосгіосстосовктсев ис сгсгісоісесстсоготос сюди стос сс іс ссвіосс ФА Є ман. Зжрем. Манеж. ЗРК. З БЖОнНКВену КАТ БИ мн я пк є Е Я не В йо: ї пе о ; хх ке НВ у ІК ї їні Ж х жо що А 4 в. ї- БЕ х Жов Те зв Е зв ВУ За: ян М 8 Ж х вк й й чут в | -К В ЩЕ фооуютектюутновяня рення 8 а пи нн На В. ож я 30 чаБ Мтліжу б вові я 6 не я. 15 -Меск о ЗеМ «Моск о ЗвУ 000000 Мосю ву. па й Я ЕхУ ч3 9 де ме ожив че обо 0 обов ще КК її ЖЕКЦЕ ШО ли МВВ Ве пд їх ХК екс т . п я п. кі ще. ШОВ Б ОО Н ще її М сх ШК ЩЕ 0 ШЕ СЕ дих 1 0 (і Ек ни о 5 БО г МОН ве 0 ТВясв- о. А 000. КЕ в ий нн ИН шо ОО

В г. чи СМ де сх бат 0. ОО:

г. шо кра 3-5 НАХ т ії і щи 0 ЩА вес о 0 ШЕ 0. ОБ Ви в ЗО Іо НК ПЕ Не нт о в РОМОКОМУК ОВК ЗИ КИ ПЕ Ким ТОЕМЕОКК КЕ ЖЕ В о Б рі ПОВНЕ Ві ІЕЕ я о ПО В ЗЕ ЕХ ово я ди БО ОО а И Кия КО МОДА теврневсу» ре Мнгсу» ічврмнрсує імпульс 8-24 год ові івнульк я тод р. імпутьс Я под в. фізввіутьяхів на хвилину! Не

Н.І А В А Зеу З как, ме я -Щ 5 їх а 6 б; газ 6 42 24 365 Час ро лтод) в Беу З М ж нт я Б 2 а Зб ЯК б о ї2 ав Зб ЯЖХ Часові год) ПЕК ОТ ВО ВЕ МБ ОО ОО ОС ск ЗауАК Іі в кни ГБі-Месув БНО АВ

ЕЕ - Зеу Ж - ца о Щи нім) Го м) ЗО КАХ З мила рин ВИК р о пи р ТЯ в ГЕ ши: ши ШЕ СЕ - дек жене я боаютин ФІ Некнеутетне екю нуститнююню 0 реактин оферту і ге Н т 5 | нн й о й й-актив п о и КК д-зктих

ФІ. 15 А-В. БАК ще св Ева Збільшення « й ЩЕ 1 ші 000 р : Е 00 ва 0000 і... ШЕ М М СУ НН МО і ЗМНЕВЕВН ВЕН СО В "ЩІ 1 Щ ' -е 00000 0 «ШИ ; МНН ВИХ МИС -- ВИКОН Я Меси ща Би з 3 НО т НН МЕ МОЮ 5 2 Же со ШЩЕБК 0. В ФІгє Мічення поверхні ЗЕ У-Е й Фо Ф(яе Пе й й Моск Зау Беу МТ тат

А У В ; З НежЕ стю ВиВУЕ ство х Ясен Кр т нти Е | «еще - сстубупін Я шк щі я Ме и ОБ ш- Ж - і че,» я Ка ень | я-тубувін ють жну.ївАн В мож 0 нБУєсСтІАС ВБУЕСТІАСоМХ ФА